Summary
Xenopus laevis kurbağa yavrularında retina hasarını veya retina dejenerasyonunu indüklemek için çeşitli protokoller geliştirdik. Bu modeller retinal rejenerasyon mekanizmalarını inceleme imkanı sunar.
Abstract
Retinal nörodejeneratif hastalıklar körlüğün önde gelen nedenleridir. Araştırılan çok sayıda terapötik strateji arasında, son zamanlarda kendi kendini onarmayı teşvik etmek özellikle çekici olarak ortaya çıktı. Retina onarımı için hücresel bir ilgi kaynağı, kök hücre potansiyelini ve anamniyotlarda olağanüstü bir rejeneratif kapasiteyi barındıran Müller glial hücresidir. Ancak bu potansiyel memelilerde çok sınırlıdır. Rejeneratif yeteneklere sahip hayvan modellerinde retinal rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesi, memeli Müller hücrelerinin retinayı yenilemek için gizli yeteneğinin nasıl ortaya çıkarılacağına dair fikir vermelidir. Bu, rejeneratif tıpta terapötik stratejilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır. Bu amaçla, Xenopus'ta birkaç retina yaralanması paradigması geliştirdik: mekanik bir retina yaralanması, nitroredüktaz aracılı fotoreseptör koşullu ablasyonuna izin veren bir transgenik hat, CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtına dayalı bir retinitis pigmentosa modeli ve göz içi CoCl2 enjeksiyonları tarafından yönlendirilen bir sitotoksik model. Avantajlarını ve dezavantajlarını vurgulayarak, burada çeşitli dejeneratif koşullar oluşturan ve Xenopus'ta retinal rejenerasyonun incelenmesine izin veren bu protokol serisini açıklıyoruz.
Introduction
Dünya çapında milyonlarca insan, retinitis pigmentosa, diyabetik retinopati veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi körlüğe yol açan çeşitli retinal dejeneratif hastalıklardan muzdariptir. Bugüne kadar, bu koşullar büyük ölçüde tedavi edilemez kalmaktadır. Değerlendirilmekte olan mevcut terapötik yaklaşımlar arasında gen terapisi, hücre veya doku nakilleri, nöroprotektif tedaviler, optogenetik ve protez cihazlar yer almaktadır. Ortaya çıkan bir başka strateji, kök hücre potansiyeline sahip endojen hücrelerin aktivasyonu yoluyla kendi kendini yenilemeye dayanmaktadır. Retinanın majör glial hücre tipi olan Müller glial hücreleri, bu bağlamda hücresel ilgi kaynakları arasındadır. Yaralanma üzerine, farklılaşabilir, çoğalabilir ve nöronlar üretebilirler 1,2,3. Bu işlem zebra balığı veya Xenopus'ta çok etkili olmasına rağmen, memelilerde büyük ölçüde verimsizdir.
Bununla birlikte, mitojenik proteinlerle veya çeşitli faktörlerin aşırı ekspresyonu ile uygun tedavilerin, memeli Müller glia hücre döngüsünün yeniden girişini indükleyebileceği ve bazı durumlarda müteakip nörojenez taahhüdünü tetikleyebileceği gösterilmiştir 1,2,3,4,5. Ancak bu, tedaviler için büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle, Müller kök benzeri hücre özelliklerini verimli bir şekilde yeni hücresel terapötik stratejilere dönüştürebilen molekülleri tanımlamak için rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgimizi artırmak gereklidir.
Bu amaçla, Xenopus'ta retinal hücre dejenerasyonunu tetikleyen çeşitli yaralanma paradigmaları geliştirdik. Burada, (1) hücre tipine özgü olmayan mekanik bir retina hasarı, (2) çubuk hücrelerini hedef alan NTR-MTZ sistemini kullanan koşullu ve geri dönüşümlü bir hücre ablasyon modeli, (3) bir CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı, ilerleyici çubuk hücre dejenerasyonunu tetikleyen bir retinitis pigmentosa modeli ve (4) bir CoCl2-doza göre spesifik olarak konileri hedefleyebilen veya daha geniş retinal hücre dejenerasyonuna yol açabilen indüklenmiş sitotoksik model. Her paradigmanın özelliklerini, avantajlarını ve dezavantajlarını vurguluyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve deneyleri, kurumsal yönergelere uygun olarak, kurumsal lisans A91272108 altında yürütülmüştür. Çalışma protokolleri, kurumsal hayvan bakım komitesi CEEA #59 tarafından onaylandı ve APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ve APAFIS #21474-2019071210549691 v2 referans numarası altında Direction Départementale de la Protection des Populations tarafından yetkilendirildi. Bu protokollerde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Mekanik retina yaralanması
NOT: Burada açıklanan yaralanma paradigma protokolü, evre 45'ten itibaren bir kurbağa yavrusunun mekanik retinal delinmesinden oluşur. Bu nedenle, belirli bir retina hücre tipini hedeflemez, ancak delinme bölgesinde retinanın tüm kalınlığına zarar verir.
- Kurbağa yavruları için anestezinin hazırlanması
- % 10'luk bir benzokain stok çözeltisi hazırlayın. Toplam 10 mL hacim için 1 g benzokain, 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ve 8 mL propilen glikol ekleyin. Stok çözeltisini alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 4 °C'de birkaç ay muhafaza edin.
- 50 mL kurbağa yavrusu yetiştirme suyuna (filtrelenmiş ve klorsuz musluk suyu) 25 μL %10 benzokain stok çözeltisi ekleyerek kullanım sırasında% 0.005 benzokain çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
NOT: Benzokain konsantrasyonu özellikle düşüktür çünkü kurbağa yavruları yetişkinlere kıyasla anesteziye karşı oldukça hassastır.
- Pim hazırlama
- Sterilize edilmiş bir pim tutucuya 0.2 mm çapında steril bir pim takın (Şekil 1A).
- Kurbağa yavrusu anestezisi
- Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları% 0.005 benzokain çözeltisi içeren yeni bir tanka aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin (tanka dokunmak veya doğrudan temas).
NOT: Birkaç kurbağa yavrusu aynı anda uyuşturulabilir, ancak anestezik solüsyonda harcanan süre 30 dakikadan az olmalıdır.
- Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları% 0.005 benzokain çözeltisi içeren yeni bir tanka aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin (tanka dokunmak veya doğrudan temas).
- Retina ponksiyonu
- Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve ıslak bir doku içeren küçük bir Petri kabına (55 mm çapında) dikkatlice koyun. Kurbağa yavrusunun sırt tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kabının ortasına yerleştirin.
- Stereomikroskop altında, retinadan geçene kadar gözün dorsal tarafındaki pimi nazikçe sokarak retinayı delin (Şekil 1A). Birkaç dürtme gerekiyorsa, bu işlemi farklı yerlerde tekrarlayın. Sağ gözü deldikten sonra, sol gözü delmek için Petri kabını 180° çevirin.
- Lezyonlu kurbağa yavrusunu, Petri kabını dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın. Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.
2. NTR-MTZ sistemini kullanarak koşullu çubuk hücre ablasyonu
Protokol, Fransız Xenopus kaynak merkezine ev sahipliği yapan TEFOR Paris-Saclay'in zooteknik servisinde bulunan Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) transgenik hat6'da spesifik çubuk hücre ablasyonunu indüklemeyi amaçlıyor. Bu kemogenetik sistem, NTR eksprese eden çubukları spesifik olarak ablate etmek için ön ilaç metronidazolünü (MTZ) sitotoksik bir DNA çapraz bağlama maddesine dönüştürmek için nitroredüktaz (NTR) enziminin kapasitesini kullanır (Şekil 1B). Tg(rho:GFP-NTR) veya Tg(rho:NTR) transgenik hayvanları yapmak ve dejenerasyonu indüklemek için iki ayrıntılı protokol daha önce yayınlanmıştır 7,8. Burada, retina dejenerasyonunun indüksiyonunu ve dejenerasyon sürecinin in vivo olarak nasıl izleneceğini detaylandırıyoruz.
- Metronidazol çözeltisinin hazırlanması
- Manyetik bir karıştırma çubuğu ve bir manyetik karıştırıcı kullanarak% 0,1 DMSO içeren 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyunda 1,67 g MTZ tozunu koyu renkli bir şişede çözerek kullanım sırasında 10 mM MTZ çözeltisi hazırlayın.
NOT: MTZ ışığa duyarlıdır. Tam çözünme 10 dakika kadar sürebilir.
- Manyetik bir karıştırma çubuğu ve bir manyetik karıştırıcı kullanarak% 0,1 DMSO içeren 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyunda 1,67 g MTZ tozunu koyu renkli bir şişede çözerek kullanım sırasında 10 mM MTZ çözeltisi hazırlayın.
- Tg(rho:GFP-NTR) hattından doğal çiftleşme yoluyla transgenik kurbağa yavrularının üretilmesi
NOT: Transgenik erkekler değerli bir stoğu temsil ettiğinden, erkeği feda etmemek ve tekrar tekrar kullanmak için doğal çiftleşme yoluyla embriyo üretmeyi tercih ediyoruz.- Hormon uygulaması
- 600 IU insan koryonik gonadotropin hormonu (hCG) 25G iğnelerle Xenopus laevis vahşi tip dişilerin dorsal lenf kesesine enjekte edin. Transgenik erkeklere 100-200 IU hCG ile dorsal lenf kesesine enjekte edin. Çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesi için (adım 2.4), üretilen transgenik kurbağa yavrularının gözündeki floresan varyasyonlarını daha iyi görselleştirmek için pigmentli olanlar yerine albino Xenopus kullanın.
NOT: Xenopus dişileri, planlanan yumurtlamadan 1 ila 7 gün önce 50 IU hCG ile hazırlanabilir, ancak bu isteğe bağlıdır.
- 600 IU insan koryonik gonadotropin hormonu (hCG) 25G iğnelerle Xenopus laevis vahşi tip dişilerin dorsal lenf kesesine enjekte edin. Transgenik erkeklere 100-200 IU hCG ile dorsal lenf kesesine enjekte edin. Çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesi için (adım 2.4), üretilen transgenik kurbağa yavrularının gözündeki floresan varyasyonlarını daha iyi görselleştirmek için pigmentli olanlar yerine albino Xenopus kullanın.
- Çiftleşme ve yumurta toplama
- HCG enjeksiyonundan hemen sonra, ertesi güne kadar 20 ° C'de bir hCG enjekte edilmiş dişi ile birlikte bir Tg (rho: GFP-NTR) transgenik erkeği bir tanka koyun. Büyük bir hacim (en az 10 L) kullanın ve yumurtaların yapışması için küçük nesneler ekleyin, böylece yumurtalar yetişkinlerin hareketlerinden zarar görmez. Ertesi gün, kurbağalar artık amplexus'ta olmadığında, yetişkinleri tanktan çıkarın ve embriyoları toplayın.
- Embriyo ve kurbağa yavrularının yetiştirilmesi
- Embriyoları ve kurbağa yavrularını Xenopus gelişiminin normal tablosuna göre evreleyin9.
- Kurbağa yavrusu yetiştirme suyuyla dolu bir tankta embriyoları büyütün. 45. aşamadan itibaren, kurbağa yavrularını toz yavru yemi ile besleyin ve suyu bir fıskiye ile oksijenlendirin. Buharlaşmayı telafi etmek için gerekirse günlük su ekleyin ve tüm tank suyunu haftalık olarak değiştirin.
NOT: Alternatif olarak, hacmin %50'sini haftada iki kez değiştirmek de mümkündür. Ayrıntılı bir protokol10'da bulunabilir.
- Transgenik embriyo ayıklama
- Aşama 37/38'den itibaren, GFP'yi doğrudan görselleştirerek bir floresan stereomikroskop altında transgenik embriyoları sıralayın ve seçin (Şekil 1C).
- Hormon uygulaması
- Kurbağa yavrusu MTZ tedavisi
- Tg(rho:GFP-NTR) transgenik kurbağa yavrularını 10 mM MTZ solüsyonu içeren bir tanka aktarın ve 1 hafta boyunca karanlıkta 20 °C'de bekletin. Kontrol olarak% 0.1 DMSO içeren kurbağa yavrusu yetiştirme suyunda yetiştirilen transgenik kardeşleri kullanın.
- Tedavi süresi boyunca MTZ'yi ve kontrol solüsyonunu iki günde bir değiştirin. MTZ tedavisi sırasında kurbağa yavrularını her zamanki gibi besleyin.
- Bireysel floresan izleme için (adım 2.4), her bir kurbağa yavrusunu 30 mL MTZ veya adım 2.3.1'den itibaren kontrol solüsyonu içeren küçük kabına yerleştirin.
NOT: MTZ tedavisi evre 45'ten itibaren herhangi bir zamanda yapılabilir.
- Çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesi
NOT: Çubukların aşamalı dejenerasyonu gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bu nedenle, 2.4.1 adımlarını gerçekleştirin. 2.4.4'e kadar. MTZ tedavisinden önce ve daha sonra tedaviden sonra düzenli olarak.- Anestezik ve kurbağa yavrusu anestezisinin hazırlanması için sırasıyla 1.1 ve 1.3 adımlarını izleyin.
- Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve küçük bir Petri kabında (55 mm çapında) ıslak bir mendil üzerine dikkatlice koyun. GFP floresansını bir floresan stereomikroskop altında gözlemleyin (uyarma dalga boyu = 488 nm ve emisyon dalga boyu = 509 nm) ve gözün fotoğraflarını çekin. Azalan floresan yoğunluğu, çubukların bozulmasını yansıtır.
NOT: Kantitatif karşılaştırmalar yapmak için, tüm kurbağa yavrularını görüntülemek için aynı ayarlar korunmalıdır. - Görüntülenen kurbağa yavrusunu, Petri kabını dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın. Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.
- Dejenerasyon sürecinin etkinliğini izlemek ve değerlendirmek için MTZ ile tedavi edilen ve kontrol kurbağa yavrusu gözleri arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırın.
3. CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavt ile çubuk hücre dejenerasyonu
NOT: Bu protokol, CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı kullanılarak spesifik çubuk hücre dejenerasyonunu indükleyerek Xenopus laevis'te bir retinitis pigmentosa modeli oluşturmak için oluşturulmuştur. F0'daki ekleme-silme (indels) yüzdesi11'de sağlanır ve ~%75'tir. Böyle bir CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavt, Xenopus tropicalis kurbağa yavrularında da gerçekleştirilebilir 11.
- Çözeltilerin ve reaktiflerin hazırlanması
- crRNA ve tracrRNA sıralaması
- Rodopsin (rho) genini ve standart trans-aktive edici crRNA'yı (tracrRNA) hedefleyen sentetik CRISPR RNA'yı (crRNA) satın alın. crRNA, rho hedefine özgü bir bölgeden (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ve tracrRNA'ya hibritleşen başka bir bölgeden (GUUUUAGAGCUAUGCU) oluşur.
- crRNA:tracrRNA dubleks (rho gRNA dubleks)
- Nükleaz içermeyen dubleks tamponda crRNA ve tracrRNA'yı 100 μM'de yeniden süspanse edin.
- 3 μL 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA ve 94 μL dubleks tamponu karıştırarak gRNA dupleksini hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar 36 ng/μL rho crRNA ve 67 ng/μL tracrRNA'dır.
- Oligoları 95 °C'de 5 dakika ısıtarak tavlayın ve yavaşça oda sıcaklığına soğutun. Alikotlar yapın ve -20 °C'de saklayın.
- CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi (yani, gRNA dupleks/Cas9 proteini)
- Kullanım sırasında, rho gRNA dubleks ve Cas9 proteini karışımını hazırlayın. 20 μL için 10 μL rho gRNA dupleks çözeltisi, 2 μL Cas9 proteini (5 mg/mL'de stok), 2 μL floresein lizin dekstran (10 mg/mL'de stok) ve 6 μL RNaz içermeyen su ekleyin.
- Ribonükleoprotein kompleksini oluşturmak için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin ve çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
- 20 μL kontrol çözeltisi için 2 μL Cas9 proteini, 2 μL floresein lizin dekstran ve 16 μL RNaz içermeyen su karıştırın.
- 10x, 1x ve 0.1x MBS çözümlerinin hazırlanması
- 11.92 g HEPES, 51.43 g sodyum klorür (NaCl), 0.75 g potasyum klorür (KCl), 2.1 g sodyum bikarbonat (NaHCO3) ve 2.46 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgS4, 7H2O) ekleyerek Modifiye Barth'ın Tuzlu su stok çözeltisini (10x MBS) hazırlayın 800 mL tip II suda. %30 sodyum hidroksit (NaOH) ile pH'ı 7,8'e ayarlayın. Hacim 1 L olana kadar tip II su ekleyin ve otoklavlayarak sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
- Tip II suda 100 mL 10x MBS tuz çözeltisi ve 7 mL 0.1 M kalsiyum klorür dihidrat (CaCl 2, 2H2 O) seyrelterek 1 L 1x MBS çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- 1x MBS çözeltisini tip II suda seyrelterek 0.1x MBS çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- Yetişkinler için benzokain çözeltisi
- 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyuna 5 mL %10 benzokain stok çözeltisi (bkz. adım 1.1.1.) ekleyerek %0,05 benzokain çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
NOT: Bu çözeltiyi alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 4 °C'de birkaç ay saklayın. Çözeltiyi hayvanlarda kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
- 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyuna 5 mL %10 benzokain stok çözeltisi (bkz. adım 1.1.1.) ekleyerek %0,05 benzokain çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
- L-sistein çözeltisi
- 100 mL 0.1x MBS çözeltisine 2 g L-sistein hidroklorik monohidrat ekleyerek kullanım sırasında jelleştirme çözeltisini hazırlayın. PH'ı %30 NaOH ile 7,8'e ayarlayın.
- Polisükroz çözeltisi
- 100 mL 0.1x MBS çözeltisine 3 g polisakaroz ekleyerek yoğun polisakaroz çözeltisini hazırlayın. Bu solüsyonu 4 °C'de birkaç hafta saklayın.
- crRNA ve tracrRNA sıralaması
- İn vitro fertilizasyon ve jelitasyon
NOT: Xenopus in vitro fertilizasyon hakkında daha fazla ayrıntı,12'deki ayrıntılı özel bir protokolde bulunabilir.- Yumurtlamayı indüklemek için Xenopus laevis dişilerine hormon uygulaması
- Oosit alımından yaklaşık 15 saat önce, dişinin dorsal lenf kesesine 600 IU hCG enjekte edin ve gece boyunca 18 ° C'de tutun.
- Testis diseksiyonu
- Xenopus erkeğini 10-15 dakika boyunca öldürücü dozda% 0.05 benzokain çözeltisi ile ötenazi yapın. Tamamlayıcı bir ötenazi yöntemi olarak, keskin ve sağlam bir makasla kafatasının hemen arkasındaki omurgayı kesin. Karın boşluğunu diseksiyon makasıyla açın, testisleri kesin ve bağlı yağ ve kılcal damarları kesin. Her testisi hemen 1 mL 1x MBS'de buza yerleştirin.
- Sperm hazırlama
- Mikrosantrifüj tüpleri için bir havaneli kullanarak bir testisi ezin ve süspansiyonu 9 mL 1x MBS içeren 15 mL'lik bir tüpte seyreltin. İkinci testis tüpüne 10 μg/mL gentamisin ekleyin ve daha sonraki döllenme deneyleri için birkaç gün 4 °C'de tutun.
- Tüp bebek tedavisi
- Hormon enjekte edilen dişinin sırtına hafifçe masaj yapın ve oositleri bir Petri kabında (100 mm çapında) toplayın. Yumurta çözeltisine birkaç damla sperm çözeltisi sürün. 5 dakika bekleyin ve 0.1x MBS ile örtün. Jelalize işlemine devam etmeden önce 10 dakika bekleyin.
- Döllenmiş yumurta dejelasyonu
- Döllenmiş yumurtalardan jöle tabakasını çıkarmak için 0.1x MBS solüsyonunu jöle giderme solüsyonu ile değiştirin (~5 dk). Embriyoları 0.1x MBS ile 5-6 kez iyice durulayın ve 0.1x MBS ile doldurulmuş 100 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın.
- Yumurtlamayı indüklemek için Xenopus laevis dişilerine hormon uygulaması
- Mikroenjeksiyon sisteminin hazırlanması
- Cam kılcal damarları mikropipet çektirmesiyle keskinleştirin13.
- Keskinleştirilmiş bir kılcal damarı 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi veya bir mikro yükleyici ucu kullanarak kontrol solüsyonu ile doldurun ve kılcal damarı mikroenjektör işleyicisine yerleştirin.
- Bir stereomikroskobun en yüksek büyütme oranında, kılcal ucu ince forseps ile kırın ve darbe başına 10 nL'lik bir ejeksiyon hacmi elde etmek için enjeksiyon süresini (~ 400 ms) ayarlayın. Ejeksiyon basıncını yaklaşık 40 PSI'ye ayarlayın.
- CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile tek hücreli aşamalı embriyo mikroenjeksiyonu
- Tek hücreli aşamalı embriyoları,% 3 polisakaroz çözeltisi ile doldurulmuş 100 mm'lik bir Petri kabına yapıştırılmış bir ızgaraya (1 mm naylon doku) yerleştirin (Şekil 1D).
- Mikroenjektörü kullanarak ve bir stereomikroskop altında, 10 nL CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi (embriyo başına 500 pg gRNA dubleks + 5 ng Cas9 proteinine karşılık gelir) veya kontrol solüsyonunu hayvan kutbu seviyesinde, kortikal bölgede, sitoplazmik membranın hemen altında enjekte edin.
NOT: Çözeltide bulunan floresein lizin dekstran, enjekte edilen embriyoların daha sonra sıralanmasına izin verir. - Enjekte edilen embriyoları temiz bir poliskaroz çözeltisi içeren 100 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın ve 21 °C'ye yerleştirin.
- İlk gün, iyi gelişmiş embriyoları düzenli olarak ayırın ve polisakaroz çözeltisini mikroenjeksiyondan yaklaşık 5 saat sonra 0.1x MBS ile değiştirin.
- Enjeksiyondan sonra, floresan stereomikroskop altında floresein lizin dekstranı görselleştirerek iyi enjekte edilmiş rho gevrek embriyoları sıralamak ve seçmek için 24 saat bekleyin (Şekil 1E).
NOT: Döllenmeden sonra mikroenjeksiyon ne kadar erken olursa, nakavt o kadar etkili olur.
- Embriyo ve kurbağa yavrularının yetiştirilmesi
- Evre 37/38'e kadar Petri kaplarında 0.1x MBS'de rho gevrek embriyoları yükseltin. Ölü embriyoları günlük olarak çıkarın ve 0.1x MBS solüsyonunu değiştirin. Aşama 37/38'den itibaren, kurbağa yavrusu yetiştirme suyuyla dolu bir tankta embriyoları büyütün ve aşama 45'ten itibaren adım 2.2.3'teki gibi devam edin.
4. Sitotoksik göz içi CoCl 2 enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonu
NOT: Bu protokol, Xenopus laevis kurbağa yavrularında göz içi kobalt klorür (CoCl2) enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonunu indüklemek için oluşturulmuştur. Doza göre, koniye özgü bir dejenerasyonu veya daha geniş bir dejenerasyonu tetikleyebilir14. Bu protokolü 48. aşamadan itibaren yaşlanan Xenopus laevis kurbağa yavrularında kullanıyoruz. Xenopus tropicalis kurbağa yavrularında da kullanılabilir.
- Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
- Adım 1.1'de olduğu gibi kullanım sırasında% 0.005 benzokain çözeltisi hazırlayın.
- 100 mL ila 5 mL 0.1x MBS ekleyerek 2 mM CoCl2 stok çözeltisi hazırlayın (0.1x MBS hazırlamak için adım 3.1.4'e bakın). Bu stok çözeltisini 4 °C'de birkaç ay boyunca alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak muhafaza edin.
DİKKAT: CoCl2 , insan ve hayvan yaşamı için toksik bir bileşik olarak sınıflandırılır. Güvenlik bilgi formundaki taşıma, depolama ve atık bertarafı talimatlarını dikkatlice izleyin. - Koniye özgü dejenerasyon için, 0.1x MBS'de seyreltilmiş 100 mM stok çözeltisinden kullanım sırasında 10 mM CoCl2 çözeltisi hazırlayın. Daha geniş retinal hücre dejenerasyonu için 25 mM CoCl2 çözeltisi hazırlayın.
- Enjeksiyon sisteminin hazırlanması
- Cam kılcal damarları mikropipet çektirmesiyle keskinleştirin 13.
- Bir mikro yükleyici ucu kullanarak keskinleştirilmiş bir kılcal damarı 2-10 μL 10 veya 25 mM CoCl2 çözeltisi veya kontrol çözeltisi (0.1x MBS) ile doldurun ve kılcal damarı mikroenjektör işleyicisine yerleştirin.
- Bir stereomikroskobun en yüksek büyütme oranında, kılcal ucu ince forseps ile kırın ve darbe başına 15-40 nL'lik bir ejeksiyon hacmi elde etmek için enjeksiyon süresini (yaklaşık 100 ms) ayarlayın. Ejeksiyon basıncını ~40 PSI olarak ayarlayın.
NOT: Damlanın boyutu, kurbağa yavrularının evresine ve gözlerinin boyutuna göre uyarlanmalıdır. Örneğin, 48-49. aşamalarda damla boyutu ~15-20 nL iken, 52-56. aşamalarda 30-40 nL'dir. Görsel olarak, damlanın boyutu lens boyutundan biraz daha büyüktür.
- CoCl2 göz içi enjeksiyonları
- Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları 50 mL% 0.005 benzokain çözeltisine aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin.
NOT: Birkaç kurbağa yavrusu aynı anda uyuşturulabilir, ancak anestezide geçirilen süre 30 dakikadan az olmalıdır. - Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve ıslak bir doku içeren küçük bir Petri kabına (55 mm çapında) dikkatlice koyun. Kurbağa yavrusunun sırt tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kabının ortasına yerleştirin (Şekil 1F,G).
- CoCl2 solüsyonunu göz içine enjekte etmek için mikroenjektörü stereomikroskop altında kullanın. Kılcal damarı nazikçe lensin üzerinden göze sokun. Kılcal uç gözün içindeyken, göz başına iki damla dökün. Sağ gözü enjekte ettikten sonra, sol gözü enjekte etmek için Petri kabını manuel olarak 180° çevirin.
NOT: Enjeksiyonun gözün içinde yapıldığından emin olun, bu nedenle solüsyonun her çıkarılmasından sonra gözde hafif bir şişlik görülmelidir. Kurbağa yavrusu mümkün olduğunca az suyun dışında kalmalıdır. Her iki gözün enjeksiyonu 1 dakikadan az sürmelidir. - Enjekte edilen kurbağa yavrusunu, Petri kabına dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın (Şekil 1H). Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.
- Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları 50 mL% 0.005 benzokain çözeltisine aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin.
5. Retina hasarını veya retina dejenerasyonunu değerlendirmek için boyama
- Kurbağa yavrusu fiksasyonu ve dehidrasyon
- 100 mL %32 PFA çözeltisini 700 mL 1x PBS'ye seyrelterek %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Bu stok çözeltisini ayırın ve -20 °C'de birkaç ay saklayın.
- Kurbağa yavrularını %0.01 benzokain içinde ötenazi yapın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalama ile veya gece boyunca 4 °C'de %4 PFA içeren bir şişeye aktarın. 1x PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
- Kurbağa yavrularını %70 ve %95 etanol (tip II suda seyreltilmiş) içinde art arda 30 dakikalık inkübasyonlarla aşamalı olarak dehidre edin, ardından %100 etanol içinde üç adet 1 saatlik inkübasyon daha yapın. Kurbağa yavrusu kafalarını bu adımda -20 °C'de saklayın veya sonraki adımlar için gece boyunca doğrudan% 100 bütanol'e aktarın.
- Parafin kesit alma
- % 100 bütanol'ü 62 ° C'de 2 saat eritilmiş parafin ile değiştirin. Parafini 62 ° C'de 2 x 2 saat ek inkübasyonla değiştirin.
- Kurbağa yavrusu kafalarını tek kullanımlık parafin gömme kalıplarına aktarın ve gözleri iyi hizalanacak şekilde yönlendirin ve ardından parafinin sertleşmesine izin verin. Blokları oda sıcaklığında saklayın.
- Fazla parafini kesin ve bloğu gömülü kurbağa yavru(lar)ı ile mikrotom desteğine monte edin.
- Bloğu uygun kalınlıkta (10-12 μm) bir mikrotom ile bölümlere ayırın. Şeritleri, daha önce% 3 gliserin albümini (suyla seyreltilmiş) ile kaplanmış bir slayt üzerinde bölümlerle aktarın.
- Slaytı birkaç dakika boyunca 42 °C'de bir slayt ısıtıcısına yerleştirin ve ardından fazla gliserin albüminini çıkarın. Slaytları gece boyunca 37 °C'lik bir fırında kurumaya bırakın.
- Slaytları %100 ksilen ile doldurulmuş bir Coplin kavanozuna 2 x 15 dakika daldırarak mumdan arındırın. Bölümleri kademeli etanol serisi ile yeniden sulandırın:% 100 iki kez,% 70,% 50 (tip II suda seyreltilmiş), her biri ~ 5 dakika, ardından 2 x 5 dakika suda.
- İmmünofloresan etiketleme
- 1 L Tip II suya 29.4 g sodyum sitrat trisodyum tuzu dihidrat (C6H5Na3O7,2H2O) ekleyerek 100 mMsodyum sitrat (CiNa) stok çözeltisi hazırlayın; Hidroklorik asit (HCl) ile pH'ı 6'ya ayarlayın. Otoklavlama ile sterilize edin ve birkaç ay oda sıcaklığında saklayın. Kullanım sırasında 225 mL tip II suya 25 mL 100 mM CiNa stok çözeltisi ekleyerek maskeleme solüsyonunu hazırlayın. 125 μL Tween-20 ekleyin ve iyice karıştırın (nihai konsantrasyon 10 mM CiNa,% 0.05 Tween-20'dir).
- 10 mL tip I suya 100 mg bisBenzimide H 33258 ekleyerek 10 mg / mL'de Hoechst stok çözeltisini hazırlayın. Bu stok çözeltisini 4 °C'de birkaç ay boyunca alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak muhafaza edin. 400 mL 1x PBS'ye 300 μL Hoechst stok çözeltisi ekleyerek 7.5 μg / mL'de Hoechst çözeltisi hazırlayın.
NOT: Bu çözelti 10 defaya kadar kullanılabilir ve alüminyum folyo ile ışıktan korunarak 4 °C'de yaklaşık 6 ay muhafaza edilebilir. - Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra, bölümleri maskeleme solüsyonunda 9 dakika kaynatarak antijen alımını gerçekleştirin. Çözeltiyi 20 dakika soğumaya bırakın.
- Tip II suda bir kez ve 1x PBS'de bir kez durulayın. Slaytları nemli bir odaya düz bir şekilde koyun ve 30 dakika boyunca slayt başına 400-600 μL bloke edici solüsyon (antikor seyreltici +% 0.2 Triton X100) ekleyin.
- Blokaj solüsyonunu, bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş primer antikorun slayt başına 200 μL ile değiştirin. Çözeltiyi bölümlere yaymak için kabarcık oluşumunu önleyerek bir lamel kullanın. Gece boyunca 4 °C'de nemli bir odada inkübe edin.
- Slaytları bir Coplin kavanozuna aktarın ve %0,1 Triton X100 ile desteklenmiş 1x PBS'de 3 x 10 dakika durulayın. Slaytları düz bir şekilde yerleştirin, blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş ikincil antikorun slayt başına 400 μL ekleyin ve nemli bir odada oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
- Slaytları bir Coplin kavanozuna aktarın ve %0,1 Triton X100 ile desteklenmiş 1x PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
- Hücre çekirdeklerini Hoechst solüsyonu ile 10 dakika boyunca lekeleyin ve 1x PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
- Lamelleri, floresansı korumak için özel olarak tasarlanmış sulu bir montaj ortamında slaytların üzerine yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat kurumaya bırakın ve 4 °C'de saklayın.
- Slaytları bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin.
- Retina hasarını değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (H&E) boyama
NOT: Belirli bir hücre tipini immün boyama ile etiketlemek yerine, genel retinal histoloji H & E renklendirmesi ile değerlendirilebilir.- Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra, slaytları 2 dakika boyunca hematoksilen çözeltisine batırarak nükleik asit etiketlemesi yapın. Musluk suyuyla iyice durulayın.
- Slaytları 1 dakika boyunca% 1 eozin çözeltisine batırarak sitoplazma etiketlemesi yapın. Su ile hızlıca durulayın.
NOT: Eozin çok çözünür; Slaytlar suda çok uzun süre bırakılırsa, tüm boya kaybolur. - % 100 etanolde 2 x 5 dakika ve ksilen içinde 2 x 5 dakika durulayın.
- Kaputun altına, lamellerin üzerine 4-5 damla montaj ortamı yerleştirin. Slaytları bir kaputun altında kurumaya bırakın ve ertesi gün mikroskopla görüntüleyin.
- Apoptotik hücrelerin tespiti
- Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra (bkz. bölüm 5.2.6), apoptotik DNA parçalanmasını tespit etmek için kit üreticisinin protokolünü izleyin.
- Slaytları Hoechst çözeltisine daldırarak çekirdek boyama gerçekleştirin (bkz. bölüm 5.3.8) ve floresansı korumak için özel olarak tasarlanmış sulu bir montaj ortamı ile monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat kurumaya bırakın ve 4 °C'de saklayın.
- Slaytları bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanik retina yaralanması
Protokol bölüm 1'de tarif edilen mekanik yaralanmaya maruz kalan kurbağa yavrularının retina kesitleri, retina lezyonunun ponksiyon bölgesi ile sınırlı kalırken dokunun tüm katmanlarını kapsadığını göstermektedir (Şekil 2A,B).
NTR-MTZ sistemi kullanılarak koşullu çubuk hücresi ablasyonu
Protokol bölüm 2'de tarif edildiği gibi MTZ tedavisi ile tedavi edilen anestezi uygulanmış Tg(rho:GFP-NTR) transgenik kurbağa yavrularının gözleri stereomikroskop altında analiz edildi (Şekil 3A,B). GFP floresansındaki azalma, protokol bölüm 5'te (Şekil 3C) açıklandığı gibi, GFP immün boyama ile retina kesitlerinde doğrulanan kontrollere kıyasla ilerleyici hedefli çubuk hücre ablasyonunu ortaya koymaktadır (Şekil 3B).
CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı ile çubuk hücre dejenerasyonu
Protokol bölüm 3'te tarif edildiği gibi elde edilen rho gevrek kurbağa yavrularının retinaları, protokol bölüm 5'te tarif edildiği gibi analiz edildi (Şekil 4A). Kaspaz 3 ve Rodopsin etiketlemesi, bazı çubukların apoptoza uğradığını vurgulamaktadır (Şekil 4B). H&E boyama, nükleer katmanların küresel olarak korunduğunu, ancak fotoreseptör dış segmentlerinin ciddi şekilde kısaldığını ortaya koymaktadır (Şekil 4C). Fotoreseptör belirteçleri ile daha ileri immün boyama analizi, çubukların dejenerasyonunu ve müteakip koni kusurlarını gösterir (Şekil 4D ve gösterilmemiştir). Fenotip evre 40'tan itibaren görünür olmaya başlar ve çubukların dış segmentleri, evre 47'den itibaren merkezi retinada bulunmayana kadar aşamalı olarak kaybolur.
Sitotoksik göz içi CoCl 2 enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonu
Protokol bölüm 4'te tarif edildiği gibi CoCl2 göz içi enjeksiyonlarına tabi tutulan kurbağa yavrularının retinaları, protokol bölüm 5'te tarif edildiği gibi immün boyama ve TUNEL testi ile analiz edildi (Şekil 5A). Bu, 10 mMCoCl2 enjeksiyonunun koni fotoreseptörlerinin spesifik hücre ölümüne yol açtığını (Şekil 5B, C), 25 mM'nin ise geniş retinal hücre ölümüne yol açtığını ortaya koymaktadır (Şekil 5E). Protokol bölüm 5'te tarif edildiği gibi immün boyama analizi, ayrıca 10 mM CoCl 2 enjekte edilen retinalarda koni olmadığını (Şekil 5D) ve 25 mM CoCl2 enjeksiyonlarını takiben hem bipolar hücrelerin hem de fotoreseptörlerin ciddi bir kaybını ortaya çıkardı (Şekil 5F).
Şekil 1: Bazı deneysel prosedürlerin çizimleri. (A) Retinayı delmek için bir pim tutucuya tutturulmuş 0,2 mm çapında bir pim kullanılır. Bir kurbağa yavrusunun sırt, yanal ve önden görünümlerinin diyagramları, pimin (kırmızı renkte) nereye yerleştirildiğini gösterir. (B) Koşullu çubuk hücre ablasyonunun transgenik modelinin şematik gösterimi. Rodopsin promotörü, çubuk hücrelerinde bir GFP-Nitroredüktaz füzyon proteininin ekspresyonunu yönlendirir. Xenopus yetiştirme suyuna eklendiğinde, NTR, metronidazolü bir sitotoksine dönüştürür ve özellikle GFP-NTR çubuklarını aşar. (C ) Bir Tg(rho:GFP-NTR) transgenik kurbağa yavrusunun başı beyaz ışıkta veya floresan altında gösterilir. Gözdeki GFP boyama, transgenik kurbağa yavrularının sıralanmasına izin verir. (D) Picospritzer mikroenjeksiyon sistemi ile enjekte edilmeye hazır stereomikroskop altında naylon bir ızgara üzerinde tek hücreli aşama embriyoları. (E) Floresein lizin dekstran içeren CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksinin tek hücreli aşamasında enjeksiyondan sonra nevurula aşamasındaki embriyolar (iç kısımda şematik). İyi enjekte edilmiş floresan embriyolar (yeşil oklar), enjekte edilmemiş olanlardan (beyaz oklar) ayırt edilebilir. (F) Anestezi uygulanmış kurbağa yavrularını transfer etmek için kullanılan kaşığı gösteren resim. (G) Islak bir doku üzerinde bir Petri kabında uyuşturulmuş kurbağa yavruları. Mikroenjektöre yerleştirilen kılcal damar, CoCl2 çözeltisinin göz içi enjeksiyonlarına izin verir. (H) Bir kurbağa yavrusunun, hayvanın uyanana kadar izlenebileceği 1 L'lik bir tanka transferini gösteren resim. Ölçek çubukları = 2 mm (C), 1 mm (E). Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan proteini; NTR = nitroredüktaz; MTZ = metronidazol; NF = Nieuwkoop ve Faber aşaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mekanik retina yaralanması. (A) (B)'de kullanılan deneysel prosedürün ana hatları. Xenopus laevis kurbağa yavrusu gözleri delinir ve yaralanmadan 7 gün sonra retina kesitlerinde analiz edilir. Noktalı kutu, görüntülenen alanı gösterir. (B) Hücre çekirdekleri Hoechst ile karşı boyanır. Üç farklı retina gösterilmiştir. Oklar, tüm retina katmanlarını geçen yaralı bölgeye işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: dpi = yaralanmadan sonraki gün sayısı; GCL = ganglion hücre tabakası; INL = iç nükleer katman; ONL = dış nükleer katman. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NTR-MTZ sistemi kullanılarak koşullu çubuk hücre ablasyonu. (A) (B,C)'de kullanılan deneysel prosedürün ana hatları. Tg(rho:GFP-NTR) transgenik Xenopus laevis kurbağa yavruları 7-9 gün boyunca MTZ ile tedavi edilir. GFP etiketli çubukların ilerleyici dejenerasyonu, (B)'de 7 günde gösterildiği gibi bir floresan stereomikroskop altında gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Çubuk hücre ölümü, görüntülenen alanı gösteren noktalı kutu olan (C)'de 14 gün sonra gösterildiği gibi retina kesitlerinde de analiz edilebilir. (B) 7 günlük tedaviden sonra, transgenik MTZ ile tedavi edilen kurbağa yavrularında retinadaki GFP yoğunluğu kontrollere kıyasla zamanla azalır. (C) GFP floresansındaki azalma, 14 gün sonra retina kesitlerinde GFP immün boyama ile doğrulanır. Hücre çekirdekleri Hoechst ile mavi renkte boyanmıştır. Ölçek çubukları = 500 μm (B), 50 μm (C). Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan proteini; NTR = nitroredüktaz; MTZ = metronidazol; L = mercek; R = retina; GCL = ganglion hücre tabakası; INL = iç nükleer katman; ONL = dış nükleer katman; OS = dış segmentler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Xenopus laevis rho gevreklerinde çubuk dejenerasyonu. (A) (B-D)'de kullanılan deneysel prosedürün ana hatları. Tek hücreli aşama embriyolarına, floresan lizin dekstran içeren CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi (gRNA duplex/Cas9 proteini) enjekte edilir. Nörula aşamasında, floresan enjekte edilen embriyolar sıralanabilir ve (B) hücre ölümü analizi için parçalanmış Kaspaz 3 immün boyama veya (C) anatomik analiz için hematoksilen ve eozin boyama veya (D) fotoreseptör hücre dejenerasyonu analizi için çubuk belirteçleri ile immün boyama gerçekleştirmek için çeşitli aşamalara kadar gelişmesine izin verilebilir. Noktalı kutu, görüntülenen alanı gösterir. (B) Bölünmüş Kaspaz 3 (apoptotik hücrelerin bir belirteci) ve Rodopsin'in (çubuk dış segmentlerinin bir belirteci) kontrol veya rho crispantların retinal bölümlerinde çift etiketlenmesi Xenopus laevis embriyoları 39. aşamada, kontrollerde ölmekte olan hücrelerin olmadığını ve rho crispantlarda ölmekte olan hücrelerin çubuk fotoreseptörleri olduğunu gösterir. (C) Evre 48'de rho crispants Xenopus laevis kurbağa yavrularının retina bölümlerinde H&E boyama, fotoreseptörlerin dış segmentlerinin kontrolüne kıyasla küçülmüş boyutunu ortaya koymaktadır. (D) Evre 48'de rho crispants Xenopus laevis kurbağa yavrularının retinal bölümlerinde recoverin (çubuk iç segmentlerinin bir belirteci) ve Rhodopsin ko-immün boyama, kontrollere kıyasla ciddi bir dejenerasyon ortaya koymaktadır. Hücre çekirdekleri Hoechst ile mavi renkte boyanmıştır. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: gRNA = kılavuz RNA; H&E = hematoksilen ve eozin; GCL = ganglion hücre tabakası; INL = iç nükleer katman; ONL = dış nükleer katman; OS = dış segmentler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sitotoksik göz içi CoCl2 enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonu. (A) (B-F)'de kullanılan deneysel prosedürün ana hatları. Noktalı kutu, görüntülenen alanı gösterir. Kurbağa yavrusu gözüne 10 mM veya 25 mM CoCl2 çözeltisi göz içine enjekte edilir. Hücre apoptozu, yaralanmadan 2 gün sonra (dpi) (B,C,E) bir TUNEL testi ile analiz edilirken, retinal hücre dejenerasyonu, çeşitli belirteçlerle (D,F) immün boyama ile 7 ila 14 dpi analiz edilir. (B-D) Kurbağa yavrularının retina kesitlerine salin solüsyonu (Kontroller) veya 51-54. aşamalarda 10 mM CoCl2 solüsyonu enjekte edilir. (B) 2 dpi'de hücre ölümü analizi, esas olarak fotoreseptör nükleer tabakasında CoCl2 enjeksiyonunu takiben ölen hücrelerin varlığını ortaya koymaktadır. (C) Hücre ölümü boyamasının S/M Opsin (konilerin bir belirteci) immün boyama ile birleştirilmesi, bu ölmekte olan hücrelerin esas olarak koniler olduğunu ortaya koymaktadır; Oklar çift etiketli hücrelere işaret eder. (D) S / M Opsin (bir koni belirteci) ve Rodopsin (bir çubuk belirteci) ko-immün boyama, CoCl2 enjekte edilen retinalarda 14 dpi'deki kontrollere kıyasla koni hücre etiketlemesinde ciddi bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. (E,F) Kurbağa yavrularının retina kesitlerine 51-54. aşamalarda 25 mM CoCl2 çözeltisi enjekte edildi. (E) 2 dpi'de hücre ölümü analizi, hem fotoreseptörde hem de iç nükleer katmanlarda ölmekte olan hücrelerin varlığını ortaya çıkarır. (F) Otx2 (hem fotoreseptörlerin hem de bipolar hücrelerin bir belirteci) immün boyama, CoCl 2 enjekte edilen retinalarda 7 dpi'deki kontrollere kıyasla her iki katmanda da boyamada ciddi bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır, bu da hem fotoreseptörlerin hem de bipolar hücrelerin CoCl2 kaynaklı hücre ölümünü göstermektedir. Hücre çekirdekleri Hoechst ile mavi renkte boyanmıştır. Ölçek çubukları: 25 μm. Kısaltmalar: ONL = Dış Nükleer Katman; INL = İç Nükleer Katman; GCL = Ganglion Hücre Katmanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus kurbağa yavrularında çeşitli retina yaralanması paradigmalarının avantajları ve dezavantajları
Mekanik retina yaralanması
Xenopus kurbağa yavrularında nöral retinanın çeşitli cerrahi yaralanmaları gelişmiştir. Nöral retina ya tamamençıkarılabilir 15,16 ya da sadece kısmen çıkarılabilir16,17. Burada sunulan mekanik yaralanma herhangi bir retina eksizyonu değil, daha önce Xenopus kurbağa yavruları6'da geliştirdiğimiz basit bir göz ponksiyonunu içerir. Böyle bir mekanik retina yaralanması modelinin manuel prosedürü göz önüne alındığında, fenotip bir kurbağa yavrusundan diğerine önemli ölçüde değişebilir. Ayrıca, tekrarlanabilirlik ve hasarın kapsamı, deneyi kimin yaptığına bağlı olarak da değişebilir. Bu nedenle, tüm yaralanma prosedürlerini aynı kişinin yapmasını öneririz.
NTR-MTZ sistemi kullanılarak koşullu çubuk hücresi ablasyonu
NTR-MTZ sistemi, transgenik Xenopus retina 6,7,8,18'deki çubuk hücrelerini ablate etmek için kullanılmıştır. MTZ tedavisinin süresi bir çalışmadan diğerine 2 ila 7 gün arasında önemli ölçüde değişir. Bu, farklı transgenik hatlardaki kromozomal insersiyona bağlı olarak NTR'nin farklı aktivitelerini yansıtabilir. Ayrıca, belirli bir MTZ tedavisi süresi için Tg(rho:GFP-NTR) kurbağa yavrularının tepkisinde bazı değişkenlikler fark ettik, bazıları ciddi çubuk dejenerasyonu yaşarken, diğerleri çok az hasar gösterdi. Bu transgenik hat ile MTZ tedavisinin 7 ila 9-10 gün uzatılması bu değişkenliği azaltıyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, MTZ'nin potansiyel olarak toksik etkileri göz önüne alındığında dikkatli olunmalıdır. Bu modelin bariz avantajları, koşullu ve geri dönüşümlü çubuk hücresi ablasyonuna ve çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesine izin vermesidir.
CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı ile çubuk hücre dejenerasyonu
Retinitis pigmentosa'nın CRISPR-Cas9 rho gen düzenleme modeli, Xenopus kurbağa yavrusu11'de çubuk hücre dejenerasyonuna yol açar. Bununla birlikte, NTR-MTZ modelinin aksine, çubuk hücre ablasyonu yapıcıdır ve geri dönüşümlü değildir. İlginç bir şekilde, bu yaklaşımın yüksek verimliliği (şu anda düzenli olarak şiddetli çubuk dejenerasyonu sergileyen kurbağa yavrularının% >90'ını elde ediyoruz) bu model üzerinde F0 nesli üzerinde çalışmaya izin veriyor. Başlangıçta sgRNA ile çalışıyorduk, ancak farklı RNA preparatlarından kaynaklanan değişkenliği fark ettik. Son zamanlarda, sentetik crRNA ve tracrRNA sipariş etmenin ve bu protokolde tarif edildiği gibi gRNA dupleks hazırlamanın daha güvenilir sonuçlar verdiğini bulduk.
Sitotoksik göz içi CoCl2 enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonu
Bu modelin, burada açıklanan diğer modellere göre çeşitli avantajları vardır. Sadece retinal hücre tiplerinin ablasyonunu koşullu olarak indüklemekle kalmaz, aynı zamanda hasarın şiddetini modüle etmeye de izin verir14. Dahası, bildiğimiz kadarıyla, Xenopus'taki tek spesifik koni dejenerasyonu modelini temsil ediyor. Son olarak, dejeneratif fenotipte düşük değişkenlik yaratır.
Dört retinal lezyon paradigmasının etkinliği
Fenotiplerin bir kurbağa yavrusu grubundan diğerine potansiyel değişkenliğini hesaba katmak için, retina dejenerasyonunun 8-10 kurbağa yavrusu üzerindeki etkinliğinin kontrol edilmesi önerilir. Mekanik yaralanma durumunda, lezyon bir hafta sonra artık görünmediğinden, yaralanmayı takip eden günlerde hasar analiz edilmelidir. NTR-MTZ modelinde, MTZ tedavisinin bitiminden 1 hafta sonra çubuk dejenerasyonu açıkça görülebilir. Rho crispantlar için, fotoreseptörler tamamen farklılaştığında çubuk hücre ölümü başladığından, 45. aşamadan itibaren dejeneratif verimliliği analiz etmenizi öneririz. CoCl2 modelinde, hücre ölümü enjeksiyondan sonraki bir hafta içinde gerçekleşir. Her yöntem için beklenen % sağkalım ile ilgili olarak, CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleks enjeksiyonlarının ilk 48 saatte geleneksel RNA enjeksiyonlarından daha yüksek ölüm oranlarına yol açtığını (bu ilk 48 saatten sonra büyüme veya hayatta kalma sorunları devam etmediğini) ve bu nedenle gerektiğinde daha fazla embriyo enjekte edilmelidir. Buna karşılık, diğer prosedürler (mekanik yaralanmalar, MTZ tedavisi veya göz içi CoCl2 enjeksiyonları) herhangi bir sağkalım sorunu oluşturmaz.
Retina rejenerasyonunu incelemek için bu yaralanma paradigmalarının potansiyel uygulamaları
Bu retina yaralanma modelleri serisinin potansiyel bir uygulaması, retina rejenerasyonunun incelenmesidir. CMZ hücreleri, Müller glial hücreleri ve RPE hücreleri dahil olmak üzere patolojik bağlamda farklı retina kök veya kök benzeri hücre kaynakları işe alınabilir. Mekanik yaralanma modelinin, NRT/MTZ modelinin ve CRISPR/Cas9 modelinin, yaralanmaüzerine Müller hücre aktivasyonunu incelemek için çekici modeller olduğunu bildirdik 6,11. İlginç bir şekilde, CoCl2 modelinde, üç hücresel kaynağın tümü işe alınabilir14, bu da farklı retinal hücre tiplerinin işe alınması ve yeniden programlanmasının altında yatan mekanizmaları incelemek için yeni bir model sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) ortaklığında Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ve UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) tarafından milletvekillerine verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
