Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65771
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay
* These authors contributed equally

Summary

لقد قمنا بتطوير العديد من البروتوكولات للحث على تلف الشبكية أو تنكس الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . توفر هذه النماذج إمكانية دراسة آليات تجديد الشبكية.

Abstract

الأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين هي الأسباب الرئيسية للعمى. من بين العديد من الاستراتيجيات العلاجية التي يتم استكشافها ، ظهر تحفيز الإصلاح الذاتي مؤخرا على أنه جذاب بشكل خاص. المصدر الخلوي المهم لإصلاح الشبكية هو خلية مولر الدبقية ، التي تؤوي إمكانات الخلايا الجذعية وقدرة تجددية غير عادية في anamniotes. ومع ذلك ، فإن هذه الإمكانات محدودة للغاية في الثدييات. يجب أن توفر دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الشبكية في النماذج الحيوانية ذات القدرات التجديدية نظرة ثاقبة حول كيفية إطلاق العنان للقدرة الكامنة لخلايا مولر الثديية على تجديد شبكية العين. هذه خطوة أساسية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي. لتحقيق هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج إصابة الشبكية في Xenopus: إصابة ميكانيكية في الشبكية ، وخط معدل وراثيا يسمح بالاستئصال الشرطي لمستقبلات الضوء بوساطة النيتروريدوكتاز ، ونموذج التهاب الشبكية الصباغي القائم على خروج المغلوب رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، ونموذج سام للخلايا مدفوع بحقن CoCl2 داخل العين. تسليط الضوء على مزاياها وعيوبها ، وصفنا هنا هذه السلسلة من البروتوكولات التي تولد حالات تنكسية مختلفة وتسمح بدراسة تجديد الشبكية في Xenopus.

Introduction

يعاني ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم من أمراض تنكسية مختلفة في شبكية العين تؤدي إلى العمى ، مثل التهاب الشبكية الصباغي أو اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). حتى الآن ، لا تزال هذه الحالات غير قابلة للعلاج إلى حد كبير. تشمل الأساليب العلاجية الحالية قيد التقييم العلاج الجيني ، وزرع الخلايا أو الأنسجة ، والعلاجات الوقائية العصبية ، وعلم البصريات الوراثي ، والأجهزة التعويضية. وتستند استراتيجية ناشئة أخرى إلى التجديد الذاتي من خلال تنشيط الخلايا الداخلية ذات إمكانات الخلايا الجذعية. خلايا مولر الدبقية ، نوع الخلايا الدبقية الرئيسي في شبكية العين ، هي من بين المصادر الخلوية ذات الأهمية في هذا السياق. عند الإصابة ، يمكنهم إلغاء التمايز والتكاثر وتوليد الخلايا العصبية1،2،3. على الرغم من أن هذه العملية فعالة جدا في الزرد أو Xenopus ، إلا أنها غير فعالة إلى حد كبير في الثدييات.

ومع ذلك ، فقد ثبت أن العلاجات المناسبة بالبروتينات الانقسامية أو الإفراط في التعبير عن عوامل مختلفة يمكن أن تحفز عودة دورة الخلايا الدبقية في الثدييات مولر ، وفي بعض الحالات ، تؤدي إلى التزامها اللاحق بتكوين الخلايا العصبية1،2،3،4،5. ومع ذلك ، لا يزال هذا غير كاف إلى حد كبير للعلاجات. ومن ثم ، فإن زيادة معرفتنا بالآليات الجزيئية الكامنة وراء التجديد أمر ضروري لتحديد الجزيئات القادرة على تحويل خصائص الخلايا الجذعية مولر بكفاءة إلى استراتيجيات علاجية خلوية جديدة.

مع هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج الإصابة في Xenopus التي تؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية. هنا ، نقدم (1) إصابة ميكانيكية في شبكية العين ليست خاصة بنوع الخلية ، (2) نموذج استئصال الخلايا المشروط والقابل للانعكاس باستخدام نظام NTR-MTZ الذي يستهدف الخلايا القضيبية ، (3) ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، نموذج التهاب الشبكية الصباغي الذي يؤدي إلى تنكس خلايا القضيب التدريجي ، و (4) CoCl2- نموذج سام للخلايا مستحث يمكن أن يستهدف المخاريط على وجه التحديد أو يؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية على نطاق أوسع. نسلط الضوء على خصوصيات ومزايا وعيوب كل نموذج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء رعاية وتجربتها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بموجب A91272108 الترخيص المؤسسي. تمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة رعاية المؤسسية CEEA # 59 وحصلت على إذن من الإدارة الإدارية لحماية السكان تحت الرقم المرجعي APAFIS # 32589-2021072719047904 v4 و APAFIS # 21474-2019071210549691 v2. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذه البروتوكولات.

1. إصابة الشبكية الميكانيكية

ملاحظة: يتكون بروتوكول نموذج الإصابة الموصوف هنا من ثقب ميكانيكي في شبكية الشرغوف من المرحلة 45 فصاعدا. لذلك ، لا يستهدف أي نوع معين من خلايا الشبكية ولكنه يدمر سمك الشبكية بالكامل في موقع البزل.

  1. تحضير مخدر الضفادع الصغيرة
    1. إعداد حل الأسهم 10 ٪ من البنزوكائين. للحصول على حجم إجمالي قدره 10 مل ، أضف 1 جم من البنزوكائين ، و 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 8 مل من البروبيلين جليكول. حافظ على محلول المخزون لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء بورق الألمنيوم.
    2. تحضير محلول بنزوكائين 0.005٪ في وقت الاستخدام بإضافة 25 ميكرولتر من محلول مخزون البنزوكائين 10٪ إلى 50 مل من ماء تربية الشرغوف (ماء الصنبور المصفى والمكلور). تخلط جيدا.
      ملاحظة: تركيز البنزوكائين منخفض بشكل خاص لأن الضفادع الصغيرة حساسة للغاية للتخدير مقارنة بالبالغين.
  2. إعداد دبوس
    1. قم بتوصيل دبوس معقم بقطر 0.2 مم بحامل دبوس معقم (الشكل 1 أ).
  3. تخدير الشرغوف
    1. استخدم شبكة غمس للقبض على الضفادع الصغيرة في خزاناتها. انقلها إلى خزان جديد يحتوي على محلول البنزوكائين 0.005٪. انتظر بضع دقائق حتى تتوقف الضفادع الصغيرة عن التفاعل مع المنبهات (النقر على الخزان أو الاتصال المباشر).
      ملاحظة: قد يتم تخدير العديد من الضفادع الصغيرة في وقت واحد ، ولكن يجب أن يكون الوقت المستغرق في محلول التخدير أقل من 30 دقيقة.
  4. ثقب الشبكية
    1. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية على طبق بتري صغير (قطره 55 مم) يحتوي على منديل مبلل. ضع الجانب الظهري للشرغوف لأعلى في منتصف طبق بتري.
    2. تحت المجهر المجسم ، ثقب الشبكية عن طريق إدخال الدبوس برفق على الجانب الظهري من العين ، حتى يمر عبر الشبكية (الشكل 1 أ). إذا كانت هناك حاجة إلى عدة وخزات ، كرر هذا الإجراء في أماكن مختلفة. بعد ثقب العين اليمنى ، أدر طبق بتري 180 درجة لثقب العين اليسرى.
    3. انقل الشرغوف المصاب إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من مياه التربية عن طريق غمر طبق بتري بعناية. راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.

2. الاجتثاث الشرطي لخلية القضيب باستخدام نظام NTR-MTZ

يهدف البروتوكول إلى إحداث استئصال محدد لخلايا القضيبفي الخط المعدل وراثيا Xenopus Tg (rho: GFP-NTR) 6 ، المتاح في خدمة TEFOR Paris-Saclays zootechnics ، التي تستضيف مركز موارد Xenopus الفرنسي. يستخدم هذا النظام الكيميائي الوراثي قدرة إنزيم النيتروريدوكتاز (NTR) على تحويل الميترونيدازول (MTZ) إلى عامل ربط الحمض النووي السام للخلايا ، على وجه التحديد لاستئصال قضبان التعبير عن NTR (الشكل 1 ب). تم نشر بروتوكولين مفصلين لجعل Tg (rho: GFP-NTR) أو Tg (rho: NTR) معدلة وراثيا وتحفيز التنكس سابقا 7,8. هنا ، نقوم ببساطة بتفصيل تحريض تنكس الشبكية وكيفية مراقبة عملية التنكس في الجسم الحي.

  1. تحضير محلول ميترونيدازول
    1. تحضير محلول 10 mM MTZ في وقت الاستخدام عن طريق إذابة 1.67 جم من مسحوق MTZ في زجاجة داكنة في 1 لتر من ماء تربية الشرغوف يحتوي على 0.1٪ DMSO ، باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي ومحرض مغناطيسي.
      ملاحظة: MTZ حساس للضوء. قد يستغرق الذوبان الكامل ما يصل إلى 10 دقائق.
  2. توليد الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا عن طريق التزاوج الطبيعي من خط Tg (rho: GFP-NTR)
    ملاحظة: نظرا لأن الذكور المعدلة وراثيا تمثل مخزونا ثمينا ، فإننا نفضل توليد الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي لعدم التضحية بالذكر واستخدامه بشكل متكرر.
    1. إعطاء الهرمونات
      1. حقن 600 وحدة دولية من هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) مع إبر 25G في الكيس الليمفاوي الظهري للإناث من النوع البري Xenopus laevis . حقن الذكور المعدلة وراثيا مع 100-200 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية في الكيس الليمفاوي الظهري. للمراقبة الحية لتنكس القضيب (الخطوة 2.4) ، استخدم ألبينو زينوبوس بدلا من تلك المصطبغة ، لتصور الاختلافات الفلورية بشكل أفضل عبر عين الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا المتولدة.
        ملاحظة: يمكن تحضير إناث Xenopus ب 50 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية قبل 1 إلى 7 أيام من الإباضة المخطط لها ، ولكن هذا اختياري.
    2. التزاوج وجمع البيض
      1. مباشرة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية ، ضع في خزان واحد Tg (rho: GFP-NTR) ذكر معدل وراثيا مع أنثى واحدة محقونة من قوات حرس السواحل الهايتية عند 20 درجة مئوية حتى اليوم التالي. استخدم كمية كبيرة (10 لتر على الأقل) وأضف أشياء صغيرة حتى يلتصق البيض بها ، حتى لا يتضرر البيض من حركات البالغين. في اليوم التالي ، عندما لم تعد الضفادع في amplexus ، قم بإزالة البالغين من الخزان وجمع الأجنة.
    3. تربية الأجنة والضفادع الصغيرة
      1. مرحلة الأجنة والضفادع الصغيرة وفقا للجدول الطبيعي لتطور Xenopus 9.
      2. تربية الأجنة في خزان مملوء بماء تربية الشرغوف. من المرحلة 45 ، قم بتغذية الضفادع الصغيرة بمسحوق البطاطس المقلية وأكسجة الماء باستخدام فقاعات. أضف الماء يوميا إذا لزم الأمر لتعويض التبخر وتغيير ماء الخزان بالكامل أسبوعيا.
        ملاحظة: بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استبدال 50٪ من الحجم مرتين في الأسبوع. يمكن العثور على بروتوكول مفصل في10.
    4. فرز الأجنة المعدلة وراثيا
      1. من المرحلة 37/38 ، قم بفرز واختيار الأجنة المعدلة وراثيا تحت المجهر المجسم الفلوري عن طريق تصور GFP مباشرة (الشكل 1C).
  3. علاج الشرغوف MTZ
    1. نقل الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا Tg (rho: GFP-NTR) إلى خزان يحتوي على محلول MTZ 10 mM وخلفها عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة أسبوع واحد. استخدم الأشقاء المحورين وراثيا الذين يتم تربيتهم في مياه تربية الشرغوف التي تحتوي على 0.1٪ DMSO كعناصر تحكم.
    2. قم بتغيير MTZ ومحلول التحكم كل يوم خلال فترة العلاج. إطعام الضفادع الصغيرة كالمعتاد أثناء علاج MTZ.
    3. لمراقبة التألق الفردي (الخطوة 2.4) ، ضع كل شرغوف في وعاءه الصغير مع 30 مل من MTZ أو محلول التحكم من الخطوة 2.3.1 فصاعدا.
      ملاحظة: يمكن إجراء علاج MTZ في أي وقت من المرحلة 45 فصاعدا.
  4. المراقبة الحية لتنكس القضيب
    ملاحظة: يمكن مراقبة الانحطاط التدريجي للقضبان في الوقت الفعلي. لذلك، قم بتنفيذ الخطوات 2.4.1. إلى 2.4.4. قبل علاج MTZ ثم بانتظام بعد العلاج.
    1. اتبع الخطوتين 1.1 و 1.3 لإعداد التخدير وتخدير الشرغوف ، على التوالي.
    2. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية على منديل مبلل في طبق بتري صغير (قطره 55 مم). راقب مضان GFP تحت مجهر مجسم فلوري (الطول الموجي للإثارة = 488 نانومتر وطول موجة الانبعاث = 509 نانومتر) والتقط صورا للعين. يعكس انخفاض شدة التألق تدهور القضبان.
      ملاحظة: لإجراء مقارنات كمية ، يجب الحفاظ على نفس الإعدادات لتصوير جميع الضفادع الصغيرة.
    3. انقل الشرغوف المصور إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من مياه التربية عن طريق غمر طبق بتري بعناية. راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.
    4. قارن شدة التألق بين عيون الشرغوف المعالجة ب MTZ والتحكم لمراقبة وتقييم فعالية عملية التنكس.

3. تنكس خلايا القضيب بواسطة ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9

ملاحظة: تم إنشاء هذا البروتوكول لتوليد نموذج لالتهاب الشبكية الصباغي في Xenopus laevis عن طريق إحداث تنكس معين لخلايا القضيب باستخدام ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9. يتم توفير النسبة المئوية لحذف الإدراج (indels) في F0 في11 وهي ~ 75٪. يمكن أيضا إجراء مثل هذه الضربة القاضية بوساطة رودوبسين CRISPR / Cas9 في الضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis 11.

  1. إعداد المحاليل والكواشف
    1. طلب crRNA و tracrRNA
      1. اشتر الحمض النووي الريبي الاصطناعي كريسبر (crRNA) الذي يستهدف جين رودوبسين (rho) والحمض النووي الريبي المنشط القياسي (tracrRNA). يتكون crRNA من منطقة محددة الهدف (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ومنطقة أخرى (GUUUAAGAGCUAUGCU) تهجن إلى tracrRNA.
    2. crRNA:tracrRNA دوبلكس (رو gRNA دوبلكس)
      1. أعد تعليق crRNA و tracrRNA عند 100 ميكرومتر في المخزن المؤقت المزدوج الخالي من النيوكلياز.
      2. قم بإعداد gRNA duplex عن طريق خلط 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر rho crRNA ، و 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر tracrRNA ، و 94 ميكرولتر من المخزن المؤقت المزدوج. التركيزات النهائية هي 36 نانوغرام / ميكرولتر rho crRNA ، و 67 نانوغرام / ميكرولتر tracrRNA.
      3. قم بتلدين الأوليجوس عن طريق تسخينها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتبريدها ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. اصنع القسمة وقم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. مركب البروتين النووي الريبي كريسبر-كاس9 (أي بروتين gRNA المزدوج / بروتين Cas9)
      1. في وقت الاستخدام ، تحضير خليط من رو gRNA دوبلكس وبروتين Cas9. بالنسبة إلى 20 ميكرولتر ، أضف 10 ميكرولتر من محلول rho gRNA المزدوج ، و 2 ميكرولتر من بروتين Cas9 (مخزون عند 5 مجم / مل) ، و 2 ميكرولتر من فلوريسئين ليسين ديكستران (مخزون عند 10 مجم / مل) ، و 6 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
      2. لتشكيل مركب البروتين النووي الريبي ، احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية واترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      3. للحصول على 20 ميكرولتر من محلول التحكم ، امزج 2 ميكرولتر من بروتين Cas9 ، و 2 ميكرولتر من فلوريسئين ليسين ديكستران ، و 16 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
    4. إعداد حلول 10x و 1x و 0.1x MBS
      1. تحضير محلول بارث الملحي المعدل (10x MBS) بإضافة 11.92 جم من HEPES ، و 51.43 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.75 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 2.1 جم من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 2.46 جم من كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتي (MgSO4 ، 7 H2O) في 800 مل من الماء من النوع الثاني. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام 30٪ هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). أضف الماء من النوع الثاني حتى يصبح الحجم 1 لتر وقم بتعقيمه عن طريق التعقيم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      2. تحضير 1 لتر من محلول 1x MBS عن طريق تخفيف 100 مل من محلول ملح 10x MBS و 7 مل من 0.1 M ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 ، 2H2O) في الماء من النوع الثاني. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      3. تحضير محلول 0.1x MBS عن طريق تخفيف محلول 1x MBS في الماء من النوع الثاني. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    5. حل البنزوكائين للبالغين
      1. تحضير محلول بنزوكائين 0.05٪ بإضافة 5 مل من محلول مخزون البنزوكائين 10٪ (انظر الخطوة 1-1-1) إلى 1 لتر من ماء تربية الشرغوف. تخلط جيدا.
        ملاحظة: احفظ هذا المحلول لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء بورق الألمنيوم. أحضر المحلول إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه على.
    6. محلول ل-سيستين
      1. تحضير محلول dejellying في وقت الاستخدام عن طريق إضافة 2 غرام من مونوهيدرات الهيدروكلوريك L-cysteine إلى 100 مل من محلول 0.1x MBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 مع 30٪ هيدروكسيد الصوديوم.
    7. محلول بوليسكروز
      1. تحضير محلول السكروز الكثيف بإضافة 3 جم من بوليسكروز إلى 100 مل من محلول 0.1x MBS. قم بتخزين هذا المحلول لبضعة أسابيع عند 4 درجات مئوية.
  2. الإخصاب في المختبر وإزالة الهلام
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الإخصاب في المختبر Xenopus في بروتوكول مخصص مفصل في12.
    1. إعطاء هرمون لإناث Xenopus laevis للحث على الإباضة
      1. قبل 15 ساعة تقريبا من حصاد البويضة ، قم بحقن 600 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية في الكيس الليمفاوي الظهري للإناث واحتفظ بها طوال الليل عند 18 درجة مئوية.
    2. تشريح الخصية
      1. القتل الرحيم للذكور Xenopus بجرعة مميتة من محلول البنزوكائين 0.05٪ لمدة 10-15 دقيقة. كطريقة تكميلية للقتل الرحيم ، قم بقطع العمود الفقري مباشرة خلف الجمجمة بمقص حاد وقوي. افتح تجويف البطن بمقص التشريح ، واقطع الخصيتين ، وقم بإزالة أي دهون وشعيرات دموية متصلة. ضع كل خصية على الفور على الثلج في 1 مل من 1x MBS.
    3. إعداد المنوية
      1. سحق خصية واحدة باستخدام مدقة لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخفيف التعليق في أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل من 1x MBS. أضف 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين إلى أنبوب الخصية الثاني واحتفظ به عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام لمزيد من تجارب الإخصاب.
    4. الإخصاب في المختبر
      1. قم بتدليك الجزء الخلفي من الأنثى المحقونة بالهرمونات بلطف وجمع البويضات في طبق بتري (قطره 100 مم). انشر بضع قطرات من محلول المنوية على البويضات. انتظر 5 دقائق وقم بتغطيتها ب 0.1x MBS. انتظر 10 دقائق قبل الشروع في إزالة الجيلينج.
    5. إزالة هلام البيض المخصب
      1. استبدل محلول 0.1x MBS بمحلول إزالة الهلام لإزالة طبقة الهلام من البيض المخصب (~ 5 دقائق). شطف الأجنة جيدا 5-6 مرات مع 0.1x MBS ونقلها إلى طبق بتري جديد 100 ملم مليئة 0.1x MBS.
  3. تحضير نظام الحقن المجهري
    1. شحذ الشعيرات الدموية الزجاجية مع مجتذب micropipette13.
    2. املأ الشعيرات الدموية الحادة ب 2-10 ميكرولتر من مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 أو محلول التحكم باستخدام طرف محمل دقيق وضع الشعيرات الدموية في معالج الحاقن الدقيق.
    3. عند أعلى تكبير للمجهر المجسم ، قم بقطع الطرف الشعري بالملقط الدقيق ، واضبط وقت الحقن (~ 400 مللي ثانية) للحصول على حجم طرد يبلغ 10 نانولتر لكل نبضة. اضبط ضغط الطرد على حوالي 40 رطل لكل بوصة مربعة.
  4. الحقن المجهري للجنين أحادي الخلية مع مركب البروتين النووي الريبي كريسبر-كاس9
    1. ضع أجنة ذات مرحلة خلية واحدة على شبكة (نسيج نايلون 1 مم) ملتصقة في طبق بتري 100 مم مملوء بمحلول بوليسكروز 3٪ (الشكل 1 د).
    2. باستخدام الحاقن الدقيق وتحت المجهر المجسم ، قم بحقن 10 nL من مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (الذي يتوافق مع 500 بيكوغرام من gRNA duplex + 5 نانوغرام من بروتين Cas9 لكل جنين) أو محلول التحكم على مستوى القطب الحيواني ، في المنطقة القشرية ، أسفل الغشاء السيتوبلازمي مباشرة.
      ملاحظة: يسمح فلوريسئين ليسين ديكستران الموجود في المحلول بالفرز اللاحق للأجنة المحقونة.
    3. انقل الأجنة المحقونة إلى طبق بتري جديد 100 مم يحتوي على محلول بوليسكروز نظيف وضعه على حرارة 21 درجة مئوية.
    4. في اليوم الأول ، قم بفرز الأجنة المتطورة بانتظام واستبدل محلول السكروز ب 0.1x MBS حوالي 5 ساعات بعد الحقن المجهري.
    5. انتظر لمدة 24 ساعة بعد الحقن لفرز واختيار أجنة rho المقرمشة المحقونة جيدا تحت مجهر مجسم فلوري عن طريق تصور فلوريسئين ليسين ديكستران (الشكل 1E).
      ملاحظة: كلما كان الحقن المجهري مبكرا بعد الإخصاب ، زادت فعالية الضربة القاضية.
  5. تربية الأجنة والضفادع الصغيرة
    1. رفع أجنة rho crispant في 0.1x MBS في أطباق بتري حتى المرحلة 37/38. قم بإزالة الأجنة الميتة يوميا وقم بتغيير محلول 0.1x MBS. من المرحلة 37/38 ، قم بتربية الأجنة في خزان مملوء بمياه تربية الشرغوف ، ومن المرحلة 45 تابع كما في الخطوة 2.2.3.

4. تنكس خلايا الشبكية عن طريق حقن CoCl 2 السامة للخلايا داخل العين

ملاحظة: تم إنشاء هذا البروتوكول للحث على تنكس خلايا الشبكية عن طريق الحقن داخل العين من كلوريد الكوبالت (CoCl2) في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . وفقا للجرعة ، يمكن أن يؤدي إلى انحطاط مخروطي أو انحطاط أوسع14. نستخدم هذا البروتوكول في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis التي تتراوح أعمارها بين المرحلة 48 فصاعدا. ويمكن أيضا أن تستخدم في الضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis .

  1. إعداد العازلة والكواشف
    1. تحضير محلول البنزوكائين 0.005٪ في وقت الاستخدام كما في الخطوة 1.1.
    2. قم بإعداد محلول مخزون CoCl2 100 mM بإضافة 118.5 مجم إلى 5 مل من 0.1x MBS (انظر الخطوة 3.1.4 لتحضير 0.1x MBS). حافظ على محلول المخزون هذا لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم.
      تنبيه: يصنف CoCl2 على أنه مركب سام لحياة الإنسان. اتبع بعناية التعليمات الخاصة بالمناولة والتخزين والتخلص من النفايات في ورقة بيانات السلامة.
    3. بالنسبة للتنكس المخروطي النوعي ، قم بإعداد محلول CoCl2 10 mM في وقت الاستخدام من محلول مخزون 100 mM المخفف في 0.1x MBS. لتنكس خلايا الشبكية على نطاق أوسع ، قم بإعداد محلول CoCl2 25 mM.
  2. تحضير نظام الحقن
    1. شحذ الشعيرات الدموية الزجاجية مع مجتذب micropipette 13.
    2. املأ الشعيرات الدموية الحادة بمحلول 2-10 ميكرولتر من محلول CoCl2 10 أو 25 mM أو محلول التحكم (0.1x MBS) باستخدام طرف محمل دقيق وضع الشعيرات الدموية في معالج الحاقن الدقيق.
    3. عند أعلى تكبير للمجهر المجسم ، قم بقطع الطرف الشعري بالملقط الدقيق ، واضبط وقت الحقن (حوالي 100 مللي ثانية) للحصول على حجم طرد يتراوح بين 15 و 40 نانولتر لكل نبضة. اضبط ضغط الطرد على ~ 40 رطل لكل بوصة مربعة.
      ملاحظة: يجب تكييف حجم القطرة مع مرحلة الضفادع الصغيرة وحجم عينها. على سبيل المثال ، في المراحل 48-49 ، يكون حجم السقوط ~ 15-20 nL ، بينما يكون 30-40 nL في المراحل 52-56. بصريا ، حجم القطرة أكبر قليلا من حجم العدسة.
  3. حقن CoCl2 داخل العين
    1. استخدم شبكة غمس للقبض على الضفادع الصغيرة في خزاناتها. نقلها إلى 50 مل من محلول البنزوكائين 0.005 ٪. انتظر بضع دقائق حتى تتوقف الضفادع الصغيرة عن التفاعل مع المنبهات.
      ملاحظة: قد يتم تخدير العديد من الضفادع الصغيرة في نفس الوقت ، ولكن يجب أن يكون الوقت المستغرق في التخدير أقل من 30 دقيقة.
    2. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية في طبق بتري صغير (قطره 55 مم) يحتوي على منديل مبلل. ضع الجانب الظهري للشرغوف لأعلى في منتصف طبق بتري (الشكل 1F ، G).
    3. استخدم الحاقن الدقيق تحت المجهر المجسم لحقن محلول CoCl2 داخل العين. أدخل الشعيرات الدموية برفق في العين فوق العدسة. عندما يكون الطرف الشعري داخل العين ، أخرج قطرتين لكل عين. بعد حقن العين اليمنى ، اقلب طبق بتري يدويا 180 درجة لحقن العين اليسرى.
      ملاحظة: تأكد من أن الحقن يتم داخل العين ، لذلك يجب رؤية تورم طفيف في العين بعد كل طرد للمحلول. يجب أن يبقى الشرغوف خارج الماء بأقل قدر ممكن. يجب أن يستغرق حقن كلتا العينين أقل من 1 دقيقة.
    4. انقل الشرغوف المحقون إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من ماء التربية عن طريق غمره بعناية في طبق بتري (الشكل 1H). راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.

5. تلطيخ لتقييم تلف الشبكية أو تنكس الشبكية

  1. تثبيت الشرغوف والجفاف
    1. تحضير محلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) عن طريق تخفيف 100 مل من محلول PFA 32٪ إلى 700 مل من 1x PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH. قم بقسمة محلول المخزون هذا وحفظه لعدة أشهر عند -20 درجة مئوية.
    2. القتل الرحيم للضفادع الصغيرة في 0.01٪ بنزوكائين ونقلها إلى قنينة تحتوي على 4٪ PFA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. شطف 3 × 5 دقائق في 1x PBS.
    3. تجفيف الضفادع الصغيرة تدريجيا عن طريق حضانات متتالية لمدة 30 دقيقة في 70٪ و 95٪ إيثانول (مخفف في الماء من النوع الثاني) ، تليها ثلاث حضانات أخرى لمدة 1 ساعة في الإيثانول بنسبة 100٪. قم بتخزين رؤوس الشرغوف في هذه الخطوة عند -20 درجة مئوية أو انقلها مباشرة إلى 100٪ بيوتانول طوال الليل لمزيد من الخطوات.
  2. تقسيم البارافين
    1. استبدل 100٪ بيوتانول بالبارافين المذاب لمدة 2 ساعة عند 62 درجة مئوية. استبدل البارافين لمدة 2 × 2 ساعة من الحضانات الإضافية عند 62 درجة مئوية.
    2. انقل رؤوس الشرغوف في قوالب تضمين البارافين التي تستخدم لمرة واحدة وقم بتوجيهها بحيث تكون عيونها محاذاة جيدا ، ثم اترك البارافين يتصلب. تخزين الكتل في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بقص البارافين الزائد وقم بتركيب الكتلة باستخدام الشرغوف (الشرغوف) المضمن على دعامة الميكروتوم.
    4. قسم الكتلة مع microtome بسمك مناسب (10-12 ميكرومتر). انقل الشرائط بأقسام على شريحة مغطاة مسبقا ب 3٪ من الجلسرين الزلالي (المخفف في الماء).
    5. ضع الشريحة على جهاز تدفئة منزلق على حرارة 42 درجة مئوية لبضع دقائق ثم أزل فائض الجلسرين الزلالي. اترك الشرائح تجف طوال الليل في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
    6. قم بإزالة الشمع عن طريق غمر الشرائح لمدة 2 × 15 دقيقة في وعاء كوبلين مملوء بالزيلين بنسبة 100٪. أعد ترطيب الأقسام بسلسلة إيثانول متدرجة: 100٪ مرتين ، 70٪ ، 50٪ (مخففة في الماء من النوع الثاني) ، ~ 5 دقائق لكل منهما ، متبوعة ب 2 × 5 دقائق في الماء.
  3. وضع العلامات المناعية
    1. تحضير محلول مخزون سترات الصوديوم (CiNa) 100 مللي متر بإضافة 29.4 جم من ثنائي هيدرات ملح الصوديوم ثلاثي الصوديوم (C6H5Na3O7 ، 2H2O) إلى 1 لتر من الماء من النوع الثاني ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl). تعقيم عن طريق التعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. قم بإعداد محلول إزالة القناع في وقت الاستخدام عن طريق إضافة 25 مل من محلول مخزون CiNa 100 مللي متر إلى 225 مل من الماء من النوع الثاني. أضف 125 ميكرولتر من Tween-20 واخلطه جيدا (التركيز النهائي هو 10 mM CiNa ، 0.05٪ Tween-20).
    2. قم بإعداد محلول مخزون Hoechst عند 10 مجم / مل بإضافة 100 مجم من bisBenzimide H 33258 إلى 10 مل من الماء من النوع الأول. حافظ على محلول المخزون هذا لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم. قم بإعداد محلول Hoechst عند 7.5 ميكروغرام / مل بإضافة 300 ميكرولتر من محلول مخزون Hoechst إلى 400 مل من 1x PBS.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا المحلول حتى 10 مرات وحفظه لمدة 6 أشهر تقريبا عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم.
    3. بعد إزالة الشمع من المقاطع ، قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غلي الأقسام في محلول إزالة القناع لمدة 9 دقائق. دع المحلول يبرد لمدة 20 دقيقة.
    4. شطف مرة واحدة في الماء من النوع الثاني ومرة واحدة في 1x PBS. ضع الشرائح بشكل مسطح في غرفة رطبة وأضف 400-600 ميكرولتر من محلول الحجب لكل شريحة (مخفف الأجسام المضادة + 0.2٪ Triton X100) لمدة 30 دقيقة.
    5. استبدل محلول الحجب ب 200 ميكرولتر لكل شريحة من الجسم المضاد الأساسي المخفف في محلول الحظر. استخدم غطاء لنشر المحلول على الأقسام ، وتجنب تكوين الفقاعة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة.
    6. انقل الشرائح إلى جرة كوبلين واشطفها لمدة 3 × 10 دقائق في 1x PBS مع 0.1٪ Triton X100. ضع الشرائح مسطحة ، أضف 400 ميكرولتر لكل شريحة من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع ، واتركه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
    7. انقل الشرائح إلى برطمان كوبلين واشطفها لمدة 3 × 5 دقائق مع 1x PBS مكمل ب 0.1٪ Triton X100.
    8. نوى الخلايا المضادة مع محلول Hoechst لمدة 10 دقائق وشطف 3 × 5 دقائق مع 1x PBS.
    9. ضع أغطية الأغطية فوق الشرائح في وسط تثبيت مائي مصمم خصيصا للحفاظ على التألق. اترك الشرائح تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    10. تخيل الشرائح بمجهر مضان.
  4. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لتقييم تلف الشبكية
    ملاحظة: بدلا من تسمية نوع معين من الخلايا عن طريق التلوين المناعي ، يمكن تقييم أنسجة الشبكية العامة باستخدام تلوين H&E.
    1. بعد إزالة الشمع من المقاطع ، قم بإجراء وضع العلامات على الحمض النووي عن طريق غمر الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة. شطف جيدا بماء الصنبور.
    2. قم بوضع العلامات على السيتوبلازم عن طريق غمر الشرائح في محلول eosin بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة. شطف بسرعة بالماء.
      ملاحظة: Eosin قابل للذوبان جدا. إذا تركت الشرائح لفترة طويلة في الماء ، تختفي كل الصبغة.
    3. شطف 2 × 5 دقائق في 100٪ الإيثانول و 2 × 5 دقيقة في الزيلين.
    4. تحت الغطاء ، ضع أغطية فوق الشرائح في 4-5 قطرات من وسيط التثبيت. دع الشرائح تجف تحت غطاء محرك السيارة وصورها في اليوم التالي باستخدام المجهر.
  5. الكشف عن خلايا موت الخلايا المبرمج
    1. بعد إزالة الشمع من الأقسام (انظر القسم 5.2.6) ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة للكشف عن تجزئة الحمض النووي المبرمج.
    2. قم بإجراء تلطيخ النوى عن طريق غمر الشرائح في محلول Hoechst (انظر القسم 5.3.8) وقم بالتركيب باستخدام وسيط تركيب مائي مصمم خصيصا للحفاظ على التألق. اترك الشرائح تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. تخيل الشرائح بمجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إصابة الشبكية الميكانيكية
تظهر أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة المعرضة للإصابة الميكانيكية الموصوفة في قسم البروتوكول 1 أن آفة الشبكية تشمل جميع طبقات الأنسجة بينما تظل محدودة بموقع البزل (الشكل 2 أ ، ب).

الاجتثاث الشرطي لخلية القضيب باستخدام نظام NTR-MTZ
تم تحليل عيون الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا Tg (rho: GFP-NTR) المعالجة بمعالجة MTZ ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 2 ، تحت المجهر المجسم (الشكل 3A ، B). يكشف الانخفاض في مضان GFP عن الاجتثاث التدريجي لخلايا القضيب المستهدفة مقارنة بالضوابط (الشكل 3 ب) ، والتي تم تأكيدها على أقسام الشبكية بواسطة التلوين المناعي ل GFP ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 5 (الشكل 3C).

تنكس خلايا القضيب بواسطة ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9
تم تحليل شبكية العين من الضفادع الصغيرة rho crispant ، التي تم الحصول عليها كما هو موضح في قسم البروتوكول 3 ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 5 (الشكل 4A). يسلط وضع العلامات Caspase 3 و Rhodopsin الضوء على أن بعض القضبان تخضع لموت الخلايا المبرمج (الشكل 4 ب). يكشف تلطيخ H& E عن الحفاظ العالمي على الطبقات النووية ولكن تقصيرا شديدا في الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (الشكل 4C). يظهر تحليل المناعة الإضافي مع علامات المستقبلات الضوئية انحطاط القضبان وعيوب المخروط اللاحقة (الشكل 4D وغير معروض). يبدأ النمط الظاهري في الظهور من المرحلة 40 فصاعدا ، وتختفي الأجزاء الخارجية من القضبان تدريجيا حتى تغيب عن الشبكية المركزية من المرحلة 47.

تنكس خلايا الشبكية عن طريق حقن CoCl 2 السامة للخلايا داخل العين
تم تحليل شبكية العين من الضفادع الصغيرة التي خضعت لحقن CoCl2 داخل العين ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 4 ، عن طريق التلوين المناعي ومقايسة TUNEL ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 5 (الشكل 5A). هذا يكشف أن حقن 10 mM CoCl2 يؤدي إلى موت خلايا محددة للمستقبلات الضوئية المخروطية (الشكل 5B ، C) بينما يؤدي 25 mM إلى موت خلايا الشبكية الواسع (الشكل 5E). كشف تحليل التلوين المناعي ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 5 ، عن عدم وجود مخاريط في شبكية العين المحقونة ب 10 mM CoCl 2 (الشكل 5D) وفقدان شديد لكل من الخلايا ثنائية القطب والمستقبلات الضوئية بعد حقن 25 mM CoCl2 (الشكل 5F).

Figure 1
الشكل 1: رسوم توضيحية لبعض الإجراءات التجريبية. (أ) يستخدم دبوس قطره 0.2 مم متصل بحامل دبوس لثقب الشبكية. توضح الرسوم البيانية للمناظر الظهرية والجانبية والأمامية للشرغوف مكان إدخال الدبوس (باللون الأحمر). ب: التمثيل التخطيطي للنموذج المعدل وراثيا لاستئصال الخلايا القضيبية الشرطية. يقود مروج رودوبسين التعبير عن بروتين اندماج GFP-Nitroreductase في خلايا القضيب. عند إضافته إلى مياه تربية Xenopus ، يحول NTR الميترونيدازول إلى سم خلوي ، وتحديدا يتخلص من قضبان GFP-NTR. (ج ) يظهر رأس الشرغوف المعدل وراثيا Tg(rho:GFP-NTR) في ضوء أبيض أو تحت التألق. يسمح تلطيخ GFP في العين بفرز الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا. (د) أجنة ذات مرحلة خلية واحدة على شبكة من النايلون تحت مجهر مجسم جاهزة للحقن بنظام الحقن المجهري Picospritzer. (ه ) الأجنة في مرحلة العصب (تخطيطي في أقحم) بعد الحقن في مرحلة الخلية الواحدة من مركب البروتين النووي الريبي كريسبر-كاس9 الذي يحتوي على فلوريسئين ليسين ديكستران. يمكن تمييز الأجنة الفلورية المحقونة جيدا (الأسهم الخضراء) عن الأجنة غير المحقونة (الأسهم البيضاء). (و) صورة توضح الملعقة المستخدمة لنقل الضفادع الصغيرة المخدرة. (ز) الضفادع الصغيرة المخدرة في طبق بتري فوق منديل مبلل. يسمح الشعيرات الدموية التي يتم إدخالها في الحاقن الدقيق بالحقن داخل العين لمحلول CoCl2 . (H) صورة توضح انتقال الشرغوف إلى خزان سعة 1 لتر حيث يمكن مراقبة حتى الاستيقاظ. قضبان المقياس = 2 مم (C) ، 1 مم (E). الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. NTR = نيتروريدوكتاز ؛ MTZ = ميترونيدازول ؛ NF = مرحلة نيوكوب وفابر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إصابة ميكانيكية في الشبكية. (أ) الخطوط العريضة للإجراء التجريبي المستخدم في (ب). يتم ثقب عيون الشرغوف Xenopus laevis وتحليلها على أقسام الشبكية بعد 7 أيام من الإصابة. يشير المربع المنقط إلى المساحة المصورة. (ب) نوى الخلية متقابلة مع هويشت. تظهر ثلاث شبكيات مختلفة. تشير الأسهم إلى الموقع المصاب الذي يعبر جميع طبقات الشبكية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ GCL = طبقة خلية العقدة ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استئصال خلية قضيب شرطي باستخدام نظام NTR-MTZ. (أ) الخطوط العريضة للإجراء التجريبي المستخدم في (ب ، ج). Tg (rho: GFP-NTR) يتم التعامل مع الضفادع الصغيرة Xenopus laevis المعدلة وراثيا باستخدام MTZ لمدة 7-9 أيام. يمكن مراقبة الانحطاط التدريجي للقضبان التي تحمل علامة GFP في الوقت الفعلي تحت مجهر مجسم مضان كما هو موضح في 7 أيام في (B). يمكن أيضا تحليل موت خلايا القضيب على أقسام الشبكية كما هو موضح بعد 14 يوما في (C) ، المربع المنقط الذي يشير إلى المنطقة المصورة. (ب) بعد 7 أيام من العلاج ، تقل شدة GFP في شبكية العين بمرور الوقت في الضفادع الصغيرة المعالجة ب MTZ المعدلة وراثيا مقارنة بالضوابط. (ج) يتم تأكيد الانخفاض في مضان GFP في أقسام الشبكية في 14 يوما عن طريق التلوين المناعي GFP. يتم تلطيخ نوى الخلية باللون الأزرق مع Hoechst. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر (ب) ، 50 ميكرومتر (ج). الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. NTR = نيتروريدوكتاز ؛ MTZ = ميترونيدازول ؛ L = عدسة. R = شبكية العين. GCL = طبقة خلية العقدة ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ نظام التشغيل = الأجزاء الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تنكس القضيب في Xenopus laevis rho crispants. (أ) الخطوط العريضة للإجراء التجريبي المستخدم في (B-D). يتم حقن الأجنة ذات المرحلة الواحدة بمركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (بروتين gRNA duplex / Cas9) الذي يحتوي على اللايسين ديكستران الفلوري. في مرحلة العصبة ، يمكن فرز الأجنة المحقونة بالفلورسنت والسماح لها بالتطور حتى مراحل مختلفة لأداء (B) التلوين المناعي Caspase 3 المشقوق لتحليل موت الخلايا ، أو (C) تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين للتحليل التشريحي ، أو (D) التلوين المناعي بعلامات القضيب لتحليل تنكس الخلايا المستقبلة للضوء. يشير المربع المنقط إلى المساحة المصورة. (ب) وضع العلامات المزدوجة على Caspase 3 المشقوق (علامة على الخلايا المبرمجة) ورودوبسين (علامة للأجزاء الخارجية للقضيب) على أقسام الشبكية من التحكم أو rho crispants تظهر أجنة Xenopus laevis في المرحلة 39 عدم وجود خلايا ميتة في عناصر التحكم وأن الخلايا الميتة في rho crispants هي مستقبلات ضوئية قضيبية. (C) يكشف تلطيخ H& E على أقسام شبكية العين من الشراغيف Xenopus laevis في المرحلة 48 عن انخفاض حجم الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية مقارنة بالضوابط. (د) يكشف Recoverin (علامة على الأجزاء الداخلية للقضيب) و Rhodopsin المناعي المشترك على أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة Xenopus laevis في المرحلة 48 عن انحطاط شديد مقارنة بالضوابط. يتم تلطيخ نوى الخلية باللون الأزرق مع Hoechst. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: gRNA = دليل الحمض النووي الريبي. H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. GCL = طبقة خلية العقدة ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ نظام التشغيل = الأجزاء الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تنكس خلايا الشبكية عن طريق حقن CoCl2 السامة داخل العين . (أ) الخطوط العريضة للإجراء التجريبي المستخدم في (B-F). يشير المربع المنقط إلى المساحة المصورة. يتم حقن محلول 10 mM أو 25 mM CoCl2 داخل العين في العين الشرغوف. يتم تحليل موت الخلايا المبرمج عن طريق اختبار TUNEL بعد يومين من الإصابة (DPI) (B ، C ، E) ، بينما يتم تحليل تنكس خلايا الشبكية من 7 إلى 14 نقطة في البوصة عن طريق التلوين المناعي بعلامات مختلفة (D ، F). (ب-د) حقن أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة بمحلول ملحي (عناصر التحكم) أو بمحلول 10 mM CoCl2 في المراحل 51-54. (ب) يكشف تحليل موت الخلايا عند 2 نقطة في البوصة عن وجود خلايا ميتة بعد حقن CoCl2 بشكل رئيسي في الطبقة النووية المستقبلة للضوء. (ج) يكشف اقتران تلطيخ موت الخلايا مع التلوين المناعي ل S / M Opsin (علامة المخاريط) أن هذه الخلايا الميتة هي مخاريط بشكل أساسي ؛ تشير الأسهم إلى الخلايا ذات التسميات المزدوجة. (د) يكشف التلوين المناعي المشترك S / M Opsin (علامة المخاريط) والرودوبسين (علامة القضبان) عن انخفاض حاد في وسم الخلايا المخروطية في شبكية العين المحقونة CoCl2 مقارنة بالضوابط عند 14 نقطة في البوصة. (ه، و) حقن أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة بمحلول 25 mM CoCl2 في المراحل 51-54. (ه) يكشف تحليل موت الخلايا عند 2 نقطة في البوصة عن وجود خلايا ميتة في كل من المستقبلات الضوئية والطبقات النووية الداخلية. (F) يكشف التلوين المناعي Otx2 (علامة لكل من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب) عن انخفاض حاد في التلوين في كلتا الطبقتين في شبكية العين المحقونة ب CoCl 2 مقارنة بالضوابط عند 7 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى موت الخلايا الناجم عن CoCl2 لكل من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب. يتم تلطيخ نوى الخلية باللون الأزرق مع Hoechst. قضبان المقياس: 25 ميكرومتر. الاختصارات: ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ GCL = طبقة خلية العقدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مزايا وعيوب نماذج إصابة الشبكية المختلفة في الضفادع الصغيرة Xenopus

إصابة الشبكية الميكانيكية
تم تطوير إصابات جراحية مختلفة في شبكية العين العصبية في الضفادع الصغيرة Xenopus. قد تتم إزالة الشبكية العصبية بالكامل 15,16 أو استئصالها جزئيافقط 16,17. لا تنطوي الإصابة الميكانيكية المعروضة هنا على أي استئصال للشبكية ولكن ثقب بسيط في العين طورناه سابقا في الضفادع الصغيرة Xenopus 6. بالنظر إلى الإجراء اليدوي لنموذج إصابة الشبكية الميكانيكي هذا ، قد يختلف النمط الظاهري اختلافا كبيرا من شرغوف إلى آخر. علاوة على ذلك ، قد تختلف قابلية التكرار ومدى الضرر أيضا اعتمادا على من يقوم بإجراء التجربة. لذلك ، نوصي بأن يقوم نفس الشخص بإجراء جميع إجراءات الإصابة.

الاجتثاث الشرطي لخلية القضيب باستخدام نظام NTR-MTZ
تم استخدام نظام NTR-MTZ لاستئصال الخلايا القضيبية في شبكية Xenopus المعدلة وراثيا6،7،8،18. تختلف مدة علاج MTZ بشكل كبير من دراسة إلى أخرى ، من 2 إلى 7 أيام. قد يعكس هذا الأنشطة المختلفة ل NTR اعتمادا على إدخال الكروموسومات في الخطوط المعدلة وراثيا المختلفة. علاوة على ذلك ، لاحظنا بعض التباين في استجابة الضفادع الصغيرة Tg (rho: GFP-NTR) لفترة معينة من علاج MTZ ، حيث يعاني بعضها من تنكس شديد للقضيب بينما يظهر البعض الآخر ضررا ضئيلا جدا. يبدو أن تمديد علاج MTZ من 7 إلى 9-10 أيام باستخدام هذا الخط المعدل وراثيا يقلل من هذا التباين. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر بالنظر إلى الآثار السامة المحتملة ل MTZ. تتمثل المزايا الواضحة لهذا النموذج في أنه يسمح باستئصال خلايا القضيب المشروط والقابل للانعكاس والمراقبة الحية لتنكس القضيب.

تنكس خلايا القضيب بواسطة ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9
يؤدي نموذج تحرير الجينات CRISPR-Cas9 rho لالتهاب الشبكية الصباغي إلى تنكس الخلايا القضيبية في الشرغوف Xenopus 11. ومع ذلك ، على عكس نموذج NTR-MTZ ، فإن استئصال الخلايا القضيبية يكون تأسيسيا وغير قابل للعكس. ومن المثير للاهتمام ، أن الكفاءة العالية لهذا النهج (نحصل الآن بانتظام على >90٪ من الضفادع الصغيرة التي تظهر تنكسا شديدا للقضيب) تسمح بالعمل على هذا النموذج على جيل F0. كنا نعمل في البداية مع sgRNA لكننا لاحظنا تباينا من دفعات مختلفة من مستحضرات الحمض النووي الريبي. لقد وجدنا مؤخرا أن طلب crRNA الاصطناعية و tracrRNA وإعداد gRNA على الوجهين كما هو موضح في هذا البروتوكول يوفر نتائج أكثر موثوقية.

تنكس خلايا الشبكية عن طريق حقن CoCl2 السامة للخلايا داخل العين
هذا النموذج له العديد من المزايا على النماذج الأخرى الموضحة هنا. لا يسمح فقط بالحث على استئصال أنواع خلايا الشبكية بشكل مشروط ولكن أيضا لتعديل شدة الضرر14. علاوة على ذلك ، فإنه يمثل على حد علمنا النموذج الوحيد لانحطاط مخروطي محدد في Xenopus. أخيرا ، يولد تباينا منخفضا في النمط الظاهري التنكسي.

فعالية نماذج آفة الشبكية الأربعة
لمراعاة التباين المحتمل للأنماط الظاهرية من دفعة واحدة من الضفادع الصغيرة إلى أخرى ، يوصى بالتحقق من فعالية تنكس الشبكية على 8-10 شراغف. في حالة الإصابة الميكانيكية ، يجب تحليل الضرر في الأيام التالية للإصابة ، حيث لم تعد الآفة مرئية بعد أسبوع. في نموذج NTR-MTZ ، يكون تنكس القضيب مرئيا بوضوح بعد 1 أسبوع من انتهاء علاج MTZ. بالنسبة لمقرمشات الرو ، عندما يبدأ موت الخلايا القضيبية عندما تتمايز المستقبلات الضوئية تماما ، نوصي بتحليل الكفاءة التنكسية من المرحلة 45 فصاعدا. في نموذج CoCl2 ، يحدث موت الخلايا في غضون أسبوع من الحقن. فيما يتعلق بنسبة البقاء المتوقعة لكل طريقة ، نود أن نلاحظ أن حقن مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 تؤدي إلى معدلات وفيات أعلى في أول 48 ساعة من حقن الحمض النووي الريبي التقليدية (لا توجد مشاكل في النمو أو البقاء على قيد الحياة بعد هذه ال 48 ساعة الأولى) ، وبالتالي ، يجب حقن المزيد من الأجنة حسب الضرورة. في المقابل ، لا تشكل الإجراءات الأخرى (الإصابات الميكانيكية أو علاج MTZ أو حقن CoCl2 داخل العين) أي مشاكل في البقاء على قيد الحياة.

التطبيقات المحتملة لنماذج الإصابة هذه لدراسة تجديد الشبكية
أحد التطبيقات المحتملة لهذه السلسلة من نماذج إصابة الشبكية هو دراسة تجديد الشبكية. يمكن تجنيد مصادر مختلفة من الخلايا الجذعية الشبكية أو الخلايا الجذعية في سياق مرضي ، بما في ذلك خلايا CMZ وخلايا مولر الدبقية وخلايا RPE. لقد أبلغنا أن نموذج الإصابة الميكانيكية ، ونموذج NRT / MTZ ، ونموذج CRISPR / Cas9 ، كلها نماذج جذابة لدراسة تنشيط خلية مولر عند الإصابة 6,11. ومن المثير للاهتمام ، في نموذج CoCl2 ، يمكن تجنيد جميع المصادر الخلوية الثلاثة14 ، مما يوفر نموذجا جديدا لدراسة الآليات الكامنة وراء تجنيد وإعادة برمجة أنواع مختلفة من خلايا الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال منح إلى M.P. من جمعية شبكية العين في فرنسا ، ومؤسسة فرنسا ، ونشرة الهجرة القسرية (مؤسسة الأمراض الراديوية) ، و BBS (جمعية متلازمة بارديه بيدل) ، و UNADEV (الاتحاد الوطني للعلماء و Déficients Visuels) بالشراكة مع ITMO NNP (المعهد المسرحي متعدد الكائنات الحية ، العلوم المعرفية ، علم الأعصاب ، الطب النفسي) / AVIESAN (التحالف الوطني لعلوم الحياة والصحة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Tags

نماذج إصابة الشبكية ، الضفادع الصغيرة Xenopus ، الأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين ، العمى ، الإصلاح الذاتي ، M& 252 ؛ Ller Glial Cell ، إمكانات الخلايا الجذعية ، القدرة على التجدد ، الآليات الجزيئية ، النماذج الحيوانية ، الثدييات M & 252 ؛ خلايا لير، تجديد الشبكية، الاستراتيجيات العلاجية، الطب التجديدي، نماذج إصابة الشبكية، إصابة الشبكية الميكانيكية، الاستئصال الشرطي لمستقبلات الضوء بوساطة النيتروريدوكتاز، نموذج التهاب الشبكية الصباغي، خروج رودوبسين بالضربة القاضية بوساطة كريسبر/كاس9، نموذج سام للخلايا، حقن CoCl2
توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة <em>Xenopus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parain, K., Donval, A., Chesneau,… More

Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter