Summary
As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.
Abstract
As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) são uma população celular intracraniana recentemente descoberta com uma distribuição única claramente distinta das células endoteliais linfáticas periféricas. Sua função celular e implicações clínicas permanecem em grande parte desconhecidas. Consequentemente, a disponibilidade de um suprimento de LLECs é essencial para a realização de pesquisas funcionais in vitro. No entanto, atualmente não existe um protocolo para colheita e cultivo de LLECs in vitro.
Este estudo colheu LLECs com sucesso usando um protocolo de várias etapas, que incluiu o revestimento do frasco com fibronectina, dissecando as leptomeninges com o auxílio de um microscópio, digerindo enzimaticamente as leptomeninges para preparar uma suspensão de célula única, induzindo a expansão de LLECs com fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) e selecionando células positivas para receptor hialurônico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1) através de triagem celular ativada por magnetismo (MACS). Esse processo acabou levando ao estabelecimento de uma cultura primária. A pureza dos LLECs foi confirmada através da coloração por imunofluorescência e análise por citometria de fluxo, com um nível de pureza superior a 95%. Este protocolo de várias etapas demonstrou reprodutibilidade e viabilidade, o que facilitará sobremaneira a exploração da função celular e as implicações clínicas dos LLECs.
Introduction
As recém-descobertas células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) formam uma malha de células individuais dentro das leptomeninges, exibindo um padrão de distribuição distinto quando comparadas às células endoteliais linfáticas periféricas 1,2. As funções celulares e as implicações clínicas associadas aos LLECs permanecem em grande parte território desconhecido. A fim de abrir caminho para a pesquisa funcional em LLECs, é imperativo estabelecer um modelo in vitro para o seu estudo. Portanto, este estudo elaborou um protocolo abrangente para o isolamento e cultura primária de LLECs.
Camundongos são o modelo animal preferido devido à sua adequação para manipulação genética em pesquisas de doenças. Estudos prévios isolaram com sucesso células endoteliais linfáticas de vários tecidos de camundongos, incluindo linfonodos3, tecido mesentérico4, tecido dérmico5, linfáticos coletores6 e tecido pulmonar7. Esses procedimentos de isolamento têm se baseado principalmente em técnicas como a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e a classificação por citometria de fluxo 8,9,10. Além disso, esforços de pesquisa levaram ao estabelecimento de linhagens de células aracnoides de ratos e linhagens de células capilares linfáticas deratos11,12. Apesar da existência de técnicas de cultura de explantes para leptomeninges13, existe uma necessidade urgente de um protocolo padronizado para o isolamento e cultivo de LLECs. Consequentemente, este estudo colheu e cultivou com sucesso LLECs dissociando meticulosamente leptomeninges sob a orientação de um microscópio e promovendo a expansão de LLECs através do uso do fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C). O marcador distintivo das células endoteliais linfáticas é o receptor hialurônico dos vasos linfáticos-1 (LYVE-1)14. Este protocolo de várias etapas isola seletivamente LLECs LYVE-1-positivos usando MACS e, posteriormente, verifica sua pureza através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência.
As etapas primárias deste protocolo de várias etapas podem ser resumidas da seguinte forma: revestimento do frasco, dissociação de leptomeninges, digestão enzimática de leptomeninges, expansão celular, seleção de células magnéticas e subsequente cultura de LLECs. Finalmente, a pureza dos LLECs isolados é confirmada através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência. O objetivo geral deste estudo é apresentar um protocolo reprodutível em várias etapas para o isolamento de LLECs de leptomeninges de camundongos e seu subsequente cultivo in vitro . Este protocolo está pronto para facilitar muito as investigações sobre as funções celulares e implicações clínicas dos LLECs.
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Protocol
Esta pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Kunming Medical University (kmmu20220945). Todos os experimentos seguiram as diretrizes estabelecidas para os cuidados com os animais. Células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) foram coletadas de camundongos machos C57Bl/6J com idade entre 6-8 semanas e peso entre 20-25 g. Esses camundongos foram adquiridos da Universidade de Medicina de Kunming, em Kunming, na China. Todo o procedimento experimental foi conduzido sob rigorosas condições estéreis. Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente, salvo especificação em contrário.
1. Preparação de reagentes e instrumentos
NOTA: Todas as etapas que envolvem soluções devem ser conduzidas dentro de um gabinete de risco biológico classe II.
- Preparar o tampão de lavagem misturando solução salina tamponada com fosfato (PBS) com cálcio e magnésio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) (ver Tabela de Materiais). Mantenha este tampão frio a 4 °C. É essencial prepará-lo fresco no dia do uso e desgaseificar o tampão.
- Preparar as enzimas digestivas combinando 10 mL de PBS (sem cálcio e magnésio) com 2 mL de tripsina a 0,25%, 1 mL de papaína 20 mg/mL e 200 μL de 1 mg/mL de colagenase I (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Garantir o uso de alíquotas de volumes apropriados para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Conservar estas alíquotas a -20 °C. - Preparar o meio de cultura utilizando o kit de meio de crescimento de células endoteliais disponível comercialmente, que inclui VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (ver Tabela de Materiais).
- Prepare o tampão de parada suplementando o meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% de FBS para interromper o processo de digestão.
- Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis: esses instrumentos devem incluir tesouras, pinças de ponta serrilhada e pinças de ponta fina.
2. Revestimento do frasco
- Cobrir o balão T25 com uma solução de fibronectina a 100 μg/ml (ver Tabela de Materiais) e incubar durante a noite a 37 °C. Antes de usar, remova a solução de revestimento usando uma pipeta.
- Lavar o frasco três vezes com PBS, aspirar posteriormente o PBS e deixar o frasco T25 secar ao ar.
3. Dissociação das leptomeninges
NOTA: Utilize sempre tampões e soluções pré-arrefecidos a 4 °C.
- Anestesiar os camundongos com inalação excessiva de isoflurano a 4% e, em seguida, sacrificá-los por decapitação rápida usando tesouras previamente limpas com etanol 70%.
- Inciso cuidadosamente a pele ao longo da linha média, começando pela abertura na parte de trás do crânio e estendendo-se em direção à área frontal.
- Remova delicadamente o crânio, levantando-o suavemente com a tesoura para evitar danificar as leptomeninges, garantindo que todo o cérebro, incluindo as leptomeninges, seja obtido.
- Submerja todo o cérebro em um tampão de lavagem e lave-o suavemente para remover o sangue da superfície.
- Transfira o cérebro para uma placa de Petri estéril sem cortar e extraia as leptomeninges da superfície do cérebro usando pinças de ponta fina sob um microscópio.
- Cortar o tecido das leptomeninges em fragmentos usando microtesouras estéreis.
4. Digestão enzimática das leptomeninges
- Adicionar 10 ml da mistura enzimática (passo 1.2) aos fragmentos e incubar a 37 °C durante 15 minutos. Agite suavemente para garantir que os fragmentos se desprendem do fundo do tubo. Depois, adicionar 10 ml de tampão de paragem (passo 1.4) para interromper a digestão.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C e remover cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta.
- Adicione 10 mL de PBS frio e passe a mistura através de um filtro de 70 μm em um tubo estéril de 50 mL para filtrar quaisquer aglomerações.
5. Expansão celular
- Placa 1 x 10 5 células por cm 2 em frasco T25 revestido com fibronectina (passo2) com5 mL de meio de cultura.
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas. Depois, remova o meio para eliminar as células não aderidas.
- Manter a cultura substituindo 50% do meio a cada dois dias. Repita esse processo duas ou três vezes.
6. Seleção de células magnéticas
NOTA: Trabalhe rapidamente, mantenha a frieza da célula e utilize soluções pré-resfriadas para evitar a marcação celular não específica.
- Preparação de instrumentos e reagentes: fixar um separador magnético a um suporte separador magnético (ver Tabela de Materiais). Conecte uma coluna de seleção ao separador magnético e posicione um filtro de células de 70 μm no topo da coluna de seleção. Coloque um tubo de 50 mL abaixo da coluna de seleção para coletar o fluxo.
- Digestão enzimática: uma vez que as células atinjam 80% de confluência, aspirar o meio e enxaguar as células com PBS. Adicionar tripsina a 0,25% para destacar as células aderentes e incubar a 37 °C por 5 min. Pare a digestão adicionando o buffer de parada. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
- Incubação de anticorpos: ressuspender 1 x 107 células totais em 100 μL de PBS e adicionar 10 μL de anticorpo LYVE-1 (ver Tabela de Materiais). Misture bem e incube durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
- Gire as células a 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Enxaguar as células introduzindo 1 mL de PBS e centrifugando a 300 x g por 5 min. Remova completamente o sobrenadante.
- Marcação de microesferas : ressuspender as células em 100 μL de PBS e adicionar 20 μL de Microesferas (ver Tabela de Materiais). Misture bem e incube durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
- Gire as células a 300 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Em seguida, limpar as células com 1 mL de PBS através de centrifugação a 300 x g por 5 min. Por fim, remova completamente o sobrenadante.
- Exclusão magnética negativa: ressuspender as células em 4 mL de PBS. Passe as células através de um filtro celular de 70 μm para eliminar aglomerações. Prepare a coluna de seleção (consulte Tabela de Materiais) enxaguando-a com 3 mL de PBS e, em seguida, aplique a suspensão de células na coluna de seleção.
- Execute as etapas de lavagem com 3 mL de PBS e colete as células negativas para LYVE-1 em um tubo de 50 mL posicionado abaixo da coluna de seleção para permitir a sua passagem.
- Seleção positiva magnética: pipetar 6 mL de PBS na coluna de seleção. Elimine instantaneamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna de seleção para obter LLECs positivos para LYVE-1.
Observação : sempre aguarde até que o reservatório da coluna de seleção está vazio antes de prosseguir para a próxima etapa.
7. Cultura de LLECs
- Centrifugar os LLECs positivos para LYVE-1 a 300 x g por 5 minutos e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante.
- Placa 1 x 10 5 células por cm2 em frasco T25 revestido com fibronectina com5 mL de meio de cultura.
- Manter a cultura substituindo 50% do meio a cada dois dias. Quando as células atingirem 80% de confluência, desprender as células com 0,25% de tripsina e realizar a passagem celular. Utilizar as células para experimentos subsequentes após 2-3 passagens.
8. Análise por citometria de fluxo
OBS: A análise por citometria de fluxo foi realizada seguindo o procedimento descritoanteriormente15.
- Adicionar tripsina a 0,25% para destacar as células aderentes e incubar a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione o tampão de parada para interromper a digestão.
- Centrifugar as células a 300 x g por 5 min e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspender 1 x 106 células em 100 μL de PBS.
- Adicionar 1 μL do anticorpo LYVE-1. Misture bem e incube por 10 min no escuro à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em uma quantidade apropriada de tampão PBS para análise usando citometria de fluxo e software FlowJo (consulte Tabela de Materiais).
9. Coloração por imunofluorescência
OBS: A coloração por imunofluorescência foi realizada seguindo o procedimento descrito anteriormente16.
- Lave as células com PBS três vezes. Fixar as células com paraformaldeído (PFA) a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o PFA e lave as células com PBS três vezes.
- Aplique o tampão de bloco durante 1 h à temperatura ambiente. Remova o buffer de bloco das lamínulas.
- Adicione o anticorpo LYVE-1 no tampão de coloração às células e incube no escuro. Lave as células três vezes com PBS.
- Adicione um anticorpo secundário apropriado (ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração às células e incube no escuro. Lave as células três vezes com PBS.
- Contracoloração com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). As células já estão prontas para a microscopia de imunofluorescência.
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Representative Results
Este estudo apresenta um protocolo reprodutível de várias etapas para a coleta de células endoteliais linfáticas (LLECs) de camundongos e, posteriormente, estabelecimento de sua cultura primária in vitro. As principais etapas envolvem a preparação do frasco e o revestimento da fibronectina, a dissociação das leptomeninges, a obtenção de uma suspensão unicelular por digestão enzimática e a indução da expansão dos LLECs com VEGF-C. LLECs LYVE-1-positivos são então seletivamente isolados usando classificação de células ativadas por magnetismo (MACS). Finalmente, a coloração por imunofluorescência e a análise por citometria de fluxo são realizadas para avaliar a pureza dos LLECs, com os resultados do ensaio de MTT demonstrando taxas robustas de crescimento de LLECs (Figura 1 Suplementar). As etapas primárias desse protocolo multiprocedimento estão ilustradas no fluxograma, com todo o processo levando aproximadamente 2-3 semanas (Figura 1).
Para a colheita de CMELs, é essencial dissociar as leptomeninges e promover a expansão das LLECs, preservando a viabilidade celular por meio de técnicas cirúrgicas eficientes e mantendo um ambiente frio (Figura 2A-E). Após a obtenção de todo o cérebro juntamente com as leptomeninges em condições estéreis, uma etapa de lavagem suave é realizada para remover as hemácias do sangue (Figura 2F). Em seguida, as leptomeninges são cuidadosamente extraídas da superfície do cérebro sob um microscópio (Figura 2G). Essas leptomeninges consistem principalmente de fibras colágenas, de modo que são fragmentadas para acelerar a digestão enzimática (Figura 2H). Posteriormente, é realizada a digestão enzimática desses fragmentos, e quaisquer aglomerados remanescentes são filtrados através de um filtro de 70 μm para eliminar aglomerados maiores de fibras colágenas (Figura 2I). Finalmente, as células são plaqueadas em um frasco T25 revestido com fibronectina, e VEGF-C é adicionado para induzir a expansão (Figura 2J). Após 24 h, o meio de cultura é removido para eliminar as células não aderidas. Essas etapas facilitam a colheita de células de leptomeninges e promovem expansão, o que é crítico para a obtenção de LLECs LYVE-1-positivos suficientes mais tarde no processo.
Enquanto o VEGF-C induz a expansão da LLEC, populações celulares heterogêneas ainda podem crescer juntas. Para isolar LLECs puros LYVE-1-positivos, o MACS é empregado, pois LYVE-1 é um marcador reconhecido para células endoteliais linfáticas. A pureza dos LLECs é avaliada por citometria de fluxo, com resultados indicando que a porcentagem de células positivas para LYVE-1 na passagem 2 não é significativamente diferente da passagem 3 após MACS, demonstrando uma pureza maior que 95% (Figura 3A). Para validar ainda mais a especificidade dos LLECs positivos para LYVE-1, três marcadores adicionais de células endoteliais linfáticas - podoplanina (PDPN), receptor 3 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-3) e homeobox relacionado a Prospero1 (PROX1) foram usados para identificação17,18,19. A coloração por imunofluorescência confirmou que o LYVE-1 co-corou com esses três marcadores (Figura 3B). Além disso, a identidade dos LLECs foi estabelecida em cortes cerebrais sob condições fisiológicas, mostrando a co-coloração de LYVE-1 com PROX1, VEGFR-3 e PDPN (Figura 2A Suplementar). As células positivas para LYVE-1 não expressaram F4/80 e Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas beta (PDGFR-β), distinguindo efetivamente LLECs de macrófagos e fibroblastos (Figura 2B suplementar). Em resumo, este protocolo permite a colheita de LLECs altamente puros capazes de cultivo in vitro.
As células leptomeníngeas antes da MACS exibem heterogeneidade, diferindo das colônias de células endoteliais linfáticas. Sua morfologia varia de esferas redondas simples a formas de fibras fundidas (Figura 4A-D). No entanto, pós-MACS, os LLECs exibem características típicas de fuso e paralelepípedos semelhantes aos endoteliais(Figura 4E-H). Com base nesses resultados, os LLECs são efetivamente colhidos por meio deste protocolo multiprocedimento e mantidos em um estado de crescimento saudável.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo multiprocedimento. Este fluxograma ilustra o protocolo multiprocedimento para a colheita e cultivo de LLECs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Colheita de células de leptomeninges . (A) Preparo de instrumentais cirúrgicos estéreis. (B) Os camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano a 4% e posteriormente limpos com etanol 70% após a eutanásia. (C) Decapitação dos camundongos e incisão cuidadosa na linha média da pele, começando pela parte posterior do crânio em direção à área frontal. (D) Delicada remoção do crânio para preservar a integridade das leptomeninges. (E) Recuperação de todo o cérebro contendo as leptomeninges. (F) Lavagem de todo o cérebro em uma solução tampão com lavagem suave para remover o sangue da superfície. (G) Dissecção de leptomeninges da superfície do cérebro com pinça de ponta fina. (H) Corte das leptomeninges em fragmentos com microtesoura estéril, seguido da adição de 10 mL de mistura enzimática e incubação a 37 °C por 15 min. (I) Ressuspensão do pellet em 10 mL de PBS e filtração dos aglomerados através de filtro de 70 μm. (J) Chapeamento das células em um balão T25 revestido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da pureza do LLEC após MACS. (A) Histogramas representativos da análise por citometria de fluxo demonstrando a expressão de células positivas para LYVE-1 nas passagens 2 e 3 após MACS. A porcentagem de células positivas para LYVE-1 excede 95% após MACS. Os dados são representativos de três experimentos independentes (média ± EPM). (B) Imagem representativa de imunofluorescência mostrando a cocoloração de LYVE-1 com PDPN, VEGFR-3 e PROX1. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Características de crescimento das células leptomeníngeas e LLECs. (A) Morfologia das células leptomeníngeas capturadas em imagens representativas. Barra de escala = 50 μm. (B-D) Imagens representativas descrevendo a morfologia das células leptomeníngeas no dia 1, dia 2 e dia 3 antes da MACS. Barras de escala = 100 μm. (E) Morfologia dos LLECs capturados em imagens representativas. Barra de escala = 50 μm. (F-H) Imagens representativas ilustrando a morfologia dos LLECs no dia 1, dia 2 e dia 3 após o MACS. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Taxa de crescimento de LLECs e SVEC4-10. Os resultados do ensaio MTT mostram uma diminuição significativa na taxa de crescimento de LLECs na passagem 1 em comparação com o grupo SVEC4-10. Não houve diferenças significativas entre os grupos de passagem 2 e passagem 3 de LLECs em comparação com o grupo SVEC4-10. Os dados representam resultados de seis experimentos independentes (média ± EPM). As barras de erro indicam SEM. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Caracterização e discriminação de LLECs em fatias cerebrais. (A) Imagem representativa de imunofluorescência ilustrando a co-coloração de LYVE-1 com PROX1, VEGFR-3 e PDPN em cortes cerebrais em condições fisiológicas. Barras de escala = 2 μm. (B) Imagem representativa de imunofluorescência demonstrando que LYVE-1 não co-cora com F4/80 e PDGFR-β em cortes cerebrais em condições fisiológicas. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Crescimento de LLECs sob estimulação VEGF-C. (A) Imagens representativas de LLECs sob estimulação com 1 ng/mL de VEGF-C. (B) Imagens representativas de LLECs sob estimulação de 100 ng/mL de VEGF-C. (C) Imagens representativas de LLECs sob estimulação de 500 ng/mL de VEGF-C. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 4 suplementar: Expressão de CD31, PDPN e VEGFR-3 após a colheita. (A) Histogramas representativos da análise por citometria de fluxo mostram que as células CD31-positivas são inferiores a 5%. (B) Histogramas representativos da análise por citometria de fluxo indicam que as células positivas para PDPN excedem 95%. (C) Histogramas representativos da análise por citometria de fluxo demonstram que as células positivas para VEGFR-3 excedem 95%. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 5: Morfologia dos LLECs e distinção de CD31. (A) Imagens representativas da morfologia dos LLECs reveladas pela coloração hematoxilina-eosina. Barra de escala = 20 μm. (B) Imagens representativas de imunofluorescência ilustram que LYVE-1 e PDPN não co-co-cocolor. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura complementar 6: Taxa de proliferação de LLECs. Resultados representativos do ensaio CCK-8 mostram uma diminuição significativa na taxa de proliferação de LLECs na passagem 1 e na passagem 6 em comparação com as passagens 2 e 5, respectivamente. Os dados representam resultados de seis experimentos independentes (média ± EPM). As barras de erro indicam SEM. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo existente para colheita e cultivo de LLECs in vitro não foi relatado anteriormente. Este estudo apresenta um protocolo multiprocedimento reprodutível para coleta e cultivo de LLECs de leptomeninges de camundongos.
Embora esse protocolo multiprocedimento seja reprodutível, há várias considerações importantes. Por exemplo, frascos T25 revestidos com fibronectina promovem a adesão de LLECs e funcionam eliminando células não aderentes, garantindo assim uma população celular mais homogênea. Além disso, o tempo de duração e a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos para dissociar leptomeninges são fatores críticos que afetam a viabilidade celular. Portanto, é crucial manter uma duração de tempo dentro de 1 h e manter o tampão suficientemente frio. Outro ponto crítico diz respeito à presença de hemácias nas leptomeninges, a partir das quais a liberação de hemoglobina pode prejudicar as LLECs. Para mitigar isso, é essencial lavar e lavar suavemente para remover os glóbulos vermelhos, evitando seus efeitos citotóxicos. Finalmente, os LLECs requerem estimulação com VEGF-C20, particularmente na concentração de 100 ng/mL. Sob essa estimulação, os CMEs exibem morfologia endotelial característica, em vez de formar tubos (Figura 3A-C Suplementar). Consequentemente, este estudo empregou um meio de cultura contendo 100 ng/mL de VEGF-C para induzir a expansão e manter a homogeneidade nas populações celulares.
O protocolo multiprocedimento descrito aqui vem com etapas de solução de problemas e algumas limitações. Em primeiro lugar, este protocolo leva 2-3 semanas para ser concluído, tornando-o impraticável para repetições frequentes. Em segundo lugar, procedimentos cirúrgicos e enzimáticos podem resultar na presença de células mortas que não são eliminadas antes do plaqueamento, potencialmente afetando a cultura celular. Essa possibilidade será explorada em futuras implementações de protocolos. Em terceiro lugar, enquanto a pureza dos LLECs colhidos (células positivas para VEGFR-3 e PDPN) excede 95%, algumas populações heterogêneas de células persistem, incluindo células CD31-positivas, que constituem menos de 5% (Figura Suplementar 4A-C). Este é um desafio comum na cultura de células primárias. Imagens de alta resolução da coloração hematoxilina-eosina demonstram que os CMEs exibem formas endoteliais características, mas não expressam CD31 (Figura 5A,B suplementar). Por fim, os resultados do ensaio CCK-8 indicam uma diminuição significativa na taxa de proliferação de LLECs na passagem 1 e 6 em comparação com a passagem 2 e 5, respectivamente (Figura 6 Suplementar). A passagem 1 pode levar a danos nos LLECs devido ao tratamento com anticorpos e ao estresse físico durante a triagem, enquanto a passagem 6 mostra proliferação reduzida à medida que o número de passagens aumenta. Portanto, células subsequentes após a passagem 6 são inadequadas para experimentos relevantes. Dada a distribuição dos fibroblastos nas meninges21, aproximadamente 5% das células contaminadas podem conter fibroblastos. Para resolver isso, a adição de genética e a triagem imunomagnética de células podem ser usadas para remover fibroblastos contaminados22,23. O monitoramento da taxa de contaminação dos fibroblastos em cada passagem dos LLECs ajudará a eliminar o impacto dos fibroblastos no crescimento dos LLECs24. Considerando a heterogeneidade entre camundongos e humanos, a coleta e o cultivo de LLECs humanos primários devem ser buscados para potenciais aplicações clínicas em pesquisas futuras.
Em resumo, atualmente não há um protocolo estabelecido para colheita e cultivo de LLECs in vitro. Este estudo introduz um protocolo reprodutível e multiprocedimento para a colheita de LLECs de camundongos leptomeninges e, posteriormente, estabelecimento de sua cultura primária in vitro. Este trabalho facilitará a exploração das funções celulares e potenciais aplicações clínicas para LLECs.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81960226, 81760223), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e da Fundação de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
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