Summary
Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.
Abstract
Neurodegenerative Netzhauterkrankungen sind die Hauptursachen für Erblindung. Unter den zahlreichen therapeutischen Strategien, die erforscht werden, hat sich in jüngster Zeit die Stimulierung der Selbstreparatur als besonders attraktiv erwiesen. Eine zelluläre Quelle von Interesse für die Netzhautreparatur ist die Müller-Gliazelle, die Stammzellpotenzial und eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit in Anamnioten birgt. Dieses Potenzial ist jedoch bei Säugetieren sehr begrenzt. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Netzhautregeneration in Tiermodellen mit regenerativen Fähigkeiten zugrunde liegen, soll Aufschluss darüber geben, wie die latente Fähigkeit von Säugetier-Müller-Zellen zur Regeneration der Netzhaut freigesetzt werden kann. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung therapeutischer Strategien in der regenerativen Medizin. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt: eine mechanische Netzhautverletzung, eine transgene Linie, die eine bedingte Ablation von Nitroreduktase-vermittelten Photorezeptoren ermöglicht, ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare CoCl2-Injektionen gesteuert wird. Unter Hervorhebung ihrer Vor- und Nachteile beschreiben wir hier diese Reihe von Protokollen, die verschiedene degenerative Zustände hervorrufen und die Untersuchung der Netzhautregeneration bei Xenopus ermöglichen.
Introduction
Millionen von Menschen weltweit leiden an verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen, die zur Erblindung führen, wie z. B. Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Bis heute sind diese Erkrankungen weitgehend unbehandelbar. Zu den derzeit untersuchten therapeutischen Ansätzen gehören Gentherapie, Zell- oder Gewebetransplantationen, neuroprotektive Behandlungen, Optogenetik und Prothesen. Eine weitere neue Strategie basiert auf der Selbstregeneration durch die Aktivierung körpereigener Zellen mit Stammzellpotenzial. Müller-Gliazellen, der wichtigste Gliazelltyp der Netzhaut, gehören zu den zellulären Quellen von Interesse in diesem Zusammenhang. Bei Verletzungen können sie dedifferenzieren, sich vermehren und Neuronen erzeugen 1,2,3. Obwohl dieser Prozess bei Zebrafischen oder Xenopus sehr effektiv ist, ist er bei Säugetieren weitgehend ineffizient.
Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass geeignete Behandlungen mit mitogenen Proteinen oder die Überexpression verschiedener Faktoren den Wiedereintritt in den Zyklus der Müllergliazellen von Säugetieren induzieren und in einigen Fällen deren anschließende Neurogeneseverpflichtung auslösen können 1,2,3,4,5. Für die Behandlung ist dies jedoch nach wie vor weitgehend unzureichend. Daher ist es notwendig, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die der Regeneration zugrunde liegen, zu erweitern, um Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, die Eigenschaften von Müller-Stammzellen effizient in neue zelluläre therapeutische Strategien umzuwandeln.
Zu diesem Zweck haben wir mehrere Verletzungsparadigmen in Xenopus entwickelt, die die Degeneration von Netzhautzellen auslösen. Hier präsentieren wir (1) eine mechanische Netzhautverletzung, die nicht zelltypspezifisch ist, (2) ein konditionelles und reversibles Zellablationsmodell mit dem NTR-MTZ-System, das auf Stäbchenzellen abzielt, (3) einen CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout , ein Modell der Retinitis pigmentosa, das eine progressive Stäbchenzelldegeneration auslöst, und (4) ein CoCl2-induziertes zytotoxisches Modell, das je nach Dosis spezifisch auf Zapfen abzielen oder zu einer breiteren Degeneration von Netzhautzellen führen kann. Wir beleuchten die Besonderheiten, Vor- und Nachteile der einzelnen Paradigmen.
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Protocol
Die Tierpflege und die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unter der institutionellen Lizenz A91272108 durchgeführt. Die Studienprotokolle wurden vom institutionellen Tierpflegeausschuss CEEA #59 genehmigt und von der Direction Départementale de la Protection des Populations unter der Referenznummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 und APAFIS #21474-2019071210549691 v2 genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesen Protokollen verwendet werden.
1. Mechanische Netzhautverletzung
ANMERKUNG: Das hier beschriebene Verletzungsparadigma-Protokoll besteht aus einer mechanischen Netzhautpunktion einer Kaulquappe ab Stadium 45. Es zielt also nicht auf einen bestimmten Netzhautzelltyp ab, sondern schädigt die gesamte Dicke der Netzhaut an der Einstichstelle.
- Vorbereitung des Anästhetikums für Kaulquappen
- Bereiten Sie eine 10%ige Stammlösung von Benzocain zu. Für ein Gesamtvolumen von 10 ml fügen Sie 1 g Benzocain, 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und 8 ml Propylenglykol hinzu. Konservieren Sie die Stammlösung mehrere Monate bei 4 °C, lichtgeschützt mit Aluminiumfolie.
- Bereiten Sie 0,005%ige Benzocainlösung zum Zeitpunkt der Anwendung vor, indem Sie 25 μl 10%ige Benzocain-Stammlösung zu 50 ml Kaulquappenaufzuchtwasser (gefiltertes und entchlortes Leitungswasser) geben. Gut mischen.
HINWEIS: Die Konzentration von Benzocain ist besonders niedrig, da Kaulquappen im Vergleich zu Erwachsenen sehr empfindlich auf Narkose reagieren.
- Vorbereitung der Stifte
- Befestigen Sie einen sterilen Stift mit einem Durchmesser von 0,2 mm an einem sterilisierten Stifthalter (Abbildung 1A).
- Anästhesie von Kaulquappen
- Verwenden Sie ein Kescher, um Kaulquappen in ihren Becken zu fangen. Füllen Sie sie in einen neuen Tank mit der 0,005%igen Benzocainlösung. Warten Sie einige Minuten, bis die Kaulquappen nicht mehr auf Reize reagieren (Klopfen auf das Becken oder direkten Kontakt).
HINWEIS: Mehrere Kaulquappen können gleichzeitig betäubt werden, aber die Zeit, die in der Anästhesielösung verbracht wird, sollte weniger als 30 Minuten betragen.
- Verwenden Sie ein Kescher, um Kaulquappen in ihren Becken zu fangen. Füllen Sie sie in einen neuen Tank mit der 0,005%igen Benzocainlösung. Warten Sie einige Minuten, bis die Kaulquappen nicht mehr auf Reize reagieren (Klopfen auf das Becken oder direkten Kontakt).
- Netzhautpunktion
- Fangen Sie mit einem Löffel eine Kaulquappe und legen Sie sie vorsichtig auf eine kleine Petrischale (55 mm Durchmesser), die ein feuchtes Taschentuch enthält. Positionieren Sie die Kaulquappe mit der Rückenseite nach oben in der Mitte der Petrischale.
- Unter einem Stereomikroskop wird die Netzhaut punktiert, indem der Stift vorsichtig auf der dorsalen Seite des Auges eingeführt wird, bis er durch die Netzhaut geht (Abbildung 1A). Wenn mehrere Stiche erforderlich sind, wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Stellen. Nach der Punktion des rechten Auges drehen Sie die Petrischale um 180°, um das linke Auge zu punktieren.
- Geben Sie die verletzte Kaulquappe in einen großen Tank mit 1 l Aufzuchtwasser, indem Sie die Petrischale vorsichtig eintauchen. Beobachte die Kaulquappen, bis sie vollständig erwacht sind.
2. Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Das Protokoll zielt darauf ab, eine spezifische Stäbchenzellablation in der transgenen Xenopus-Tg(rho:GFP-NTR)-Linie6 zu induzieren, die im Tierzuchtdienst der TEFOR Paris-Saclay erhältlich ist, der das französische Xenopus-Ressourcenzentrum beherbergt. Dieses chemogenetische System nutzt die Fähigkeit des Enzyms Nitroreduktase (NTR), das Prodrug Metronidazol (MTZ) in ein zytotoxisches DNA-Vernetzungsmittel umzuwandeln, um NTR-exprimierende Stäbchen spezifisch abzutragen (Abbildung 1B). Zwei detaillierte Protokolle zur Herstellung von Tg(rho:GFP-NTR)- oder Tg(rho:NTR)-transgenen Tieren und zur Induktion von Degeneration wurden bereits veröffentlicht 7,8. Hier beschreiben wir einfach die Induktion der Netzhautdegeneration und wie man den Degenerationsprozess in vivo überwacht.
- Herstellung der Metronidazol-Lösung
- Bereiten Sie 10 mM MTZ-Lösung zum Zeitpunkt der Anwendung vor, indem Sie 1,67 g MTZ-Pulver in einer dunklen Flasche in 1 l Kaulquappenaufzuchtwasser mit 0,1 % DMSO unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs und eines magnetischen Rührwerks auflösen.
HINWEIS: MTZ ist lichtempfindlich. Die vollständige Auflösung kann bis zu 10 Minuten dauern.
- Bereiten Sie 10 mM MTZ-Lösung zum Zeitpunkt der Anwendung vor, indem Sie 1,67 g MTZ-Pulver in einer dunklen Flasche in 1 l Kaulquappenaufzuchtwasser mit 0,1 % DMSO unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs und eines magnetischen Rührwerks auflösen.
- Generierung transgener Kaulquappen durch natürliche Paarung aus der Tg(rho:GFP-NTR)- Linie
HINWEIS: Da transgene Männchen einen kostbaren Bestand darstellen, ziehen wir es vor, Embryonen durch natürliche Paarung zu erzeugen, um das Männchen nicht zu opfern und es wiederholt zu verwenden.- Verabreichung von Hormonen
- Injizieren Sie 600 I.E. humanes Choriongonadotropin-Hormon (hCG) mit 25G-Nadeln in den dorsalen Lymphsack von Xenopus laevis Wildtyp-Weibchen. Injizieren Sie transgenen Männern 100-200 I.E. hCG in den dorsalen Lymphsack. Für die Live-Überwachung der Stäbchendegeneration (Schritt 2.4) verwenden Sie Albino-Xenopus anstelle von pigmentierten, um Fluoreszenzvariationen im Auge der erzeugten transgenen Kaulquappen besser sichtbar zu machen.
HINWEIS: Xenopus-Weibchen können 1 bis 7 Tage vor dem geplanten Eisprung mit 50 I.E. hCG geprimt werden, dies ist jedoch optional.
- Injizieren Sie 600 I.E. humanes Choriongonadotropin-Hormon (hCG) mit 25G-Nadeln in den dorsalen Lymphsack von Xenopus laevis Wildtyp-Weibchen. Injizieren Sie transgenen Männern 100-200 I.E. hCG in den dorsalen Lymphsack. Für die Live-Überwachung der Stäbchendegeneration (Schritt 2.4) verwenden Sie Albino-Xenopus anstelle von pigmentierten, um Fluoreszenzvariationen im Auge der erzeugten transgenen Kaulquappen besser sichtbar zu machen.
- Paarung und Eiabnahme
- Unmittelbar nach der hCG-Injektion wird ein Tg(rho:GFP-NTR)- transgenes Männchen zusammen mit einem hCG-injizierten Weibchen bei 20 °C bis zum nächsten Tag in einen Tank gegeben. Verwenden Sie ein großes Volumen (mindestens 10 l) und fügen Sie kleine Gegenstände hinzu, an denen die Eier haften können, damit die Eier nicht durch die Bewegungen der Erwachsenen beschädigt werden. Am nächsten Tag, wenn die Frösche nicht mehr in Amplexus sind, nehmen Sie die erwachsenen Tiere aus dem Becken und sammeln Sie die Embryonen.
- Aufzucht von Embryonen und Kaulquappen
- Stadien der Embryonen und Kaulquappen gemäß der normalen Tabelle der Xenopus-Entwicklung 9.
- Embryonen in einem Tank aufziehen, der mit Kaulquappenaufzuchtwasser gefüllt ist. Füttern Sie Kaulquappen ab Stufe 45 mit Pulverbrutfutter und reichern Sie das Wasser mit einem Bubbler mit Sauerstoff an. Fügen Sie bei Bedarf täglich Wasser hinzu, um die Verdunstung auszugleichen, und wechseln Sie das gesamte Aquarienwasser wöchentlich.
HINWEIS: Alternativ ist es auch möglich, zweimal pro Woche 50% des Volumens umzutauschen. Ein detailliertes Protokoll finden Sie in10.
- Transgene Embryonensortierung
- Ab Stadium 37/38 werden transgene Embryonen unter einem Fluoreszenzstereomikroskop sortiert und selektiert, indem GFP direkt visualisiert wird (Abbildung 1C).
- Verabreichung von Hormonen
- Kaulquappe MTZ-Behandlung
- Transgene Tg(rho:GFP-NTR)- Kaulquappen werden in ein Becken mit 10 mM MTZ-Lösung überführt und 1 Woche lang bei 20 °C in Dunkelheit aufgezogen. Verwenden Sie transgene Geschwister, die in Kaulquappenaufzuchtwasser mit 0,1 % DMSO aufgezogen wurden, als Kontrollen.
- Wechseln Sie die MTZ und die Kontrolllösung während der Behandlungszeit jeden zweiten Tag. Füttern Sie die Kaulquappen während der MTZ-Behandlung wie gewohnt.
- Für die individuelle Fluoreszenzüberwachung (Schritt 2.4) legen Sie jede Kaulquappe in ihren kleinen Behälter mit 30 ml MTZ oder Kontrolllösung ab Schritt 2.3.1.
HINWEIS: Die MTZ-Behandlung kann ab Stadium 45 jederzeit durchgeführt werden.
- Live-Überwachung der Stabdegeneration
HINWEIS: Die fortschreitende Degeneration der Stäbe kann in Echtzeit überwacht werden. Führen Sie daher die Schritte 2.4.1 aus. zu 2.4.4. vor der MTZ-Behandlung und dann regelmäßig nach der Behandlung.- Befolgen Sie die Schritte 1.1 und 1.3 für die Vorbereitung des Anästhetikums bzw. der Kaulquappenanästhesie.
- Fangen Sie mit einem Löffel eine Kaulquappe und legen Sie sie vorsichtig auf ein feuchtes Taschentuch in einer kleinen Petrischale (55 mm Durchmesser). Beobachten Sie die GFP-Fluoreszenz unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop (Anregungswellenlänge = 488 nm und Emissionswellenlänge = 509 nm) und fotografieren Sie das Auge. Eine verminderte Fluoreszenzintensität spiegelt den Abbau der Stäbchen wider.
HINWEIS: Um quantitative Vergleiche anstellen zu können, müssen für die Abbildung aller Kaulquappen die gleichen Einstellungen beibehalten werden. - Bringen Sie die abgebildete Kaulquappe in ein großes Becken mit 1 l Aufzuchtwasser, indem Sie die Petrischale vorsichtig eintauchen. Beobachte die Kaulquappen, bis sie vollständig erwacht sind.
- Vergleichen Sie die Fluoreszenzintensität zwischen MTZ-behandelten und Kontrollkaulquappenaugen, um die Wirksamkeit des Degenerationsprozesses zu überwachen und zu bewerten.
3. Stäbchenzelldegeneration durch CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um ein Modell der Retinitis pigmentosa in Xenopus laevis zu generieren, indem eine spezifische Stäbchenzelldegeneration mittels CRISPR/Cas9-vermitteltem Rhodopsin-Knockout induziert wird. Der Prozentsatz der Einfüge-Deletion (Indels) in F0 ist in11 angegeben und beträgt ~75%. Ein solcher CRISPR/Cas9-vermittelter Rhodopsin-Knockout kann auch bei Kaulquappen von Xenopus tropicalis durchgeführt werden 11.
- Herstellung von Lösungen und Reagenzien
- crRNA- und tracrRNA-Ordnung
- Kaufen Sie die synthetische CRISPR-RNA (crRNA), die auf das Rhodopsin-Gen (rho) abzielt, und die standardmäßige transaktivierende crRNA (tracrRNA). Die crRNA besteht aus einer rho-target-spezifischen Region (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) und einer weiteren (GUUUUAGAGCUAUGCU), die mit der tracrRNA hybridisiert.
- crRNA:tracrRNA-Duplex (rho-gRNA-Duplex)
- Resuspendieren Sie crRNA und tracrRNA bei 100 μM im nukleasefreien Duplexpuffer.
- Bereiten Sie den gRNA-Duplex vor, indem Sie 3 μl 100 μM rho crRNA, 3 μl 100 μM tracrRNA und 94 μl Duplexpuffer mischen. Die Endkonzentrationen betragen 36 ng/μL rho crRNA und 67 ng/μL tracrRNA.
- Die Oligos werden durch Erhitzen bei 95 °C für 5 min geglüht und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Stellen Sie Aliquots her und lagern Sie diese bei -20 °C.
- CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex (d. h. gRNA-Duplex/Cas9-Protein)
- Bereiten Sie zum Zeitpunkt der Anwendung die Mischung aus rho gRNA duplex und dem Cas9-Protein vor. Für 20 μl fügen Sie 10 μl der rho-gRNA-Duplexlösung, 2 μl Cas9-Protein (Stamm bei 5 mg/ml), 2 μl Fluorescein-Lysin-Dextran (Stamm bei 10 mg/ml) und 6 μl RNase-freies Wasser hinzu.
- Um den Ribonukleoproteinkomplex zu bilden, wird die Lösung 10 min bei 37 °C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt.
- Mischen Sie für 20 μl der Kontrolllösung 2 μl Cas9-Protein, 2 μl Fluorescein-Lysin-Dextran und 16 μl RNase-freies Wasser.
- Herstellung von 10x-, 1x- und 0,1x-MBS-Lösungen
- Bereiten Sie modifizierte Barth-Kochsalzlösung (10x MBS) vor, indem Sie 11,92 g HEPES, 51,43 g Natriumchlorid (NaCl), 0,75 g Kaliumchlorid (KCl), 2,1 g Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 2,46 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4, 7H2O) in 800 ml Typ-II-Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit 30% Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,8 ein. Geben Sie Typ-II-Wasser hinzu, bis das Volumen 1 l beträgt, und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 1 l 1x MBS-Lösung vor, indem Sie 100 ml 10x MBS-Salzlösung und 7 ml 0,1 M Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl 2, 2H2 O) in Typ-II-Wasser verdünnen. Bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 0,1x MBS-Lösung vor, indem Sie 1x MBS-Lösung in Typ-II-Wasser verdünnen. Bei Raumtemperatur lagern.
- Benzocain-Lösung für Erwachsene
- 0,05%ige Benzocainlösung wird durch Zugabe von 5 ml 10%iger Benzocain-Stammlösung (siehe Schritt 1.1.1.) zu 1 l Kaulquappenaufzuchtwasser hergestellt. Gut mischen.
HINWEIS: Diese Lösung mehrere Monate bei 4 °C lichtgeschützt mit Aluminiumfolie aufbewahren. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur, bevor Sie sie an Tieren anwenden.
- 0,05%ige Benzocainlösung wird durch Zugabe von 5 ml 10%iger Benzocain-Stammlösung (siehe Schritt 1.1.1.) zu 1 l Kaulquappenaufzuchtwasser hergestellt. Gut mischen.
- L-Cystein-Lösung
- Bereiten Sie die Dejellierungslösung zum Zeitpunkt der Verwendung vor, indem Sie 2 g L-Cystein-Salzmonohydrat zu 100 ml 0,1-facher MBS-Lösung hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit 30% NaOH auf 7,8 ein.
- Polysaccharose-Lösung
- Bereiten Sie die dichte Polysaccharoselösung vor, indem Sie 3 g Polysaccharose zu 100 ml 0,1x MBS-Lösung hinzufügen. Lagern Sie diese Lösung einige Wochen bei 4 °C.
- crRNA- und tracrRNA-Ordnung
- In-vitro-Fertilisation und Dejellying
HINWEIS: Weitere Details zur Xenopus-In-vitro-Fertilisation finden Sie in einem ausführlichen speziellen Protokoll in12.- Hormongabe an Xenopus laevis-Weibchen , um den Eisprung auszulösen
- Etwa 15 Stunden vor der Eizellentnahme 600 I.E. hCG in den dorsalen Lymphsack des Weibchens injizieren und über Nacht bei 18 °C halten.
- Hoden-Dissektion
- Euthanasieren Sie den männlichen Xenopus mit einer tödlichen Dosis von 0,05%iger Benzocainlösung für 10-15 Minuten. Als ergänzende Euthanasie-Methode wird die Wirbelsäule unmittelbar hinter dem Schädel mit einer scharfen und robusten Schere durchtrennt. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Sezierschere, schneiden Sie die Hoden heraus und schneiden Sie anhaftendes Fett und Kapillaren ab. Legen Sie jeden Hoden sofort auf Eis in 1 ml 1x MBS.
- Spermien-Aufbereitung
- Zerkleinern Sie einen Hoden mit einem Stößel für Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie die Suspension in einem 15-ml-Röhrchen, das 9 ml 1x MBS enthält. Geben Sie 10 μg/ml Gentamicin in das zweite Hodenröhrchen und bewahren Sie es für weitere Befruchtungsversuche einige Tage bei 4 °C auf.
- In-vitro-Fertilisation
- Massieren Sie sanft den Rücken der hormonell injizierten Frau und sammeln Sie die Eizellen in einer Petrischale (100 mm Durchmesser). Verteilen Sie ein paar Tropfen der Spermienlösung auf den Eizellen. Warten Sie 5 Minuten und decken Sie sie mit 0,1x MBS ab. Warten Sie 10 Minuten, bevor Sie mit dem Dejelly fortfahren.
- Befruchtetes Ei-Dejelen
- Ersetzen Sie die 0,1-fache MBS-Lösung durch die Dejelliing-Lösung, um die Geleeschicht von den befruchteten Eiern zu entfernen (~5 min). Spülen Sie die Embryonen 5-6 Mal gründlich mit 0,1x MBS und übertragen Sie sie in eine neue 100 mm Petrischale, die mit 0,1x MBS gefüllt ist.
- Hormongabe an Xenopus laevis-Weibchen , um den Eisprung auszulösen
- Vorbereitung des Mikroinjektionssystems
- Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher13 schärfen.
- Füllen Sie eine geschärfte Kapillare mit 2-10 μl CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinkomplex oder der Kontrolllösung mit einer Microloader-Spitze und platzieren Sie die Kapillare in den Mikroinjektor-Handler.
- Bei der höchsten Vergrößerung eines Stereomikroskops wird die Kapillarspitze mit einer feinen Pinzette abgebrochen und die Injektionszeit (~400 ms) eingestellt, um ein Auswurfvolumen von 10 nL pro Impuls zu erhalten. Stellen Sie den Auswurfdruck auf ca. 40 PSI ein.
- Mikroinjektion von Embryonen im Einzelzellstadium mit dem Ribonukleoprotein-Komplex CRISPR-Cas9
- Die Embryonen im Einzelzellstadium werden auf ein Gitter (1 mm Nylongewebe) gelegt, das in eine 100 mm große Petrischale geklebt ist, die mit 3%iger Polysaccharoselösung gefüllt ist (Abbildung 1D).
- Injizieren Sie mit dem Mikroinjektor und unter einem Stereomikroskop 10 nL des Ribonukleoproteinkomplexes CRISPR-Cas9 (das entspricht 500 pg gRNA-Duplex + 5 ng Cas9-Protein pro Embryo) oder Kontrolllösung auf Höhe des tierischen Pols, in der kortikalen Region, direkt unter der zytoplasmatischen Membran.
HINWEIS: Das in der Lösung enthaltene Fluorescein-Lysin-Dextran ermöglicht eine anschließende Sortierung der injizierten Embryonen. - Die injizierten Embryonen werden in eine neue 100-mm-Petrischale mit einer sauberen Polysaccharoselösung überführt und bei 21 °C platziert.
- Sortieren Sie am ersten Tag regelmäßig die gut entwickelten Embryonen aus und ersetzen Sie die Polysaccharoselösung etwa 5 Stunden nach der Mikroinjektion durch 0,1x MBS.
- Warten Sie 24 Stunden nach der Injektion, um gut injizierte Rho-Crispant-Embryonen unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu sortieren und auszuwählen, indem Sie Fluorescein-Lysin-Dextran visualisieren (Abbildung 1E).
HINWEIS: Je früher die Mikroinjektion nach der Befruchtung erfolgt, desto effektiver ist der Knockout.
- Aufzucht von Embryonen und Kaulquappen
- Aufzucht von Rho-Crispant-Embryonen in 0,1x MBS in Petrischalen bis zum Stadium 37/38. Entfernen Sie täglich abgestorbene Embryonen und wechseln Sie die 0,1-fache MBS-Lösung. Ab Stadium 37/38 werden die Embryonen in einem mit Kaulquappenaufzuchtwasser gefüllten Tank aufgezogen und ab Stadium 45 wie in Schritt 2.2.3 vorgegangen.
4. Retinale Zelldegeneration durch zytotoxische intraokulare CoCl 2-Injektionen
ANMERKUNG: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Degeneration von Netzhautzellen durch intraokulare Injektionen von Kobaltchlorid (CoCl2) bei Kaulquappen von Xenopus laevis zu induzieren. Je nach Dosis kann es eine zapfenspezifische Degeneration oder eine breitere Degeneration auslösen14. Wir verwenden dieses Protokoll bei Kaulquappen von Xenopus laevis ab dem Stadium 48. Es kann auch bei Kaulquappen von Xenopus tropicalis verwendet werden.
- Herstellung von Puffer und Reagenzien
- Bereiten Sie zum Zeitpunkt der Anwendung 0,005%ige Benzocainlösung wie in Schritt 1.1 vor.
- Bereiten Sie 100 mM CoCl2-Stammlösung vor, indem Sie 118,5 mg zu 5 ml 0,1x MBS hinzufügen (siehe Schritt 3.1.4 zur Herstellung von 0,1x MBS). Diese Stammlösung mehrere Monate bei 4 °C aufbewahren und mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
VORSICHT: CoCl2 ist als toxische Verbindung für Mensch und Tier eingestuft. Befolgen Sie sorgfältig die Hinweise zur Handhabung, Lagerung und Entsorgung auf dem Sicherheitsdatenblatt. - Für die zapfenspezifische Degeneration wird zum Zeitpunkt der Verwendung eine 10 mM CoCl2-Lösung aus der 100 mM Stammlösung hergestellt, die in 0,1x MBS verdünnt ist. Für eine breitere Degeneration der Netzhautzellen stellen Sie eine 25 mM CoCl2-Lösung her.
- Vorbereitung des Einspritzsystems
- Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher 13 schärfen.
- Füllen Sie eine geschärfte Kapillare mit 2-10 μl 10 oder 25 mM CoCl2-Lösung oder der Kontrolllösung (0,1x MBS) mit einer Microloader-Spitze und platzieren Sie die Kapillare in den Mikroinjektor-Handler.
- Bei der höchsten Vergrößerung eines Stereomikroskops wird die Kapillarspitze mit einer feinen Pinzette abgebrochen und die Injektionszeit (ca. 100 ms) eingestellt, um ein Auswurfvolumen von 15-40 nL pro Impuls zu erhalten. Stellen Sie den Auswurfdruck auf ~40 PSI ein.
HINWEIS: Die Größe des Tropfens sollte an das Stadium der Kaulquappen und die Größe ihres Auges angepasst werden. Zum Beispiel beträgt die Tropfengröße in den Stadien 48-49 ~15-20 nL, während sie in den Stadien 52-56 30-40 nL beträgt. Optisch ist die Größe des Tropfens etwas größer als die Linsengröße.
- CoCl2 intraokulare Injektionen
- Verwenden Sie ein Kescher, um Kaulquappen in ihren Becken zu fangen. Übertragen Sie sie in 50 ml 0,005%ige Benzocainlösung. Warten Sie einige Minuten, bis die Kaulquappen nicht mehr auf die Reize reagieren.
HINWEIS: Mehrere Kaulquappen können gleichzeitig betäubt werden, aber die Zeit, die in der Narkose verbracht wird, sollte weniger als 30 Minuten betragen. - Fangen Sie mit einem Löffel eine Kaulquappe und legen Sie sie vorsichtig in eine kleine Petrischale (55 mm Durchmesser), die ein feuchtes Taschentuch enthält. Positionieren Sie die Kaulquappe dorsal nach oben in der Mitte der Petrischale (Abbildung 1F,G).
- Verwenden Sie den Mikroinjektor unter einem Stereomikroskop, um die CoCl2-Lösung intraokular zu injizieren. Führen Sie die Kapillare vorsichtig über der Linse in das Auge ein. Wenn sich die Kapillarspitze im Inneren des Auges befindet, stoßen Sie zwei Tropfen pro Auge aus. Nach der Injektion des rechten Auges drehen Sie die Petrischale manuell um 180°, um das linke Auge zu injizieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Injektion im Inneren des Auges erfolgt, so dass nach jedem Auswurf der Lösung eine leichte Schwellung des Auges zu sehen sein muss. Die Kaulquappe sollte sich so wenig wie möglich außerhalb des Wassers aufhalten. Die Injektion beider Augen sollte weniger als 1 Minute dauern. - Geben Sie die injizierte Kaulquappe in einen großen Tank mit 1 l Aufzuchtwasser, indem Sie sie vorsichtig in die Petrischale tauchen (Abbildung 1H). Beobachte die Kaulquappen, bis sie vollständig erwacht sind.
- Verwenden Sie ein Kescher, um Kaulquappen in ihren Becken zu fangen. Übertragen Sie sie in 50 ml 0,005%ige Benzocainlösung. Warten Sie einige Minuten, bis die Kaulquappen nicht mehr auf die Reize reagieren.
5. Färbung zur Beurteilung von Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration
- Kaulquappenfixierung und Dehydrierung
- Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung vor, indem Sie 100 ml 32%ige PFA-Lösung in 700 ml 1x PBS verdünnen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein. Aliquotieren Sie diese Stammlösung und bewahren Sie sie mehrere Monate bei -20 °C auf.
- Euthanasieren Sie die Kaulquappen in 0,01%igem Benzocain und überführen Sie sie in ein Fläschchen mit 4% PFA für 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren oder über Nacht bei 4 °C. 3 x 5 min in 1x PBS spülen.
- Schrittweise Dehydrierung der Kaulquappen durch aufeinanderfolgende 30-minütige Inkubationen in 70%igem und 95%igem Ethanol (verdünnt in Typ-II-Wasser), gefolgt von drei weiteren 1-h-Inkubationen in 100%igem Ethanol. Lagern Sie die Kaulquappenköpfe bei diesem Schritt bei -20 °C oder überführen Sie sie direkt über Nacht auf 100% Butanol für weitere Schritte.
- Paraffin-Sektion
- Ersetzen Sie 100% Butanol durch geschmolzenes Paraffin für 2 h bei 62 °C. Ersetzen Sie das Paraffin für 2 x 2 h zusätzliche Inkubationen bei 62 °C.
- Kaulquappenköpfe in Einweg-Paraffin-Einbettformen geben und so ausrichten, dass ihre Augen gut ausgerichtet sind, und dann das Paraffin aushärten lassen. Lagern Sie die Blöcke bei Raumtemperatur.
- Schneiden Sie das überschüssige Paraffin ab und montieren Sie den Block mit der/den eingebetteten(n) Kaulquappe(n) auf der Mikrotomstütze.
- Schneiden Sie den Block mit einem Mikrotom in der entsprechenden Dicke (10-12 μm). Übertragen Sie die Bänder mit Abschnitten auf einen Objektträger, der zuvor mit 3% Glycerinalbumin (in Wasser verdünnt) bedeckt war.
- Legen Sie den Objektträger für einige Minuten auf einen Objektträgerwärmer bei 42 °C und entfernen Sie dann den Überschuss an Glycerinalbumin. Die Objektträger über Nacht im Backofen bei 37 °C trocknen lassen.
- Entwachsen Sie, indem Sie die Objektträger 2 x 15 Minuten lang in ein mit 100% Xylol gefülltes Coplin-Glas tauchen. Rehydrieren Sie die Abschnitte mit abgestufter Ethanolreihe: 100 % zweimal, 70 %, 50 % (verdünnt in Typ-II-Wasser), jeweils ~5 min, gefolgt von 2 x 5 min in Wasser.
- Immunfluoreszenz-Markierung
- 100 mM Natriumcitrat (CiNa)-Stammlösung durch Zugabe von 29,4 g Natriumcitrat-Trinatriumsalz-Dihydrat (C6H5Na3O7, 2H2O) zu 1 L Typ-II-Wasser herstellen; Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure (HCl) auf 6 ein. Durch Autoklavieren sterilisieren und mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie die Demaskierungslösung zum Zeitpunkt der Verwendung vor, indem Sie 25 ml 100 mM CiNa-Stammlösung zu 225 ml Wasser vom Typ II geben. 125 μl Tween-20 zugeben und gut mischen (Endkonzentration 10 mM CiNa, 0,05 % Tween-20).
- Hoechst Stammlösung mit 10 mg/ml wird durch Zugabe von 100 mg Bisbenzimid H 33258 zu 10 ml Wasser Typ I hergestellt. Diese Stammlösung mehrere Monate bei 4 °C aufbewahren und mit einer Aluminiumfolie vor Licht schützen. Bereiten Sie die Hoechst-Lösung mit 7,5 μg/ml vor, indem Sie 300 μl Hoechst-Stammlösung zu 400 ml 1x PBS hinzufügen.
HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 10 Mal verwendet und ca. 6 Monate bei 4 °C aufbewahrt werden, lichtgeschützt mit Aluminiumfolie. - Führen Sie nach dem Entwachsen der Abschnitte die Antigengewinnung durch, indem Sie die Abschnitte 9 Minuten lang in der Entlarvungslösung kochen. Lassen Sie die Lösung 20 Minuten abkühlen.
- Einmal in Typ-II-Wasser und einmal in 1x PBS abspülen. Legen Sie die Objektträger flach in eine feuchte Kammer und fügen Sie pro Objektträger 400-600 μl Blockierungslösung (Antikörperverdünnungsmittel + 0,2 % Triton X100) für 30 Minuten hinzu.
- Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch 200 μl pro Objektträger des in der Blockierungslösung verdünnten Primärantikörpers. Verwenden Sie ein Deckglas, um die Lösung auf den Abschnitten zu verteilen und Blasenbildung zu vermeiden. Über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
- Die Objektträger in ein Coplin-Glas umfüllen und 3 x 10 min in 1x PBS mit 0,1 % Triton X100 spülen. Legen Sie die Objektträger flach auf, fügen Sie 400 μl des in Blockierungslösung verdünnten Sekundärantikörpers pro Objektträger hinzu und lassen Sie sie 2 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer stehen.
- Die Objektträger in ein Coplin-Glas umfüllen und 3 x 5 Minuten lang mit 1x PBS und 0,1 % Triton X100 abspülen.
- Zellkerne mit der Hoechst-Lösung 10 min gegenfärben und 3 x 5 min mit 1x PBS spülen.
- Legen Sie Deckgläser über Objektträger in ein wässriges Eindeckmedium, das speziell für die Erhaltung der Fluoreszenz entwickelt wurde. Lassen Sie die Objektträger 1 h bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Fotografieren Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop.
- Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) zur Beurteilung von Netzhautschäden
HINWEIS: Anstatt einen bestimmten Zelltyp durch Immunfärbung zu markieren, kann die allgemeine Netzhauthistologie mit H&E-Färbung beurteilt werden.- Führen Sie nach dem Entwachsen der Abschnitte eine Nukleinsäuremarkierung durch, indem Sie die Objektträger 2 Minuten lang in Hämatoxylinlösung eintauchen. Gut mit Leitungswasser abspülen.
- Führen Sie die Zytoplasmamarkierung durch, indem Sie Objektträger 1 Minute lang in 1%ige Eosinlösung eintauchen. Schnell mit Wasser abspülen.
HINWEIS: Eosin ist sehr gut löslich; Wenn die Objektträger zu lange im Wasser gelassen werden, verschwindet der gesamte Farbstoff. - 2 x 5 min in 100% Ethanol und 2 x 5 min in Xylol spülen.
- Unter der Haube Deckgläser in 4-5 Tropfen eines Eindeckmediums über die Objektträger legen. Lassen Sie die Objektträger unter einer Haube trocknen und fotografieren Sie sie am nächsten Tag mit einem Mikroskop.
- Nachweis apoptotischer Zellen
- Befolgen Sie nach der Entwachsung (siehe Abschnitt 5.2.6) das Protokoll des Kit-Herstellers, um eine apoptotische DNA-Fragmentierung nachzuweisen.
- Die Färbung der Zellkerne ist durchzuführen, indem Objektträger in Hoechst-Lösung getaucht werden (siehe Abschnitt 5.3.8) und mit einem wässrigen Eindeckmedium eingefasst werden, das speziell für die Erhaltung der Fluoreszenz entwickelt wurde. Lassen Sie die Objektträger 1 h bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Fotografieren Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Mechanische Netzhautverletzung
Netzhautschnitte von Kaulquappen, die der in Protokollabschnitt 1 beschriebenen mechanischen Verletzung ausgesetzt waren, zeigen, dass die Netzhautläsion alle Schichten des Gewebes umfasst, während sie auf die Punktionsstelle beschränkt bleibt (Abbildung 2A,B).
Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Die Augen von anästhesierten Tg(rho:GFP-NTR)-transgenen Kaulquappen, die mit einer MTZ-Behandlung behandelt wurden, wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben, wurden unter dem Stereomikroskop analysiert (Abbildung 3A,B). Die Abnahme der GFP-Fluoreszenz zeigt die progressive gezielte Stäbchenzellablation im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 3B), die an Netzhautschnitten durch GFP-Immunfärbung bestätigt wurde, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben (Abbildung 3C).
Stäbchenzelldegeneration durch CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout
Die Netzhäute von Rho-Crispant-Kaulquappen, die wie in Protokollabschnitt 3 beschrieben erhalten wurden, wurden wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben analysiert (Abbildung 4A). Die Markierung von Caspase 3 und Rhodopsin zeigt, dass einige Stäbchen Apoptose durchlaufen (Abbildung 4B). Die H&E-Färbung zeigt eine globale Konservierung der Kernschichten, aber eine starke Verkürzung der äußeren Photorezeptorsegmente (Abbildung 4C). Weitere Immunfärbeanalysen mit Photorezeptormarkern zeigen die Degeneration der Stäbchen und die anschließenden Zapfendefekte (Abbildung 4D und nicht gezeigt). Der Phänotyp wird ab Stadium 40 sichtbar, und die äußeren Segmente der Stäbchen verschwinden allmählich, bis sie ab Stadium 47 nicht mehr in der zentralen Netzhaut vorhanden sind.
Degeneration von Netzhautzellen durch zytotoxische intraokulare CoCl 2-Injektionen
Die Netzhäute von Kaulquappen, die einer intraokularen CoCl2-Injektion unterzogen wurden, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben, wurden mittels Immunfärbung und TUNEL-Assay analysiert, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben (Abbildung 5A). Dies zeigt, dass eine 10 mM CoCl2-Injektion zu einem spezifischen Zelltod von Zapfen-Photorezeptoren führt (Abbildung 5B,C), während 25 mM zu einem breiten retinalen Zelltod führt (Abbildung 5E). Die Immunfärbeanalyse, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben, ergab außerdem das Fehlen von Zapfen in 10 mM CoCl 2-injizierten Netzhäuten (Abbildung 5D) und einen schweren Verlust sowohl von Bipolarzellen als auch von Photorezeptoren nach 25 mM CoCl2-Injektionen (Abbildung 5F).
Abbildung 1: Illustrationen einiger experimenteller Verfahren. (A) Ein Stift mit einem Durchmesser von 0,2 mm, der an einem Stifthalter befestigt ist, wird verwendet, um die Netzhaut zu punktieren. Die Diagramme der Rücken-, Seiten- und Frontalansicht einer Kaulquappe veranschaulichen, wo der Stift (in rot) eingesetzt wird. (B) Schematische Darstellung des transgenen Modells der bedingten Stäbchenzellablation. Der Rhodopsin-Promotor steuert die Expression eines GFP-Nitroreduktase-Fusionsproteins in Stäbchenzellen. Wenn NTR dem Xenopus-Aufzuchtwasser zugesetzt wird, wandelt es Metronidazol in ein Zytotoxin um, wodurch GFP-NTR-Stäbchen gezielt abgetragen werden. (C) Der Kopf einer transgenen Tg(rho:GFP-NTR)-Kaulquappe wird in weißem Licht oder unter Fluoreszenz dargestellt. Die GFP-Färbung im Auge ermöglicht die Sortierung von transgenen Kaulquappen. (D) Embryonen im Einzelzellstadium auf einem Nylongitter unter einem Stereomikroskop, die bereit sind, mit einem Picospritzer-Mikroinjektionssystem injiziert zu werden. (E) Embryonen im Neurula-Stadium (schematisch im Einschub) nach Injektion in das Einzelzellstadium des CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexes, der Fluorescein-Lysin-Dextran enthält. Gut injizierte fluoreszierende Embryonen (grüne Pfeile) können von nicht injizierten (weiße Pfeile) unterschieden werden. (F) Das Bild zeigt den Löffel, der zum Transfer der betäubten Kaulquappen verwendet wurde. (G) Betäubte Kaulquappen in einer Petrischale über einem feuchten Taschentuch. Die in den Mikroinjektor eingeführte Kapillare ermöglicht intraokulare Injektionen der CoCl2-Lösung. (H) Bild, das den Transfer einer Kaulquappe in ein 1-Liter-Becken zeigt, in dem das Tier bis zum Erwachen überwacht werden kann. Maßstabsleisten = 2 mm (C), 1 mm (E). Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; NTR = Nitroreduktase; MTZ = Metronidazol; NF = Nieuwkoop- und Faber-Stadium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mechanische Netzhautverletzung. (A ) Überblick über das in (B) angewandte Versuchsverfahren. Die Kaulquappenaugen von Xenopus laevis werden punktiert und 7 Tage nach der Verletzung an Netzhautschnitten analysiert. Das gepunktete Kästchen zeigt den abgebildeten Bereich an. (B) Zellkerne werden mit Hoechst gegengefärbt. Es werden drei verschiedene Netzhäute gezeigt. Die Pfeile zeigen auf die verletzte Stelle, die alle Netzhautschichten durchquert. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; GCL = Ganglienzellschicht; INL = innere Kernschicht; ONL = äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System. (A ) Überblick über das in (B,C) angewandte Versuchsverfahren. Tg(rho:GFP-NTR)- transgene Kaulquappen von Xenopus laevis werden 7-9 Tage lang mit MTZ behandelt. Die fortschreitende Degeneration der GFP-markierten Stäbchen kann in Echtzeit unter einem Fluoreszenzstereomikroskop beobachtet werden, wie bei 7 Tagen in (B) dargestellt. Der Zelltod der Stäbchen kann auch an Netzhautschnitten analysiert werden, wie nach 14 Tagen in (C) dargestellt, wobei das gepunktete Kästchen den abgebildeten Bereich anzeigt. (B) Nach 7-tägiger Behandlung nimmt die GFP-Intensität in der Netzhaut bei transgenen MTZ-behandelten Kaulquappen im Vergleich zu Kontrollen mit der Zeit ab. (C) Die Abnahme der GFP-Fluoreszenz wird nach 14 Tagen auf Netzhautschnitten durch GFP-Immunfärbung bestätigt. Zellkerne werden mit Hoechst blau gegengefärbt. Maßstabsbalken = 500 μm (B), 50 μm (C). Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; NTR = Nitroreduktase; MTZ = Metronidazol; L = Linse; R = Netzhaut; GCL = Ganglienzellschicht; INL = innere Kernschicht; ONL = äußere Kernschicht; OS = äußere Segmente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Stäbchendegeneration in Xenopus laevis rho crispants. (A) Überblick über das in (B-D) angewandte Versuchsverfahren. Embryonen im Einzelzellstadium wird der Ribonukleoproteinkomplex CRISPR-Cas9 (gRNA-Duplex/Cas9-Protein) injiziert, der das fluoreszierende Lysin Dextran enthält. Im Neurula-Stadium können fluoreszierende injizierte Embryonen sortiert und bis zu verschiedenen Stadien entwickelt werden, um (B) gespaltene Caspase-3-Immunfärbung für die Zelltodanalyse oder (C) Hämatoxylin- und Eosinfärbung für die anatomische Analyse oder (D) Immunfärbung mit Stäbchenmarkern für die Analyse der Degeneration von Photorezeptorzellen durchzuführen. Das gepunktete Kästchen zeigt den abgebildeten Bereich an. (B) Doppelte Markierung von gespaltener Caspase 3 (ein Marker für apoptotische Zellen) und Rhodopsin (ein Marker für Stäbchenaußensegmente) auf Netzhautschnitten von Kontroll- oder Rho-Crispant-Embryonen im Stadium 39 zeigt ein Fehlen von sterbenden Zellen in den Kontrollen und dass sterbende Zellen in Rho-Crispants Stäbchen-Photorezeptoren sind. (C) Die H&E-Färbung auf Netzhautschnitten von Xenopus laevis-Kaulquappen im Stadium 48 zeigt die verringerte Größe der äußeren Segmente der Photorezeptoren im Vergleich zu Kontrollen. (D) Die Co-Immunfärbung von Recoverin (ein Marker für die inneren Stäbchensegmente) und Rhodopsin auf Netzhautschnitten von Xenopus laevis Kaulquappen im Stadium 48 zeigt eine schwere Degeneration im Vergleich zu den Kontrollen. Zellkerne werden mit Hoechst blau gegengefärbt. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: gRNA = guide RNA; H&E = Hämatoxylin und Eosin; GCL = Ganglienzellschicht; INL = innere Kernschicht; ONL = äußere Kernschicht; OS = äußere Segmente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Degeneration von Netzhautzellen durch zytotoxische intraokulare CoCl 2-Injektionen. (A) Überblick über das in (B-F) angewandte Versuchsverfahren. Das gepunktete Kästchen zeigt den abgebildeten Bereich an. Eine Lösung von 10 mM oder 25 mM CoCl2wird intraokular in das Kaulquappenauge injiziert. Die Zellapoptose wird 2 Tage nach der Verletzung (dpi) mit einem TUNEL-Assay (B,C,E) analysiert, während die Degeneration von Netzhautzellen mit 7 bis 14 dpi durch Immunfärbung mit verschiedenen Markern (D,F) analysiert wird. (B-D) Netzhautschnitte von Kaulquappen, die in den Stadien 51-54 mit einer Kochsalzlösung (Kontrollen) oder mit einer 10 mM CoCl2-Lösung injiziert wurden. (B) Die Zelltodanalyse bei 2 dpi zeigt das Vorhandensein sterbender Zellen nach CoCl2-Injektion hauptsächlich in der Kernschicht des Photorezeptors. (C) Die Kopplung der Zelltodfärbung mit der Immunfärbung von S/M Opsin (einem Marker für Zapfen) zeigt, dass es sich bei diesen sterbenden Zellen hauptsächlich um Zapfen handelt. Pfeile zeigen auf doppelt beschriftete Zellen. (D) Die Co-Immunfärbung von S/M Opsin (ein Marker für Zapfen) und Rhodopsin (ein Marker für Stäbchen) zeigt eine starke Abnahme der Zapfenzellmarkierung in CoCl 2-injizierten Netzhäuten im Vergleich zu Kontrollen bei 14 dpi. (E,F) Netzhautschnitte von Kaulquappen, die in den Stadien 51-54 mit einer 25 mM CoCl2-Lösung injiziert wurden. (E) Die Zelltodanalyse bei 2 dpi zeigt das Vorhandensein sterbender Zellen sowohl im Photorezeptor als auch in den inneren Kernschichten. (F) Die Immunfärbung von Otx2 (ein Marker sowohl für Photorezeptoren als auch für bipolare Zellen) zeigt eine starke Abnahme der Färbung in beiden Schichten in CoCl 2-injizierten Netzhäuten im Vergleich zu Kontrollen bei 7 dpi, was auf einen CoCl2-induzierten Zelltod sowohl von Photorezeptoren als auch von Bipolarzellen hindeutet. Zellkerne werden mit Hoechst blau gegengefärbt. Maßstabsleisten: 25 μm. Abkürzungen: ONL = Outer Nuclear Layer; INL = Innere Kernschicht; GCL = Ganglienzellschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Vor- und Nachteile verschiedener Netzhautverletzungsparadigmen bei Xenopus-Kaulquappen
Mechanische Netzhautverletzung
Bei Xenopus-Kaulquappen haben sich verschiedene chirurgische Verletzungen der neuralen Netzhaut entwickelt. Die neurale Netzhaut kann entweder vollständig entfernt werden 15,16 oder nur teilweise entfernt werden16,17. Bei der hier vorgestellten mechanischen Verletzung handelt es sich nicht um eine Netzhautexzision, sondern um eine einfache Augenpunktion, die wir zuvor bei Xenopus-Kaulquappen 6 entwickelt haben. Aufgrund des manuellen Vorgehens eines solchen mechanischen Netzhautverletzungsmodells kann der Phänotyp von Kaulquappe zu Kaulquappe erheblich variieren. Darüber hinaus können die Reproduzierbarkeit und das Ausmaß des Schadens auch variieren, je nachdem, wer das Experiment durchführt. Wir empfehlen daher, dass alle Verletzungsverfahren von derselben Person durchgeführt werden.
Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Das NTR-MTZ-System wurde zur Ablation von Stäbchenzellen in der transgenen Xenopus-Netzhaut verwendet 6,7,8,18. Die Dauer der MTZ-Behandlung variiert von Studie zu Studie erheblich, von 2 bis 7 Tagen. Dies kann unterschiedliche Aktivitäten des NTR widerspiegeln, abhängig von der chromosomalen Insertion in den verschiedenen transgenen Linien. Darüber hinaus stellten wir eine gewisse Variabilität in der Reaktion von Tg(rho:GFP-NTR)-Kaulquappen für eine bestimmte Zeit der MTZ-Behandlung fest, wobei einige eine schwere Stäbchendegeneration erfuhren, während andere nur sehr geringe Schäden aufwiesen. Die Verlängerung der MTZ-Behandlung von 7 auf 9-10 Tage mit dieser transgenen Linie scheint diese Variabilität zu reduzieren. Angesichts der potenziell toxischen Wirkungen von MTZ ist jedoch Vorsicht geboten. Die offensichtlichen Vorteile dieses Modells liegen darin, dass es eine bedingte und reversible Stäbchenzellablation und eine Live-Überwachung der Stäbchendegeneration ermöglicht.
Stäbchenzelldegeneration durch CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout
Das CRISPR-Cas9-Rho-Gen-Editing-Modell von Retinitis pigmentosa führt zu einer Stäbchenzelldegeneration in Xenopus-Kaulquappe 11. Im Gegensatz zum NTR-MTZ-Modell ist die Stäbchenzellablation jedoch konstitutiv und nicht reversibel. Interessanterweise ermöglicht die hohe Effizienz dieses Ansatzes (wir erhalten jetzt regelmäßig >90% der Kaulquappen weisen eine starke Stäbchendegeneration auf) die Arbeit an diesem Modell auf der F0-Generation. Wir arbeiteten zunächst mit sgRNA, stellten aber eine Variabilität bei verschiedenen Chargen von RNA-Präparaten fest. Wir haben kürzlich festgestellt, dass die Bestellung von synthetischer crRNA und tracrRNA und die Herstellung von gRNA-Duplex, wie in diesem Protokoll beschrieben, zuverlässigere Ergebnisse liefert.
Degeneration von Netzhautzellen durch zytotoxische intraokulare CoCl2-Injektionen
Dieses Modell hat mehrere Vorteile gegenüber den anderen hier beschriebenen Modellen. Es ermöglicht nicht nur, die Ablation von Netzhautzelltypen bedingt zu induzieren, sondern auch die Schwere der Schädigung zu modulieren14. Darüber hinaus stellt es unseres Wissens das einzige Modell der spezifischen Zapfendegeneration bei Xenopus dar. Schließlich erzeugt es eine geringe Variabilität des degenerativen Phänotyps.
Wirksamkeit der vier Paradigmen der Netzhautläsion
Um die potenzielle Variabilität der Phänotypen von einer Charge von Kaulquappen zur anderen zu berücksichtigen, wird empfohlen, die Wirksamkeit der Netzhautdegeneration an 8-10 Kaulquappen zu überprüfen. Bei mechanischen Verletzungen muss der Schaden an den Tagen nach der Verletzung analysiert werden, da die Läsion eine Woche später nicht mehr sichtbar ist. Im NTR-MTZ-Modell ist die Stäbchendegeneration 1 Woche nach Beendigung der MTZ-Behandlung deutlich sichtbar. Da der Zelltod der Stäbchen mit der vollständigen Differenzierung der Photorezeptoren beginnt, empfehlen wir für Rho-Crispants, die degenerative Effizienz ab Stadium 45 zu analysieren. Im CoCl2-Modell tritt der Zelltod innerhalb einer Woche nach der Injektion ein. In Bezug auf das zu erwartende prozentuale Überleben für jede Methode möchten wir anmerken, dass CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex-Injektionen in den ersten 48 Stunden zu höheren Mortalitätsraten führen als herkömmliche RNA-Injektionen (nach diesen ersten 48 Stunden bleiben keine Wachstums- oder Überlebensprobleme bestehen), und daher sollten bei Bedarf mehr Embryonen injiziert werden. Im Gegensatz dazu stellen andere Verfahren (mechanische Verletzungen, MTZ-Behandlung oder intraokulare CoCl2-Injektionen) keine Überlebensprobleme dar.
Mögliche Anwendungen dieser Verletzungsparadigmen zur Untersuchung der Netzhautregeneration
Eine mögliche Anwendung dieser Reihe von Netzhautverletzungsmodellen ist die Untersuchung der Netzhautregeneration. In einem pathologischen Kontext können verschiedene Quellen von retinalen Stammzellen oder stammähnlichen Zellen rekrutiert werden, darunter CMZ-Zellen, Müller-Gliazellen und RPE-Zellen. Wir haben berichtet, dass das Modell der mechanischen Verletzung, das NRT/MTZ-Modell und das CRISPR/Cas9-Modell alle attraktive Modelle für die Untersuchung der Müller-Zellaktivierung nach einer Verletzung sind 6,11. Interessanterweise können im CoCl2-Modell alle drei zellulären Quellen rekrutiert werden14, was ein neuartiges Modell für die Untersuchung der Mechanismen darstellt, die der Rekrutierung und Reprogrammierung verschiedener Netzhautzelltypen zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Stipendien an M.P. von der Association Retina France, der Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) und UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in Zusammenarbeit mit ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
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- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
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- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
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