Summary
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.
Abstract
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.
Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l'assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l'induzione dell'espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l'esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.
Introduction
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all'interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche 1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l'isolamento e la coltura primaria delle LLEC.
I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi3, il tessuto mesenterico4, il tessuto dermico5, i linfatici di raccolta6 e il tessuto polmonare7. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso 8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto11,12. Nonostante l'esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi13, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l'isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l'espansione delle LLEC attraverso l'uso del fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)14. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.
Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L'obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l'isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.
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Protocol
Questa ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L'intera procedura sperimentale è stata condotta in condizioni di sterilità rigorosa. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato.
1. Preparazione dei reagenti e degli strumenti
NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono le soluzioni devono essere eseguite all'interno di un armadio a rischio biologico di classe II.
- Preparare il tampone di lavaggio mescolando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con calcio e magnesio, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali). Conservare questo tampone al freddo a 4 °C. È fondamentale prepararlo fresco il giorno dell'utilizzo e degassare il tampone.
- Preparare gli enzimi digestivi combinando 10 mL di PBS (senza calcio e magnesio) con 2 mL di tripsina allo 0,25%, 1 mL di papaina 20 mg/mL e 200 μL di collagenasi I da 1 mg/mL (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Assicurarsi dell'uso di aliquote di volumi appropriati per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Conservare queste aliquote a -20 °C. - Preparare il terreno di coltura utilizzando il kit di terreno di crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio, che include VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare il tampone di arresto integrando il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di FBS per arrestare il processo di digestione.
- Prepara strumenti chirurgici sterili: questi strumenti dovrebbero includere forbici, pinzette a punta seghettata e pinzette a punta fine.
2. Rivestimento del pallone
- Rivestire il matraccio T25 con una soluzione di fibronectina 100 μg/mL (vedere Tabella dei materiali) e incubare per una notte a 37 °C. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta.
- Lavare il pallone tre volte con PBS, successivamente aspirare il PBS e lasciare asciugare il pallone T25 all'aria.
3. Dissociazione delle leptomeningi
NOTA: Utilizzare sempre tamponi e soluzioni preraffreddati a 4 °C.
- Anestetizzare i topi con un'inalazione eccessiva di isoflurano al 4% e poi sacrificarli mediante rapida decapitazione utilizzando forbici precedentemente pulite con etanolo al 70%.
- Incidere con cura la pelle lungo la linea mediana, partendo dall'apertura nella parte posteriore del cranio ed estendendosi verso la zona frontale.
- Rimuovere delicatamente il cranio, sollevandolo delicatamente con le forbici per evitare di danneggiare le leptomeningi, assicurandosi di ottenere l'intero cervello, comprese le leptomeningi.
- Immergere l'intero cervello in un tampone di lavaggio e sciacquarlo delicatamente per rimuovere il sangue superficiale.
- Trasferisci il cervello in una capsula di Petri sterile senza tritare ed estrai le leptomeningi dalla superficie del cervello usando una pinzetta a punta fine al microscopio.
- Tagliare il tessuto delle leptomeningi in frammenti utilizzando microforbici sterili.
4. Digestione enzimatica delle leptomeningi
- Aggiungere 10 mL della miscela enzimatica (fase 1.2) ai frammenti e incubare a 37 °C per 15 min. Agitare delicatamente per assicurarsi che i frammenti si stacchino dal fondo del tubo. Successivamente, aggiungere 10 ml di tampone di arresto (passaggio 1.4) per arrestare la digestione.
- Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 10 mL di PBS freddo e passare la miscela attraverso un colino da 70 μm in una provetta sterile da 50 mL per filtrare eventuali grumi.
5. Espansione cellulare
- Piastra 1 x 10 5 cellule per cm 2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina (fase2) con5 mL di terreno di coltura.
- Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore. Successivamente, rimuovere il terreno per eliminare le cellule non attaccate.
- Sostenere la cultura sostituendo il 50% del terreno ogni due giorni. Ripeti questo processo due o tre volte.
6. Selezione della cella magnetica
NOTA: Lavorare rapidamente, mantenere la freddezza delle celle e utilizzare soluzioni pre-raffreddate per prevenire l'etichettatura non specifica delle cellule.
- Preparazione degli strumenti e dei reagenti: collegare un separatore magnetico a un supporto per separatore magnetico (vedere la tabella dei materiali). Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra la colonna di selezione. Posizionare una provetta da 50 ml sotto la colonna di selezione per raccogliere il flusso.
- Digestione enzimatica: una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il terreno e risciacquare le cellule con PBS. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Arrestare la digestione aggiungendo il tampone di arresto. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
- Incubazione degli anticorpi: risospendere 1 x 107 cellule totali in 100 μL di PBS e aggiungere 10 μL di anticorpo LYVE-1 (vedere la tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sciacquare le cellule introducendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.
- Marcatura delle microsfere: risospendere le cellule in 100 μL di PBS e aggiungere 20 μL di Microsfere (vedi Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti e travasare il surnatante. Successivamente, detergere le cellule con 1 mL di PBS attraverso centrifugazione a 300 x g per 5 min. Infine, rimuovere completamente il surnatante.
- Esclusione magnetica negativa: risospendere le cellule in 4 mL di PBS. Passare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 μm per eliminare i grumi. Preparare la colonna di selezione (vedere Tabella dei materiali) sciacquandola con 3 mL di PBS, quindi applicare la sospensione cellulare nella colonna di selezione.
- Eseguire le fasi di lavaggio con 3 mL di PBS e raccogliere le cellule LYVE-1-negative in una provetta da 50 mL posizionata sotto la colonna di selezione per consentirne il passaggio.
- Selezione magnetica positiva: pipettare 6 mL di PBS nella colonna di selezione. Svuotare istantaneamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna di selezione per ottenere LLEC positivi a LYVE-1.
NOTA: Attendere sempre che il serbatoio della colonna di selezione sia vuoto prima di procedere al passaggio successivo.
7. Cultura dei LLEC
- Centrifugare gli LLEC LYVE-1-positivi a 300 x g per 5 minuti, quindi rimuovere con cautela il surnatante.
- Inserire 1 x 10 5 cellule per cm2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina con5 mL di terreno di coltura.
- Mantieni la cultura sostituendo il 50% del mezzo a giorni alterni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina ed eseguire il passaggio cellulare. Utilizzare le cellule per esperimenti successivi dopo 2-3 passaggi.
8. Analisi citofluorimetrica
NOTA: L'analisi citofluorimetrica a flusso è stata condotta seguendo la procedura precedentemente descritta15.
- Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Quindi, aggiungi il tampone di arresto per arrestare la digestione.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e aspirare completamente il surnatante. Risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di PBS.
- Aggiungere 1 μL di anticorpo LYVE-1. Mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule in una quantità appropriata di tampone PBS per l'analisi utilizzando la citometria a flusso e il software FlowJo (vedere Tabella dei materiali).
9. Colorazione immunofluorescente
NOTA: La colorazione immunofluorescente è stata condotta seguendo la procedura descritta in precedenza16.
- Lavare le celle con PBS tre volte. Fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PFA e lavare le celle con PBS tre volte.
- Applicare il tampone a blocchi per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco dai vetrini coprioggetti.
- Aggiungere l'anticorpo LYVE-1 nel tampone di colorazione alle cellule e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.
- Aggiungere alle cellule un anticorpo secondario appropriato (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.
- Controcolorante con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Le cellule sono ora pronte per la microscopia a immunofluorescenza.
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Representative Results
Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l'ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l'induzione dell'espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selettivamente utilizzando il cell sorting ad attivazione magnetica (MACS). Infine, vengono eseguite colorazioni in immunofluorescenza e analisi citofluorimetriche per valutare la purezza degli LLEC, con i risultati del saggio MTT che dimostrano robusti tassi di crescita degli LLEC (Figura 1 supplementare). Le fasi principali di questo protocollo multiprocedurale sono illustrate nel diagramma di flusso, con l'intero processo che richiede circa 2-3 settimane (Figura 1).
Per raccogliere le LLEC, è essenziale dissociare le leptomeningi e promuovere l'espansione delle LLEC, preservando la vitalità cellulare attraverso tecniche chirurgiche efficienti e mantenendo un ambiente freddo (Figura 2A-E). Dopo aver prelevato l'intero cervello insieme alle leptomeningi in condizioni sterili, viene eseguita una delicata fase di lavaggio a filo per rimuovere i globuli rossi del sangue (Figura 2F). Successivamente, le leptomeningi vengono accuratamente estratte dalla superficie del cervello al microscopio (Figura 2G). Queste leptomeningi sono costituite principalmente da fibre di collagene, quindi sono frammentate per accelerare la digestione enzimatica (Figura 2H). Successivamente, viene effettuata la digestione enzimatica di questi frammenti e gli eventuali grumi rimanenti vengono filtrati attraverso un colino da 70 μm per eliminare i cluster più grandi di fibre di collagene (Figura 2I). Infine, le cellule vengono placcate in un pallone T25 rivestito di fibronectina e viene aggiunto VEGF-C per indurre l'espansione (Figura 2J). Dopo 24 ore, il terreno di coltura viene rimosso per eliminare le cellule non attaccate. Questi passaggi facilitano la raccolta di cellule dalle leptomeningi e promuovono l'espansione, che è fondamentale per ottenere un numero sufficiente di LLEC positivi a LYVE-1 più avanti nel processo.
Mentre il VEGF-C induce l'espansione di LLEC, le popolazioni cellulari eterogenee possono ancora crescere insieme. Per isolare LLEC puri LYVE-1-positivi, viene impiegato MACS poiché LYVE-1 è un marcatore riconosciuto per le cellule endoteliali linfatiche. La purezza delle LLEC viene valutata attraverso la citometria a flusso, con risultati che indicano che la percentuale di cellule positive a LYVE-1 nel passaggio 2 non è significativamente diversa dal passaggio 3 dopo MACS, dimostrando una purezza superiore al 95% (Figura 3A). Per convalidare ulteriormente la specificità delle LLEC positive a LYVE-1, per l'identificazionesono stati utilizzati tre ulteriori marcatori di cellule endoteliali linfatiche: podoplanina (PDPN), recettore 3 del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR-3) e omeobox1 correlato a Prospero1 (PROX1). La colorazione in immunofluorescenza ha confermato che LYVE-1 si è co-colorato con questi tre marcatori (Figura 3B). Inoltre, l'identità delle LLEC è stata stabilita in fette di cervello in condizioni fisiologiche, mostrando la co-colorazione di LYVE-1 con PROX1, VEGFR-3 e PDPN (Figura supplementare 2A). Le cellule LYVE-1-positive non esprimevano F4/80 e il fattore di crescita beta derivato dalle piastrine (PDGFR-β), distinguendo efficacemente gli LLEC dai macrofagi e dai fibroblasti (Figura 2B supplementare). In sintesi, questo protocollo consente la raccolta di LLEC altamente puri in grado di essere coltivati in vitro.
Le cellule leptomeningee prima della MACS mostrano eterogeneità, differendo dalle colonie di cellule endoteliali linfatiche. La loro morfologia varia da singole sfere rotonde a forme di fibre fuse (Figura 4A-D). Tuttavia, dopo la MACS, le LLEC presentano caratteristiche endoteliali tipiche a forma di fuso e ciottolo (Figura 4E-H). Sulla base di questi risultati, le LLEC vengono raccolte in modo efficace attraverso questo protocollo multiprocedurale e mantenute in uno stato di crescita sano.
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo multiprocedurale. Questo diagramma di flusso illustra il protocollo multiprocedurale per la raccolta e la coltura dei LLEC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Prelievo di cellule leptomeningi. (A) Preparazione di strumenti chirurgici sterili. (B) I topi sono stati anestetizzati per inalazione di isoflurano al 4% e successivamente puliti con etanolo al 70% dopo l'eutanasia. (C) Decapitazione dei topi e attenta incisione della linea mediana della pelle, partendo dalla parte posteriore del cranio verso la zona frontale. (D) Delicata asportazione del cranio per preservare l'integrità delle leptomeningi. (E) Recupero dell'intero cervello contenente le leptomeningi. (F) Lavaggio dell'intero cervello in una soluzione tampone con lavaggio delicato per rimuovere il sangue superficiale. (G) Dissezione delle leptomeningi dalla superficie del cervello utilizzando pinzette a punta fine. (H) Taglio delle leptomeningi in frammenti con microforbici sterili, seguito dall'aggiunta di 10 mL di miscela enzimatica e incubazione a 37 °C per 15 min. (I) Risospensione del pellet in 10 mL di PBS e filtrazione dei grumi attraverso un colino da 70 μm. (J) Placcatura di cellule in un pallone T25 rivestito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della purezza di LLEC dopo MACS. (A) Istogrammi rappresentativi dell'analisi citofluorimetrica che dimostrano l'espressione di cellule LYVE-1-positive nei passaggi 2 e 3 dopo MACS. La percentuale di cellule positive a LYVE-1 supera il 95% dopo MACS. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti (Mean ± SEM). Le barre di errore indicano SEM. (B) Immagine rappresentativa di immunofluorescenza che mostra la co-colorazione di LYVE-1 con PDPN, VEGFR-3 e PROX1. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratteristiche di crescita delle cellule leptomeningee e delle LLEC. (A) Morfologia delle cellule leptomeningee catturate in immagini rappresentative. Barra della scala = 50 μm. (B-D) Immagini rappresentative che raffigurano la morfologia delle cellule leptomeningee il giorno 1, il giorno 2 e il giorno 3 prima della MACS. Barre di scala = 100 μm. (E) Morfologia dei LLEC catturati in immagini rappresentative. Barra della scala = 50 μm. (F-H) Immagini rappresentative che illustrano la morfologia delle LLEC il giorno 1, il giorno 2 e il giorno 3 dopo MACS. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Tasso di crescita dei LLEC e SVEC4-10. I risultati del test MTT mostrano una significativa diminuzione del tasso di crescita degli LLEC nel passaggio 1 rispetto al gruppo SVEC4-10. Non ci sono state differenze significative tra i gruppi LLEC del passaggio 2 e del passaggio 3 rispetto al gruppo SVEC4-10. I dati rappresentano i risultati di sei esperimenti indipendenti (Mean ± SEM). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura 2 supplementare: Caratterizzazione e discriminazione delle LLEC in fette di cervello. (A) Immagine rappresentativa di immunofluorescenza che illustra la co-colorazione di LYVE-1 con PROX1, VEGFR-3 e PDPN in fette di cervello in condizioni fisiologiche. Barre della scala = 2 μm. (B) Immagine rappresentativa di immunofluorescenza che dimostra che LYVE-1 non co-colora con F4/80 e PDGFR-β in fette di cervello in condizioni fisiologiche. Barre di scala = 20 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Crescita di LLEC sotto stimolazione VEGF-C. (A) Immagini rappresentative di LLEC sotto stimolazione di 1 ng/mL di VEGF-C. (B) Immagini rappresentative di LLEC sotto stimolazione di VEGF-C a 100 ng/mL. (C) Immagini rappresentative di LLEC sotto stimolazione di VEGF-C a 500 ng/mL. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura 4 supplementare: Espressione di CD31, PDPN e VEGFR-3 dopo la raccolta. (A) Istogrammi rappresentativi dell'analisi citofluorimetrica mostrano che le cellule CD31-positive sono inferiori al 5%. (B) Istogrammi rappresentativi dell'analisi citofluorimetrica indicano che le cellule PDPN-positive superano il 95%. (C) Istogrammi rappresentativi dell'analisi citofluorimetrica dimostrano che le cellule VEGFR-3-positive superano il 95%. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura supplementare 5: Morfologia dei LLEC e distinzione da CD31. (A) Immagini rappresentative della morfologia delle LLEC rivelate dalla colorazione ematossilina-eosina. Barra della scala = 20 μm. (B) Le immagini rappresentative dell'immunofluorescenza illustrano che LYVE-1 e PDPN non co-colorano con CD31. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 6: Tasso di proliferazione dei LLEC. I risultati rappresentativi del test CCK-8 mostrano una significativa diminuzione del tasso di proliferazione delle LLEC nel passaggio 1 e nel passaggio 6 rispetto ai passaggi 2 e 5, rispettivamente. I dati rappresentano i risultati di sei esperimenti indipendenti (Mean ± SEM). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.
Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l'adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo così una popolazione cellulare più omogenea. Inoltre, il tempo, la durata e la temperatura durante le procedure chirurgiche per la dissociazione delle leptomeningi sono fattori critici che influenzano la vitalità cellulare. Pertanto, è fondamentale mantenere una durata di tempo entro 1 ora e mantenere il tampone sufficientemente freddo. Un altro punto critico riguarda la presenza di globuli rossi nelle leptomeningi, da cui il rilascio di emoglobina può danneggiare le LLEC. Per mitigare questo problema, è essenziale sciacquare e lavare delicatamente per rimuovere i globuli rossi, prevenendone gli effetti citotossici. Infine, gli LLEC richiedono la stimolazione con VEGF-C20, in particolare a una concentrazione di 100 ng/mL. Sotto questa stimolazione, le LLEC mostrano una caratteristica morfologia simile a quella endoteliale piuttosto che formare tubi (Figura supplementare 3A-C). Di conseguenza, questo studio ha impiegato un terreno di coltura contenente 100 ng/mL di VEGF-C per indurre l'espansione e mantenere l'omogeneità nelle popolazioni cellulari.
Il protocollo multiprocedurale qui descritto viene fornito con passaggi per la risoluzione dei problemi e alcune limitazioni. In primo luogo, questo protocollo richiede 2-3 settimane per essere completato, il che lo rende impraticabile per la ripetizione frequente. In secondo luogo, le procedure chirurgiche ed enzimatiche possono comportare la presenza di cellule morte che non vengono eliminate prima della placcatura, influenzando potenzialmente la coltura cellulare. Questa possibilità sarà esplorata nelle future implementazioni del protocollo. In terzo luogo, mentre la purezza delle LLEC raccolte (cellule VEGFR-3 e PDPN-positive) supera il 95%, persistono alcune popolazioni cellulari eterogenee, comprese le cellule CD31-positive, che costituiscono meno del 5% (Figura supplementare 4A-C). Questa è una sfida comune nella coltura di cellule primarie. Immagini ad alta risoluzione dalla colorazione ematossilina-eosina dimostrano che le LLEC mostrano forme endoteliali caratteristiche, ma non esprimono CD31 (Figura supplementare 5A,B). Infine, i risultati del saggio CCK-8 indicano una significativa diminuzione del tasso di proliferazione nei LLEC al passaggio 1 e 6 rispetto al passaggio 2 e 5, rispettivamente (Figura supplementare 6). Il passaggio 1 può portare a danni agli LLEC a causa del trattamento anticorpale e dello stress fisico durante lo smistamento, mentre il passaggio 6 mostra una proliferazione ridotta all'aumentare del numero di passaggi. Pertanto, le cellule successive dopo il passaggio 6 non sono adatte per esperimenti pertinenti. Data la distribuzione dei fibroblasti nelle meningi21, circa il 5% delle cellule contaminate può contenere fibroblasti. Per risolvere questo problema, l'aggiunta di geneticina e la selezione cellulare immunomagnetica possono essere utilizzate per rimuovere i fibroblasti contaminati22,23. Il monitoraggio del tasso di contaminazione dei fibroblasti in ogni passaggio dei LLEC aiuterà a eliminare l'impatto dei fibroblasti sulla crescita dei LLEC24. Considerando l'eterogeneità tra topi ed esseri umani, la raccolta e la coltura di LLEC umani primari dovrebbero essere perseguiti per potenziali applicazioni cliniche nella ricerca futura.
In sintesi, attualmente non esiste un protocollo stabilito per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multi-procedurale per la raccolta di LLEC da leptomeningi di topo e successivamente la loro coltura primaria in vitro. Questo lavoro faciliterà l'ulteriore esplorazione delle funzioni cellulari e delle potenziali applicazioni cliniche per le LLEC.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), della Natural Science Foundation della provincia dello Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e della Scientific Research Foundation del Dipartimento dell'Istruzione della provincia dello Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
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