Summary
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.
Abstract
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) son una población celular intracraneal recientemente descubierta con una distribución única claramente distinta de las células endoteliales linfáticas periféricas. Su función celular y sus implicaciones clínicas siguen siendo en gran medida desconocidas. En consecuencia, la disponibilidad de un suministro de LLEC es esencial para llevar a cabo la investigación funcional in vitro. Sin embargo, actualmente no existe un protocolo para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro.
Este estudio cosechó con éxito los LLEC utilizando un protocolo de varios pasos, que incluyó el recubrimiento del matraz con fibronectina, la disección de las leptomeninges con la ayuda de un microscopio, la digestión enzimática de las leptomeninges para preparar una suspensión unicelular, la inducción de la expansión de los LLEC con el factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) y la selección de células positivas para el receptor hialurónico-1 del vaso linfático (LYVE-1) a través de la clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este proceso condujo finalmente al establecimiento de una cultura primaria. La pureza de los LLEC se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, con un nivel de pureza superior al 95%. Este protocolo de varios pasos ha demostrado reproducibilidad y viabilidad, lo que facilitará en gran medida la exploración de la función celular y las implicaciones clínicas de los LLECs.
Introduction
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) recientemente descubiertas forman una malla de células individuales dentro de las leptomeninges, exhibiendo un patrón de distribución distinto en comparación con las células endoteliales linfáticas periféricas 1,2. Las funciones celulares y las implicaciones clínicas asociadas con los LLEC siguen siendo en gran medida un territorio inexplorado. Con el fin de allanar el camino para la investigación funcional de los LLECs, es imperativo establecer un modelo in vitro para su estudio. Por lo tanto, este estudio ha diseñado un protocolo integral para el aislamiento y el cultivo primario de los LLECs.
Los ratones son el modelo animal preferido debido a su idoneidad para la manipulación genética en la investigación de enfermedades. Estudios anteriores han aislado con éxito células endoteliales linfáticas de varios tejidos de ratón, incluidos los ganglios linfáticos3, el tejido mesentérico4, el tejido dérmico5, los linfáticos colectores6 y el tejido pulmonar7. Estos procedimientos de aislamiento se han basado principalmente en técnicas como la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) y la clasificación por citometría de flujo 8,9,10. Además, los esfuerzos de investigación han llevado al establecimiento de líneas celulares aracnoideas de rata y líneas celulares capilares linfáticas de rata11,12. A pesar de la existencia de técnicas de cultivo de explantes para leptomeninges13, existe una necesidad urgente de un protocolo estandarizado para el aislamiento y cultivo de LLECs. En consecuencia, este estudio ha cosechado y cultivado con éxito LLECs disociando meticulosamente leptomeninges bajo la guía de un microscopio y promoviendo la expansión de LLECs mediante el uso del factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C). El marcador distintivo de las células endoteliales linfáticas es el receptor hialurónico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1)14. Este protocolo de varios pasos aísla selectivamente los LLEC positivos para LYVE-1 mediante MACS y, posteriormente, verifica su pureza mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente.
Los pasos principales de este protocolo de varios pasos se pueden resumir de la siguiente manera: recubrimiento de matraz, disociación de leptomeninges, digestión enzimática de leptomeninges, expansión celular, selección celular magnética y posterior cultivo de LLECs. Finalmente, se confirma la pureza de los LLEC aislados mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente. El objetivo general de este estudio es presentar un protocolo reproducible de varios pasos para el aislamiento de LLECs de leptomeninges de ratón y su posterior cultivo in vitro . Este protocolo está preparado para facilitar en gran medida las investigaciones sobre las funciones celulares y las implicaciones clínicas de los LLECs.
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Protocol
Esta investigación recibió la aprobación del Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Todos los experimentos se adhirieron a las pautas establecidas para el cuidado de los animales. Se recolectaron células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC) de ratones machos C57Bl/6J de 6-8 semanas de edad y con un peso de entre 20-25 g. Estos ratones fueron adquiridos de la Universidad Médica de Kunming en Kunming, China. Todo el procedimiento experimental se llevó a cabo bajo estrictas condiciones estériles. Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario.
1. Preparación de reactivos e instrumentos
NOTA: Todos los pasos que involucren soluciones deben llevarse a cabo dentro de un gabinete de riesgo biológico de clase II.
- Prepare el tampón de lavado mezclando solución salina tamponada con fosfato (PBS) con calcio y magnesio, suero fetal bovino (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina (P/S) al 1% (ver Tabla de materiales). Mantener este tampón frío a 4 °C. Es fundamental prepararlo fresco el día de su uso y desgasificar el tampón.
- Prepare las enzimas digestivas combinando 10 ml de PBS (sin calcio ni magnesio) con 2 ml de tripsina al 0,25%, 1 ml de 20 mg/ml de papaína y 200 μl de colagenasa I (ver Tabla de materiales).
NOTA: Asegure el uso de alícuotas de volúmenes apropiados para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Almacenar estas alícuotas a -20 °C. - Prepare el medio de cultivo utilizando el kit de medio de crecimiento de células endoteliales disponible en el mercado, que incluye VEGF-C (100 ng/mL) y 1% de P/S (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare el tampón de detención complementando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de FBS para detener el proceso de digestión.
- Prepare instrumentos quirúrgicos estériles: estos instrumentos deben incluir tijeras, pinzas de punta dentada y pinzas de punta fina.
2. Recubrimiento del matraz
- Recubra el matraz T25 con una solución de fibronectina de 100 μg/ml (véase la tabla de materiales) e incube durante la noche a 37 °C. Antes de usar, retire la solución de recubrimiento con una pipeta.
- Lave el matraz tres veces con PBS, posteriormente aspire el PBS y deje que el matraz T25 se seque al aire.
3. Disociación de leptomeninges
NOTA: Utilice siempre tampones y soluciones preenfriados a 4 °C.
- Anestesiar a los ratones con exceso de inhalación de isoflurano al 4% y luego sacrificarlos por decapitación rápida utilizando tijeras previamente limpias con etanol al 70%.
- Incida con cuidado la piel a lo largo de la línea media, comenzando desde la abertura en la parte posterior del cráneo y extendiéndose hacia el área frontal.
- Retire delicadamente el cráneo, levantándolo suavemente con las tijeras para evitar dañar las leptomeninges, asegurándose de obtener todo el cerebro, incluidas las leptomeninges.
- Sumerge todo el cerebro en un tampón de lavado y enjuágalo suavemente para eliminar la sangre de la superficie.
- Transfiera el cerebro a una placa de Petri estéril sin picar y extraiga las leptomeninges de la superficie del cerebro usando pinzas de punta fina bajo un microscopio.
- Cortar el tejido de las leptomeninges en fragmentos con unas microtijeras estériles.
4. Digestión enzimática de Leptomeninges
- Añadir 10 ml de la mezcla enzimática (paso 1.2) a los fragmentos e incubar a 37 °C durante 15 min. Agite suavemente para asegurarse de que los fragmentos se desprendan del fondo del tubo. Después, añade 10 ml de tampón de parada (paso 1.4) para detener la digestión.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
- Agregue 10 ml de PBS frío y pase la mezcla a través de un colador de 70 μm a un tubo estéril de 50 ml para filtrar los grumos.
5. Expansión celular
- Colocar 1 x 10 5 células porcm2 en un matraz T25 recubierto de fibronectina (paso 2) con5 ml de medio de cultivo.
- Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Después, retire el medio para eliminar las células no adheridas.
- Mantener el cultivo reemplazando el 50% del medio cada dos días. Repite este proceso dos o tres veces.
6. Selección de celdas magnéticas
NOTA: Trabaje rápidamente, mantenga la frialdad de las células y utilice soluciones preenfriadas para evitar el etiquetado de células no específicas.
- Preparación de instrumentos y reactivos: conecte un separador magnético a un soporte separador magnético (consulte la tabla de materiales). Conecte una columna de selección al separador magnético y coloque un filtro de células de 70 μm encima de la columna de selección. Coloque un tubo de 50 ml debajo de la columna de selección para recoger el flujo.
- Digestión enzimática: una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, aspirar el medio y enjuagar las células con PBS. Añadir tripsina al 0,25% para separar las células adherentes e incubar a 37 °C durante 5 min. Detenga la digestión agregando el tampón de parada. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
- Incubación de anticuerpos: resuspender 1 x 107 células totales en 100 μL de PBS y añadir 10 μL de anticuerpo LYVE-1 (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C.
- Girar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Enjuagar las células introduciendo 1 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire completamente el sobrenadante.
- Etiquetado de microperlas: resuspender las células en 100 μL de PBS y añadir 20 μL de microperlas (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
- Girar las celdas a 300 x g durante 5 min y decantar el sobrenadante. Posteriormente, limpiar las células con 1 mL de PBS mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min. Finalmente, retire completamente el sobrenadante.
- Exclusión magnética negativa: resuspender las células en 4 mL de PBS. Pase las células a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar los grumos. Prepare la columna de selección (consulte la Tabla de materiales) enjuagándola con 3 ml de PBS, luego aplique la suspensión de celdas en la columna de selección.
- Realice los pasos de lavado con 3 ml de PBS y recoja las células negativas de LYVE-1 en un tubo de 50 ml colocado debajo de la columna de selección para permitir que pasen.
- Selección magnética positiva: pipetear 6 mL de PBS en la columna de selección. Elimine instantáneamente las celdas marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna de selección para obtener LLEC positivos para LYVE-1.
NOTA: Espere siempre hasta que el depósito de la columna de selección esté vacío antes de continuar con el siguiente paso.
7. Cultura de los LLECs
- Centrifugar los LLEC positivos LYVE-1 a 300 x g durante 5 minutos y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante.
- Colocar 1 x 105 células porcm2 en un matraz T25 recubierto de fibronectina con 5 mL de medio de cultivo.
- Mantenga el cultivo reemplazando el 50% del medio cada dos días. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, separe las células con tripsina al 0,25% y realice el paso celular. Utilice las celdas para experimentos posteriores después de 2-3 pasadas.
8. Análisis de citometría de flujo
NOTA: El análisis citométrico de flujo se realizó siguiendo el procedimiento15 descrito anteriormente.
- Añadir tripsina al 0,25% para separar las células adherentes e incubar a 37 °C durante 5 min. Luego, agregue el tampón de parada para detener la digestión.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y aspirar completamente el sobrenadante. Resuspender 1 x 106 células en 100 μL de PBS.
- Añadir 1 μL de anticuerpo LYVE-1. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender las células en una cantidad adecuada de tampón PBS para su análisis mediante citometría de flujo y el software FlowJo (consulte la tabla de materiales).
9. Tinción inmunofluorescente
NOTA: La tinción inmunofluorescente se realizó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente16.
- Lave las células con PBS tres veces. Fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el PFA y lave las células con PBS tres veces.
- Aplique el tampón de bloque durante 1 h a temperatura ambiente. Retire el búfer de bloque de los cubreobjetos.
- Agregue el anticuerpo LYVE-1 en el tampón de tinción a las células e incube en la oscuridad. Lave las celdas tres veces con PBS.
- Agregue un anticuerpo secundario apropiado (ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a las células e incube en la oscuridad. Lave las celdas tres veces con PBS.
- Contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las células ya están listas para la microscopía de inmunofluorescencia.
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Representative Results
Este estudio presenta un protocolo reproducible de varios pasos para la recolección de células endoteliales linfáticas (LLECs) de ratones y posteriormente establecer su cultivo primario in vitro. Los pasos clave incluyen la preparación del matraz y el recubrimiento de fibronectina, la disociación de leptomeninges, la obtención de una suspensión unicelular a través de la digestión enzimática y la inducción de la expansión de los LLEC con VEGF-C. A continuación, los LLEC positivos para LYVE-1 se aíslan selectivamente mediante la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Finalmente, se realiza la tinción de inmunofluorescencia y el análisis citométrico de flujo para evaluar la pureza de los LLC, y los resultados del ensayo MTT demuestran tasas de crecimiento robustas de los LLC (Figura suplementaria 1). Los pasos principales de este protocolo multiprocedimiento se ilustran en el diagrama de flujo, y todo el proceso dura aproximadamente de 2 a 3 semanas (Figura 1).
Para recolectar LLECs, es esencial disociar las leptomeninges y promover la expansión de LLECs preservando la viabilidad celular a través de técnicas quirúrgicas eficientes y manteniendo un ambiente frío (Figura 2A-E). Después de obtener todo el cerebro junto con las leptomeninges en condiciones estériles, se realiza un paso de lavado de lavado suave para eliminar los glóbulos rojos de la sangre (Figura 2F). A continuación, las leptomeninges se extraen cuidadosamente de la superficie del cerebro bajo un microscopio (Figura 2G). Estas leptomeninges consisten principalmente en fibras de colágeno, por lo que se fragmentan para acelerar la digestión enzimática (Figura 2H). Posteriormente, se lleva a cabo la digestión enzimática de estos fragmentos, y los grumos restantes se filtran a través de un colador de 70 μm para eliminar los grupos más grandes de fibras de colágeno (Figura 2I). Finalmente, las células se siembran en un matraz T25 recubierto de fibronectina y se agrega VEGF-C para inducir la expansión (Figura 2J). Después de 24 h, se retira el medio de cultivo para eliminar las células no adheridas. Estos pasos facilitan la recolección de células de leptomeninges y promueven la expansión, lo cual es fundamental para obtener suficientes LLEC positivos para LYVE-1 más adelante en el proceso.
Si bien el VEGF-C induce la expansión del LUC, las poblaciones celulares heterogéneas aún pueden crecer juntas. Para aislar LLAC puros positivos para LYVE-1, se emplea MACS, ya que LYVE-1 es un marcador reconocido para las células endoteliales linfáticas. La pureza de los LLECs se evalúa mediante citometría de flujo, y los resultados indican que el porcentaje de células positivas para LYVE-1 en el pasaje 2 no es significativamente diferente del paso 3 después del MACS, demostrando una pureza superior al 95% (Figura 3A). Para validar aún más la especificidad de los LLC positivos para LYVE-1, se utilizaron tres marcadores adicionales de células endoteliales linfáticas: podoplanina (PDPN), receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-3) y homeobox1 relacionado con Prospero (PROX1) para la identificación17,18,19. La tinción por inmunofluorescencia confirmó que LYVE-1 se tiñó conjuntamente con estos tres marcadores (Figura 3B). Además, se estableció la identidad de los LLEC en cortes de cerebro en condiciones fisiológicas, mostrando la co-tinción de LYVE-1 con PROX1, VEGFR-3 y PDPN (Figura suplementaria 2A). Las células positivas para LYVE-1 no expresaron F4/80 ni el factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFR-β), lo que distingue eficazmente a los LLEC de los macrófagos y fibroblastos (Figura complementaria 2B). En resumen, este protocolo permite la recolección de LLECs de alta pureza capaces de cultivo in vitro.
Las células leptomeníngeas antes de MACS exhiben heterogeneidad, diferenciándose de las colonias de células endoteliales linfáticas. Su morfología varía desde esferas redondas simples hasta formas de fibras fusionadas (Figura 4A-D). Sin embargo, después de MACS, los LLEC exhiben características típicas de tipo endotelial en forma de huso y adoquín (Figura 4E-H). Sobre la base de estos resultados, los LLEC se cosechan de manera efectiva a través de este protocolo de procedimientos múltiples y se mantienen en un estado de crecimiento saludable.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo multiprocedimiento. Este diagrama de flujo ilustra el protocolo de procedimientos múltiples para la recolección y el cultivo de LLAC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Recolección de células leptomeninges . (A) Preparación de instrumentos quirúrgicos estériles. (B) Los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano al 4% y posteriormente limpiados con etanol al 70% después de la eutanasia. (C) Decapitación de los ratones e incisión cuidadosa de la línea media de la piel, comenzando desde la parte posterior del cráneo hacia el área frontal. (D) Extracción delicada del cráneo para preservar la integridad de las leptomeninges. (E) Recuperación de todo el cerebro que contiene las leptomeninges. (F) Lavado de todo el cerebro en una solución tampón con un lavado suave para eliminar la sangre de la superficie. (G) Disección de leptomeninges de la superficie del cerebro utilizando pinzas de punta fina. (H) Corte de leptomeninges en fragmentos con microtijeras estériles, seguido de la adición de 10 mL de mezcla de enzimas e incubación a 37 °C durante 15 min. (I) Resuspensión del pellet en 10 mL de PBS y filtración de grumos a través de un colador de 70 μm. (J) Siembra de células en un matraz T25 recubierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la pureza de LLEC después de MACS. (A) Histogramas representativos del análisis citométrico de flujo que demuestran la expresión de células positivas para LYVE-1 en los pasajes 2 y 3 después de MACS. El porcentaje de células positivas para LYVE-1 supera el 95% después de MACS. Los datos son representativos de tres experimentos independientes (media ± SEM). Las barras de error indican SEM. (B) Imagen representativa de inmunofluorescencia que muestra la tinción conjunta de LYVE-1 con PDPN, VEGFR-3 y PROX1. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Características de crecimiento de las células leptomeníngeas y de los LLECs. (A) Morfología de las células leptomeníngeas captadas en imágenes representativas. Barra de escala = 50 μm. (B-D) Imágenes representativas que representan la morfología de las células leptomeníngeas en los días 1, 2 y 3 antes del MACS. Barras de escala = 100 μm. (E) Morfología de los LLEC capturados en imágenes representativas. Barra de escala = 50 μm. (F-H) Imágenes representativas que ilustran la morfología de los LLEC en el día 1, el día 2 y el día 3 después de MACS. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Tasa de crecimiento de los LLECs y SVEC4-10. Los resultados del ensayo MTT muestran una disminución significativa en la tasa de crecimiento de los LLEC en el pasaje 1 en comparación con el grupo SVEC4-10. No hubo diferencias significativas entre los grupos de LLECs de pasaje 2 y pasaje 3 en comparación con el grupo SVEC4-10. Los datos representan los resultados de seis experimentos independientes (media ± SEM). Las barras de error indican SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Caracterización y discriminación de los LLEC en cortes de cerebro. (A) Imagen representativa de inmunofluorescencia que ilustra la tinción conjunta de LYVE-1 con PROX1, VEGFR-3 y PDPN en cortes de cerebro en condiciones fisiológicas. Barras de escala = 2 μm. (B) Imagen representativa de inmunofluorescencia que demuestra que LYVE-1 no se tiñe conjuntamente con F4/80 y PDGFR-β en cortes de cerebro en condiciones fisiológicas. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Crecimiento de los LLEC bajo la estimulación del VEGF-C. (A) Imágenes representativas de LLECs bajo estimulación de VEGF-C de 1 ng/mL. (B) Imágenes representativas de LLECs bajo estimulación de VEGF-C de 100 ng/mL. (C) Imágenes representativas de LLECs bajo estimulación de VEGF-C de 500 ng/mL. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Expresión de CD31, PDPN y VEGFR-3 después de la cosecha. (A) Los histogramas representativos del análisis de citometría de flujo muestran que las células CD31 positivas son inferiores al 5%. (B) Los histogramas representativos del análisis de citometría de flujo indican que las células positivas para PDPN superan el 95%. (C) Los histogramas representativos del análisis de citometría de flujo demuestran que las células positivas para VEGFR-3 superan el 95%. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 5: Morfología de los LLEC y distinción de CD31. (A) Imágenes representativas de la morfología de los LLECs reveladas por tinción de hematoxilina-eosina. Barra de escala = 20 μm. (B) Las imágenes representativas de inmunofluorescencia ilustran que LYVE-1 y PDPN no se tiñen conjuntamente con CD31. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 6: Tasa de proliferación de los LLECs. Los resultados representativos del ensayo CCK-8 muestran una disminución significativa en la tasa de proliferación de LÉC en el pasaje 1 y el pasaje 6 en comparación con los pasajes 2 y 5, respectivamente. Los datos representan los resultados de seis experimentos independientes (media ± SEM). Las barras de error indican SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo existente para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro no ha sido reportado previamente. Este estudio presenta un protocolo reproducible y multiprocedimiento para la recolección y el cultivo de LLEC de leptomeninges de ratón.
Si bien este protocolo de procedimientos múltiples es reproducible, hay varias consideraciones clave. Por ejemplo, los matraces T25 recubiertos de fibronectina promueven la adhesión de los LLEC y su función eliminando las células no adherentes, asegurando así una población celular más homogénea. Además, el tiempo, la duración y la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos para disociar las leptomeninges son factores críticos que afectan la viabilidad celular. Por lo tanto, es crucial mantener una duración de tiempo dentro de 1 h y mantener el tampón lo suficientemente frío. Otro punto crítico se refiere a la presencia de glóbulos rojos en las leptomeninges, a partir de los cuales la liberación de hemoglobina puede dañar los LÉC. Para mitigar esto, es esencial enjuagar y lavar suavemente para eliminar los glóbulos rojos, evitando sus efectos citotóxicos. Por último, los LLEC requieren estimulación con VEGF-C20, especialmente a una concentración de 100 ng/mL. Bajo esta estimulación, los LLEC exhiben una morfología característica similar a la endotelia en lugar de formar tubos (Figura suplementaria 3A-C). En consecuencia, este estudio empleó un medio de cultivo que contenía 100 ng/mL de VEGF-C para inducir la expansión y mantener la homogeneidad en las poblaciones celulares.
El protocolo de procedimientos múltiples que se describe en este documento viene con pasos de solución de problemas y algunas limitaciones. En primer lugar, este protocolo tarda entre 2 y 3 semanas en completarse, lo que lo hace poco práctico para la repetición frecuente. En segundo lugar, los procedimientos quirúrgicos y enzimáticos pueden dar lugar a la presencia de células muertas que no se eliminan antes de la siembra, lo que puede afectar al cultivo celular. Esta posibilidad se explorará en futuras implementaciones de protocolos. En tercer lugar, mientras que la pureza de los LLEC cosechados (células positivas para VEGFR-3 y PDPN) supera el 95%, persisten algunas poblaciones celulares heterogéneas, incluidas las células CD31 positivas, que constituyen menos del 5% (Figura suplementaria 4A-C). Este es un desafío común en el cultivo de células primarias. Las imágenes de alta resolución de la tinción con hematoxilina-eosina demuestran que los LLEC muestran formas características similares a las endoteliales, pero no expresan CD31 (Figura suplementaria 5A,B). Por último, los resultados del ensayo CCK-8 indican una disminución significativa en la tasa de proliferación en los LLEC en el pasaje 1 y 6 en comparación con el pasaje 2 y 5, respectivamente (Figura suplementaria 6). El pasaje 1 puede provocar daños en los LLEC debido al tratamiento con anticuerpos y al estrés físico durante la clasificación, mientras que el pasaje 6 muestra una proliferación reducida a medida que aumenta el número de pasajes. Por lo tanto, las células posteriores después del paso 6 no son adecuadas para experimentos relevantes. Dada la distribución de los fibroblastos en las meninges21, aproximadamente el 5% de las células contaminadas pueden contener fibroblastos. Para hacer frente a esto, la adición de genética y la clasificación celular inmunomagnética se puede utilizar para eliminar los fibroblastos contaminados22,23. El monitoreo de la tasa de contaminación de los fibroblastos en cada paso de los LLEC ayudará a eliminar el impacto de los fibroblastos en el crecimiento de los LLEC24. Teniendo en cuenta la heterogeneidad entre ratones y humanos, se debe buscar la recolección y el cultivo de LLEC humanos primarios para posibles aplicaciones clínicas en futuras investigaciones.
En resumen, en la actualidad no existe un protocolo establecido para la recolección y el cultivo de LLECs in vitro. Este estudio presenta un protocolo reproducible y multiprocedimiento para la recolección de LLECs de leptomeninges de ratones y posteriormente el establecimiento de su cultivo primario in vitro. Este trabajo facilitará una mayor exploración de las funciones celulares y las posibles aplicaciones clínicas de los LLECs.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
El estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81960226, 81760223), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) y la Fundación de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
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