Summary
Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.
Abstract
Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l'autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl2 . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.
Introduction
Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l'optogenetica e i dispositivi protesici. Un'altra strategia emergente si basa sull'auto-rigenerazione attraverso l'attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cellule gliali della retina, sono tra le fonti cellulari di interesse in questo contesto. In caso di lesione, possono dedifferenziarsi, proliferare e generare neuroni 1,2,3. Sebbene questo processo sia molto efficace nel pesce zebra o nello Xenopus, è in gran parte inefficiente nei mammiferi.
Ciononostante, è stato dimostrato che trattamenti appropriati con proteine mitogeniche o sovraespressione di vari fattori possono indurre il rientro del ciclo cellulare della glia di Müller nei mammiferi e, in alcuni casi, innescare il loro successivo impegno di neurogenesi 1,2,3,4,5. Questo rimane, tuttavia, largamente insufficiente per i trattamenti. Pertanto, è necessario aumentare la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione per identificare molecole in grado di trasformare in modo efficiente le proprietà delle cellule staminali di Müller in nuove strategie terapeutiche cellulari.
Con questo obiettivo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di lesione in Xenopus che innescano la degenerazione delle cellule retiniche. Qui, presentiamo (1) una lesione retinica meccanica che non è specifica per il tipo di cellula, (2) un modello di ablazione cellulare condizionale e reversibile che utilizza il sistema NTR-MTZ che prende di mira le cellule dei bastoncelli, (3) un knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9, un modello di retinite pigmentosa che innesca la degenerazione progressiva delle cellule dei bastoncelli e (4) un CoCl2-modello citotossico indotto che, a seconda della dose, può colpire in modo specifico i coni o portare a una più ampia degenerazione delle cellule retiniche. Evidenziamo le particolarità, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun paradigma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La cura degli animali e la sperimentazione sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali, nell'ambito della licenza istituzionale A91272108. I protocolli di studio sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura degli animali CEEA #59 e hanno ricevuto l'autorizzazione dalla Direction Départementale de la Protection des Populations con il numero di riferimento APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questi protocolli.
1. Lesione meccanica della retina
NOTA: Il protocollo del paradigma di lesione qui descritto consiste in una puntura meccanica della retina di un girino dallo stadio 45 in poi. Pertanto, non prende di mira un particolare tipo di cellula retinica, ma danneggia l'intero spessore della retina nel sito di puntura.
- Preparazione dell'anestetico per girini
- Preparare una soluzione madre al 10% di benzocaina. Per un volume totale di 10 ml, aggiungere 1 g di benzocaina, 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e 8 mL di glicole propilenico. Conservare la soluzione madre per diversi mesi a 4 °C al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
- Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,005% al momento dell'uso aggiungendo 25 μL di soluzione madre di benzocaina al 10% a 50 mL di acqua di allevamento girino (acqua di rubinetto filtrata e declorata). Mescolare bene.
NOTA: La concentrazione di benzocaina è particolarmente bassa perché i girini sono altamente sensibili all'anestesia rispetto agli adulti.
- Preparazione del perno
- Collegare un perno sterile di 0,2 mm di diametro a un portaperno sterilizzato (Figura 1A).
- Anestesia girino
- Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in un nuovo serbatoio contenente la soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendere qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli (picchiettando la vasca o contatto diretto).
NOTA: Diversi girini possono essere anestetizzati contemporaneamente, ma il tempo trascorso nella soluzione anestetica deve essere inferiore a 30 minuti.
- Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in un nuovo serbatoio contenente la soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendere qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli (picchiettando la vasca o contatto diretto).
- Puntura della retina
- Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura su una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro) contenente un fazzoletto bagnato. Posiziona il girino con il lato dorsale rivolto verso l'alto al centro della capsula di Petri.
- Sotto uno stereomicroscopio, perforare la retina inserendo delicatamente il perno sul lato dorsale dell'occhio, fino a quando non passa attraverso la retina (Figura 1A). Se sono necessari diversi colpi, ripetere questa procedura in punti diversi. Dopo aver perforato l'occhio destro, ruotare la capsula di Petri di 180° per perforare l'occhio sinistro.
- Trasferire il girino lesionato in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendo con cura la capsula di Petri. Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.
2. Ablazione condizionale delle cellule a bastoncelli utilizzando il sistema NTR-MTZ
Il protocollo ha lo scopo di indurre l'ablazione specifica dei bastoncelli nella lineatransgenica 6 di Xenopus Tg(rho:GFP-NTR), disponibile presso il servizio di zootecnia di TEFOR Paris-Saclay, che ospita il centro risorse francese Xenopus. Questo sistema chemiogenetico utilizza la capacità dell'enzima nitroreduttasi (NTR) di convertire il profarmaco metronidazolo (MTZ) in un agente reticolante del DNA citotossico, per ablare in modo specifico i bastoncelli che esprimono NTR (Figura 1B). In precedenza sono stati pubblicati due protocolli dettagliati per rendere transgenici gli animali Tg(rho:GFP-NTR) o Tg(rho:NTR) e indurre la degenerazione 7,8. Qui, descriviamo semplicemente in dettaglio l'induzione della degenerazione retinica e come monitorare il processo di degenerazione in vivo.
- Preparazione della soluzione di metronidazolo
- Preparare 10 mM di soluzione di MTZ al momento dell'uso sciogliendo 1,67 g di polvere di MTZ in un flacone scuro in 1 L di acqua di allevamento di girini contenente lo 0,1% di DMSO, utilizzando una barra di agitazione magnetica e un agitatore magnetico.
NOTA: MTZ è sensibile alla luce. La dissoluzione completa può richiedere fino a 10 minuti.
- Preparare 10 mM di soluzione di MTZ al momento dell'uso sciogliendo 1,67 g di polvere di MTZ in un flacone scuro in 1 L di acqua di allevamento di girini contenente lo 0,1% di DMSO, utilizzando una barra di agitazione magnetica e un agitatore magnetico.
- Generazione di girini transgenici mediante accoppiamento naturale dalla linea Tg(rho:GFP-NTR)
NOTA: Poiché i maschi transgenici rappresentano un ceppo prezioso, preferiamo generare embrioni tramite accoppiamento naturale per non sacrificare il maschio e usarlo ripetutamente.- Somministrazione ormonale
- Iniettare 600 U.I. di ormone gonadotropina corionica umana (hCG) con aghi 25G nel sacco linfatico dorsale delle femmine wild-type di Xenopus laevis . Iniettare nei maschi transgenici 100-200 U.I. di hCG nel sacco linfatico dorsale. Per il monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli (fase 2.4), utilizzare Xenopus albini piuttosto che quelli pigmentati, per visualizzare meglio le variazioni di fluorescenza attraverso l'occhio dei girini transgenici generati.
NOTA: Le femmine di Xenopus possono essere adescate con 50 U.I. di hCG da 1 a 7 giorni prima dell'ovulazione programmata, ma questo è facoltativo.
- Iniettare 600 U.I. di ormone gonadotropina corionica umana (hCG) con aghi 25G nel sacco linfatico dorsale delle femmine wild-type di Xenopus laevis . Iniettare nei maschi transgenici 100-200 U.I. di hCG nel sacco linfatico dorsale. Per il monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli (fase 2.4), utilizzare Xenopus albini piuttosto che quelli pigmentati, per visualizzare meglio le variazioni di fluorescenza attraverso l'occhio dei girini transgenici generati.
- Accoppiamento e raccolta delle uova
- Subito dopo l'iniezione di hCG, mettere in una vasca un maschio transgenico Tg(rho:GFP-NTR) insieme a una femmina iniettata di hCG a 20 °C fino al giorno successivo. Utilizzare un volume grande (almeno 10 L) e aggiungere piccoli oggetti a cui far aderire le uova, in modo che le uova non vengano danneggiate dai movimenti degli adulti. Il giorno seguente, quando le rane non sono più in amplesso, prelevare gli adulti dalla vasca e raccogliere gli embrioni.
- Allevamento di embrioni e girini
- Stadio embrionali e girini secondo la normale tabella di sviluppo di Xenopus 9.
- Alleva gli embrioni in una vasca piena di acqua per l'allevamento dei girini. Dalla fase 45, nutri i girini con avannotti in polvere e ossigena l'acqua con un gorgogliatore. Aggiungere acqua ogni giorno, se necessario, per compensare l'evaporazione e cambiare settimanalmente l'acqua dell'intero serbatoio.
NOTA: In alternativa, è anche possibile scambiare il 50% del volume due volte a settimana. Un protocollo dettagliato può essere trovato in10.
- Selezione di embrioni transgenici
- A partire dalla fase 37/38, ordinare e selezionare gli embrioni transgenici sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza visualizzando direttamente la GFP (Figura 1C).
- Somministrazione ormonale
- Trattamento girino MTZ
- Trasferire girini transgenici Tg(rho:GFP-NTR) in una vasca contenente 10 mM di soluzione MTZ e allevarli a 20 °C al buio per 1 settimana. Utilizzare fratelli transgenici allevati in acqua di allevamento di girini contenente lo 0,1% di DMSO come controlli.
- Cambiare la soluzione MTZ e di controllo a giorni alterni durante il periodo di trattamento. Nutrire i girini come di consueto durante il trattamento MTZ.
- Per il monitoraggio individuale della fluorescenza (passaggio 2.4), posizionare ciascun girino nel suo piccolo contenitore con 30 mL di MTZ o soluzione di controllo dal passaggio 2.3.1 in poi.
NOTA: Il trattamento MTZ può essere eseguito in qualsiasi momento dallo stadio 45 in poi.
- Monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli
NOTA: La progressiva degenerazione delle aste può essere monitorata in tempo reale. Pertanto, eseguire i passaggi 2.4.1. al punto 2.4.4. prima del trattamento MTZ e poi regolarmente dopo il trattamento.- Seguire i passaggi 1.1 e 1.3 rispettivamente per la preparazione dell'anestetico e dell'anestesia girino.
- Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura su un fazzoletto bagnato in una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro). Osservare la fluorescenza GFP con uno stereomicroscopio fluorescente (lunghezza d'onda di eccitazione = 488 nm e lunghezza d'onda di emissione = 509 nm) e scattare fotografie dell'occhio. Una diminuzione dell'intensità della fluorescenza riflette la degradazione dei bastoncelli.
NOTA: Per effettuare confronti quantitativi, è necessario mantenere le stesse impostazioni per l'imaging di tutti i girini. - Trasferire il girino ripreso in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendo con cura la capsula di Petri. Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.
- Confrontare l'intensità della fluorescenza tra gli occhi dei girini trattati con MTZ e quelli di controllo per monitorare e valutare l'efficacia del processo di degenerazione.
3. Degenerazione delle cellule dei bastoncelli mediante knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9
NOTA: Questo protocollo è stato stabilito per generare un modello di retinite pigmentosa in Xenopus laevis inducendo una specifica degenerazione delle cellule dei bastoncelli utilizzando il knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9. La % di inserzione-delezione (indel) in F0 è fornita in11 ed è ~75%. Tale knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 può essere eseguito anche nei girini di Xenopus tropicalis 11.
- Preparazione di soluzioni e reagenti
- Ordinamento di crRNA e tracrRNA
- Acquista l'RNA sintetico CRISPR (crRNA) che ha come bersaglio il gene della rodopsina (rho) e il crRNA transattivante standard (tracrRNA). Il crRNA è composto da una regione rho target-specifica (GCUCUGCUAAAGUAAUACUGA) e da un'altra (GUUUUAGAGCUAUGCU) che si ibrida con il tracrRNA.
- crRNA: tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
- Risospendere crRNA e tracrRNA a 100 μM nel tampone duplex privo di nucleasi.
- Preparare il duplex di gRNA mescolando 3 μL di 100 μM di crRNA rho , 3 μL di 100 μM di tracrRNA e 94 μL di tampone duplex. Le concentrazioni finali sono 36 ng/μL rho crRNA e 67 ng/μL tracrRNA.
- Ricuocere gli oligo riscaldandoli a 95 °C per 5 minuti e raffreddarli lentamente a temperatura ambiente. Realizzare aliquote e conservarle a -20 °C.
- Complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (i.e., gRNA duplex/proteina Cas9)
- Al momento dell'uso, preparare la miscela di rho gRNA duplex e la proteina Cas9. Per 20 μL, aggiungere 10 μL della soluzione duplex di gRNA rho , 2 μL di proteina Cas9 (stock a 5 mg/mL), 2 μL di destrano di lisina fluoresceina (stock a 10 mg/mL) e 6 μL di acqua priva di RNasi.
- Per formare il complesso ribonucleoproteico, incubare per 10 minuti a 37 °C e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
- Per 20 μL della soluzione di controllo, miscelare 2 μL di proteina Cas9, 2 μL di destrano di lisina fluoresceina e 16 μL di acqua priva di RNasi.
- Preparazione di soluzioni MBS 10x, 1x e 0,1x
- Preparare la soluzione madre salina di Barth modificata (10x MBS) aggiungendo 11,92 g di HEPES, 51,43 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,75 g di cloruro di potassio (KCl), 2,1 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 2,46 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4, 7 H2O) in 800 ml di acqua di tipo II. Regolare il pH a 7,8 con idrossido di sodio (NaOH) al 30%. Aggiungere acqua di tipo II fino a quando il volume è di 1 L e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare 1 L di 1x soluzione MBS diluendo 100 mL di soluzione salina 10x MBS e 7 mL di cloruro di calcio 0,1 M diidrato (CaCl 2, 2H2 O) in acqua di tipo II. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione 0,1x MBS diluendo 1x soluzione MBS in acqua di tipo II. Conservare a temperatura ambiente.
- Soluzione di benzocaina per adulti
- Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,05% aggiungendo 5 ml di soluzione madre di benzocaina al 10% (vedere fase 1.1.1.) a 1 L di acqua per l'allevamento dei girini. Mescolare bene.
NOTA: Conservare questa soluzione per diversi mesi a 4 °C al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. Portare la soluzione a temperatura ambiente prima di utilizzarla sugli animali.
- Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,05% aggiungendo 5 ml di soluzione madre di benzocaina al 10% (vedere fase 1.1.1.) a 1 L di acqua per l'allevamento dei girini. Mescolare bene.
- Soluzione di L-cisteina
- Preparare la soluzione degelatinante al momento dell'uso aggiungendo 2 g di L-cisteina cloridrico monoidrato a 100 mL di soluzione 0,1x MBS. Regolare il pH a 7,8 con il 30% di NaOH.
- Soluzione di polisaccarosio
- Preparare la soluzione densa di polisaccarosio aggiungendo 3 g di polisaccarosio a 100 mL di soluzione 0,1x MBS. Conservare questa soluzione per alcune settimane a 4 °C.
- Ordinamento di crRNA e tracrRNA
- Fecondazione in vitro e dejellying
NOTA: Maggiori dettagli sulla fecondazione in vitro di Xenopus possono essere trovati in un protocollo dedicato dettagliato in12.- Somministrazione di ormoni alle femmine di Xenopus laevis per indurre l'ovulazione
- Circa 15 ore prima del prelievo degli ovociti, iniettare 600 U.I. di hCG nel sacco linfatico dorsale della femmina e tenerlo per una notte a 18 °C.
- Dissezione del testicolo
- Sopprimere il maschio di Xenopus con una dose letale di soluzione di benzocaina allo 0,05% per 10-15 minuti. Come metodo di eutanasia complementare, recidere la colonna vertebrale immediatamente posteriore al cranio con forbici affilate e robuste. Apri la cavità addominale con le forbici da dissezione, taglia i testicoli e taglia via il grasso e i capillari attaccati. Mettere immediatamente ogni testicolo sul ghiaccio in 1 ml di 1x MBS.
- Preparazione dello sperma
- Frantumare un testicolo utilizzando un pestello per provette da microcentrifuga e diluire la sospensione in una provetta da 15 mL contenente 9 mL di 1x MBS. Aggiungere 10 μg/mL di gentamicina alla seconda provetta testicolare e mantenerla a 4 °C per alcuni giorni per ulteriori esperimenti di fecondazione.
- Fecondazione in vitro
- Massaggiare delicatamente il dorso della femmina a cui è stato iniettato l'ormone e raccogliere gli ovociti in una capsula di Petri (100 mm di diametro). Distribuire alcune gocce della soluzione di sperma sugli ovociti. Attendi 5 minuti e coprili con 0,1x MBS. Attendere 10 minuti prima di procedere con la degelatinizzazione.
- Dejellying degli ovuli fecondati
- Sostituire la soluzione 0,1x MBS con la soluzione degelatinante per rimuovere il rivestimento gelatinoso dalle uova fecondate (~5 min). Sciacquare accuratamente gli embrioni 5-6 volte con MBS 0,1x e trasferirli in una nuova capsula di Petri da 100 mm riempita con MBS 0,1x.
- Somministrazione di ormoni alle femmine di Xenopus laevis per indurre l'ovulazione
- Preparazione del sistema di microiniezione
- Affilare i capillari di vetro con un estrattore per micropipette13.
- Riempire un capillare affilato con 2-10 μL di complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 o la soluzione di controllo utilizzando una punta del microcaricatore e posizionare il capillare nel manipolatore del microiniettore.
- All'ingrandimento più alto di uno stereomicroscopio, rompere la punta capillare con una pinza fine e regolare il tempo di iniezione (~400 ms) per ottenere un volume di eiezione di 10 nL per impulso. Impostare la pressione di espulsione a circa 40 PSI.
- Microiniezione embrionale in fase unicellulare con il complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9
- Posizionare gli embrioni allo stadio di una cellula su una griglia (tessuto di nylon da 1 mm) incollata in una capsula di Petri da 100 mm riempita con una soluzione di polisaccarosio al 3% (Figura 1D).
- Utilizzando il microiniettore e sotto uno stereomicroscopio, iniettare 10 nL del complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (che corrisponde a 500 pg di gRNA duplex + 5 ng di proteina Cas9 per embrione) o soluzione di controllo a livello del polo animale, nella regione corticale, appena sotto la membrana citoplasmatica.
NOTA: Il destrano di lisina fluoresceina contenuto nella soluzione consente la successiva cernita degli embrioni iniettati. - Trasferire gli embrioni iniettati in una nuova capsula di Petri da 100 mm contenente una soluzione di polisaccarosio pulita e posizionarli a 21 °C.
- Il primo giorno, selezionare regolarmente gli embrioni ben sviluppati e sostituire la soluzione di polisaccarosio con 0,1x MBS circa 5 ore dopo la microiniezione.
- Attendere 24 ore dopo l'iniezione per selezionare e selezionare gli embrioni rho crispant ben iniettati con uno stereomicroscopio a fluorescenza visualizzando il destrano di lisina fluoresceina (Figura 1E).
NOTA: Prima è la microiniezione dopo la fecondazione, più efficace è il knockout.
- Allevamento di embrioni e girini
- Allevare embrioni rho crispant in 0,1x MBS in piastre di Petri fino allo stadio 37/38. Rimuovere gli embrioni morti ogni giorno e cambiare la soluzione MBS 0,1x. Dalla fase 37/38, allevare gli embrioni in una vasca riempita con acqua per l'allevamento dei girini e dalla fase 45 procedere come nella fase 2.2.3.
4. Degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari citotossiche di CoCl 2
NOTA: Questo protocollo è stabilito per indurre la degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari di cloruro di cobalto (CoCl2) nei girini di Xenopus laevis . A seconda della dose, può innescare una degenerazione specifica del cono o una degenerazione più ampia14. Utilizziamo questo protocollo nei girini di Xenopus laevis di età compresa tra i 48 e gli anni in poi. Può essere utilizzato anche nei girini di Xenopus tropicalis .
- Preparazione del tampone e dei reagenti
- Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,005% al momento dell'uso come al punto 1.1.
- Preparare 100 mM di soluzione madre di CoCl2 aggiungendo 118,5 mg a 5 mL di 0,1x MBS (vedere il passaggio 3.1.4 per preparare 0,1x MBS). Conservare questa soluzione madre per diversi mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
ATTENZIONE: CoCl2 è classificato come composto tossico per la vita umana e animale. Seguire scrupolosamente le istruzioni per la manipolazione, lo stoccaggio e lo smaltimento dei rifiuti riportate nella scheda di sicurezza. - Per la degenerazione specifica del cono, preparare una soluzione di CoCl2 da 10 mM al momento dell'uso dalla soluzione madre da 100 mM diluita in MBS 0,1x. Per una più ampia degenerazione delle cellule retiniche, preparare una soluzione di CoCl2 25 mM.
- Preparazione del sistema di iniezione
- Affilare i capillari di vetro con un estrattore per micropipette 13.
- Riempire un capillare affilato con 2-10 μL di soluzione di CoCl2 da 10 o 25 mM o la soluzione di controllo (0,1x MBS) utilizzando una punta del microcaricatore e posizionare il capillare nel manipolatore del microiniettore.
- All'ingrandimento più alto di uno stereomicroscopio, rompere la punta capillare con una pinza fine e regolare il tempo di iniezione (circa 100 ms) per ottenere un volume di espulsione di 15-40 nL per impulso. Impostare la pressione di espulsione su ~40 PSI.
NOTA: La dimensione della goccia deve essere adattata allo stadio dei girini e alle dimensioni del loro occhio. Ad esempio, nelle fasi 48-49, la dimensione della goccia è ~15-20 nL, mentre è 30-40 nL nelle fasi 52-56. Visivamente, la dimensione della goccia è un po' più grande della dimensione dell'obiettivo.
- Iniezioni intraoculari di CoCl2
- Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in 50 mL di soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendi qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli.
NOTA: Diversi girini possono essere anestetizzati contemporaneamente, ma il tempo trascorso nell'anestetico deve essere inferiore a 30 minuti. - Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura in una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro) contenente un fazzoletto bagnato. Posizionare il girino con il lato dorsale rivolto verso l'alto al centro della capsula di Petri (Figura 1F,G).
- Utilizzare il microiniettore sotto uno stereomicroscopio per iniettare intraocularmente la soluzione di CoCl2 . Inserire delicatamente il capillare nell'occhio sopra la lente. Quando la punta capillare è all'interno dell'occhio, espellere due gocce per occhio. Dopo aver iniettato l'occhio destro, ruotare manualmente la capsula di Petri di 180° per iniettare l'occhio sinistro.
NOTA: Assicurarsi che l'iniezione venga eseguita all'interno dell'occhio, in modo da notare un leggero gonfiore dell'occhio dopo ogni espulsione della soluzione. Il girino dovrebbe stare fuori dall'acqua il meno possibile. L'iniezione di entrambi gli occhi deve richiedere meno di 1 minuto. - Trasferire il girino iniettato in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendolo con cura nella capsula di Petri (Figura 1H). Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.
- Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in 50 mL di soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendi qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli.
5. Colorazione per valutare il danno retinico o la degenerazione retinica
- Fissazione e disidratazione del girino
- Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% diluendo 100 mL di soluzione di PFA al 32% in 700 mL di PBS 1x. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Aliquotare questa soluzione madre e conservarla per diversi mesi a -20 °C.
- Eutanasia i girini in benzocaina allo 0,01% e trasferirli in una fiala contenente PFA al 4% per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione o per una notte a 4 °C. Risciacquare 3 x 5 min in 1x PBS.
- Disidratare progressivamente i girini mediante successive incubazioni di 30 minuti in etanolo al 70% e al 95% (diluito in acqua di tipo II), seguite da altre tre incubazioni di 1 ora in etanolo al 100%. Conservare le teste dei girini in questa fase a -20 °C o trasferirle direttamente al butanolo al 100% durante la notte per ulteriori passaggi.
- Sezionamento della paraffina
- Sostituire il butanolo al 100% con paraffina fusa per 2 ore a 62 °C. Sostituire la paraffina per 2 x 2 ore di incubazione supplementare a 62 °C.
- Trasferisci le teste dei girini in stampi usa e getta per inclusione di paraffina e orientali in modo che i loro occhi siano ben allineati, quindi lascia che la paraffina si indurisca. Conservare i blocchi a temperatura ambiente.
- Tagliare la paraffina in eccesso e montare il blocco con il/i girino/i incorporato/i sul supporto del microtomo.
- Sezionare il blocco con un microtomo allo spessore appropriato (10-12 μm). Trasferire i nastri con le sezioni su un vetrino precedentemente ricoperto con glicerina albumina al 3% (diluita in acqua).
- Posizionare il vetrino su uno scaldavetrini a 42 °C per alcuni minuti e poi rimuovere l'eccesso di glicerina albumina. Lasciare asciugare i vetrini per una notte in forno a 37 °C.
- Decerare immergendo i vetrini per 2 x 15 minuti in un barattolo Coplin riempito al 100% di xilene. Reidratare le sezioni con una serie di etanolo graduato: 100% due volte, 70%, 50% (diluito in acqua di tipo II), ~5 minuti ciascuna, seguito da 2 x 5 minuti in acqua.
- Marcatura a immunofluorescenza
- Preparare 100 mM di soluzione madre di citrato di sodio (CiNa) aggiungendo 29,4 g di citrato di sodio sale trisodico diidrato (C6H5Na3O7, 2H2O) a 1 L di acqua di tipo II; regolare il pH a 6 con acido cloridrico (HCl). Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente per diversi mesi. Preparare la soluzione di smascheramento al momento dell'uso aggiungendo 25 mL di soluzione madre CiNa 100 mM a 225 mL di acqua di tipo II. Aggiungere 125 μL di Tween-20 e mescolare bene (la concentrazione finale è 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
- Preparare la soluzione madre Hoechst a 10 mg/mL aggiungendo 100 mg di bisBenzimide H 33258 a 10 mL di acqua di tipo I. Conservare questa soluzione madre per diversi mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. Preparare la soluzione di Hoechst a 7,5 μg/mL aggiungendo 300 μL di soluzione madre di Hoechst a 400 mL di 1x PBS.
NOTA: Questa soluzione può essere utilizzata fino a 10 volte e conservata per circa 6 mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. - Dopo aver depato le sezioni, eseguire il recupero dell'antigene facendo bollire le sezioni nella soluzione di smascheramento per 9 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione per 20 min.
- Risciacquare una volta in acqua di tipo II e una volta in 1x PBS. Mettere i vetrini in una camera umida e aggiungere 400-600 μL di soluzione bloccante per vetrino (diluente anticorpale + 0,2% Triton X100) per 30 minuti.
- Sostituire la soluzione bloccante con 200 μL per vetrino dell'anticorpo primario diluito nella soluzione bloccante. Utilizzare un vetrino coprioggetto per distribuire la soluzione sulle sezioni, evitando la formazione di bolle. Incubare per una notte a 4 °C in camera umida.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e risciacquare per 3 x 10 minuti in 1x PBS integrato con Triton X100 allo 0,1%. Mettere i vetrini in piano, aggiungere 400 μL per vetrino dell'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante e lasciare agire per 2 ore a temperatura ambiente in una camera umida.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e risciacquare per 3 x 5 minuti con 1x PBS integrato con Triton X100 allo 0,1%.
- Controcolorare i nuclei cellulari con la soluzione Hoechst per 10 minuti e risciacquare 3 x 5 minuti con 1x PBS.
- Posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini in un mezzo di montaggio acquoso specificamente progettato per preservare la fluorescenza. Lasciare asciugare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente e conservarli a 4 °C.
- Visualizzare i vetrini con un microscopio a fluorescenza.
- Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) per valutare il danno retinico
NOTA: Invece di marcare un particolare tipo di cellula mediante immunocolorazione, l'istologia retinica generale può essere valutata con la colorazione H&E.- Dopo la deceratura delle sezioni, eseguire la marcatura degli acidi nucleici immergendo i vetrini in una soluzione di ematossilina per 2 minuti. Risciacquare bene con acqua di rubinetto.
- Eseguire la marcatura del citoplasma immergendo i vetrini in una soluzione di eosina all'1% per 1 minuto. Risciacquare velocemente con acqua.
NOTA: L'eosina è molto solubile; Se i vetrini vengono lasciati troppo a lungo nell'acqua, tutto il colorante scompare. - Risciacquare 2 x 5 min in etanolo al 100% e 2 x 5 min in xilene.
- Sotto il cofano, posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini in 4-5 gocce di un mezzo di montaggio. Lasciare asciugare i vetrini sotto una cappa e fotografarli il giorno seguente con un microscopio.
- Rilevamento di cellule apoptotiche
- Dopo le sezioni di deceratura (vedere paragrafo 5.2.6), seguire il protocollo del produttore del kit per rilevare la frammentazione del DNA apoptotico.
- Eseguire la colorazione dei nuclei immergendo i vetrini nella soluzione di Hoechst (vedere paragrafo 5.3.8) e montarli con un mezzo di montaggio acquoso specificamente progettato per preservare la fluorescenza. Lasciare asciugare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente e conservarli a 4 °C.
- Visualizzare i vetrini con un microscopio a fluorescenza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lesione meccanica della retina
Le sezioni retiniche dei girini sottoposti alla lesione meccanica descritta nella sezione 1 del protocollo mostrano che la lesione retinica comprende tutti gli strati del tessuto pur rimanendo limitata al sito di puntura (Figura 2A,B).
Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ
Gli occhi di girini transgenici Anestetizzati Tg(rho:GFP-NTR) trattati con trattamento MTZ, come descritto nella sezione 2 del protocollo, sono stati analizzati allo stereomicroscopio (Figura 3A,B). La diminuzione della fluorescenza della GFP rivela la progressiva ablazione mirata dei bastoncelli rispetto ai controlli (Figura 3B), confermata sulle sezioni retiniche mediante immunocolorazione con GFP, come descritto nella sezione 5 del protocollo (Figura 3C).
Degenerazione dei bastoncelli mediante knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9
Le retine dei girini rho crispant, ottenute come descritto nella sezione 3 del protocollo, sono state analizzate come descritto nella sezione 5 del protocollo (Figura 4A). La marcatura della caspasi 3 e della rodopsina evidenzia che alcuni bastoncelli vanno incontro ad apoptosi (Figura 4B). La colorazione H&E rivela la conservazione globale degli strati nucleari, ma un grave accorciamento dei segmenti esterni dei fotorecettori (Figura 4C). Ulteriori analisi di immunocolorazione con marcatori fotorecettori mostrano la degenerazione dei bastoncelli e i conseguenti difetti dei coni (Figura 4D e non mostrata). Il fenotipo inizia ad essere visibile dallo stadio 40 in poi, e i segmenti esterni dei bastoncelli scompaiono progressivamente fino a quando non sono assenti dalla retina centrale dallo stadio 47.
Degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari citotossiche di CoCl2
Le retine dei girini sottoposti a iniezioni intraoculari di CoCl2, come descritto nella sezione 4 del protocollo, sono state analizzate mediante immunocolorazione e test TUNEL, come descritto nella sezione 5 del protocollo (Figura 5A). Ciò rivela che l'iniezione di CoCl2 da 10 mM porta alla morte cellulare specifica dei fotorecettori dei coni (Figura 5B,C), mentre 25 mM portano alla morte delle cellule retiniche (Figura 5E). L'analisi dell'immunocolorazione, come descritto nella sezione 5 del protocollo, ha inoltre rivelato l'assenza di coni nelle retine iniettate con CoCl 2 da 10 mM (Figura 5D) e una grave perdita sia di cellule bipolari che di fotorecettori a seguito di iniezioni di CoCl2 da 25 mM (Figura 5F).
Figura 1: Illustrazioni di alcune procedure sperimentali. (A) Un perno di 0,2 mm di diametro attaccato a un supporto per perni viene utilizzato per perforare la retina. I diagrammi delle viste dorsale, laterale e frontale di un girino illustrano dove è inserito il perno (in rosso). (B) Rappresentazione schematica del modello transgenico di ablazione condizionale dei bastoncelli. Il promotore della rodopsina guida l'espressione di una proteina di fusione GFP-nitroreduttasi nei bastoncelli. Quando viene aggiunto all'acqua di allevamento di Xenopus , l'NTR converte il metronidazolo in una citotossina, ablando in particolare i bastoncelli GFP-NTR. (C ) La testa di un girino transgenico Tg(rho:GFP-NTR) è mostrata in luce bianca o in fluorescenza. La colorazione GFP nell'occhio permette la selezione dei girini transgenici. (D) Embrioni allo stadio unicellulare su una griglia di nylon sotto uno stereomicroscopio pronti per essere iniettati con un sistema di microiniezione Picospritzer. (E ) Embrioni allo stadio di neurula (schematico nel riquadro) dopo l'iniezione allo stadio unicellulare del complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 contenente destrano di fluoresceina lisina. Gli embrioni fluorescenti ben iniettati (frecce verdi) possono essere distinti da quelli non iniettati (frecce bianche). (F) Immagine che mostra il cucchiaio utilizzato per trasferire i girini anestetizzati (G) Girini anestetizzati in una capsula di Petri su un tessuto bagnato. Il capillare inserito nel microiniettore permette iniezioni intraoculari della soluzione di CoCl2 . (H) Immagine che mostra il trasferimento di un girino in una vasca da 1 L dove l'animale può essere monitorato fino al risveglio. Barre graduate = 2 mm (C), 1 mm (E). Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; NTR = nitroreduttasi; MTZ = metronidazolo; NF = stadio di Nieuwkoop e Faber. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lesione meccanica della retina. (A) Cenni sulla procedura sperimentale di cui al punto (B). Gli occhi del girino di Xenopus laevis vengono perforati e analizzati sulle sezioni retiniche 7 giorni dopo la lesione. La casella tratteggiata indica l'area di cui è stata creata l'immagine. (B) I nuclei cellulari sono controcolorati con Hoechst. Vengono mostrate tre diverse retine. Le frecce indicano il sito lesionato che attraversa tutti gli strati della retina. Barra graduata = 50 μm. Abbreviazioni: dpi = giorni dopo l'infortunio; GCL = strato di cellule ganglionari; INL = strato nucleare interno; ONL = strato nucleare esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ablazione condizionale delle cellule a bastoncelli utilizzando il sistema NTR-MTZ. (A) Cenni sulla procedura sperimentale utilizzata in (B,C). I girini transgenici di Xenopus laevis Tg(rho:GFP-NTR) vengono trattati con MTZ per 7-9 giorni. La progressiva degenerazione delle barre marcate con GFP può essere monitorata in tempo reale con uno stereomicroscopio a fluorescenza, come illustrato a 7 giorni in (B). La morte dei bastoncelli può essere analizzata anche su sezioni retiniche, come illustrato dopo 14 giorni in (C), il riquadro tratteggiato che indica l'area ripresa. (B) Dopo 7 giorni di trattamento, l'intensità della GFP nella retina diminuisce con il tempo nei girini transgenici trattati con MTZ rispetto ai controlli. (C) La diminuzione della fluorescenza della GFP è confermata sulle sezioni retiniche a 14 giorni mediante immunocolorazione della GFP. I nuclei delle cellule sono controcolorati in blu con Hoechst. Barre di scala = 500 μm (B), 50 μm (C). Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; NTR = nitroreduttasi; MTZ = metronidazolo; L = lente; R = retina; GCL = strato di cellule ganglionari; INL = strato nucleare interno; ONL = strato nucleare esterno; OS = segmenti esterni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Degenerazione dei bastoncelli in Xenopus laevis rho crispants. (A) Cenni sulla procedura sperimentale utilizzata in (B-D). Agli embrioni in fase unicellulare viene iniettato il complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (gRNA duplex/proteina Cas9) contenente il destrano di lisina fluorescente. Allo stadio di neurula, gli embrioni iniettati con fluorescenza possono essere ordinati e lasciati sviluppare fino a vari stadi per eseguire (B) immunocolorazione con caspasi 3 scissione per l'analisi della morte cellulare, o (C) colorazione con ematossilina ed eosina per l'analisi anatomica, o (D) immunocolorazione con marcatori a bastoncelli per l'analisi della degenerazione cellulare dei fotorecettori. La casella tratteggiata indica l'area di cui è stata creata l'immagine. (B) La doppia marcatura della caspasi 3 scissa (un marcatore delle cellule apoptotiche) e della rodopsina (un marcatore dei segmenti esterni dei bastoncelli) su sezioni retiniche di embrioni di controllo o rho crispants allo stadio 39 mostra un'assenza di cellule morenti nei controlli e che le cellule morenti nei rho crispants sono fotorecettori dei bastoncelli. (C) La colorazione H&E su sezioni retiniche di girini di Xenopus laevis allo stadio 48 rivela la diminuzione delle dimensioni dei segmenti esterni dei fotorecettori rispetto ai controlli. (D) La co-immunocolorazione della recupina (un marcatore dei segmenti interni dei bastoncelli) e della rodopsina su sezioni retiniche di girini di Xenopus laevis allo stadio 48 rivela una grave degenerazione rispetto ai controlli. I nuclei delle cellule sono controcolorati in blu con Hoechst. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: gRNA = RNA guida; H&E = ematossilina ed eosina; GCL = strato di cellule ganglionari; INL = strato nucleare interno; ONL = strato nucleare esterno; OS = segmenti esterni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari citotossiche di CoCl2. (A) Cenni sulla procedura sperimentale utilizzata in (B-F). La casella tratteggiata indica l'area di cui è stata creata l'immagine. Una soluzione di 10 mM o 25 mM di CoCl2 viene iniettata per via intraoculare nell'occhio del girino. L'apoptosi cellulare viene analizzata mediante un test TUNEL 2 giorni dopo la lesione (dpi) (B,C,E), mentre la degenerazione delle cellule retiniche viene analizzata da 7 a 14 dpi mediante immunocolorazione con vari marcatori (D,F). (B-D) Sezioni retiniche di girini iniettati con una soluzione salina (controlli) o con una soluzione di CoCl2 10 mM agli stadi 51-54. (B) L'analisi della morte cellulare a 2 dpi rivela la presenza di cellule morenti dopo l'iniezione di CoCl2 principalmente nello strato nucleare del fotorecettore. (C) L'accoppiamento della colorazione della morte cellulare con l'immunocolorazione S/M Opsin (un marcatore dei coni) rivela che queste cellule morenti sono principalmente coni; Le frecce puntano alle celle con doppia etichetta. (D) La co-immunocolorazione S/M Opsina (un marcatore dei coni) e Rodopsina (un marcatore dei bastoncelli) rivela una grave diminuzione della marcatura delle cellule coniche nelle retine iniettate con CoCl2 rispetto ai controlli a 14 dpi. (E,F) Sezioni retiniche di girini iniettate con una soluzione di CoCl2 25 mM negli stadi 51-54. (E) L'analisi della morte cellulare a 2 dpi rivela la presenza di cellule morenti sia nel fotorecettore che negli strati nucleari interni. (F) L'immunocolorazione con Otx2 (un marcatore sia dei fotorecettori che delle cellule bipolari) rivela una grave diminuzione della colorazione in entrambi gli strati nelle retine iniettate con CoCl 2 rispetto ai controlli a 7 dpi, indicando la morte cellulare indotta da CoCl2 sia dei fotorecettori che delle cellule bipolari. I nuclei delle cellule sono controcolorati in blu con Hoechst. Barre graduate: 25 μm. Abbreviazioni: ONL = strato nucleare esterno; INL = Strato Nucleare Interno; GCL = strato di cellule ganglionari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus
Lesione meccanica della retina
Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente16,17. La lesione meccanica qui presentata non comporta alcuna escissione retinica, ma una semplice puntura oculare che abbiamo precedentemente sviluppato nei girini di Xenopus 6. Data la procedura manuale di un tale modello di lesione retinica meccanica, il fenotipo può variare significativamente da un girino all'altro. Inoltre, la replicabilità e l'entità del danno possono variare anche a seconda di chi sta eseguendo l'esperimento. Pertanto, raccomandiamo che la stessa persona esegua tutte le procedure di lesione.
Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ
Il sistema NTR-MTZ è stato utilizzato per l'ablazione dei bastoncelli nella retina transgenica Xenopus 6,7,8,18. La durata del trattamento MTZ varia significativamente da uno studio all'altro, da 2 a 7 giorni. Ciò può riflettere diverse attività dell'NTR a seconda dell'inserzione cromosomica nelle diverse linee transgeniche. Inoltre, abbiamo notato una certa variabilità nella risposta dei girini Tg(rho:GFP-NTR) per un dato periodo di trattamento MTZ, con alcuni che hanno subito una grave degenerazione dei bastoncelli mentre altri hanno mostrato pochissimi danni. L'estensione del trattamento MTZ da 7 a 9-10 giorni con questa linea transgenica sembra ridurre tale variabilità. Tuttavia, è necessario prestare attenzione dati gli effetti potenzialmente tossici della MTZ. Gli evidenti vantaggi di questo modello sono che consente l'ablazione condizionale e reversibile delle cellule dei bastoncelli e il monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli.
Degenerazione dei bastoncelli mediante knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9
Il modello di editing genetico rho CRISPR-Cas9 della retinite pigmentosa porta alla degenerazione dei bastoncelli nel girino11 di Xenopus. Tuttavia, a differenza del modello NTR-MTZ, l'ablazione dei bastoncelli è costitutiva e non reversibile. È interessante notare che l'elevata efficienza di questo approccio (ora otteniamo regolarmente il >90% dei girini che presentano una grave degenerazione dei bastoncelli) consente di lavorare su questo modello sulla generazione F0. Inizialmente stavamo lavorando con l'sgRNA, ma abbiamo notato la variabilità di diversi lotti di preparazioni di RNA. Recentemente abbiamo scoperto che l'ordinazione di crRNA e tracrRNA sintetici e la preparazione del gRNA duplex come descritto in questo protocollo forniscono risultati più affidabili.
Degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari citotossiche di CoCl2
Questo modello presenta diversi vantaggi rispetto agli altri modelli qui descritti. Permette non solo di indurre condizionatamente l'ablazione di tipi di cellule retiniche, ma anche di modulare la gravità del danno14. Inoltre, rappresenta, per quanto ne sappiamo, l'unico modello di degenerazione specifica dei coni in Xenopus. Infine, genera una bassa variabilità nel fenotipo degenerativo.
Efficacia dei quattro paradigmi di lesione retinica
Per tenere conto della potenziale variabilità dei fenotipi da un lotto di girini all'altro, si consiglia di verificare l'efficacia della degenerazione retinica su 8-10 girini. In caso di lesione meccanica, il danno deve essere analizzato nei giorni successivi all'infortunio, in quanto la lesione non è più visibile una settimana dopo. Nel modello NTR-MTZ, la degenerazione dei bastoncelli è chiaramente visibile 1 settimana dopo la fine del trattamento MTZ. Per i croccanti rho, poiché la morte dei bastoncelli inizia quando i fotorecettori si differenziano completamente, si consiglia di analizzare l'efficienza degenerativa dallo stadio 45 in poi. Nel modello CoCl2 , la morte cellulare si verifica entro una settimana dall'iniezione. Per quanto riguarda la % di sopravvivenza attesa per ciascun metodo, vorremmo notare che le iniezioni di complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 portano a tassi di mortalità più elevati nelle prime 48 ore rispetto alle iniezioni convenzionali di RNA (non persistono problemi di crescita o sopravvivenza dopo queste prime 48 ore) e, pertanto, dovrebbero essere iniettati più embrioni se necessario. Al contrario, altre procedure (lesioni meccaniche, trattamento MTZ o iniezioni intraoculari di CoCl2 ) non pongono alcun problema di sopravvivenza.
Potenziali applicazioni di questi paradigmi di lesione per studiare la rigenerazione retinica
Una potenziale applicazione di questa serie di modelli di lesioni retiniche è lo studio della rigenerazione retinica. Diverse fonti di cellule staminali retiniche o staminali possono essere reclutate in un contesto patologico, tra cui le cellule CMZ, le cellule gliali di Müller e le cellule RPE. Abbiamo riportato che il modello di lesione meccanica, il modello NRT/MTZ e il modello CRISPR/Cas9, sono tutti modelli interessanti per studiare l'attivazione delle cellule di Müller dopo la lesione 6,11. È interessante notare che, nel modello CoCl2, tutte e tre le fonti cellulari possono essere reclutate14, fornendo un nuovo modello per studiare i meccanismi alla base del reclutamento e della riprogrammazione di diversi tipi di cellule retiniche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a M.P. da parte dell'Association Retina France, della Fondation de France, della FMR (Fondation Maladies Rares), della BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e dell'UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in collaborazione con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
