Summary
我们已经开发了几种方案来诱导 非洲爪 蟾蝌蚪的视网膜损伤或视网膜变性。这些模型为研究视网膜再生机制提供了可能性。
Abstract
视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在正在探索的众多治疗策略中，刺激自我修复最近显得特别有吸引力。Müller神经胶质细胞是视网膜修复的一个感兴趣的细胞来源，它具有干细胞的潜力和非凡的再生能力。然而，这种潜力在哺乳动物中非常有限。在具有再生能力的动物模型中研究视网膜再生的分子机制应该有助于了解如何释放哺乳动物Müller细胞再生视网膜的潜在能力。这是再生医学治疗策略发展的关键一步。为此，我们在 非洲爪蟾中开发了几种视网膜损伤范式：机械性视网膜损伤、允许硝基还原酶介导的光感受器条件消融的转基因系、基于 CRISPR/Cas9 介导的视紫 红质 敲除的视网膜色素变性模型，以及由眼内注射 CoCl2 驱动的细胞毒性模型。为了强调它们的优点和缺点，我们在这里描述了这一系列的方案，这些方案会产生各种退行性条件，并允许研究 非洲爪蟾的视网膜再生。
Introduction
全世界有数百万人患有各种导致失明的视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性 （AMD）。迄今为止，这些疾病在很大程度上仍然无法治愈。目前正在评估的治疗方法包括基因治疗、细胞或组织移植、神经保护治疗、光遗传学和假肢装置。另一种新兴策略是基于通过激活具有干细胞潜力的内源性细胞进行自我再生。Müller 神经胶质细胞是视网膜的主要神经胶质细胞类型，是在这种情况下感兴趣的细胞来源之一。受伤后，它们可以去分化、增殖并产生神经元 1,2,3。虽然这个过程在斑马鱼或非洲爪蟾中非常有效，但在哺乳动物中却在很大程度上是低效的。
尽管如此，已经表明，用有丝分裂蛋白进行适当的治疗或各种因子的过表达可以诱导哺乳动物 Müller 神经胶质细胞周期重新进入，并且在某些情况下，触发其随后的神经发生承诺 1,2,3,4,5。然而，这在很大程度上仍不足以进行治疗。因此，增加我们对再生分子机制的了解对于确定能够有效地将Müller干细胞样特性转化为新的细胞治疗策略的分子是必要的。
为此，我们在 非洲爪蟾 中开发了几种触发视网膜细胞变性的损伤范式。在这里，我们提出了 （1） 非细胞类型特异性的机械性视网膜损伤，（2） 使用靶向杆细胞的 NTR-MTZ 系统的条件性和可逆细胞消融模型，（3） CRISPR/Cas9 介导的视 紫红质 敲除，触发进行性杆细胞变性的视网膜色素变性模型， 以及 （4） CoCl2诱导的细胞毒性模型，根据剂量可以特异性靶向视锥细胞或导致更广泛的视网膜细胞变性。我们强调每种范式的特殊性、优点和缺点。
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Protocol
动物护理和实验是根据机构许可A91272108根据机构准则进行的。该研究方案已获得机构动物护理委员会 CEEA #59 的批准，并获得了 Direction Départementale de la Protection des Populations 的授权，参考编号为 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 和 APAFIS #21474-2019071210549691 v2。有关这些方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。
1.机械性视网膜损伤
注意：这里描述的损伤范式方案包括从第 45 阶段开始对蝌蚪进行机械性视网膜穿刺。因此，它不针对任何特定的视网膜细胞类型，但会破坏穿刺部位视网膜的整个厚度。
- 制备蝌蚪麻醉剂
- 制备10%苯佐卡因储备溶液。总体积为 10 mL，加入 1 g 苯佐卡因、2 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 和 8 mL 丙二醇。将储备溶液在4°C下保存数月，用铝箔避光保护。
- 使用时，通过向50mL蝌蚪饲养水（过滤和脱氯的自来水）中加入25μL的10%苯佐卡因储备溶液来制备0.005%苯佐卡因溶液。搅拌均匀。
注意：苯佐卡因的浓度特别低，因为与成人相比，蝌蚪对麻醉高度敏感。
- 引脚准备
- 将直径为0.2mm的无菌销连接到灭菌销架上（图1A）。
- 蝌蚪麻醉
- 使用蘸网捕捉水箱中的蝌蚪。将它们转移到含有0.005%苯佐卡因溶液的新罐中。等待几分钟，直到蝌蚪停止对刺激做出反应（敲击水箱或直接接触）。
注意：可以同时麻醉几个蝌蚪，但在麻醉液中花费的时间应少于 30 分钟。
- 使用蘸网捕捉水箱中的蝌蚪。将它们转移到含有0.005%苯佐卡因溶液的新罐中。等待几分钟，直到蝌蚪停止对刺激做出反应（敲击水箱或直接接触）。
- 视网膜穿刺
- 用勺子抓住一只蝌蚪，小心地把它放在一个装有湿纸巾的小培养皿（直径55毫米）上。将蝌蚪背面朝上放在培养皿的中间。
- 在立体显微镜下，通过轻轻地将针插入眼睛背面来刺穿视网膜，直到它穿过视网膜（图1A）。如果需要多次戳戳，请在不同的地方重复此过程。刺穿右眼后，将培养皿旋转 180° 以刺穿左眼。
- 小心地浸入培养皿，将病变的蝌蚪转移到装有1L饲养水的大水箱中。监视蝌蚪，直到它们完全醒来。
2. 使用NTR-MTZ系统进行条件性杆细胞消融
该协议旨在诱导非洲爪蟾Tg（rho：GFP-NTR）转基因品系6中的特定杆细胞消融，该品系可在TEFOR巴黎-萨克雷的动物技术服务处获得，该服务是法国非洲爪蟾资源中心的所在地。该化学遗传学系统利用硝基还原酶 （NTR） 酶将前药甲硝唑 （MTZ） 转化为细胞毒性 DNA 交联剂的能力，以特异性消融表达 NTR 的杆状细胞（图 1B）。之前已经发表了两种使Tg（rho：GFP-NTR）或Tg（rho：NTR）转基因动物并诱导变性的详细方案7,8。在这里，我们简单地详细介绍了视网膜变性的诱导以及如何监测体内的变性过程。
- 甲硝唑溶液的制备
- 使用时，使用磁力搅拌棒和磁力搅拌器，将1.67gMTZ粉末溶解在含有0.1%DMSO的1L蝌蚪饲养水中的深色瓶中，以制备10mM MTZ溶液。
注意： MTZ 对光敏感。完全溶解可能需要长达 10 分钟。
- 使用时，使用磁力搅拌棒和磁力搅拌器，将1.67gMTZ粉末溶解在含有0.1%DMSO的1L蝌蚪饲养水中的深色瓶中，以制备10mM MTZ溶液。
- 通过 Tg（rho：GFP-NTR） 系自然交配产生转基因蝌蚪
注意：由于转基因雄性代表珍贵的种群，我们更愿意通过自然交配产生胚胎，而不是牺牲雄性并重复使用它。- 激素给药
- 用 25G 针头将 600 IU 的人绒毛膜促性腺激素 （hCG） 注射到 非洲爪 蟾野生型雌性的背侧淋巴囊中。将含有 100-200 IU 的 hCG 的转基因男性注射到背侧淋巴囊中。对于杆变性的实时监测（步骤2.4），使用白化 非洲爪蟾 而不是色素沉着的非洲爪蟾，以更好地可视化生成的转基因蝌蚪眼睛的荧光变化。
注意： 非洲爪蟾 雌性可以在计划排卵前 1 至 7 天接种 50 IU 的 hCG，但这是可选的。
- 用 25G 针头将 600 IU 的人绒毛膜促性腺激素 （hCG） 注射到 非洲爪 蟾野生型雌性的背侧淋巴囊中。将含有 100-200 IU 的 hCG 的转基因男性注射到背侧淋巴囊中。对于杆变性的实时监测（步骤2.4），使用白化 非洲爪蟾 而不是色素沉着的非洲爪蟾，以更好地可视化生成的转基因蝌蚪眼睛的荧光变化。
- 交配和卵子收集
- hCG注射后，立即将1只 Tg（rho：GFP-NTR） 转基因雄性和1只注射hCG的雌性在20°C下放入罐中，直至第二天。使用大容量（至少 10 升）并添加小物体让卵粘附，以免卵子因成虫的运动而损坏。第二天，当青蛙不再处于 amplexus 中时，将成虫从水箱中取出并收集胚胎。
- 胚胎和蝌蚪的饲养
- 根据 非洲爪蟾 发育的正常表对胚胎和蝌蚪进行分期9.
- 在装满蝌蚪饲养水的水箱中抚养胚胎。从第 45 阶段开始，用油炸粉喂养蝌蚪，并用起泡器给水充氧。如有必要，每天加水以补偿蒸发，并每周更换整个水箱的水。
注意：或者，也可以每周两次交换 50% 的交易量。详细的协议可以在10 中找到。
- 转基因胚胎分选
- 从第37/38阶段开始，通过直接观察GFP在荧光立体显微镜下对转基因胚胎进行分类和选择（图1C）。
- 激素给药
- 蝌蚪MTZ治疗
- 将 Tg（rho：GFP-NTR） 转基因蝌蚪转移到含有10mM MTZ溶液的水箱中，并在20°C下在黑暗中饲养1周。使用在含有0.1%DMSO的蝌蚪饲养水中饲养的转基因兄弟姐妹作为对照。
- 在治疗期间每隔一天更换一次MTZ和对照溶液。在MTZ治疗期间像往常一样喂蝌蚪。
- 对于单独的荧光监测（步骤2.4），从步骤2.3.1开始，将每个蝌蚪放入装有30mL MTZ或对照溶液的小容器中。
注意：MTZ 治疗可以从第 45 阶段开始的任何时间进行。
- 杆状变性实时监测
注意： 可以实时监测棒的渐进性变性。因此，请执行步骤 2.4.1。至 2.4.4。在MTZ治疗之前，然后在治疗后定期进行。- 按照步骤 1.1 和 1.3 分别准备麻醉剂和蝌蚪麻醉剂。
- 用勺子抓住一只蝌蚪，然后小心地将其放在小培养皿（直径 55 毫米）中的湿纸巾上。在荧光立体显微镜下观察GFP荧光（激发波长= 488nm，发射波长= 509nm）并拍摄眼睛的照片。荧光强度的降低反映了视杆细胞的降解。
注意：要进行定量比较，必须保持相同的设置才能对所有蝌蚪进行成像。 - 小心地浸入培养皿，将成像的蝌蚪转移到装有 1 L 饲养水的大水箱中。监视蝌蚪，直到它们完全醒来。
- 比较MTZ处理和对照蝌蚪眼之间的荧光强度，以监测和评估退化过程的功效。
3. CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除杆细胞变性
注意：建立该方案是为了通过使用 CRISPR / Cas9 介导的视紫红质敲除诱导特定的视杆细胞变性来生成非洲爪蟾视网膜色素变性模型。F0 中插入缺失（插入缺失）的百分比在11 中提供，为 ~75%。这种 CRISPR/Cas9 介导的视紫红质敲除也可以在非洲爪蟾蝌蚪 11 中进行。
- 溶液和试剂的制备
- crRNA 和 tracrRNA 排序
- 购买靶 向视紫红质 （rho） 基因的合成 CRISPR RNA （crRNA） 和标准反式激活 crRNA （tracrRNA）。crRNA 由一个 rho 靶标特异性区域 （GCUCUGCUAAGUAAUACUGA） 和另一个与 tracrRNA 杂交的区域 （GUUUUAGAGCUAUGCU） 组成。
- crRNA：tracrRNA双链体（rho gRNA双链体）
- 在无核酸酶的双链缓冲液中以 100 μM 重悬 crRNA 和 tracrRNA。
- 通过混合 3 μL 100 μM rho crRNA、3 μL 100 μM tracrRNA 和 94 μL 双链缓冲液来制备 gRNA 双链体。最终浓度为 36 ng/μL rho crRNA 和 67 ng/μL tracrRNA。
- 通过在95°C加热5分钟来退火寡核苷酸，并缓慢冷却至室温。制成等分试样并储存在-20°C。
- CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物（即 gRNA 双链体/Cas9 蛋白）
- 使用时，准备 rho gRNA双链体和Cas9蛋白的混合物。如需 20 μL，则加入 10 μL rho gRNA 双链溶液、2 μL Cas9 蛋白（原液为 5 mg/mL）、2 μL 荧光素赖氨酸葡聚糖（原液为 10 mg/mL）和 6 μL 无 RNase 水。
- 为了形成核糖核蛋白复合物，在37°C下孵育10分钟，让溶液冷却至室温。
- 如需 20 μL 对照溶液，则混合 2 μL Cas9 蛋白、2 μL 荧光素赖氨酸葡聚糖和 16 μL 无 RNase 水。
- 制备 10x、1x 和 0.1x MBS 溶液
- 通过在 800 mL II 型水中加入 11.92 g HEPES、51.43 g 氯化钠 （NaCl）、0.75 g 氯化钾 （KCl）、2.1 g 碳酸氢钠 （NaHCO3） 和 2.46 g 七水硫酸镁 （MgSO4， 7 H2O） 来制备改良的 Barth 盐水储备溶液 （10x MBS）。用30%氢氧化钠（NaOH）将pH调节至7.8。加入II型水至体积为1L，并通过高压灭菌灭菌。在室温下储存。
- 通过在II型水中稀释100mL的10x MBS盐溶液和7mL的0.1M氯化钙二水合物（CaCl 2,2H2O）来制备1L的1x MBS溶液。在室温下储存。
- 通过在II型水中稀释1x MBS溶液来制备0.1x MBS溶液。在室温下储存。
- 成人苯佐卡因溶液
- 通过向 1 L 蝌蚪饲养水中加入 5 mL 10% 苯佐卡因储备溶液（参见步骤 1.1.1）来制备 0.05% 苯佐卡因溶液。搅拌均匀。
注意：将该溶液在4°C下保存数月，用铝箔避光。在用于动物之前，将溶液带到室温。
- 通过向 1 L 蝌蚪饲养水中加入 5 mL 10% 苯佐卡因储备溶液（参见步骤 1.1.1）来制备 0.05% 苯佐卡因溶液。搅拌均匀。
- L-半胱氨酸溶液
- 在使用时，通过将 2 g L-半胱氨酸盐酸一水合物加入 100 mL 0.1x MBS 溶液中来制备脱冻溶液。用30%NaOH调节pH至7.8。
- 聚蔗糖溶液
- 通过将 3 g 聚蔗糖加入 100 mL 0.1x MBS 溶液中来制备致密的聚蔗糖溶液。将该溶液在4°C下储存数周。
- crRNA 和 tracrRNA 排序
- 体外 受精和脱糖
注意：有关 非洲爪蟾体外 受精的更多详细信息可以在12 中的详细专用方案中找到。- 给雌性 非洲爪蟾 激素以诱导排卵
- 在卵母细胞收获前约15小时，将600IU的hCG注射到女性的背侧淋巴囊中，并在18°C下保持过夜。
- 睾丸夹层
- 用致死剂量的0.05%苯佐卡因溶液对 非洲爪蟾 雄性实施安乐死10-15分钟。作为一种补充安乐死方法，用锋利而坚固的剪刀切断颅骨后方的脊柱。用解剖剪刀打开腹腔，切掉睾丸，修剪掉任何附着的脂肪和毛细血管。将每个睾丸立即置于 1 mL 1x MBS 中的冰上。
- 精子准备
- 使用微量离心管的杵压碎一个睾丸，并在含有 9 mL 1x MBS 的 15 mL 管中稀释悬浮液。向第二个睾丸管中加入10μg/ mL庆大霉素，并在4°C下保持几天，以进行进一步的受精实验。
- 体外 受精
- 轻轻按摩注射激素的雌性背部，并将卵母细胞收集在培养皿（直径100毫米）中。将几滴精子溶液撒在卵母细胞上。等待 5 分钟并用 0.1x MBS 覆盖它们。等待 10 分钟，然后再进行脱冻。
- 受精卵脱冻
- 用脱糖溶液代替0.1x MBS溶液，以去除受精卵上的果冻涂层（~5分钟）。用0.1x MBS彻底冲洗胚胎5-6次，并将它们转移到装有0.1x MBS的新100mm培养皿中。
- 给雌性 非洲爪蟾 激素以诱导排卵
- 显微注射系统的制备
- 用微量移液器拉拔器锐化玻璃毛细管13.
- 用 2-10 μL CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物或使用微量装载器尖端的对照溶液填充锐化的毛细管，并将毛细管放入显微注射器处理程序中。
- 在体视显微镜的最高放大倍率下，用细镊子折断毛细管尖端，并调整注射时间（~400 ms）以获得每个脉冲10 nL的射出体积。将喷射压力设置为 40 PSI 左右。
- 含有CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物的单细胞期胚胎显微注射
- 将单细胞期胚胎置于网格（1mm尼龙组织）上，该网格粘合在装有3%聚蔗糖溶液的100mm培养皿中（图1D）。
- 使用显微注射器并在立体显微镜下，注射 10 nL 的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物（相当于每个胚胎 500 pg gRNA 双链体 + 5 ng Cas9 蛋白）或对照溶液在动物极水平，皮质区域，就在细胞质膜下方。
注意：溶液中所含的荧光素赖氨酸葡聚糖允许随后对注射的胚胎进行分选。 - 将注射的胚胎转移到含有干净多蔗糖溶液的新100mm培养皿中，并将它们置于21°C。
- 第一天，定期分拣发育良好的胚胎，并在显微注射后5小时左右用0.1x MBS替换聚蔗糖溶液。
- 注射后等待24小时，通过观察荧光素赖氨酸葡聚糖在荧光立体显微镜下分选和选择注射良好的 rho 脆皮胚胎（图1E）。
注意：受精后越早进行显微注射，敲除效果越好。
- 胚胎和蝌蚪的饲养
- 在培养皿中以0.1x MBS培养 rho 脆皮胚胎，直到第37/38阶段。每天去除死胚胎并更换0.1x MBS溶液。从第37/38阶段开始，在装满蝌蚪饲养水的水箱中抚养胚胎，从第45阶段开始，按照步骤2.2.3进行。
4. 细胞毒性眼内注射CoCl 2 导致视网膜细胞变性
注意：该协议旨在通过在非洲爪蟾蝌蚪中眼内注射氯化钴（CoCl2）来诱导视网膜细胞变性。根据剂量，它可以引发锥体特异性变性或更广泛的变性14。我们在从第48阶段开始的非洲爪蟾蝌蚪中使用该协议。它也可以用于非洲爪蟾热带蝌蚪。
- 缓冲液和试剂的制备
- 如步骤1.1所示，在使用时制备0.005%苯佐卡因溶液。
- 通过向 5 mL 的 0.1x MBS 中加入 118.5 mg 来制备 100 mM CoCl2 储备溶液（参见步骤 3.1.4 以制备 0.1x MBS）。将该储备溶液在4°C下保存数月，用铝箔避光保护。
注意：CoCl2 被归类为对人类和动物生命的有毒化合物。请仔细按照安全数据表上的处理、储存和废物处理说明进行操作。 - 对于锥体特异性变性，在使用时从用 0.1x MBS 稀释的 100 mM 储备溶液制备 10 mM CoCl2 溶液。对于更广泛的视网膜细胞变性，制备 25 mM CoCl2 溶液。
- 注射系统的准备
- 用微量移液器拉拔器锐化玻璃毛细管 13.
- 使用微量上样器尖端用 2-10 μL 的 10 或 25 mM CoCl2 溶液或对照溶液 （0.1x MBS） 填充锐化的毛细管，并将毛细管放入显微注射器处理器中。
- 在体视显微镜的最高放大倍率下，用细镊子折断毛细管尖端，并调整注射时间（约100ms），以获得每脉冲15-40nL的射血量。将顶出压力设置为 ~40 PSI。
注意：水滴的大小应适应蝌蚪的阶段和眼睛的大小。例如，在第 48-49 阶段，液滴大小为 ~15-20 nL，而在第 52-56 阶段为 30-40 nL。从视觉上看，水滴的大小比镜头尺寸大一点。
- CoCl2 眼内注射
- 使用蘸网捕捉水箱中的蝌蚪。将它们转移到 50 mL 0.005% 苯佐卡因溶液中。等待几分钟，直到蝌蚪停止对刺激的反应。
注意：可以同时麻醉几只蝌蚪，但麻醉时间应少于 30 分钟。 - 用勺子抓住一只蝌蚪，小心地将其放入装有湿纸巾的小培养皿（直径55毫米）中。将蝌蚪背面朝上放置在培养皿的中间（图1F，G）。
- 在立体显微镜下使用显微注射器向眼内注射 CoCl2 溶液。轻轻地将毛细管插入晶状体上方的眼睛。当毛细血管尖端在眼睛内时，每只眼睛喷出两滴。注射右眼后，手动将培养皿旋转180°以注射左眼。
注意：确保注射是在眼睛内部进行的，因此每次喷射溶液后必须看到眼睛的轻微肿胀。蝌蚪应尽可能少地留在水外。双眼注射时间应少于1分钟。 - 将注射的蝌蚪小心地浸入培养皿中，将其转移到含有1L饲养水的大水箱中（图1H）。监视蝌蚪，直到它们完全醒来。
- 使用蘸网捕捉水箱中的蝌蚪。将它们转移到 50 mL 0.005% 苯佐卡因溶液中。等待几分钟，直到蝌蚪停止对刺激的反应。
5. 染色以评估视网膜损伤或视网膜变性
- 蝌蚪固定和脱水
- 通过将 100 mL 32% PFA 溶液稀释到 700 mL 1x PBS 中来制备 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液。用NaOH调节pH至7.4。将该储备溶液分装并在-20°C下保存数月。
- 在0.01%苯佐卡因中对蝌蚪实施安乐死，并将它们转移到含有4%PFA的小瓶中2小时，在室温下搅拌或在4°C下过夜。 在 1x PBS 中冲洗 3 x 5 分钟。
- 通过在70%和95%乙醇（在II型水中稀释）中连续孵育30分钟来逐渐脱水蝌蚪，然后在100%乙醇中再孵育3次1小时。在此步骤中将蝌蚪头储存在-20°C或直接将其转移到100%丁醇中过夜以进行进一步步骤。
- 石蜡切片
- 在62°C下用熔化的石蜡代替100%丁醇2小时。 更换石蜡在62°C下额外孵育2×2小时。
- 将蝌蚪头转移到一次性石蜡包埋模具中，并调整它们的方向，使它们的眼睛对齐，然后让石蜡变硬。将块储存在室温下。
- 修剪多余的石蜡并将带有嵌入式蝌蚪的块安装在切片机支架上。
- 用适当厚度（10-12μm）的切片片切片块。将色带与先前用3%甘油白蛋白（在水中稀释）覆盖的载玻片上的部分转移。
- 将载玻片放在42°C的载玻片加热器上几分钟，然后除去过量的甘油白蛋白。让载玻片在37°C的烘箱中干燥过夜。
- 通过将载玻片浸入装有 100% 二甲苯的 Coplin 罐中 2 x 15 分钟来脱蜡。用分级乙醇系列对切片进行再水化：100%两次，70%，50%（在II型水中稀释），每次~5分钟，然后在水中2×5分钟。
- 免疫荧光标记
- 通过向 1 L II 型水加入 29.4 g 柠檬酸钠三钠盐二水合物（C6H5Na3O 7,2H2O）来制备 100 mM 柠檬酸钠 （CiNa） 储备溶液;用盐酸 （HCl） 将 pH 值调节至 6。通过高压灭菌灭菌并在室温下储存数月。在使用时，通过向 225 mL II 型水中加入 25 mL 的 100 mM CiNa 储备溶液来制备揭开面纱的溶液。加入 125 μL 吐温-20 并充分混合（终浓度为 10 mM CiNa，0.05% 吐温-20）。
- 通过将 100 mg 双苯并亚胺 H 33258 加入 10 mL I 型水中，制备 10 mg/mL 的 Hoechst 储备溶液。将该储备溶液在4°C下保存数月，并用铝箔避光。通过将 300 μL Hoechst 储备溶液加入 400 mL 1x PBS 中，制备 7.5 μg/mL 的 Hoechst 溶液。
注意：该溶液最多可使用10次，并在4°C下保存约6个月，用铝箔避光保护。 - 脱蜡切片后，通过在揭开掩蔽溶液中煮沸切片9分钟来进行抗原修复。让溶液冷却20分钟。
- 用 II 型水冲洗一次，用 1x PBS 冲洗一次。将载玻片平放在潮湿的腔室中，每张载玻片加入400-600μL封闭溶液（抗体稀释剂+ 0.2%Triton X100），持续30分钟。
- 用在封闭溶液中稀释的一抗的每载玻片 200 μL 替换封闭溶液。使用盖玻片将溶液涂抹在切片上，避免气泡形成。在4°C下在潮湿的室中孵育过夜。
- 将载玻片转移到Coplin罐中，并在补充有0.1%Triton X100的1x PBS中冲洗3 x 10分钟。将载玻片平放，每张载玻片加入400μL在封闭溶液中稀释的二抗，并在室温下在潮湿的室中放置2小时。
- 将载玻片转移到 Coplin 罐中，并用补充有 0.1% Triton X100 的 1x PBS 冲洗 3 x 5 分钟。
- 用 Hoechst 溶液复染细胞核 10 分钟，并用 1x PBS 冲洗 3 x 5 分钟。
- 将盖玻片放在专门设计用于保持荧光的水性封固剂中的载玻片上。让载玻片在室温下干燥1小时，并储存在4°C。
- 用荧光显微镜对载玻片进行成像。
- 苏木精和伊红 （H&E） 染色以评估视网膜损伤
注意：一般视网膜组织学可以通过 H&E 着色来评估，而不是通过免疫染色标记特定细胞类型。- 脱蜡切片后，通过将载玻片浸入苏木精溶液中2分钟进行核酸标记。用自来水冲洗干净。
- 通过将载玻片浸入1%伊红溶液中1分钟进行细胞质标记。用水快速冲洗。
注意：曙红非常易溶;如果载玻片在水中放置时间过长，所有染料都会消失。 - 在100%乙醇中冲洗2 x 5分钟，在二甲苯中冲洗2 x 5分钟。
- 在引擎盖下，将盖玻片放在载玻片上，滴入 4-5 滴安装介质。让载玻片在引擎盖下干燥，第二天用显微镜成像。
- 凋亡细胞的检测
- 对切片进行脱蜡后（参见第 5.2.6 节），按照试剂盒制造商的方案检测凋亡 DNA 片段化。
- 通过将载玻片浸入Hoechst溶液中（参见第5.3.8节）进行细胞核染色，并用专门设计用于保持荧光的水性封固剂进行封固。让载玻片在室温下干燥1小时，并储存在4°C。
- 用荧光显微镜对载玻片进行成像。
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Representative Results
机械性视网膜损伤
遭受协议第 1 节中描述的机械损伤的蝌蚪视网膜切片显示，视网膜病变包含组织的所有层，同时仅限于穿刺部位（图 2A，B）。
使用 NTR-MTZ 系统的条件杆细胞消融
如方案第2节所述，在立体显微镜下分析经MTZ处理的麻醉Tg（rho：GFP-NTR）转基因蝌蚪的眼睛（图3A，B）。GFP荧光的降低揭示了与对照组相比的渐进性靶向杆细胞消融（图3B），如方案第5节所述，通过GFP免疫染色在视网膜切片上确认（图3C）。
CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除杆细胞变性
按照协议第3节所述获得的 rho 脆蝌蚪的视网膜按照协议第5节中的描述进行分析（图4A）。半胱天冬酶 3 和视紫红质标记突出显示一些视杆细胞发生凋亡（图 4B）。H&E染色显示核层的整体保存，但光感受器外段严重缩短（图4C）。使用光感受器标志物的进一步免疫染色分析显示杆状细胞的变性和随后的视锥细胞缺陷（图4D ，未显示）。从第 40 阶段开始，表型开始可见，杆细胞的外段逐渐消失，直到从第 47 阶段开始从中央视网膜上消失。
细胞毒性眼内注射 CoCl 2 导致视网膜细胞变性
如方案第4节所述，通过免疫染色和TUNEL测定分析经受CoCl2眼内注射的蝌蚪视网膜，如方案第5节所述（图5A）。这表明 10 mM CoCl2 注射液导致视锥细胞光感受器的特异性细胞死亡（图 5B，C），而 25 mM 导致广泛的视网膜细胞死亡（图 5E）。如方案第5节所述，免疫染色分析进一步显示，注射10mM CoCl 2的视网膜中不存在视锥细胞（图5D），注射25mM CoCl2后双极细胞和光感受器均严重丧失（图5F）。
图1：一些实验程序的图示。（A） 连接到销架的直径为 0.2 毫米的针用于刺穿视网膜。蝌蚪的背视图、侧视图和正面视图图说明了别针（红色）的插入位置。（B） 条件杆细胞消融的转基因模型示意图。视紫红质启动子驱动视杆细胞中GFP-硝基还原酶融合蛋白的表达。当添加到非洲爪蟾饲养水中时，NTR 将甲硝唑转化为细胞毒素，特异性地消融 GFP-NTR 杆。（C） Tg（rho：GFP-NTR）转基因蝌蚪的头部在白光或荧光下显示。眼睛中的GFP染色可以对转基因蝌蚪进行分选。（D） 在立体显微镜下尼龙网格上的单细胞期胚胎，准备用 Picospritzer 显微注射系统注射。（E） 在含有荧光素赖氨酸葡聚糖的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物的单细胞阶段注射后，神经阶段的胚胎（插图中的示意图）。注射良好的荧光胚胎（绿色箭头）可以与未注射的胚胎（白色箭头）区分开来。（F） 用于转移麻醉蝌蚪的勺子的图像。（G） 在培养皿中对湿组织进行麻醉的蝌蚪。插入显微注射器中的毛细管允许眼内注射 CoCl2 溶液。（H） 显示将蝌蚪转移到 1 L 水箱中的图像，在那里可以监测动物直到醒来。比例尺 = 2 mm （C）， 1 mm （E）。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;NTR = 硝基还原酶;MTZ = 甲硝唑;NF = Nieuwkoop 和 Faber 阶段。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：机械性视网膜损伤。（A ） （B）中使用的实验程序概述。非洲 爪蟾 蝌蚪的眼睛在受伤后 7 天被刺穿并在视网膜切片上进行分析。虚线框表示成像区域。 （B） 细胞核用 Hoechst 复染。图中显示了三种不同的视网膜。箭头指向穿过所有视网膜层的受伤部位。比例尺 = 50 μm。缩写：dpi = 受伤后天数;GCL = 神经节细胞层;INL = 内核层;ONL = 外核层。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用 NTR-MTZ 系统的条件性杆细胞消融。（A）（ B，C）中使用的实验程序概述。用MTZ处理 Tg（rho：GFP-NTR） 转基因 非洲爪 蟾蝌蚪7-9天。GFP标记的视杆细胞的进行性变性可以在荧光立体显微镜下实时监测，如（B）中7天所示。视杆细胞死亡也可以在视网膜切片上进行分析，如（C）中所示的14天后，虚线框表示成像区域。（B） 治疗 7 天后，与对照组相比，转基因 MTZ 处理的蝌蚪视网膜中的 GFP 强度随时间而降低。（C） 通过 GFP 免疫染色在 14 天时在视网膜切片上确认 GFP 荧光的降低。用Hoechst对细胞核进行蓝色复染。比例尺 = 500 μm （B）、50 μm （C）。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;NTR = 硝基还原酶;MTZ = 甲硝唑;L = 透镜;R = 视网膜;GCL = 神经节细胞层;INL = 内核层;ONL = 外核层;OS = 外段。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：非洲爪蟾（Xenopus laevis rho crispants）的杆变性。 （A） （B-D）中使用的实验程序概述。向单细胞期胚胎注射含有荧光赖氨酸葡聚糖的CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（gRNA双链体/ Cas9蛋白）。在神经阶段，可以对荧光注射的胚胎进行分类并使其发育到各个阶段，以进行 （B） 用于细胞死亡分析的裂解 Caspase 3 免疫染色，或 （C） 用于解剖分析的苏木精和伊红染色，或 （D） 使用杆状标记物进行免疫染色用于光感受器细胞变性分析。虚线框表示成像区域。（B） 在第 39 阶段，对照或 rho crispants 非洲爪蟾胚胎的视网膜切片上切割的 Caspase 3（凋亡细胞的标志物）和 Rho 外节段的 Rho Scanpys 的双重标记表明对照中没有垂死细胞，并且 rho 脆皮中的垂死细胞是杆状光感受器。（C） 在第 48 阶段对 rho crispants 非洲爪蟾蝌蚪视网膜切片的 H&E 染色显示，与对照组相比，光感受器外节的大小减小。（D） 第 48 阶段对 rho 脆皮蝌蚪非洲爪蟾蝌蚪视网膜切片的 Recoverin（杆内段的标志物）和 Rhodopsin 共免疫染色显示与对照组相比严重变性。用Hoechst对细胞核进行蓝色复染。比例尺 = 50 μm。缩写：gRNA = guide RNA;H&E = 苏木精和伊红;GCL = 神经节细胞层;INL = 内核层;ONL = 外核层;OS = 外段。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：细胞毒性眼内注射 CoCl2 导致的视网膜细胞变性。 （A） （B-F）中使用的实验程序概述。虚线框表示成像区域。将10mM或25mM CoCl2的溶液眼内注射到蝌蚪眼中。在损伤后 2 天通过 TUNEL 测定法分析细胞凋亡 （dpi） （B，C，E），而通过用各种标志物 （D，F） 进行免疫染色来分析视网膜细胞变性 7 至 14 dpi。（B-D）蝌蚪视网膜切片在第 51-54 阶段注射盐水溶液（对照）或 10 mM CoCl2 溶液。（B） 2 dpi 的细胞死亡分析显示，CoCl2 注射后主要存在于感光细胞核层中。（C）将细胞死亡染色与S/M视蛋白（视锥细胞的标志物）免疫染色偶联，发现这些垂死细胞主要是视锥细胞;箭头指向双标记单元格。（D） S/M 视蛋白（视锥细胞的标志物）和视紫红质（视杆细胞的标志物）共免疫染色显示，与 14 dpi 的对照组相比，CoCl2 注射视网膜的视锥细胞标记严重减少。（E，F）蝌蚪视网膜切片在第 51-54 阶段注射 25 mM CoCl2 溶液。（E） 2 dpi 的细胞死亡分析揭示了光感受器和内核层中都存在垂死细胞。（F） Otx2（光感受器和双极细胞的标志物）免疫染色显示，与对照组相比，注射 CoCl 2 的视网膜在 7 dpi 下两层的染色严重减少，表明 CoCl2 诱导的光感受器和双极细胞的细胞死亡。用Hoechst对细胞核进行蓝色复染。比例尺：25μm。缩写：ONL = 外核层;INL = 内核层;GCL = 神经节细胞层。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
非洲爪蟾蝌蚪各种视网膜损伤范式的优缺点
机械性视网膜损伤
在非洲爪蟾蝌蚪中已经发展出各种神经视网膜的手术损伤。神经视网膜可以完全切除 15,16 或仅部分切除16,17。这里介绍的机械损伤不涉及任何视网膜切除术，而是我们之前在非洲爪蟾蝌蚪6 中开发的简单眼部穿刺。鉴于这种机械性视网膜损伤模型的手动程序，表型可能因蝌蚪而异。此外，可复制性和损伤程度也可能因执行实验的人而异。因此，我们建议由同一个人执行所有伤害程序。
使用 NTR-MTZ 系统的条件杆细胞消融
NTR-MTZ 系统已用于消融转基因非洲爪蟾视网膜 6,7,8,18 中的杆细胞。MTZ治疗的持续时间因一项研究而异，从2天到7天不等。这可能反映了NTR的不同活性，具体取决于不同转基因系中的染色体插入。此外，我们注意到Tg（rho：GFP-NTR）蝌蚪在MTZ处理的给定时间内的反应存在一些差异，一些蝌蚪经历了严重的杆变性，而另一些则表现出很少的损伤。使用这种转基因系将 MTZ 处理从 7 天延长到 9-10 天似乎可以减少这种变异性。然而，鉴于 MTZ 的潜在毒性作用，应谨慎行事。该模型的明显优点是它允许有条件和可逆的视杆细胞消融以及视杆细胞变性的实时监测。
CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除杆细胞变性
视网膜色素变性的CRISPR-Cas9 rho基因编辑模型导致非洲爪蟾蝌蚪11的杆细胞变性。然而，与NTR-MTZ模型相比，杆细胞消融是组成型的，不可逆的。有趣的是，这种方法的高效率（我们现在经常获得 >90% 表现出严重杆状变性的蝌蚪）允许在 F0 一代上研究这个模型。我们最初使用的是sgRNA，但注意到不同批次的RNA制剂存在差异。我们最近发现，按照该协议中的描述订购合成 crRNA 和 tracrRNA 并制备 gRNA 双链体可提供更可靠的结果。
细胞毒性眼内注射 CoCl2 导致视网膜细胞变性
与此处描述的其他模型相比，此模型具有多个优点。它不仅允许有条件地诱导视网膜细胞类型的消融，而且还可以调节损伤的严重程度14。此外，据我们所知，它代表了 非洲爪蟾中特定锥体变性的唯一模型。最后，它在退行性表型中产生低变异性。
四种视网膜病变范式的疗效
考虑到一批蝌蚪到另一批蝌蚪的表型的潜在变异性，建议检查视网膜变性对8-10只蝌蚪的疗效。在机械损伤的情况下，必须在损伤后的几天内分析损伤，因为一周后病变不再可见。在 NTR-MTZ 模型中，MTZ 治疗结束后 1 周清晰可见杆状变性。对于 rho 脆皮，当光感受器完全分化时，杆细胞死亡就开始了，我们建议分析从第45阶段开始的退行性效率。在 CoCl2 模型中，细胞死亡发生在注射后一周内。关于每种方法的预期存活率，我们想指出的是，CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物注射在前48小时内导致的死亡率高于传统的RNA注射（在前48小时后没有生长或存活问题），因此，应根据需要注射更多的胚胎。相比之下，其他手术（机械损伤、MTZ 治疗或眼内 CoCl2 注射）不会造成任何生存问题。
这些损伤范式在研究视网膜再生方面的潜在应用
这一系列视网膜损伤模型的一个潜在应用是视网膜再生的研究。在病理背景下，可以募集不同来源的视网膜干细胞或干细胞样细胞，包括 CMZ 细胞、Müller 神经胶质细胞和 RPE 细胞。我们已经报道了机械损伤模型、NRT/MTZ 模型和 CRISPR/Cas9 模型，都是研究损伤后 Müller 细胞活化的有吸引力的模型 6,11。有趣的是，在 CoCl2 模型中，所有三种细胞来源都可以被招募14，为研究不同视网膜细胞类型的募集和重编程机制提供了一种新的模型。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项研究得到了法国视网膜协会、法国基金会、FMR（罕见病基金会）、BBS（Bardet-Biedl 综合征协会）和 UNADEV（国家 Aveugles et Déficients Visuels）的赠款，并与 ITMO NNP（多生物体神经科学、认知科学、神经学、精神病学研究所）/AVIESAN（国家生命和健康科学联盟）合作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
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