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Developmental Biology

ज़ेनोपस टैडपोल में रेटिना चोट मॉडल उत्पन्न करना

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65771
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay
* These authors contributed equally

Summary

हमने ज़ेनोपस लाविस टैडपोल में रेटिना क्षति या रेटिना अध: पतन को प्रेरित करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। ये मॉडल रेटिना पुनर्जनन तंत्र का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करते हैं।

Abstract

रेटिना न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अंधापन के प्रमुख कारण हैं। कई चिकित्सीय रणनीतियों का पता लगाया जा रहा है, हाल ही में आत्म-मरम्मत को उत्तेजित करना विशेष रूप से आकर्षक के रूप में उभरा। रेटिना की मरम्मत के लिए ब्याज का एक सेलुलर स्रोत मुलर ग्लियल सेल है, जो स्टेम सेल क्षमता और एनामोट्स में एक असाधारण पुनर्योजी क्षमता को परेशान करता है। हालांकि, स्तनधारियों में यह क्षमता बहुत सीमित है। पुनर्योजी क्षमताओं के साथ पशु मॉडल में रेटिना पुनर्जनन अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन कैसे स्तनधारी मुलर कोशिकाओं की अव्यक्त क्षमता को अनलॉक करने के लिए रेटिना पुनर्जीवित करने के लिए में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए. पुनर्योजी चिकित्सा में चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है। इस उद्देश्य के लिए, हमने ज़ेनोपस में कई रेटिना चोट प्रतिमान विकसित किए: एक यांत्रिक रेटिना चोट, एक ट्रांसजेनिक लाइन जो नाइट्रोरेडक्टेस-मध्यस्थता फोटोरिसेप्टर सशर्त पृथक्करण के लिए अनुमति देती है, सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट पर आधारित एक रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा मॉडल, और इंट्राओकुलर सीओसीएल2 इंजेक्शन द्वारा संचालित एक साइटोटोक्सिक मॉडल। उनके फायदे और नुकसान पर प्रकाश डालते हुए, हम यहां प्रोटोकॉल की इस श्रृंखला का वर्णन करते हैं जो विभिन्न अपक्षयी स्थितियों को उत्पन्न करते हैं और ज़ेनोपस में रेटिना पुनर्जनन के अध्ययन की अनुमति देते हैं।

Introduction

दुनिया भर में लाखों लोग विभिन्न रेटिना अपक्षयी रोगों से पीड़ित हैं, जो अंधापन की ओर ले जाते हैं, जैसे कि रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, डायबिटिक रेटिनोपैथी, या उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी)। आज तक, ये स्थितियां काफी हद तक अनुपचार्य बनी हुई हैं। मूल्यांकन के तहत वर्तमान चिकित्सीय दृष्टिकोणों में जीन थेरेपी, सेल या ऊतक प्रत्यारोपण, न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार, ऑप्टोजेनेटिक्स और प्रोस्थेटिक डिवाइस शामिल हैं। एक और उभरती हुई रणनीति स्टेम सेल क्षमता के साथ अंतर्जात कोशिकाओं के सक्रियण के माध्यम से आत्म-उत्थान पर आधारित है। मुलर ग्लियाल कोशिकाएं, रेटिना के प्रमुख ग्लियल सेल प्रकार, इस संदर्भ में रुचि के सेलुलर स्रोतों में से हैं। चोट लगने पर, वे विभेदन, प्रसार कर सकते हैं, और न्यूरॉन्स 1,2,3 उत्पन्न कर सकते हैं। यद्यपि यह प्रक्रिया ज़ेब्राफिश या ज़ेनोपस में बहुत प्रभावी है, लेकिन स्तनधारियों में यह काफी हद तक अक्षम है।

फिर भी, यह दिखाया गया है कि मिटोजेनिक प्रोटीन या विभिन्न कारकों की अतिअभिव्यक्ति के साथ उपयुक्त उपचार स्तनधारी मुलर ग्लिया सेल-चक्र पुन: प्रवेश को प्रेरित कर सकते हैं और कुछ मामलों में, उनके बाद के न्यूरोजेनेसिस प्रतिबद्धता 1,2,3,4,5 को ट्रिगर कर सकते हैं। हालांकि, यह उपचार के लिए काफी हद तक अपर्याप्त है। इसलिए, पुनर्जनन अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को बढ़ाना मुलर स्टेम जैसी सेल गुणों को नई सेलुलर चिकित्सीय रणनीतियों में कुशलतापूर्वक बदलने में सक्षम अणुओं की पहचान करना आवश्यक है।

इस उद्देश्य के साथ, हमने ज़ेनोपस में कई चोट प्रतिमान विकसित किए जो रेटिना सेल अपघटन को ट्रिगर करते हैं। यहां, हम (1) एक यांत्रिक रेटिना की चोट पेश करते हैं जो सेल प्रकार-विशिष्ट नहीं है, (2) एनटीआर-एमटीजेड प्रणाली का उपयोग करके एक सशर्त और प्रतिवर्ती सेल पृथक्करण मॉडल जो रॉड कोशिकाओं को लक्षित करता है, (3) एक सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा का एक मॉडल जो प्रगतिशील रॉड सेल अपघटन को ट्रिगर करता है, और (4) एक सीओसीएल2-प्रेरित साइटोटोक्सिक मॉडल जो खुराक के अनुसार विशेष रूप से शंकु को लक्षित कर सकता है या व्यापक रेटिना सेल अध: पतन का कारण बन सकता है। हम प्रत्येक प्रतिमान की विशिष्टताओं, फायदे और नुकसान पर प्रकाश डालते हैं।

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Protocol

पशु देखभाल और प्रयोग संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, संस्थागत लाइसेंस A91272108 के तहत आयोजित किए गए. अध्ययन प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल समिति सीईईए # 59 द्वारा अनुमोदित किया गया था और संदर्भ संख्या एपीएएफआईएस # 32589-2021072719047904 v4 और एपीएएफआईएस # 21474-2019071210549691 v2 के तहत दिशा विभाग डे ला प्रोटेक्शन डेस आबादी द्वारा प्राधिकरण प्राप्त किया गया था। इन प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. यांत्रिक रेटिना की चोट

नोट: यहाँ वर्णित चोट प्रतिमान प्रोटोकॉल चरण 45 के बाद से एक टैडपोल के एक यांत्रिक रेटिना पंचर के होते हैं. इसलिए, यह किसी विशेष रेटिना सेल प्रकार को लक्षित नहीं करता है, लेकिन पंचर साइट पर रेटिना की पूरी मोटाई को नुकसान पहुंचाता है।

  1. टैडपोल के लिए संवेदनाहारी की तैयारी
    1. बेंज़ोकेन का 10% स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 एमएल की कुल मात्रा के लिए, बेंज़ोकेन का 1 ग्राम, डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) के 2 एमएल, और प्रोपलीन ग्लाइकोल के 8 एमएल जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए स्टॉक समाधान का संरक्षण करें।
    2. टैडपोल-पालन पानी (फ़िल्टर्ड और डीक्लोरीनेटेड नल के पानी) के 50 एमएल में 10% बेंज़ोकेन स्टॉक समाधान के 25 माइक्रोन जोड़कर उपयोग के समय 0.005% बेंज़ोकेन समाधान तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: बेंज़ोकेन की एकाग्रता विशेष रूप से कम है क्योंकि टैडपोल वयस्कों की तुलना में संज्ञाहरण के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं।
  2. पिन तैयारी
    1. एक निष्फल पिन धारक(चित्रा 1ए)को 0.2 मिमी व्यास बाँझ पिन संलग्न करें।
  3. टैडपोल एनेस्थीसिया
    1. उनके टैंकों में टैडपोल पकड़ने के लिए एक डुबकी जाल का उपयोग करें। उन्हें 0.005% बेंज़ोकेन समाधान वाले एक नए टैंक में स्थानांतरित करें। कुछ मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि टैडपोल उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया करना बंद न कर दें (टैंक या सीधे संपर्क को टैप करना)।
      नोट: कई टैडपोल को एक साथ एनेस्थेटाइज किया जा सकता है, लेकिन संवेदनाहारी समाधान में बिताया गया समय 30 मिनट से कम होना चाहिए।
  4. रेटिना पंचर
    1. एक टैडपोल को पकड़ने के लिए एक चम्मच का प्रयोग करें और इसे गीले ऊतक वाले छोटे पेट्री डिश (55 मिमी व्यास) पर सावधानी से रखें। पेट्री डिश के बीच में टैडपोल पृष्ठीय पक्ष की स्थिति।
    2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, आंख के पृष्ठीय पक्ष पर पिन को धीरे से डालकर रेटिना को पंचर करें, जब तक कि यह रेटिना (चित्रा 1 ए) से न गुजरे। यदि कई प्रहार की आवश्यकता है, तो इस प्रक्रिया को विभिन्न स्थानों पर दोहराएं। दाहिनी आंख पंचर करने के बाद, बाईं आंख पंचर करने के लिए पेट्री डिश 180 ° बारी.
    3. पेट्री डिश को ध्यान से विसर्जित करके 1 एल पालन पानी युक्त एक बड़े टैंक में घाव वाले टैडपोल को स्थानांतरित करें। टैडपोल की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे पूरी तरह से जागृत न हो जाएं।

2. एनटीआर-एमटीजेड सिस्टम का उपयोग करके सशर्त रॉड सेल पृथक्करण

प्रोटोकॉल का उद्देश्य ज़ेनोपस टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) ट्रांसजेनिक लाइन6 में विशिष्ट रॉड सेल एब्लेशन को प्रेरित करना है, जो टीईएफओआर पेरिस-सैकले की ज़ूटेक्निक सेवा में उपलब्ध है, जो फ्रेंच ज़ेनोपस संसाधन केंद्र को होस्ट करता है। यह केमोजेनेटिक प्रणाली प्रोड्रग मेट्रोनिडाजोल (एमटीजेड) को साइटोटॉक्सिक डीएनए क्रॉस-लिंकिंग एजेंट में परिवर्तित करने के लिए नाइट्रोरेडक्टेस (एनटीआर) एंजाइम की क्षमता का उपयोग करती है, विशेष रूप से एनटीआर-व्यक्त छड़(चित्रा 1बी)को समाप्त करने के लिए। टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) या टीजी (आरएचओ: एनटीआर) ट्रांसजेनिक जानवरों को बनाने और अध: पतन को प्रेरित करने के लिए दो विस्तृत प्रोटोकॉल पहले 7,8 प्रकाशित किए गए हैं। यहां, हम केवल रेटिना अपघटन को शामिल करने और विवो में अध: पतन प्रक्रिया की निगरानी करने के तरीके का विस्तार करते हैं।

  1. मेट्रोनिडाजोल समाधान की तैयारी
    1. चुंबकीय हलचल-बार और चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग करके 0.1% डीएमएसओ युक्त टैडपोल-पालन पानी के 1 एल में एक अंधेरे बोतल में 1.67 ग्राम एमटीजेड पाउडर को भंग करके उपयोग के समय 10 एमएम एमटीजेड समाधान तैयार करें।
      नोट: MTZ प्रकाश-संवेदनशील है। पूर्ण विघटन में 10 मिनट तक का समय लग सकता है।
  2. Tg (rho: GFP-NTR) लाइन से प्राकृतिक संभोग द्वारा ट्रांसजेनिक टैडपोल उत्पन्न करना
    नोट: चूंकि ट्रांसजेनिक पुरुष एक कीमती स्टॉक का प्रतिनिधित्व करते हैं, इसलिए हम नर को बलिदान नहीं करने और बार-बार उपयोग करने के लिए प्राकृतिक संभोग के माध्यम से भ्रूण उत्पन्न करना पसंद करते हैं।
    1. हार्मोन प्रशासन
      1. Xenopus laevis जंगली प्रकार महिलाओं के पृष्ठीय लिम्फ थैली में 25G सुइयों के साथ मानव chorionic gonadotropin हार्मोन (एचसीजी) के 600 आईयू इंजेक्षन. पृष्ठीय लिम्फ थैली में एचसीजी के 100-200 आईयू के साथ ट्रांसजेनिक पुरुषों को इंजेक्ट करें। रॉड अध: पतन (2.4 कदम) की लाइव निगरानी के लिए, उत्पन्न ट्रांसजेनिक टैडपोल की आंखों में प्रतिदीप्ति विविधताओं की बेहतर कल्पना करने के लिए, रंजित लोगों के बजाय अल्बिनो ज़ेनोपस का उपयोग करें।
        नोट: ज़ेनोपस महिलाओं को नियोजित ओव्यूलेशन से 1 से 7 दिन पहले एचसीजी के 50 आईयू के साथ प्राइम किया जा सकता है, लेकिन यह वैकल्पिक है।
    2. संभोग और अंडा संग्रह
      1. एचसीजी इंजेक्शन के तुरंत बाद, अगले दिन तक 20 डिग्री सेल्सियस पर एक एचसीजी इंजेक्शन वाली महिला के साथ एक टैंक एक टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) ट्रांसजेनिक पुरुष में डाल दिया। बड़ी मात्रा (कम से कम 10 एल) का उपयोग करें और अंडों का पालन करने के लिए छोटी वस्तुओं को जोड़ें, ताकि अंडे वयस्कों के आंदोलनों से क्षतिग्रस्त न हों। अगले दिन, जब मेंढक अब एम्पलेक्सस में नहीं हैं, तो वयस्कों को टैंक से हटा दें और भ्रूण इकट्ठा करें।
    3. भ्रूण और टैडपोल का उत्थान
      1. ज़ेनोपस विकास की सामान्य तालिका के अनुसार स्टेज भ्रूण और टैडपोल9.
      2. टैडपोल पालन पानी से भरे टैंक में भ्रूण उठाएं। स्टेज 45 से, टैडपोल को पाउडर फ्राई फूड खिलाएं और पानी को बब्बलर से ऑक्सीजन दें। वाष्पीकरण की भरपाई के लिए यदि आवश्यक हो तो प्रतिदिन पानी डालें और पूरे टैंक के पानी को साप्ताहिक रूप से बदलें।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, सप्ताह में दो बार 50% वॉल्यूम का आदान-प्रदान करना भी संभव है। एक विस्तृत प्रोटोकॉल10 में पाया जा सकता है.
    4. ट्रांसजेनिक भ्रूण छँटाई
      1. चरण 37/38 से, सॉर्ट करें और सीधे जीएफपी(चित्रा 1सी)की कल्पना करके एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ट्रांसजेनिक भ्रूण का चयन करें।
  3. टैडपोल एमटीजेड उपचार
    1. Tg (rho: GFP-NTR) ट्रांसजेनिक टैडपोल को 10 मिमी MTZ समाधान वाले टैंक में स्थानांतरित करें और उन्हें 1 सप्ताह के लिए अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर पीछे करें। नियंत्रण के रूप में 0.1% डीएमएसओ युक्त टैडपोल-पालन पानी में उठाए गए ट्रांसजेनिक भाई-बहनों का उपयोग करें।
    2. उपचार अवधि के दौरान हर दूसरे दिन एमटीजेड और नियंत्रण समाधान बदलें। एमटीजेड उपचार के दौरान हमेशा की तरह टैडपोल खिलाएं।
    3. व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति निगरानी (चरण 2.4) के लिए, प्रत्येक टैडपोल को अपने छोटे कंटेनर में 30 एमएल एमटीजेड या नियंत्रण समाधान के साथ चरण 2.3.1 से आगे रखें।
      नोट: एमटीजेड उपचार चरण 45 से किसी भी समय किया जा सकता है।
  4. रॉड अध: पतन की लाइव निगरानी
    नोट: छड़ के प्रगतिशील अध: पतन वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है। इसलिए, चरण 2.4.1 करें। 2.4.4 करने के लिए। एमटीजेड उपचार से पहले और फिर नियमित रूप से उपचार के बाद।
    1. संवेदनाहारी और टैडपोल संज्ञाहरण की तैयारी के लिए क्रमशः चरण 1.1 और 1.3 का पालन करें।
    2. एक टैडपोल को पकड़ने के लिए एक चम्मच का प्रयोग करें और इसे एक छोटे पेट्री डिश (55 मिमी व्यास) में गीले ऊतक पर सावधानी से रखें। एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य = 488 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य = 509 एनएम) के तहत जीएफपी प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करें और आंख की तस्वीरें लें। एक कम प्रतिदीप्ति तीव्रता छड़ के क्षरण को दर्शाती है।
      नोट: मात्रात्मक तुलना करने के लिए, सभी टैडपोल इमेजिंग के लिए समान सेटिंग्स को बनाए रखा जाना चाहिए।
    3. ध्यान से पेट्री डिश विसर्जित द्वारा पालन पानी के 1 एल युक्त एक बड़े टैंक के लिए imaged टैडपोल स्थानांतरण. टैडपोल की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे पूरी तरह से जागृत न हो जाएं।
    4. अध: पतन प्रक्रिया की प्रभावकारिता की निगरानी और आकलन करने के लिए एमटीजेड-उपचारित और नियंत्रण टैडपोल आंखों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करें।

3. CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले रोडोप्सिन नॉकआउट द्वारा रॉड सेल अध: पतन

नोट: यह प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट का उपयोग करके विशिष्ट रॉड सेल अध: पतन को प्रेरित करके ज़ेनोपस लाविस में रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा का एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए स्थापित किया गया है। F0 में सम्मिलन-विलोपन (इंडल्स) का%11 में प्रदान किया गया है और ~ 75% है। इस तरह के CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले रोडोप्सिन नॉकआउट को ज़ेनोपस ट्रॉपिकलिस टैडपोल 11 में भी किया जा सकता है।

  1. समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. crRNA और tracrRNA आदेश देना
      1. रोडोप्सिन (rho) जीन और मानक ट्रांस-एक्टिवेटिंग crRNA (tracrRNA) को लक्षित करने वाले सिंथेटिक CRISPR RNA (crRNA) खरीदें। crRNA एक rho लक्ष्य-विशिष्ट क्षेत्र (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) और एक अन्य (GUUUUAGAGCUAUGCU) से बना है जो tracrRNA को संकरण करता है।
    2. सीआरएनए: tracrRNA डुप्लेक्स (rho gRNA डुप्लेक्स)
      1. न्यूक्लियस मुक्त द्वैध बफर में 100 माइक्रोन पर crRNA और tracrRNA को फिर से निलंबित करें।
      2. 100 माइक्रोन rho crRNA के 3 माइक्रोन, 100 माइक्रोन tracrRNA के 3 माइक्रोन, और डुप्लेक्स बफर के 94 माइक्रोन को मिलाकर जीआरएनए डुप्लेक्स तैयार करें। अंतिम सांद्रता 36 एनजी/जेड.एल.आर.एच., सीआरएनए, और 67 एनजी/ जेड.एल .
      3. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गर्म करके oligos anneal और धीरे-धीरे कमरे के तापमान के लिए उन्हें ठंडा. विभाज्य बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (यानी, gRNA डुप्लेक्स / Cas9 प्रोटीन)
      1. उपयोग के समय, rho gRNA डुप्लेक्स और Cas9 प्रोटीन का मिश्रण तैयार करें। 20 माइक्रोन के लिए, rho gRNA डुप्लेक्स समाधान के 10 माइक्रोन, Cas9 प्रोटीन के 2 माइक्रोन (5 मिलीग्राम/एमएल पर स्टॉक), फ्लोरेसिन लाइसिन डेक्सट्रान के 2 माइक्रोन (10 मिलीग्राम/एमएल पर स्टॉक), और आरएनएएसई-मुक्त पानी के 6 माइक्रोन जोड़ें।
      2. राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए इनक्यूबेट करें और समाधान को कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें।
      3. नियंत्रण समाधान के 20 माइक्रोन के लिए, कैस 9 प्रोटीन के 2 माइक्रोन, फ्लोरेसिन लाइसिन डेक्सट्रान के 2 माइक्रोन और आरएनएज़ मुक्त पानी के 16 माइक्रोन मिलाएं।
    4. 10x, 1x और 0.1x एमबीएस समाधान तैयार करना
      1. संशोधित बार्थ के खारा स्टॉक समाधान (10x एमबीएस) को 11.92 ग्राम एचईपीईएस, 51.43 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 0.75 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 2.1 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3), और 2.46 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट (एमजीएसओ4, 7 एच2ओ) टाइप II पानी में 800 एमएल जोड़कर तैयार करें। 30% सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) के साथ पीएच को 7.8 पर समायोजित करें। टाइप II पानी डालें जब तक कि वॉल्यूम 1 L न हो जाए और ऑटोक्लेविंग द्वारा बाँझ करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      2. टाइप II पानी में 10x एमबीएस नमक समाधान के 100 एमएल और 0.1 एम कैल्शियम क्लोराइड डाइहाइड्रेट (सीएसीएल 2, 2 एच2ओ) के 7 एमएल को पतला करके 1x एमबीएस समाधान का 1 एल तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      3. टाइप II पानी में 1x एमबीएस समाधान को पतला करके 0.1x एमबीएस समाधान तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    5. वयस्कों के लिए बेंज़ोकेन समाधान
      1. टैडपोल-पालन पानी के 1 एल में 10% बेंज़ोकेन स्टॉक समाधान (चरण 1.1.1 देखें) के 5 एमएल जोड़कर 0.05% बेंज़ोकेन समाधान तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं।
        नोट: एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए इस समाधान का संरक्षण। जानवरों पर इस्तेमाल होने से पहले कमरे के तापमान पर समाधान लाएं।
    6. एल-सिस्टीन समाधान
      1. 0.1x एमबीएस समाधान के 100 एमएल में एल-सिस्टीन हाइड्रोक्लोरिक मोनोहाइड्रेट के 2 ग्राम जोड़कर उपयोग के समय डीजेलिंग समाधान तैयार करें। 30% NaOH के साथ पीएच को 7.8 पर समायोजित करें।
    7. पॉलीसुक्रोज समाधान
      1. 0.1x एमबीएस समाधान के 100 एमएल में पॉलीसुक्रोज के 3 ग्राम जोड़कर घने पॉलीसुक्रोज समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ हफ्तों के लिए इस समाधान की दुकान.
  2. इन विट्रो निषेचन और dejellying में
    नोट: इन विट्रो निषेचन में Xenopus के बारे में अधिक जानकारी12 में एक विस्तृत समर्पित प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है।
    1. ओव्यूलेशन को प्रेरित करने के लिए Xenopus laevis महिलाओं को हार्मोन प्रशासन
      1. oocyte कटाई से पहले लगभग 15 घंटे, महिला के पृष्ठीय लिम्फ थैली में एचसीजी के 600 आईयू इंजेक्षन और यह 18 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखना.
    2. वृषण विच्छेदन
      1. 10-15 मिनट के लिए 0.05% बेंज़ोकेन समाधान की घातक खुराक के साथ ज़ेनोपस पुरुष को इच्छामृत्यु दें। एक पूरक इच्छामृत्यु विधि के रूप में, तेज और मजबूत कैंची के साथ खोपड़ी के तुरंत पीछे रीढ़ को अलग करें। विच्छेदन कैंची के साथ पेट गुहा खोलें, वृषण बाहर कटौती, और दूर किसी भी संलग्न वसा और केशिकाओं ट्रिम. प्रत्येक वृषण को तुरंत 1x एमबीएस के 1 एमएल में बर्फ पर रखें।
    3. शुक्राणु की तैयारी
      1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए मूसल का उपयोग करके एक वृषण को क्रश करें और 1x एमबीएस के 9 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में निलंबन को पतला करें। दूसरी वृषण ट्यूब में जेंटामाइसिन के 10 माइक्रोग्राम / एमएल जोड़ें और आगे निषेचन प्रयोगों के लिए कुछ दिनों के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. इन विट्रो निषेचन में
      1. धीरे हार्मोन इंजेक्शन महिला की पीठ मालिश और एक पेट्री डिश (100 मिमी व्यास) में oocytes इकट्ठा. शुक्राणु समाधान की कुछ बूंदों को oocytes में फैलाएं। 5 मिनट प्रतीक्षा करें और उन्हें 0.1x एमबीएस के साथ कवर करें। dejellying के साथ आगे बढ़ने से पहले 10 मिनट प्रतीक्षा करें.
    5. निषेचित अंडा dejellying
      1. निषेचित अंडे (~ 5 मिनट) से जेली कोट को हटाने के लिए dejellying समाधान के साथ 0.1x एमबीएस समाधान बदलें। अच्छी तरह से 0.1x एमबीएस के साथ भ्रूण 5-6 बार कुल्ला और 0.1x एमबीएस से भरा एक नया 100 मिमी पेट्री डिश के लिए उन्हें हस्तांतरण.
  3. माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली की तैयारी
    1. एक माइक्रोपिपेट पुलर के साथ कांच केशिकाओं को तेज करें13.
    2. CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के 2-10 माइक्रोन या माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके नियंत्रण समाधान के साथ एक तेज केशिका भरें और केशिका को माइक्रोइंजेक्टर हैंडलर में रखें।
    3. एक stereomicroscope के उच्चतम बढ़ाई पर, ठीक संदंश के साथ केशिका टिप को तोड़ने, और नाड़ी प्रति 10 एनएल की एक इंजेक्शन मात्रा प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन समय (~ 400 एमएस) को समायोजित. इजेक्शन दबाव को लगभग 40 PSI पर सेट करें।
  4. CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ एक-सेल-चरण भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन
    1. एक ग्रिड (1 मिमी नायलॉन ऊतक) पर एक सेल चरण भ्रूण 3% polysucrose समाधान (चित्रा 1 डी) से भरा एक 100 मिमी पेट्री डिश में सरेस से जोड़ा हुआ रखें.
    2. माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करना और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के 10 nL को इंजेक्ट करें (जो प्रति भ्रूण gRNA डुप्लेक्स + 5 ng Cas9 प्रोटीन के 500 pg से मेल खाती है) या पशु ध्रुव के स्तर पर नियंत्रण समाधान, कॉर्टिकल क्षेत्र में, बस साइटोप्लाज्मिक झिल्ली के नीचे।
      नोट: समाधान में निहित फ्लोरेसिन लाइसिन डेक्सट्रान इंजेक्शन भ्रूण के बाद छँटाई की अनुमति देता है।
    3. इंजेक्शन भ्रूण एक साफ polysucrose समाधान युक्त एक नया 100 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और उन्हें 21 डिग्री सेल्सियस पर जगह है.
    4. पहले दिन, नियमित रूप से अच्छी तरह से विकसित भ्रूण को छाँटने और microinjection के बाद 5 घंटे के आसपास 0.1x एमबीएस के साथ polysucrose समाधान की जगह.
    5. फ्लोरोसिन लाइसिन डेक्सट्रान(चित्रा 1ई)की कल्पना करके एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले आरएच क्रिस्पंट भ्रूण को सॉर्ट करने और चुनने के लिए इंजेक्शन के बाद 24 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: निषेचन के बाद पहले माइक्रोइंजेक्शन, नॉकआउट जितना अधिक प्रभावी होगा।
  5. भ्रूण और टैडपोल का उत्थान
    1. चरण 37/38 तक पेट्री डिश में 0.1x एमबीएस में rho कुरकुरा भ्रूण उठाएँ. दैनिक मृत भ्रूण निकालें और 0.1x एमबीएस समाधान बदलें। चरण 37/38 से, टैडपोल पालन पानी से भरा एक टैंक में भ्रूण उठाने, और चरण 45 से कदम 2.2.3 के रूप में आगे बढ़ना.

4. साइटोटॉक्सिक इंट्राओकुलर CoCl 2 इंजेक्शन द्वारा रेटिना सेल अध: पतन

नोट: यह प्रोटोकॉल ज़ेनोपस लाएविस टैडपोल में कोबाल्ट क्लोराइड (सीओसीएल2) के इंट्राओकुलर इंजेक्शन द्वारा रेटिना सेल अपघटन को प्रेरित करने के लिए स्थापित किया गया है। खुराक के अनुसार, यह एक शंकु विशिष्ट अध: पतन या एक व्यापक अध: पतन14 ट्रिगर कर सकते हैं. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग Xenopus laevis tadpoles में चरण 48 के बाद से आयु वर्ग के हैं। इसका उपयोग ज़ेनोपस ट्रॉपिकलिस टैडपोल में भी किया जा सकता है।

  1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. चरण 1.1 के रूप में उपयोग के समय 0.005% बेंज़ोकेन समाधान तैयार करें।
    2. 0.1x एमबीएस के 5 एमएल में 118.5 मिलीग्राम जोड़कर 100 एमएम सीओसीएल2 स्टॉक समाधान तैयार करें (0.1x एमबीएस तैयार करने के लिए चरण 3.1.4 देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए इस स्टॉक समाधान का संरक्षण, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से संरक्षित।
      चेतावनी: CoCl2 मानव और पशु जीवन के लिए एक विषाक्त यौगिक के रूप में वर्गीकृत किया गया है. सुरक्षा डेटा शीट पर हैंडलिंग, भंडारण और अपशिष्ट निपटान के निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करें।
    3. शंकु विशिष्ट अध: पतन के लिए, 0.1x एमबीएस में पतला 100 मिमी शेयर समाधान से उपयोग के समय एक 10 मिमी CoCl2 समाधान तैयार करें. व्यापक रेटिना सेल अध: पतन के लिए, एक 25 मिमी CoCl2 समाधान तैयार.
  2. इंजेक्शन प्रणाली की तैयारी
    1. एक माइक्रोपिपेट पुलर के साथ कांच केशिकाओं को तेज करें 13.
    2. माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके 10 या 25 एमएम सीओसीएल 2 समाधान या नियंत्रण समाधान (0.1x एमबीएस) के 2-10 माइक्रोन के साथ एक तेज केशिका भरें और केशिका को माइक्रोइंजेक्टर हैंडलर में रखें।
    3. एक stereomicroscope के उच्चतम बढ़ाई पर, ठीक संदंश के साथ केशिका टिप को तोड़ने, और नाड़ी प्रति 15-40 एनएल की एक इंजेक्शन मात्रा प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन समय (लगभग 100 एमएस) को समायोजित. ~ 40 पीएसआई करने के लिए इजेक्शन दबाव सेट.
      नोट: ड्रॉप के आकार को टैडपोल के चरण और उनकी आंख के आकार के अनुकूल बनाया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, चरणों 48-49 पर, ड्रॉप आकार ~ 15-20 एनएल है, जबकि यह 52-56 चरणों में 30-40 एनएल है। नेत्रहीन, ड्रॉप का आकार लेंस के आकार से थोड़ा बड़ा है।
  3. CoCl2 इंट्राओकुलर इंजेक्शन
    1. उनके टैंकों में टैडपोल पकड़ने के लिए एक डुबकी जाल का उपयोग करें। उन्हें 0.005% बेंज़ोकेन समाधान के 50 एमएल में स्थानांतरित करें। कुछ मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि टैडपोल उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया करना बंद न कर दें।
      नोट: एक ही समय में कई टैडपोल को एनेस्थेटाइज़ किया जा सकता है, लेकिन संवेदनाहारी में बिताया गया समय 30 मिनट से कम होना चाहिए।
    2. एक टैडपोल को पकड़ने के लिए एक चम्मच का प्रयोग करें और इसे गीले ऊतक वाले छोटे पेट्री डिश (55 मिमी व्यास) में सावधानी से डालें। टैडपोल पृष्ठीय पक्ष को पेट्री डिश (चित्रा 1 एफ, जी) के बीच में रखें।
    3. एक stereomicromécor के तहत microinjector का प्रयोग intraocularly CoCl2 समाधान इंजेक्षन करने के लिए. धीरे लेंस के ऊपर आंख में केशिका डालें. जब केशिका टिप आंख के अंदर होती है, तो प्रति आंख दो बूंदों को बाहर निकालें। दाहिनी आंख इंजेक्शन के बाद, बाईं आंख इंजेक्षन करने के लिए मैन्युअल रूप से 180 ° पेट्री डिश बारी.
      नोट: सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन आंख के अंदर किया जाता है, इसलिए समाधान की प्रत्येक अस्वीकृति के बाद आंख की थोड़ी सूजन देखी जानी चाहिए। टैडपोल को जितना संभव हो उतना कम पानी के बाहर रहना चाहिए। दोनों आंखों के इंजेक्शन में 1 मिनट से भी कम समय लगना चाहिए।
    4. इंजेक्शन टैडपोल को पेट्री डिश(चित्रा 1एच)में सावधानी से विसर्जित करके 1 एल पालन पानी वाले बड़े टैंक में स्थानांतरित करें। टैडपोल की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे पूरी तरह से जागृत न हो जाएं।

5. रेटिना क्षति या रेटिना अध: पतन का आकलन करने के लिए धुंधला हो जाना

  1. टैडपोल निर्धारण और निर्जलीकरण
    1. 1x पीबीएस के 700 एमएल में 32% पीएफए समाधान के 100 एमएल को पतला करके 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें। NaOH के साथ पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। इस शेयर समाधान विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए इसे संरक्षण.
    2. 0.01% बेंज़ोकेन में टैडपोल को इच्छामृत्यु दें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 4% पीएफए युक्त शीशी में स्थानांतरित करें या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। 1x पीबीएस में 3 x 5 मिनट कुल्ला।
    3. 70% और 95% इथेनॉल (प्रकार II पानी में पतला) में लगातार 30 मिनट ऊष्मायन द्वारा उत्तरोत्तर निर्जलीकरण टैडपोल, इसके बाद 100% इथेनॉल में तीन और 1 घंटे ऊष्मायन होते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर इस कदम पर टैडपोल सिर स्टोर करें या सीधे उन्हें आगे के चरणों के लिए रात भर 100% ब्यूटेनॉल में स्थानांतरित करें।
  2. पैराफिन सेक्शनिंग
    1. 62 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पिघला हुआ पैराफिन के साथ 100% ब्यूटेनॉल बदलें। 62 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त ऊष्मायन के 2 x 2 घंटे के लिए पैराफिन बदलें।
    2. टैडपोल सिर को डिस्पोजेबल पैराफिन एम्बेडिंग मोल्ड्स में स्थानांतरित करें और उन्हें उन्मुख करें ताकि उनकी आंखें अच्छी तरह से संरेखित हों, और फिर पैराफिन को कठोर होने दें। कमरे के तापमान पर ब्लॉक स्टोर करें।
    3. अतिरिक्त पैराफिन ट्रिम और माइक्रोटोम समर्थन पर एम्बेडेड टैडपोल (ओं) के साथ ब्लॉक माउंट.
    4. उचित मोटाई (10-12 माइक्रोन) पर एक माइक्रोटोम के साथ ब्लॉक अनुभाग. पहले से 3% ग्लिसरीन एल्ब्यूमिन (पानी में पतला) के साथ कवर एक स्लाइड पर वर्गों के साथ रिबन स्थानांतरण.
    5. कुछ मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड गर्म पर स्लाइड रखें और फिर ग्लिसरीन एल्ब्यूमिन की अधिकता को हटा दें। स्लाइड्स 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रात भर सूखी करते हैं.
    6. 100% xylene से भरे Coplin जार में 2 x 15 मिनट के लिए स्लाइड को डुबोकर डिवैक्स करें। वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के साथ वर्गों को पुनर्जलीकरण: 100% दो बार, 70%, 50% (प्रकार द्वितीय पानी में पतला), ~ 5 मिनट प्रत्येक, पानी में 2 x 5 मिनट के बाद.
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग
    1. टाइप II पानी के 1 एल में 29.4 ग्राम सोडियम साइट्रेट ट्राइसोडियम नमक डाइहाइड्रेट (सी6एच5ना3ओ7, 2 एच2ओ) जोड़कर 100 एमएम सोडियम साइट्रेट (सीना) स्टॉक समाधान तैयार करें; हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ पीएच को 6 में समायोजित करें। आटोक्लेविंग द्वारा स्टरलाइज़ करें और कई महीनों तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें। प्रकार II पानी के 225 एमएल के लिए 100 एमएम CiNa स्टॉक समाधान के 25 एमएल जोड़कर उपयोग के समय अनमास्किंग समाधान तैयार करें। ट्वीन -20 के 125 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं (अंतिम एकाग्रता 10 एमएम सीना, 0.05% ट्वीन -20 है)।
    2. 100 मिलीग्राम बिस्बेंज़िमाइड एच 33258 से टाइप I पानी के 10 एमएल जोड़कर 10 मिलीग्राम/एमएल पर होचस्ट स्टॉक समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए इस शेयर समाधान का संरक्षण, एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से संरक्षित. 1x पीबीएस के 400 एमएल में होचस्ट स्टॉक समाधान के 300 माइक्रोन जोड़कर 7.5 माइक्रोग्राम/एमएल पर होचस्ट समाधान तैयार करें।
      नोट: इस समाधान का उपयोग 10 बार तक किया जा सकता है और लगभग 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है, जो एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से सुरक्षित है।
    3. dewaxing वर्गों के बाद, 9 मिनट के लिए unmasking समाधान में वर्गों उबलते द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन. घोल को 20 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
    4. टाइप II पानी में एक बार और 1x पीबीएस में एक बार कुल्ला। स्लाइड्स फ्लैट एक नम कक्ष में रखो और 30 मिनट के लिए स्लाइड (एंटीबॉडी मंदक + 0.2% ट्राइटन X100) प्रति अवरुद्ध समाधान के 400-600 माइक्रोन जोड़ें.
    5. अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की स्लाइड प्रति 200 माइक्रोन के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें। बुलबुला गठन से बचने, वर्गों पर समाधान फैलाने के लिए एक coverslip का प्रयोग करें. एक आर्द्र कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
    6. स्लाइड्स को कोपलिन जार में स्थानांतरित करें और 0.1% ट्राइटन X100 के साथ पूरक 1x पीबीएस में 3 x 10 मिनट के लिए कुल्ला। स्लाइड्स फ्लैट रखो, माध्यमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में पतला की स्लाइड प्रति 400 माइक्रोन जोड़ें, और एक आर्द्र कक्ष में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए छोड़ दें.
    7. एक कोपलिन जार में स्लाइड स्थानांतरित करें और 0.1% ट्राइटन X100 के साथ पूरक 1x पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट के लिए कुल्ला।
    8. 10 मिनट के लिए Hoechst समाधान के साथ काउंटरस्टेन सेल नाभिक और 1x पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट कुल्ला।
    9. विशेष रूप से प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए जलीय बढ़ते माध्यम में स्लाइड पर कवरस्लिप रखें। स्लाइड्स कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सूखी और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर करते हैं.
    10. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड छवि.
  4. Hematoxylin और eosin (एच & ई) रेटिना क्षति का आकलन करने के लिए धुंधला हो जाना
    नोट: इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा एक विशेष सेल प्रकार को लेबल करने के बजाय, सामान्य रेटिना ऊतक विज्ञान का मूल्यांकन एच एंड ई रंगाई के साथ किया जा सकता है।
    1. dewaxing वर्गों के बाद, 2 मिनट के लिए hematoxylin समाधान में स्लाइड विसर्जित करके न्यूक्लिक एसिड लेबलिंग प्रदर्शन. नल के पानी से अच्छी तरह धो लें।
    2. 1 मिनट के लिए 1% eosin समाधान में स्लाइड विसर्जित करके cytoplasm लेबलिंग प्रदर्शन. पानी से जल्दी धो लें।
      नोट: Eosin बहुत घुलनशील है; स्लाइड पानी में बहुत लंबे समय तक छोड़ रहे हैं, तो सभी डाई गायब हो जाता है.
    3. 100% इथेनॉल में 2 x 5 मिनट और xylene में 2 x 5 मिनट कुल्ला।
    4. हुड के नीचे, एक बढ़ते माध्यम की 4-5 बूंदों में स्लाइड पर coverslips जगह. स्लाइड्स एक हुड और एक खुर्दबीन के साथ अगले दिन छवि के तहत सूखी करते हैं.
  5. एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाना
    1. dewaxing वर्गों के बाद (खंड 5.2.6 देखें), एपोप्टोटिक डीएनए विखंडन का पता लगाने के लिए किट निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें.
    2. Hoechst समाधान (अनुभाग 5.3.8 देखें) में स्लाइड विसर्जित करके नाभिक धुंधला प्रदर्शन और विशेष रूप से प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक जलीय बढ़ते माध्यम के साथ माउंट. स्लाइड्स कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सूखी और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर करते हैं.
    3. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड छवि.

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Representative Results

यांत्रिक रेटिना की चोट
प्रोटोकॉल खंड 1 में वर्णित यांत्रिक चोट के अधीन टैडपोल के रेटिना वर्गों से पता चलता है कि रेटिना घाव ऊतक की सभी परतों को शामिल करता है, जबकि पंचर साइट (चित्रा 2ए, बी) तक सीमित रहता है।

एनटीआर-एमटीजेड सिस्टम का उपयोग करके सशर्त रॉड सेल पृथक्करण
एनेस्थेटाइज्ड टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर ) ट्रांसजेनिक टैडपोल की आंखों को एमटीजेड उपचार के साथ इलाज किया जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 2 में वर्णित है, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए, बी) के तहत विश्लेषण किया गया था। जीएफपी प्रतिदीप्ति में कमी से नियंत्रण(चित्रा 3बी)की तुलना में प्रगतिशील लक्षित रॉड सेल पृथक्करण का पता चलता है, जीएफपी इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा रेटिना वर्गों पर पुष्टि की जाती है, जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 5(चित्रा 3सी)में वर्णित है।

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले रोडोप्सिन नॉकआउट द्वारा रॉड सेल अध: पतन
प्रोटोकॉल अनुभाग 3 में वर्णित के रूप में प्राप्त rho कुरकुरा टैडपोल के रेटिनास, प्रोटोकॉल अनुभाग 5 (चित्रा 4 ए) में वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया था। कैसपेज़ 3 और रोडोप्सिन लेबलिंग पर प्रकाश डाला गया है कि कुछ छड़ें एपोप्टोसिस(चित्रा 4बी)से गुजरती हैं। एच एंड ई धुंधला परमाणु परतों के वैश्विक संरक्षण लेकिन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों (चित्रा 4सी) की एक गंभीर कमी का पता चलता है। फोटोरिसेप्टर मार्करों के साथ आगे इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण छड़ के अध: पतन और बाद में शंकु दोष(चित्रा 4 डी और नहीं दिखाया गया) दिखाता है। फेनोटाइप चरण 40 से दिखाई देने लगता है, और छड़ के बाहरी खंड उत्तरोत्तर गायब हो जाते हैं जब तक कि वे चरण 47 से केंद्रीय रेटिना से अनुपस्थित नहीं होते हैं।

साइटोटॉक्सिक इंट्राओकुलर CoCl 2 इंजेक्शन द्वारा रेटिना सेल अध: पतन
CoCl2 इंट्राओकुलर इंजेक्शन के अधीन टैडपोल के रेटिना, जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 4 में वर्णित है, का विश्लेषण इम्यूनोस्टेनिंग और ट्यूनल परख द्वारा किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 5(चित्रा 5ए)में वर्णित है। इससे पता चलता है कि 10 एमएम सीओसीएल2 इंजेक्शन शंकु फोटोरिसेप्टर्स(चित्रा 5बी,सी)की विशिष्ट कोशिका मृत्यु की ओर जाता है, जबकि 25 मिमी व्यापक रेटिना कोशिका मृत्यु(चित्रा 5ई)की ओर जाता है। इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण, जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 5 में वर्णित है, आगे 10 एमएम सीओसीएल 2-इंजेक्शन रेटिनास(चित्रा 5डी)में शंकु की अनुपस्थिति और 25 एमएम सीओसीएल2 इंजेक्शन(चित्रा 5एफ)के बाद द्विध्रुवी कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर दोनों के गंभीर नुकसान का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1: कुछ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के चित्र। (ए) एक पिन धारक से जुड़ी एक 0.2 मिमी व्यास पिन रेटिना पंचर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. टैडपोल के पृष्ठीय, पार्श्व और ललाट दृश्यों के आरेख बताते हैं कि पिन (लाल रंग में) कहाँ डाला गया है। (बी) सशर्त रॉड सेल पृथक्करण के ट्रांसजेनिक मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। रोडोप्सिन प्रमोटर रॉड कोशिकाओं में एक GFP-Nitroreductase संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव. जब ज़ेनोपस पालन के पानी में जोड़ा जाता है, तो एनटीआर मेट्रोनिडाजोल को साइटोटॉक्सिन में परिवर्तित करता है, विशेष रूप से जीएफपी-एनटीआर छड़ को समाप्त करता है। (सी ) एक टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) ट्रांसजेनिक टैडपोल का सिर सफेद रोशनी में या प्रतिदीप्ति के तहत दिखाया गया है। आंख में GFP धुंधला ट्रांसजेनिक टैडपोल की छँटाई की अनुमति देता है। (डी) एक पिकोस्प्रिट्जर माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम के साथ इंजेक्शन लगाने के लिए तैयार स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक नायलॉन ग्रिड पर एक-कोशिका चरण भ्रूण। (ई ) सीआरआईएसपीआर-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के एक-कोशिका चरण में इंजेक्शन के बाद न्यूरुला चरण (इनसेट में योजनाबद्ध) में भ्रूण जिसमें फ्लोरेसिन लाइसिन डेक्सट्रान होता है। अच्छी तरह से इंजेक्शन फ्लोरोसेंट भ्रूण (हरे तीर) uninjected लोगों (सफेद तीर) से अलग किया जा सकता है. (एफ) एनेस्थेटाइज्ड टैडपोल को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चम्मच को दिखाने वाली छवि। (जी) एक गीले ऊतक पर एक पेट्री डिश में एनेस्थेटाइज्ड टैडपोल। माइक्रोइंजेक्टर में डाली गई केशिका CoCl2 समाधान के इंट्राओकुलर इंजेक्शन की अनुमति देती है। (एच) एक 1 एल टैंक में एक टैडपोल के हस्तांतरण को दिखाने वाली छवि जहां जागृति तक जानवर की निगरानी की जा सकती है। स्केल बार = 2 मिमी (C), 1 मिमी (E)। संक्षिप्ताक्षर: GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एनटीआर = नाइट्रोरेडक्टेस; एमटीजेड = मेट्रोनिडाजोल; NF = Nieuwkoop और Faber चरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: यांत्रिक रेटिना की चोट। (ए ) (बी) में प्रयुक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा। Xenopus laevis tadpole आंखों पंचर कर रहे हैं और रेटिना वर्गों पर विश्लेषण 7 दिनों चोट के बाद. बिंदीदार बॉक्स छवि क्षेत्र को इंगित करता है। (बी) सेल नाभिक होक्स्ट के साथ प्रति-दाग हैं। तीन अलग-अलग रेटिना दिखाए जाते हैं। तीर घायल साइट की ओर इशारा करते हैं जो सभी रेटिना परतों को पार करता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: डीपीआई = चोट लगने के बाद के दिन; GCL = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; INL = आंतरिक परमाणु परत; ONL = बाहरी परमाणु परत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एनटीआर-एमटीजेड सिस्टम का उपयोग करके सशर्त रॉड सेल पृथक्करण। (ए ) (बी, सी) में प्रयुक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा। टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) ट्रांसजेनिक ज़ेनोपस लाविस टैडपोल को 7-9 दिनों के लिए एमटीजेड के साथ इलाज किया जाता है। GFP लेबल छड़ के प्रगतिशील अध: पतन एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है के रूप में 7 में (बी) में सचित्र. रॉड सेल मौत भी रेटिना वर्गों पर विश्लेषण किया जा सकता है के रूप में (सी) में 14 दिनों के बाद सचित्र, बिंदीदार बॉक्स imaged क्षेत्र का संकेत. (बी) उपचार के 7 दिनों के बाद, रेटिना में जीएफपी तीव्रता नियंत्रण की तुलना में ट्रांसजेनिक एमटीजेड-उपचारित टैडपोल में समय के साथ घट जाती है। (सी)जीएफपी प्रतिदीप्ति में कमी जीएफपी immunostaining द्वारा 14 दिनों में रेटिना वर्गों पर पुष्टि की है. सेल नाभिक को होचस्ट के साथ नीले रंग में काउंटरस्टेन किया जाता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन (बी), 50 माइक्रोन (सी)। संक्षिप्ताक्षर: GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एनटीआर = नाइट्रोरेडक्टेस; एमटीजेड = मेट्रोनिडाजोल; एल = लेंस; आर = रेटिना; GCL = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; INL = आंतरिक परमाणु परत; ONL = बाहरी परमाणु परत; OS = बाहरी खंड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ज़ेनोपस लाविस रो क्रिस्पेंट्स में रॉड अध: पतन। (ए) (बी-डी) में प्रयुक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा। एक-कोशिका चरण भ्रूण को CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (gRNA डुप्लेक्स/Cas9 प्रोटीन) के साथ इंजेक्ट किया जाता है जिसमें फ्लोरोसेंट लाइसिन डेक्सट्रान होता है। न्यूरुला चरण में, फ्लोरोसेंट इंजेक्शन भ्रूण को क्रमबद्ध किया जा सकता है और सेल मृत्यु विश्लेषण के लिए (बी) क्लीव्ड कैसपेज़ 3 इम्यूनोस्टेनिंग, या (सी) शारीरिक विश्लेषण के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन धुंधला होने तक, या (डी) फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन विश्लेषण के लिए रॉड मार्करों के साथ इम्यूनोस्टेनिंग। बिंदीदार बॉक्स छवि क्षेत्र को इंगित करता है। (बी) नियंत्रण के रेटिना वर्गों पर क्लीव्ड कैसपेज़ 3 (एपोप्टोटिक कोशिकाओं का एक मार्कर) और रोडोप्सिन (रॉड बाहरी खंडों का एक मार्कर) की डबल लेबलिंग या चरण 39 पर आरओ क्रिस्पस ज़ेनोपस लाविस भ्रूण नियंत्रण में मरने वाली कोशिकाओं की अनुपस्थिति दिखाता है और यह कि rho क्रिस्पेंट्स में मरने वाली कोशिकाएं रॉड फोटोरिसेप्टर हैं। (सी) चरण 48 पर आरएच क्रिस्पेंट्स ज़ेनोपस लाविस टैडपोल के रेटिना वर्गों पर एच एंड ई धुंधला हो जाना नियंत्रणों की तुलना में फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों के कम आकार का पता चलता है। (डी ) रिकवरिन (रॉड इनर सेगमेंट का एक मार्कर) और रोडोप्सिन सह-इम्यूनोस्टेनिंग चरण 48 में rho crispants Xenopus laevis tadpoles के रेटिना वर्गों पर नियंत्रण की तुलना में एक गंभीर अध: पतन का खुलासा करता है। सेल नाभिक को होचस्ट के साथ नीले रंग में काउंटरस्टेन किया जाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: जीआरएनए = गाइड आरएनए; एच एंड ई = हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन; GCL = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; INL = आंतरिक परमाणु परत; ONL = बाहरी परमाणु परत; OS = बाहरी खंड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: साइटोटॉक्सिक इंट्राओकुलर सीओसीएल2 इंजेक्शन द्वारा रेटिना सेल अध: पतन। (ए) (बीएफ) में प्रयुक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा। बिंदीदार बॉक्स छवि क्षेत्र को इंगित करता है। 10 मिमी या 25 मिमी CoCl2 का एक समाधान intraocularly टैडपोल आंख में इंजेक्ट किया जाता है. सेल एपोप्टोसिस का विश्लेषण एक ट्यूनल परख 2 दिनों के बाद चोट (डीपीआई) (बी, सी, ई) द्वारा किया जाता है, जबकि रेटिना सेल अपघटन का विश्लेषण विभिन्न मार्करों (डी, एफ) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा 7 से 14 डीपीआई का विश्लेषण किया जाता है। (बी-डी) टैडपोल के रेटिना वर्गों को खारा समाधान (नियंत्रण) के साथ या चरणों 51-54 पर 10 मिमी CoCl2 समाधान के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (बी)2 डीपीआई पर सेल मृत्यु विश्लेषण से सीओसीएल2 इंजेक्शन के बाद मरने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलता है, मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर परमाणु परत में। (सी) युग्मन सेल मौत एस / एम ऑप्सिन (शंकु का एक मार्कर) immunostaining के साथ धुंधला पता चलता है कि इन मरने कोशिकाओं मुख्य रूप से शंकु हैं; तीर डबल-लेबल वाली कोशिकाओं को इंगित करते हैं। (डी) एस/एम ऑप्सिन (शंकु का एक मार्कर) और रोडोप्सिन (छड़ का एक मार्कर) सह-इम्यूनोस्टेनिंग से 14 डीपीआई पर नियंत्रण की तुलना में सीओसीएल2 इंजेक्शन रेटिना में शंकु सेल लेबलिंग की गंभीर कमी का पता चलता है। (ई, एफ) टैडपोल के रेटिना वर्गों को 51-54 चरणों में 25 एमएम सीओसीएल2 समाधान के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (ई) 2 डीपीआई पर सेल मृत्यु विश्लेषण फोटोरिसेप्टर और आंतरिक परमाणु परतों दोनों में मरने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलता है। (एफ) ओटीएक्स 2 (फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं दोनों का एक मार्कर) इम्यूनोस्टेनिंग 7 डीपीआई पर नियंत्रण की तुलना में सीओसीएल 2-इंजेक्शन रेटिना में दोनों परतों में धुंधला होने की गंभीर कमी का खुलासा करता है, जो फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं दोनों की सीओसीएल2-प्रेरित कोशिका मृत्यु का संकेत देता है। सेल नाभिक को होचस्ट के साथ नीले रंग में काउंटरस्टेन किया जाता है। स्केल बार: 25 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: ONL = बाहरी परमाणु परत; INL = आंतरिक परमाणु परत; GCL = गैंग्लियन सेल परत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ज़ेनोपस टैडपोल में विभिन्न रेटिना चोट प्रतिमानों के फायदे और नुकसान

यांत्रिक रेटिना की चोट
ज़ेनोपस टैडपोल में तंत्रिका रेटिना की विभिन्न सर्जिकल चोटें विकसित की गई हैं। तंत्रिका रेटिना या तो पूरी तरह से15,16 या केवल आंशिक रूप से 16,17 excised हटाया जा सकता है. यहां प्रस्तुत यांत्रिक चोट में कोई रेटिना छांटना शामिल नहीं है, लेकिन एक साधारण आंख पंचर है जिसे हमने पहले ज़ेनोपस टैडपोल6 में विकसित किया था। इस तरह के एक यांत्रिक रेटिना चोट मॉडल की मैनुअल प्रक्रिया को देखते हुए, फेनोटाइप एक टैडपोल से दूसरे में काफी भिन्न हो सकता है। इसके अलावा, प्रतिकृति और क्षति की सीमा भी भिन्न हो सकती है जो इस बात पर निर्भर करती है कि प्रयोग कौन कर रहा है। इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि एक ही व्यक्ति सभी चोट प्रक्रियाओं को करे।

एनटीआर-एमटीजेड सिस्टम का उपयोग करके सशर्त रॉड सेल पृथक्करण
एनटीआर-एमटीजेड प्रणाली का उपयोग ट्रांसजेनिक ज़ेनोपस रेटिना 6,7,8,18 में रॉड कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए किया गया है। एमटीजेड उपचार की अवधि एक अध्ययन से दूसरे में 2 से 7 दिनों तक काफी भिन्न होती है। यह विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों में गुणसूत्र सम्मिलन के आधार पर एनटीआर की विभिन्न गतिविधियों को प्रतिबिंबित कर सकता है। इसके अलावा, हमने एमटीजेड उपचार के एक निश्चित समय के लिए टीजी (आरएचओ: जीएफपी-एनटीआर) टैडपोल की प्रतिक्रिया में कुछ परिवर्तनशीलता देखी, कुछ गंभीर रॉड अपघटन का अनुभव करते हैं जबकि अन्य बहुत कम क्षति का प्रदर्शन करते हैं। इस ट्रांसजेनिक लाइन के साथ एमटीजेड उपचार को 7 से 9-10 दिनों तक विस्तारित करना इस तरह की परिवर्तनशीलता को कम करता है। हालांकि, एमटीजेड के संभावित विषाक्त प्रभावों को देखते हुए सावधानी बरतनी चाहिए। इस मॉडल के स्पष्ट लाभ यह हैं कि यह सशर्त और प्रतिवर्ती रॉड सेल पृथक्करण और रॉड अपघटन की लाइव निगरानी के लिए अनुमति देता है।

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता वाले रोडोप्सिन नॉकआउट द्वारा रॉड सेल अध: पतन
रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के CRISPR-Cas9 rho जीन संपादन मॉडल से ज़ेनोपस टैडपोल11 में रॉड सेल अपघटन होता है। हालांकि, एनटीआर-एमटीजेड मॉडल के विपरीत, रॉड सेल पृथक्करण संवैधानिक है और प्रतिवर्ती नहीं है। दिलचस्प बात यह है कि इस दृष्टिकोण की उच्च दक्षता (अब हम नियमित रूप से >गंभीर रॉड अपघटन का प्रदर्शन करने वाले टैडपोल का 90%) प्राप्त करते हैं, F0 पीढ़ी पर इस मॉडल पर काम करने की अनुमति देता है। हम शुरू में एसजीआरएनए के साथ काम कर रहे थे लेकिन आरएनए तैयारी के विभिन्न बैचों से परिवर्तनशीलता देखी। हमने हाल ही में पाया है कि सिंथेटिक सीआरआरएनए और ट्रैसीआरएनए का आदेश देना और इस प्रोटोकॉल में वर्णित जीआरएनए डुप्लेक्स तैयार करना अधिक विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है।

साइटोटॉक्सिक इंट्राओकुलर CoCl2 इंजेक्शन द्वारा रेटिना सेल अध: पतन
यहां वर्णित अन्य मॉडलों की तुलना में इस मॉडल के कई फायदे हैं। यह न केवल सशर्त रेटिना सेल प्रकार के पृथक्करण प्रेरित करने के लिए लेकिन यह भी क्षति14 की गंभीरता मिलाना करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, यह हमारे ज्ञान के लिए ज़ेनोपस में विशिष्ट शंकु अध: पतन का एकमात्र मॉडल है। अंत में, यह अपक्षयी फेनोटाइप में कम परिवर्तनशीलता उत्पन्न करता है।

चार रेटिना घाव प्रतिमानों की प्रभावकारिता
टैडपोल के एक बैच से दूसरे बैच में फेनोटाइप की संभावित परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखते हुए, 8-10 टैडपोल पर रेटिना अपघटन की प्रभावकारिता की जांच करने की सिफारिश की जाती है। यांत्रिक चोट के मामले में, चोट के बाद के दिनों में क्षति का विश्लेषण किया जाना चाहिए, क्योंकि घाव अब एक सप्ताह बाद दिखाई नहीं देता है। एनटीआर-एमटीजेड मॉडल में, एमटीजेड उपचार के अंत के 1 सप्ताह बाद रॉड अध: पतन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। rho crispants के लिए, रॉड सेल मौत शुरू होता है के रूप में जब photoreceptors पूरी तरह से विभेदित, हम चरण 45 से अपक्षयी दक्षता का विश्लेषण करने की सिफारिश. CoCl2 मॉडल में, कोशिका मृत्यु इंजेक्शन के एक सप्ताह के भीतर होती है। प्रत्येक विधि के लिए अपेक्षित% अस्तित्व के संबंध में, हम यह नोट करना चाहेंगे कि सीआरआईएसपीआर-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स इंजेक्शन पारंपरिक आरएनए इंजेक्शन की तुलना में पहले 48 घंटे में उच्च मृत्यु दर का कारण बनते हैं (इन पहले 48 घंटों के बाद कोई वृद्धि या अस्तित्व की समस्या नहीं रहती है), और इसलिए, अधिक भ्रूण को आवश्यक के रूप में इंजेक्ट किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, अन्य प्रक्रियाएं (यांत्रिक चोटें, एमटीजेड उपचार, या इंट्राओकुलर सीओसीएल2 इंजेक्शन) किसी भी जीवित रहने की समस्या पैदा नहीं करती हैं।

रेटिना पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए इन चोट प्रतिमानों के संभावित अनुप्रयोग
रेटिना चोट मॉडल की इस श्रृंखला का एक संभावित अनुप्रयोग रेटिना पुनर्जनन का अध्ययन है। रेटिना स्टेम या स्टेम जैसी कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों को एक रोग संदर्भ में भर्ती किया जा सकता है, जिसमें सीएमजेड कोशिकाएं, मुलर ग्लियल कोशिकाएं और आरपीई कोशिकाएं शामिल हैं। हमने बताया है कि यांत्रिक चोट मॉडल, NRT/MTZ मॉडल, और CRISPR/Cas9 मॉडल, चोट 6,11 पर मुलर सेल सक्रियण का अध्ययन करने के लिए सभी आकर्षक मॉडल हैं। दिलचस्प बात यह है कि सीओसीएल2 मॉडल में, सभी तीन सेलुलर स्रोतों को14 भर्ती किया जा सकता है, जो विभिन्न रेटिना सेल प्रकारों की भर्ती और पुन: प्रोग्रामिंग के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास मॉडल प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को एसोसिएशन रेटिना फ्रांस, फोंडेशन डी फ्रांस, एफएमआर (फोंडेशन मैलेडीज रेरेस), बीबीएस (एसोसिएशन डू सिंड्रोम डी बार्डेट-बिडल), और यूएनएडीईडब्ल्यूई (यूनियन नेशनेल डेस एवेगल्स एट डेफिसिएंट्स विसुएल्स) से एमपी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

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References

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रेटिना चोट मॉडल ज़ेनोपस टैडपोल रेटिना न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अंधापन स्व-मरम्मत एम एंड 252; एलएलआर ग्लियाल सेल स्टेम सेल क्षमता पुनर्योजी क्षमता आणविक तंत्र पशु मॉडल स्तनधारी एम और 252; एलएलआर सेल रेटिना पुनर्जनन चिकित्सीय रणनीतियाँ पुनर्योजी चिकित्सा रेटिना चोट प्रतिमान मैकेनिकल रेटिना चोट नाइट्रोरेडक्टेस-मध्यस्थता फोटोरिसेप्टर सशर्त पृथक्करण रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा मॉडल CRISPR/Cas9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट साइटोटॉक्सिक मॉडल CoCl2 इंजेक्शन
<em>ज़ेनोपस</em> टैडपोल में रेटिना चोट मॉडल उत्पन्न करना
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Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

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