Summary
Vi har utvecklat flera protokoll för att inducera näthinneskada eller näthinnedegeneration hos Xenopus laevis grodyngel. Dessa modeller ger möjlighet att studera mekanismer för näthinneregenerering.
Abstract
Näthinnans neurodegenerativa sjukdomar är de främsta orsakerna till blindhet. Bland de många terapeutiska strategier som utforskas har stimulering av självläkning nyligen framstått som särskilt tilltalande. En cellulär källa av intresse för näthinnereparation är Müller-gliacellen, som har stamcellspotential och en extraordinär regenerativ kapacitet i anamnioter. Denna potential är dock mycket begränsad hos däggdjur. Att studera de molekylära mekanismerna bakom retinal regenerering i djurmodeller med regenerativ förmåga bör ge insikter om hur man kan låsa upp den latenta förmågan hos däggdjurs Müller-celler att regenerera näthinnan. Detta är ett viktigt steg för utvecklingen av terapeutiska strategier inom regenerativ medicin. För detta ändamål utvecklade vi flera paradigm för näthinneskada i Xenopus: en mekanisk näthinneskada, en transgen linje som möjliggör nitroreduktasmedierad fotoreceptorbetingad ablation, en retinitis pigmentosa-modell baserad på CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout och en cytotoxisk modell som drivs av intraokulära CoCl2-injektioner . För att belysa deras fördelar och nackdelar beskriver vi här denna serie protokoll som genererar olika degenerativa tillstånd och gör det möjligt att studera retinal regenerering hos Xenopus.
Introduction
Miljontals människor världen över drabbas av olika degenerativa sjukdomar i näthinnan som leder till blindhet, såsom retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati eller åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Hittills är dessa tillstånd i stort sett obehandlingsbara. Nuvarande terapeutiska metoder som utvärderas inkluderar genterapi, cell- eller vävnadstransplantationer, neuroprotektiva behandlingar, optogenetik och proteser. En annan framväxande strategi är baserad på självregenerering genom aktivering av endogena celler med stamcellspotential. Müller-gliaceller, den huvudsakliga gliacellstypen i näthinnan, är bland cellulära källor av intresse i detta sammanhang. Vid skada kan de dedifferentiera, föröka sig och generera neuroner 1,2,3. Även om denna process är mycket effektiv hos zebrafiskar eller Xenopus, är den i stort sett ineffektiv hos däggdjur.
Icke desto mindre har det visats att lämpliga behandlingar med mitogena proteiner eller överuttryck av olika faktorer kan inducera återinträde i Müllers gliacellcykel hos däggdjur och, i vissa fall, utlösa deras efterföljande neurogenesåtagande 1,2,3,4,5. Detta är dock fortfarande i stort sett otillräckligt för behandlingar. Därför är det nödvändigt att öka vår kunskap om de molekylära mekanismerna bakom regenerering för att identifiera molekyler som effektivt kan omvandla Müllers stamliknande cellegenskaper till nya cellulära terapeutiska strategier.
Med detta mål utvecklade vi flera skadeparadigm i Xenopus som utlöser degeneration av näthinneceller. Här presenterar vi (1) en mekanisk näthinneskada som inte är celltypsspecifik, (2) en betingad och reversibel cellablationsmodell med NTR-MTZ-systemet som riktar sig mot stavceller, (3) en CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout , en modell av retinitis pigmentosa som utlöser progressiv stavcellsdegeneration, och (4) en CoCl2-inducerad cytotoxisk modell som beroende på dosen specifikt kan rikta in sig på tappar eller leda till bredare degeneration av näthinneceller. Vi lyfter fram särdragen, fördelarna och nackdelarna med varje paradigm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och djurförsök bedrevs i enlighet med institutionens riktlinjer, under den institutionella licensen A91272108. Studieprotokollen godkändes av den institutionella djurvårdskommittén CEEA #59 och fick godkännande av Direction Départementale de la Protection des Populations under referensnummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 och APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, instrument och reagenser som används i dessa protokoll.
1. Mekanisk näthinneskada
OBS: Skadeparadigmprotokollet som beskrivs här består av en mekanisk retinal punktion av ett grodyngel från stadium 45 och framåt. Den riktar sig därför inte mot någon särskild celltyp i näthinnan utan skadar hela näthinnans tjocklek vid punkteringsstället.
- Beredning av bedövningsmedel för grodyngel
- Bered en 10% stamlösning av bensokain. För en total volym på 10 ml, tillsätt 1 g bensokain, 2 ml dimetylsulfoxid (DMSO) och 8 ml propylenglykol. Förvara stamlösningen i flera månader vid 4 °C skyddad från ljus med aluminiumfolie.
- Bered 0,005 % bensokainlösning vid användningstillfället genom att tillsätta 25 μl 10 % stamlösning av bensokain till 50 ml yngelodlingsvatten (filtrerat och avklorerat kranvatten). Blanda väl.
OBS: Koncentrationen av bensokain är särskilt låg eftersom grodyngel är mycket känsliga för anestesi jämfört med vuxna.
- Förberedelse av stift
- Fäst ett sterilt stift med en diameter på 0.2 mm på en steriliserad stifthållare (Figur 1A).
- Gyngel anestesi
- Använd en håv för att fånga grodyngel i deras akvarier. Överför dem till en ny tank som innehåller 0,005 % bensokainlösning. Vänta några minuter tills grodynglen slutar reagera på stimuli (knacka på akvariet eller direktkontakt).
OBS: Flera grodyngel kan sövas samtidigt, men tiden i anestesilösningen bör vara mindre än 30 min.
- Använd en håv för att fånga grodyngel i deras akvarier. Överför dem till en ny tank som innehåller 0,005 % bensokainlösning. Vänta några minuter tills grodynglen slutar reagera på stimuli (knacka på akvariet eller direktkontakt).
- Punktion på näthinnan
- Använd en sked för att fånga ett grodyngel och lägg det försiktigt på en liten petriskål (55 mm diameter) som innehåller en våt servett. Placera grodyngelns ryggsida uppåt i mitten av petriskålen.
- Punktera näthinnan under ett stereomikroskop genom att försiktigt föra in stiftet på ögats dorsala sida tills det passerar genom näthinnan (Figur 1A). Om flera puffar behövs, upprepa denna procedur på olika ställen. Efter att ha punkterat det högra ögat, vrid petriskålen 180° för att punktera det vänstra ögat.
- Överför det skadade grodynglet till ett stort akvarium som innehåller 1 liter odlingsvatten genom att försiktigt sänka ner petriskålen. Övervaka grodynglen tills de är helt vakna.
2. Villkorlig stavcellsablation med NTR-MTZ-systemet
Protokollet syftar till att inducera specifik stavcellsablation i den transgena linjen Xenopus Tg(rho:GFP-NTR), som finns tillgänglig vid TEFOR Paris-Saclays zootekniska tjänst, som är värd för det franska Xenopus-resurscentret. Detta kemogenetiska system använder kapaciteten hos enzymet nitroreduktas (NTR) för att omvandla prodrogen metronidazol (MTZ) till ett cytotoxiskt DNA-tvärbindningsmedel, för att specifikt ablatera NTR-uttryckande stavar (Figur 1B). Två detaljerade protokoll för att göra Tg(rho:GFP-NTR) eller Tg(rho:NTR) transgena djur och inducera degeneration har publicerats tidigare 7,8. Här beskriver vi helt enkelt induktionen av retinal degeneration och hur man övervakar degenerationsprocessen in vivo.
- Beredning av metronidazollösning
- Bered 10 mM MTZ-lösning vid användningstillfället genom att lösa upp 1,67 g MTZ-pulver i en mörk flaska i 1 l grodyngeluppfödningsvatten innehållande 0,1 % DMSO, med hjälp av en magnetisk omrörare och en magnetisk omrörare.
OBS: MTZ är ljuskänsligt. Fullständig upplösning kan ta upp till 10 minuter.
- Bered 10 mM MTZ-lösning vid användningstillfället genom att lösa upp 1,67 g MTZ-pulver i en mörk flaska i 1 l grodyngeluppfödningsvatten innehållande 0,1 % DMSO, med hjälp av en magnetisk omrörare och en magnetisk omrörare.
- Generering av transgena grodyngel genom naturlig parning från Tg(rho:GFP-NTR) -linjen
OBS: Eftersom transgena hanar representerar en värdefull stam föredrar vi att generera embryon via naturlig parning för att inte offra hanen och att använda den upprepade gånger.- Administrering av hormoner
- Injicera 600 IE humant koriongonadotropinhormon (hCG) med 25G nålar i rygglymfsäcken hos Xenopus laevis vildtypshonor. Injicera transgena män med 100-200 IE hCG i den dorsala lymfsäcken. För liveövervakning av stavdegeneration (steg 2.4), använd albino Xenopus snarare än pigmenterade, för att bättre visualisera fluorescensvariationer över ögat hos de genererade transgena grodynglen.
OBS: Xenopus-honor kan förberedas med 50 IE av hCG 1 till 7 dagar före planerad ägglossning, men detta är valfritt.
- Injicera 600 IE humant koriongonadotropinhormon (hCG) med 25G nålar i rygglymfsäcken hos Xenopus laevis vildtypshonor. Injicera transgena män med 100-200 IE hCG i den dorsala lymfsäcken. För liveövervakning av stavdegeneration (steg 2.4), använd albino Xenopus snarare än pigmenterade, för att bättre visualisera fluorescensvariationer över ögat hos de genererade transgena grodynglen.
- Parning och äggplockning
- Omedelbart efter injektionen av hCG placeras en transgen hane av Tg(rho:GFP-NTR) tillsammans med en hona med hCG-injektion vid 20 °C i en tank fram till nästa dag. Använd en stor volym (minst 10 L) och lägg till små föremål som äggen ska fästa vid, så att äggen inte skadas av de vuxnas rörelser. Nästa dag, när grodorna inte längre är i amplexus, tar du bort de vuxna grodorna från akvariet och samlar in embryon.
- Uppfödning av embryon och grodyngel
- Stadieembryon och grodyngel enligt den normala tabellen över Xenopus utveckling9.
- Föd upp embryon i en tank fylld med yngelodlingsvatten. Från steg 45, mata grodynglen med pulveriserad yngelmat och syresätt vattnet med en bubblare. Tillsätt vatten dagligen om det behövs för att kompensera för avdunstning och byt ut hela tankvattnet varje vecka.
OBS: Alternativt är det också möjligt att byta 50% av volymen två gånger i veckan. Ett detaljerat protokoll finns i10.
- Transgen embryosortering
- Från stadium 37/38, sortera och välj transgena embryon under ett fluorescensstereomikroskop genom att direkt visualisera GFP (Figur 1C).
- Administrering av hormoner
- Behandling av grodyngel MTZ
- Överför Tg(rho:GFP-NTR) transgena grodyngel till en tank med 10 mM MTZ-lösning och föd upp dem vid 20 °C i mörker i 1 vecka. Använd transgena syskon som fötts upp i grodyngelodlingsvatten som innehåller 0,1 % DMSO som kontroller.
- Byt MTZ och kontrolllösning varannan dag under behandlingsperioden. Mata grodynglen som vanligt under MTZ-behandlingen.
- För individuell fluorescensövervakning (steg 2.4), placera varje grodyngel i sin lilla behållare med 30 ml MTZ eller kontrolllösning från steg 2.3.1 och framåt.
OBS: MTZ-behandling kan utföras när som helst från stadium 45 och framåt.
- Övervakning i realtid av stångdegeneration
OBS: Den progressiva degenerationen av stavarna kan övervakas i realtid. Utför därför steg 2.4.1. till 2.4.4. före MTZ-behandling och därefter regelbundet efter behandlingen.- Följ steg 1.1 och 1.3 för beredning av bedövningsmedlet respektive grodyngelanestesin.
- Använd en sked för att fånga ett grodyngel och lägg det försiktigt på en våt servett i en liten petriskål (55 mm diameter). Observera GFP-fluorescensen under ett fluorescerande stereomikroskop (excitationsvåglängd = 488 nm och emissionsvåglängd = 509 nm) och ta fotografier av ögat. En minskad fluorescensintensitet återspeglar nedbrytningen av stavar.
OBS: För att göra kvantitativa jämförelser måste samma inställningar bibehållas för avbildning av alla grodyngel. - Överför grodynglen till ett stort akvarium som innehåller 1 liter odlingsvatten genom att försiktigt sänka ner petriskålen. Övervaka grodynglen tills de är helt vakna.
- Jämför fluorescensintensiteten mellan MTZ-behandlade och kontrollgrodyngelögon för att övervaka och bedöma effektiviteten av degenerationsprocessen.
3. Degeneration av stavceller genom CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout
OBS: Detta protokoll är etablerat för att generera en modell av retinitis pigmentosa i Xenopus laevis genom att inducera specifik stavcellsdegeneration med hjälp av CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout. Procentandelen insertion-deletion (indels) i F0 anges i11 och är ~75 %. En sådan CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout kan också utföras i Xenopus tropicalis grodyngel 11.
- Beredning av lösningar och reagenser
- crRNA- och tracrRNA-ordning
- Köp det syntetiska CRISPR-RNA:t (crRNA) som riktar sig mot rodopsingenen (rho) och det vanliga transaktiverande crRNA:t (tracrRNA). CrRNA består av en rho-målspecifik region (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) och en annan (GUUUUAGAGCUAUGCU) som hybridiserar till tracrRNA.
- crRNA:tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
- Återsuspendera crRNA och tracrRNA vid 100 μM i den nukleasfria duplexbufferten.
- Bered gRNA-duplexen genom att blanda 3 μl 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA och 94 μL duplexbuffert. De slutliga koncentrationerna är 36 ng/μL rho crRNA och 67 ng/μL tracrRNA.
- Glödga oligos genom att värma dem till 95 °C i 5 minuter och kyl dem långsamt till rumstemperatur. Gör alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
- CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplex (dvs. gRNA duplex/Cas9-protein)
- Vid användningstillfället, förbered blandningen av rho gRNA-duplex och Cas9-proteinet. Tillsätt 10 μl av rho gRNA-duplexlösningen för 20 μl, 2 μl Cas9-protein (stam 5 mg/ml), 2 μl fluoresceinlysindextran (stam 10 mg/ml) och 6 μl RNasfritt vatten.
- För att bilda ribonukleoproteinkomplexet, inkubera i 10 minuter vid 37 °C och låt lösningen svalna till rumstemperatur.
- Blanda 2 μl Cas9-protein, 2 μl fluoresceinlysindextran och 16 μl RNasfritt vatten för 20 μl kontrolllösning.
- Beredning av 10x, 1x och 0,1x MBS-lösningar
- Bered modifierad stamlösning av koksaltlösning (10 x MBS) genom att tillsätta 11,92 g HEPES, 51,43 g natriumklorid (NaCl), 0,75 g kaliumklorid (KCl), 2,1 g natriumbikarbonat (NaHCO3) och 2,46 g magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4, 7 H2O) i 800 ml typ II-vatten. Justera pH-värdet till 7,8 med 30 % natriumhydroxid (NaOH). Tillsätt typ II-vatten tills volymen är 1 L och sterilisera genom autoklavering. Förvaras i rumstemperatur.
- Bered 1 l 1 x MBS-lösning genom att späda 100 ml 10 x MBS saltlösning och 7 ml 0,1 M kalciumkloriddihydrat (CaCl 2, 2H2O) i typ II-vatten. Förvaras i rumstemperatur.
- Bered 0,1 x MBS lösning genom att späda 1 x MBS lösning i typ II-vatten. Förvaras i rumstemperatur.
- Bensokainlösning för vuxna
- Bered 0,05 % bensokainlösning genom att tillsätta 5 ml 10 % stamlösning av bensokain (se steg 1.1.1) till 1 l yngelodlingsvatten. Blanda väl.
OBS: Förvara denna lösning i flera månader vid 4 °C skyddad från ljus med aluminiumfolie. Värm lösningen till rumstemperatur innan den används på djur.
- Bered 0,05 % bensokainlösning genom att tillsätta 5 ml 10 % stamlösning av bensokain (se steg 1.1.1) till 1 l yngelodlingsvatten. Blanda väl.
- L-cystein lösning
- Bered avgeleringslösningen vid användningstillfället genom att tillsätta 2 g L-cysteinsaltmonohydrat till 100 ml 0,1 x MBS-lösning. Justera pH-värdet till 7,8 med 30 % NaOH.
- Lösning av polysackaros
- Bered den täta polysackaroslösningen genom att tillsätta 3 g polysackaros till 100 ml 0,1 x MBS lösning. Förvara denna lösning i några veckor vid 4 °C.
- crRNA- och tracrRNA-ordning
- Provrörsbefruktning och avgelering
OBS: Mer information om Xenopus provrörsbefruktning finns i ett detaljerat dedikerat protokoll i12.- Hormonadministrering till hondjur av Xenopus laevis för att framkalla ägglossning
- Cirka 15 timmar före ägguttagningen injiceras 600 IE hCG i honans dorsala lymfsäck och hålls över natten vid 18 °C.
- Dissektion av testiklarna
- Avliva Xenopus-hanen med en dödlig dos på 0,05 % bensokainlösning i 10-15 minuter. Som en kompletterande avlivningsmetod, skär av ryggraden omedelbart bakom skallen med en vass och robust sax. Öppna bukhålan med en dissektionssax, klipp ut testiklarna och klipp bort eventuellt fett och kapillärer. Lägg varje testikel omedelbart på is i 1 ml 1x MBS.
- Förberedelse av spermier
- Krossa en testiklar med en mortelstöt för mikrocentrifugrör och späd suspensionen i ett 15 ml rör som innehåller 9 ml 1x MBS. Tillsätt 10 μg/ml gentamicin i det andra testikelröret och håll det vid 4 °C i några dagar för ytterligare befruktningsförsök.
- Provrörsbefruktning
- Massera försiktigt ryggen på den hormoninjicerade honan och samla upp äggcellerna i en petriskål (100 mm i diameter). Sprid några droppar av spermielösningen till äggcellerna. Vänta 5 minuter och täck dem med 0,1x MBS. Vänta 10 minuter innan du fortsätter med avgelé.
- Befruktade ägg avgelé
- Byt ut 0,1x MBS-lösningen mot avgeleringslösningen för att ta bort geléhöljet från de befruktade äggen (~5 min). Skölj embryona noggrant 5-6 gånger med 0,1 x MBS och överför dem till en ny 100 mm petriskål fylld med 0,1 x MBS.
- Hormonadministrering till hondjur av Xenopus laevis för att framkalla ägglossning
- Förberedelse av mikroinjektionssystemet
- Vässa glaskapillärer med en mikropipettavdragare13.
- Fyll en vässad kapillär med 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplex eller kontrolllösningen med hjälp av en mikroladdarespets och placera kapillären i mikroinjektorhanteraren.
- Vid den högsta förstoringen av ett stereomikroskop, bryt av kapillärspetsen med en fin pincett och justera injektionstiden (~400 ms) för att erhålla en ejektionsvolym på 10 nL per puls. Ställ in utstötningstrycket på cirka 40 PSI.
- Embryomikroinjektion i encellsstadiet med ribonukleoproteinkomplexet CRISPR-Cas9
- Placera embryon från encellsstadiet på ett galler (1 mm nylonvävnad) limmat i en 100 mm petriskål fylld med 3 % polysackaroslösning (figur 1D).
- Injicera med hjälp av mikroinjektorn och under ett stereomikroskop 10 nL av ribonukleoproteinkomplexet CRISPR-Cas9 (vilket motsvarar 500 pg gRNA-duplex + 5 ng Cas9-protein per embryo) eller kontrolllösning i nivå med djurpolen, i kortikala regionen, precis under cytoplasmamembranet.
OBS: Fluoresceinlysindextranet i lösningen möjliggör efterföljande sortering av de injicerade embryona. - Överför de injicerade embryona till en ny 100 mm petriskål som innehåller en ren polysackaroslösning och placera dem vid 21 °C.
- Den första dagen sorterar du regelbundet ut de välutvecklade embryona och ersätter polysackaroslösningen med 0,1 x MBS cirka 5 timmar efter mikroinjektionen.
- Vänta 24 timmar efter injektionen för att sortera och välja ut välinjicerade rho-krispiga embryon under ett fluorescerande stereomikroskop genom att visualisera fluoresceinlysindextran (figur 1E).
OBS: Ju tidigare mikroinjektion efter befruktning, desto effektivare är knockouten.
- Uppfödning av embryon och grodyngel
- Odla rho krispiga embryon i 0,1 x MBS i petriskålar fram till steg 37/38. Ta bort döda embryon dagligen och byt 0,1x MBS-lösningen. Från steg 37/38 föds embryon upp i en tank fylld med yngeluppfödningsvatten och från steg 45 fortsätter du som i steg 2.2.3.
4. Degeneration av näthinneceller genom cytotoxiska intraokulära CoCl 2-injektioner
OBS: Detta protokoll är etablerat för att inducera degeneration av näthinneceller genom intraokulära injektioner av koboltklorid (CoCl2) i Xenopus laevis grodyngel. Beroende på dosen kan det utlösa en konspecifik degeneration eller en bredare degeneration14. Vi använder detta protokoll på Xenopus laevis grodyngel från stadium 48 och framåt. Den kan också användas i grodyngel av släktet Xenopus tropicalis .
- Beredning av buffert och reagenser
- Bered 0,005 % bensokainlösning vid användningstillfället enligt steg 1.1.
- Bered 100 mM CoCl2 stamlösning genom att tillsätta 118,5 mg till 5 ml 0,1 x MBS (se steg 3.1.4 för att bereda 0,1 x MBS). Förvara denna stamlösning i flera månader vid 4 °C, skyddad från ljus med aluminiumfolie.
VARNING: CoCl2 är klassificerad som en giftig förening för människor och djur. Följ noga instruktionerna för hantering, förvaring och avfallshantering på säkerhetsdatabladet. - För konspecifik degeneration, bereda en 10 mM CoCl2-lösning vid användningstillfället från 100 mM stamlösningen utspädd i 0,1 x MBS. För bredare degeneration av näthinneceller, förbered en 25 mM CoCl2-lösning .
- Förberedelse av injektionssystemet
- Vässa glaskapillärer med en mikropipettavdragare 13.
- Fyll en vässad kapillär med 2-10 μL 10 eller 25 mM CoCl2-lösning eller kontrolllösningen (0,1 x MBS) med hjälp av en mikroladdningsspets och placera kapillären i mikroinjektorhanteraren.
- Vid högsta förstoring av ett stereomikroskop, bryt av kapillärspetsen med en fin pincett och justera injektionstiden (cirka 100 ms) för att erhålla en utstötningsvolym på 15-40 nL per puls. Ställ in utkastningstrycket på ~40 PSI.
OBS: Droppens storlek bör anpassas till grodynglens stadium och storleken på deras öga. Till exempel, vid steg 48-49, är droppstorleken ~15-20 nL, medan den är 30-40 nL vid steg 52-56. Visuellt är storleken på droppen lite större än linsstorleken.
- CoCl2 intraokulära injektioner
- Använd en håv för att fånga grodyngel i deras akvarier. Överför dem till 50 ml 0,005 % bensokainlösning. Vänta några minuter tills grodynglen slutar reagera på stimuli.
OBS: Flera grodyngel kan sövas samtidigt, men tiden i narkosen bör vara mindre än 30 min. - Använd en sked för att fånga ett grodyngel och lägg det försiktigt i en liten petriskål (55 mm diameter) som innehåller en våt servett. Placera grodyngelns ryggsida uppåt i mitten av petriskålen (Figur 1F,G).
- Använd mikroinjektorn under ett stereomikroskop för att injicera CoCl2-lösningen intraokulärt. För försiktigt in kapillären i ögat över linsen. När kapillärspetsen är inne i ögat, spruta ut två droppar per öga. Efter injektion av höger öga, vrid petriskålen manuellt 180° för att injicera vänster öga.
Se till att injektionen görs inuti ögat, så en lätt svullnad av ögat måste ses efter varje utstötning av lösningen. Grodyngel bör hålla sig utanför vattnet så lite som möjligt. Injektionen i båda ögonen bör ta mindre än 1 minut. - Överför grodynglet till ett stort akvarium som innehåller 1 liter odlingsvatten genom att försiktigt sänka ner det i petriskålen (Figur 1H). Övervaka grodynglen tills de är helt vakna.
- Använd en håv för att fånga grodyngel i deras akvarier. Överför dem till 50 ml 0,005 % bensokainlösning. Vänta några minuter tills grodynglen slutar reagera på stimuli.
5. Färgning för att bedöma näthinneskada eller näthinnedegeneration
- Grodyngelfixering och uttorkning
- Bered 4 % paraformaldehydlösning (PFA) genom att späda 100 ml 32 % PFA-lösning till 700 ml 1x PBS. Justera pH-värdet till 7,4 med NaOH. Avlägsna stamlösningen och förvara den i flera månader vid -20 °C.
- Avliva ynglen i 0,01 % bensokain och överför dem till en injektionsflaska innehållande 4 % PFA i 2 timmar vid rumstemperatur med omrörning eller över natten vid 4 °C. Skölj 3 x 5 min i 1x PBS.
- Torka gradvis grodyngel genom successiva 30 minuters inkubationer i 70 % och 95 % etanol (utspädd i typ II-vatten), följt av ytterligare tre 1 timmes inkubation i 100 % etanol. Förvara grodyngelhuvudena vid detta steg vid -20 °C eller överför dem direkt till 100 % butanol över natten för ytterligare steg.
- Sektionering av paraffin
- Ersätt 100 % butanol med smält paraffin i 2 timmar vid 62 °C. Byt ut paraffinet för ytterligare 2 x 2 timmars inkubation vid 62 °C.
- Överför grodyngelhuvuden i engångsformar för paraffininbäddning och orientera dem så att deras ögon är väl inriktade och låt sedan paraffinet härda. Förvara blocken i rumstemperatur.
- Klipp bort överflödigt paraffin och montera blocket med grodyngeln eller grodynglen på mikrotomstödet.
- Sektionera blocket med en mikrotom med lämplig tjocklek (10-12 μm). Överför banden med sektioner på ett objektglas som tidigare täckts med 3 % glycerinalbumin (utspätt i vatten).
- Placera objektglaset på en glasvärmare vid 42 °C i några minuter och ta sedan bort överskottet av glycerinalbumin. Låt objektglasen torka över natten i ugn på 37 °C.
- Avvaxa genom att sänka ner objektglasen i 2 x 15 minuter i en Coplin-burk fylld med 100 % xylen. Rehydrera sektionerna med graderad etanolserie: 100 % två gånger, 70 %, 50 % (utspädd i typ II-vatten), ~5 min vardera, följt av 2 x 5 min i vatten.
- Märkning av immunofluorescens
- Bered 100 mM stamlösning av natriumcitrat (CiNa) genom att tillsätta 29,4 g natriumcitrattrinatriumsaltdihydrat (C6H5Na3O7, 2H2O) till 1 l typ II-vatten. justera pH till 6 med saltsyra (HCl). Sterilisera genom autoklav och förvara i rumstemperatur i flera månader. Bered demaskeringslösningen vid användningstillfället genom att tillsätta 25 ml 100 mM stamlösning av CiNa till 225 ml vatten av typ II. Tillsätt 125 μl interpolering-20 och blanda väl (slutkoncentrationen är 10 mM CiNa, 0,05 % Tween-20).
- Bered stamlösningen Hoechst med 10 mg/ml genom att tillsätta 100 mg bisBenzimide H 33258 till 10 ml vatten av typ I. Förvara denna stamlösning i flera månader vid 4 °C, skyddad från ljus med en aluminiumfolie. Bered Hoechst-lösning vid 7,5 μg/ml genom att tillsätta 300 μl Hoechst-stamlösning till 400 ml 1x PBS.
OBS: Denna lösning kan användas upp till 10 gånger och förvaras i cirka 6 månader vid 4 °C, skyddad från ljus med aluminiumfolie. - Efter avvaxning av sektioner, utför antigenuttag genom att koka sektionerna i demaskeringslösningen i 9 min. Låt lösningen svalna i 20 min.
- Skölj en gång i typ II-vatten och en gång i 1x PBS. Lägg objektglasen plant i en fuktig kammare och tillsätt 400–600 μL blockerande lösning per objektglas (antikroppsspädningsvätska + 0,2 % Triton X100) i 30 minuter.
- Ersätt den blockerande lösningen med 200 μl per utspädd primärantikroppsutspädd i den blockerande lösningen. Använd ett täckglas för att sprida lösningen över sektionerna och undvik bubbelbildning. Inkubera över natten vid 4 °C i fuktig kammare.
- Överför objektglasen till en Coplin-burk och skölj i 3 x 10 minuter i 1x PBS kompletterat med 0,1 % Triton X100. Lägg objektglasen platt, tillsätt 400 μl per objektglas av den sekundära antikroppen utspädd i blockerande lösning och låt stå i 2 timmar i rumstemperatur i en fuktig kammare.
- Överför objektglasen till en Coplin-burk och skölj i 3 x 5 minuter med 1x PBS kompletterat med 0,1 % Triton X100.
- Motfärga cellkärnorna med Hoechst-lösningen i 10 minuter och skölj 3 x 5 minuter med 1 x PBS.
- Placera täckglas över objektglas i ett vattenhaltigt monteringsmedium som är speciellt utformat för att bevara fluorescens. Låt objektglasen torka i 1 timme i rumstemperatur och förvara dem vid 4 °C.
- Avbilda objektglasen med ett fluorescensmikroskop.
- Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) för att bedöma näthinneskador
OBS: Istället för att märka en viss celltyp genom immunfärgning kan allmän retinal histologi bedömas med H&E-färgning.- Efter avvaxningssektioner, utför nukleinsyramärkning genom att sänka ner objektglasen i hematoxylinlösning i 2 min. Skölj väl med kranvatten.
- Utför cytoplasmamärkning genom att sänka ner objektglasen i 1 % eosinlösning i 1 min. Skölj snabbt med vatten.
OBS: Eosin är mycket lösligt; Om objektglasen lämnas för länge i vattnet försvinner all färg. - Skölj 2 x 5 min i 100% etanol och 2 x 5 min i xylen.
- Under huven, placera täckglas över objektglasen i 4-5 droppar av ett monteringsmedium. Låt objektglasen torka under en huva och avbilda nästa dag med ett mikroskop.
- Detektion av apoptotiska celler
- Efter avvaxning (se avsnitt 5.2.6), följ kittillverkarens protokoll för att detektera apoptotisk DNA-fragmentering.
- Utför kärnfärgning genom att sänka ner objektglasen i Hoechst-lösning (se avsnitt 5.3.8) och montera med ett vattenhaltigt monteringsmedium som är särskilt utformat för att bevara fluorescensen. Låt objektglasen torka i 1 timme i rumstemperatur och förvara dem vid 4 °C.
- Avbilda objektglasen med ett fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk näthinneskada
Näthinnesnitt av grodyngel som utsatts för den mekaniska skada som beskrivs i protokollavsnitt 1 visar att näthinneskadan omfattar alla lager av vävnaden samtidigt som den är begränsad till punktionsstället (Figur 2A,B).
Villkorlig stavcellsablation med NTR-MTZ-systemet
Ögonen hos sövda Tg(rho:GFP-NTR) transgena grodyngel behandlade med MTZ-behandling, som beskrivs i protokollavsnitt 2, analyserades i stereomikroskop (Figur 3A,B). Minskningen av GFP-fluorescens avslöjar den progressiva riktade stavcellsablationen jämfört med kontrollerna (Figur 3B), bekräftad på näthinnesnitt genom GFP-immunfärgning, som beskrivs i protokollavsnitt 5 (Figur 3C).
Rodcellsdegeneration genom CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout
Näthinnor från rho crispant grodyngel, erhållna enligt beskrivningen i protokollavsnitt 3, analyserades enligt beskrivningen i protokollavsnitt 5 (Figur 4A). Märkning av kaspas 3 och rodopsin visar att vissa stavar genomgår apoptos (figur 4B). H&E-färgning avslöjar ett globalt bevarande av kärnlagren men en kraftig förkortning av fotoreceptorernas yttre segment (Figur 4C). Ytterligare immunfärgningsanalys med fotoreceptormarkörer visar degeneration av stavar och efterföljande tappdefekter (Figur 4D visas inte). Fenotypen börjar vara synlig från steg 40 och framåt, och de yttre segmenten av stavar försvinner gradvis tills de saknas från den centrala näthinnan från steg 47.
Degeneration av näthinneceller genom cytotoxiska intraokulära CoCl 2-injektioner
Näthinnor från grodyngel som utsatts för intraokulära CoCl 2-injektioner, enligt beskrivningen i protokollavsnitt 4, analyserades genom immunfärgning och TUNEL-analys, enligt beskrivningen i protokollavsnitt 5 (figur 5A). Detta visar att 10 mM CoCl2-injektion leder till specifik celldöd av tappfotoreceptorer (Figur 5B,C) medan 25 mM leder till bred celldöd i näthinnan (Figur 5E). Immunfärgningsanalys, som beskrivs i protokollavsnitt 5, avslöjade vidare frånvaron av tappar i 10 mM CoCl 2-injicerade näthinnor (Figur 5D) och en allvarlig förlust av både bipolära celler och fotoreceptorer efter 25 mM CoCl2-injektioner (Figur 5F).
Figur 1: Illustrationer av några experimentella procedurer. (A) En tapp med en diameter på 0,2 mm som är fäst vid en stifthållare används för att punktera näthinnan. Diagrammen över grodyngelns dorsala, laterala och frontala vyer illustrerar var stiftet (i rött) sätts in. (B) Schematisk representation av den transgena modellen för betingad stavcellsablation. Rodopsinpromotorn driver uttrycket av ett GFP-nitroreduktasfusionsprotein i stavceller. När NTR tillsätts till Xenopus odlingsvatten omvandlar det metronidazol till ett cytotoxin, vilket specifikt möjliggör GFP-NTR-stavar. (C ) Huvudet på ett transgent grodyngel av typen Tg(rho:GFP-NTR) visas i vitt ljus eller fluorescens. GFP-färgningen i ögat gör det möjligt att sortera transgena grodyngel. D) Embryon på encelligt stadium på ett nylongaller i stereomikroskop redo att injiceras med ett Picospritzer-mikroinjektionssystem. E ) Embryon i neurulastadiet (schematiskt i insatsen) efter injektion i encellsstadiet av CRISPR-Cas9-ribonukleoproteinkomplexet som innehåller fluoresceinlysindextran. Väl injicerade fluorescerande embryon (gröna pilar) kan skiljas från oinjicerade (vita pilar). (F) Bild som visar skeden som användes för att förflytta de sövda grodynglen. (G) Nedsövda grodyngel i en petriskål över en våt vävnad. Kapillären som sätts in i mikroinjektorn möjliggör intraokulära injektioner av CoCl2-lösningen . H) Bild som visar hur ett grodyngel överförs till ett 1 liters akvarium där djuret kan övervakas tills det vaknar. Skalstreck = 2 mm (C), 1 mm (E). Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; NTR = nitroreduktas, MTZ = metronidazol; NF = Nieuwkoop och Faber stage. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mekanisk näthinneskada. A) Översikt över det försöksförfarande som används i punkt B. Xenopus laevis grodyngelögon punkteras och analyseras på näthinnan 7 dagar efter skadan. Den prickade rutan anger det avbildade området. (B) Cellkärnor motfärgas med Hoechst. Tre olika näthinnor visas. Pilarna pekar på det skadade området som korsar alla näthinnelager. Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; GCL = gangliecellskikt; INL = inre kärnskiktet, ONL = yttre kärnskiktet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Villkorlig stavcellsablation med NTR-MTZ-systemet. A) Beskrivning av det försöksförfarande som används i B, C. Tg(rho:GFP-NTR) transgena Xenopus laevis grodyngel behandlas med MTZ i 7-9 dagar. Den progressiva degenerationen av de GFP-märkta stavarna kan övervakas i realtid under ett fluorescensstereomikroskop som illustreras vid 7 dagar i (B). Stavcellsdöd kan också analyseras på näthinnesnitt som illustreras efter 14 dagar i (C), den prickade rutan anger det avbildade området. (B) Efter 7 dagars behandling minskar GFP-intensiteten i näthinnan med tiden hos transgena MTZ-behandlade grodyngel jämfört med kontroller. (C) Minskningen av GFP-fluorescens bekräftas på näthinnesnitt efter 14 dagar genom GFP-immunfärgning. Cellkärnorna motfärgas i blått med Hoechst. Skalstreck = 500 μm (B), 50 μm (C). Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; NTR = nitroreduktas, MTZ = metronidazol; L = lins; R = näthinnan; GCL = gangliecellskikt; INL = inre kärnskiktet, ONL = yttre kärnskikt; OS = yttre segment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Stavdegeneration i Xenopus laevis rho-krisgningsmedel. A) En översikt över det försöksförfarande som används i punkterna B-D. Embryon i encellsstadiet injiceras med ribonukleoproteinkomplexet CRISPR-Cas9 (gRNA duplex/Cas9-protein) som innehåller fluorescerande lysindextran. I neurulastadiet kan fluorescerande injicerade embryon sorteras och tillåtas utvecklas fram till olika stadier för att utföra (B) klyvning av Caspase 3-immunfärgning för celldödsanalys, eller (C) hematoxylin- och eosinfärgning för anatomisk analys, eller (D) immunfärgning med stavmarkörer för analys av fotoreceptorcelldegeneration. Den prickade rutan anger det avbildade området. (B) Dubbel märkning av klyvt Caspase 3 (en markör för apoptotiska celler) och Rhodopsin (en markör för stavens yttre segment) på näthinnesektioner av kontroll- eller rho-crispants Xenopus laevis-embryon i stadium 39 visar en frånvaro av döende celler i kontrollerna och att döende celler i rho-crispants är stavfotoreceptorer. (C) H&E-färgning på näthinnesnitt av rho-krispiga Xenopus laevis-grodyngel i stadium 48 avslöjar den minskade storleken på fotoreceptorernas yttre segment jämfört med kontrollerna. (D) Recoverin (en markör för stavens inre segment) och Rhodopsin co-immunofärgning på näthinnans snitt av rho-crispant Xenopus laevis grodyngel i stadium 48 avslöjar en allvarlig degeneration jämfört med kontroller. Cellkärnorna motfärgas i blått med Hoechst. Skalstaplar = 50 μm. Förkortningar: gRNA = guide-RNA; H&E = hematoxylin och eosin; GCL = gangliecellskikt; INL = inre kärnskiktet, ONL = yttre kärnskikt; OS = yttre segment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Degeneration av näthinneceller genom cytotoxiska intraokulära CoCl 2-injektioner. A) Översikt över det experimentella förfarande som används i (B-F). Den prickade rutan anger det avbildade området. En lösning av 10 mM eller 25 mM CoCl2 injiceras intraokulärt i grodyngelögat. Cellapoptos analyseras med en TUNEL-analys 2 dagar efter skada (dpi) (B,C,E), medan retinal celldegeneration analyseras 7 till 14 dpi genom immunfärgning med olika markörer (D,F). (B-D) Näthinnesnitt av grodyngel injicerade med en saltlösning (Controls) eller med en 10 mM CoCl2-lösning i steg 51-54. (B) Celldödsanalys vid 2 dpi avslöjar närvaron av döende celler efter CoCl2-injektion huvudsakligen i fotoreceptorns kärnskikt. (C) Koppling av celldödsfärgning med S/M Opsin (en markör för tappar) immunfärgning avslöjar att dessa döende celler huvudsakligen är tappar; Pilar pekar på dubbelmärkta celler. (D) S/M Opsin (en markör för tappar) och Rhodopsin (en markör för stavar) co-immunfärgning visar en allvarlig minskning av tappcellsmärkning i CoCl 2-injicerade näthinnor jämfört med kontroller vid 14 dpi. (E,F) Näthinnesnitt av grodyngel injiceras med en 25 mM CoCl2-lösning i steg 51-54. (E) Celldödsanalys vid 2 dpi avslöjar närvaron av döende celler i både fotoreceptorn och de inre kärnlagren. (F) Otx2 (en markör för både fotoreceptorer och bipolära celler) immunfärgning visar en kraftig minskning av färgningen i båda skikten i CoCl 2-injicerade näthinnor jämfört med kontroller vid 7 dpi, vilket indikerar CoCl2-inducerad celldöd av både fotoreceptorer och bipolära celler. Cellkärnorna motfärgas i blått med Hoechst. Skalstaplar: 25 μm. Förkortningar: ONL = Outer Nuclear Layer; INL = Inre kärnskiktet; GCL = Ganglion Cell Layer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För- och nackdelar med olika paradigm för näthinneskador hos Xenopus grodyngel
Mekanisk näthinneskada
Olika kirurgiska skador på näthinnan har utvecklats hos Xenopus grodyngel. Näthinnan kan antingen avlägsnas helt15,16 eller endast delvis avlägsnas16,17. Den mekaniska skadan som presenteras här innebär inte någon näthinneexcision utan en enkel ögonpunktion som vi tidigare utvecklat hos Xenopus grodyngel6. Med tanke på det manuella förfarandet för en sådan mekanisk näthinneskademodell kan fenotypen variera avsevärt från ett grodyngel till ett annat. Dessutom kan reproducerbarheten och skadans omfattning också variera beroende på vem som utför experimentet. Vi rekommenderar därför att samma person utför alla skadeprocedurer.
Villkorlig stavcellsablation med NTR-MTZ-systemet
NTR-MTZ-systemet har använts för att avlägsna stavceller i den transgena Xenopus retina 6,7,8,18. Behandlingstiden för MTZ varierar avsevärt från en studie till en annan, från 2 till 7 dagar. Detta kan återspegla olika aktiviteter hos NTR beroende på kromosominfogningen i de olika transgena linjerna. Dessutom märkte vi en viss variation i responsen hos Tg(rho:GFP-NTR) grodyngel under en given tid av MTZ-behandling, där vissa upplevde allvarlig stavdegeneration medan andra uppvisade mycket liten skada. Att förlänga MTZ-behandlingen från 7 till 9-10 dagar med denna transgena linje verkar minska denna variabilitet. Försiktighet bör dock iakttas med tanke på de potentiellt toxiska effekterna av MTZ. De uppenbara fördelarna med denna modell är att den möjliggör villkorlig och reversibel stavcellsablation och för liveövervakning av stavdegeneration.
Rodcellsdegeneration genom CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout
CRISPR-Cas9 rho-genredigeringsmodellen för retinitis pigmentosa leder till degeneration av stavceller i Xenopus grodyngel11. Till skillnad från NTR-MTZ-modellen är dock stavcellsablation konstitutiv och inte reversibel. Intressant nog gör den höga effektiviteten i detta tillvägagångssätt (vi får nu regelbundet >90 % av grodyngel som uppvisar allvarlig stavdegeneration) att arbeta med denna modell på F0-generationen. Vi arbetade initialt med sgRNA men märkte variabilitet från olika batcher av RNA-preparat. Vi fann nyligen att beställning av syntetiskt crRNA och tracrRNA och framställning av gRNA-duplex enligt beskrivningen i detta protokoll ger mer tillförlitliga resultat.
Degeneration av näthinneceller genom cytotoxiska intraokulära CoCl 2-injektioner
Denna modell har flera fördelar jämfört med de andra modellerna som beskrivs här. Det gör det inte bara möjligt att inducera ablation av näthinnecelltyper villkorligt utan också att modulera skadans svårighetsgrad14. Dessutom representerar den så vitt vi vet den enda modellen för specifik tappdegeneration hos Xenopus. Slutligen genererar det låg variabilitet i den degenerativa fenotypen.
Effekten av de fyra paradigmen för näthinneskador
För att ta hänsyn till den potentiella variationen av fenotyper från en omgång grodyngel till en annan, rekommenderas det att kontrollera effekten av retinal degeneration på 8-10 grodyngel. Vid mekanisk skada måste skadan analyseras dagarna efter skadan, eftersom skadan inte längre är synlig en vecka senare. I NTR-MTZ-modellen är stavdegenerationen tydligt synlig 1 vecka efter avslutad MTZ-behandling. För rho-krispmedel, eftersom stavcellsdöden börjar när fotoreceptorerna differentieras helt, rekommenderar vi att man analyserar degenerativ effektivitet från steg 45 och framåt. I CoCl2-modellen sker celldöd inom en vecka efter injektionen. När det gäller den förväntade procentuella överlevnaden för varje metod vill vi notera att injektioner av CRISPR-Cas9-ribonukleoproteinkomplex leder till högre dödlighet under de första 48 timmarna än konventionella RNA-injektioner (inga tillväxt- eller överlevnadsproblem kvarstår efter dessa första 48 timmar), och därför bör fler embryon injiceras vid behov. Däremot utgör andra procedurer (mekaniska skador, MTZ-behandling eller intraokulära CoCl2-injektioner) inga överlevnadsproblem.
Potentiella tillämpningar av dessa skadeparadigm för att studera retinal regenerering
En potentiell tillämpning av denna serie av modeller för näthinneskador är studiet av retinal regeneration. Olika källor till näthinnestam eller stamliknande celler kan rekryteras i ett patologiskt sammanhang, inklusive CMZ-celler, Müller-gliaceller och RPE-celler. Vi har rapporterat att den mekaniska skademodellen, NRT/MTZ-modellen och CRISPR/Cas9-modellen alla är attraktiva modeller för att studera Müller-cellaktivering vid skada 6,11. Intressant nog kan alla tre cellulära källor rekryterasi CoCl2-modellen, vilket ger en ny modell för att studera mekanismerna bakom rekrytering och omprogrammering av olika näthinnecelltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag till MP från Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) och UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) i samarbete med ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
