Summary
Vi har utviklet flere protokoller for å indusere retinal skade eller retinal degenerasjon i Xenopus laevis rumpetroll. Disse modellene gir mulighet for å studere retinal regenereringsmekanismer.
Abstract
Retinal neurodegenerative sykdommer er de viktigste årsakene til blindhet. Blant mange terapeutiske strategier som utforskes, har stimulerende selvreparasjon nylig dukket opp som spesielt tiltalende. En cellulær kilde av interesse for retinal reparasjon er Müller glialcelle, som har stamcellepotensial og en ekstraordinær regenerativ kapasitet i anamnioter. Dette potensialet er imidlertid svært begrenset hos pattedyr. Studier av molekylære mekanismer som ligger til grunn for retinal regenerering i dyremodeller med regenerative evner, bør gi innsikt i hvordan man låser opp pattedyrs latente Müller-cellers latente evne til å regenerere netthinnen. Dette er et viktig skritt for utviklingen av terapeutiske strategier innen regenerativ medisin. Til dette målet utviklet vi flere retinale skadeparadigmer i Xenopus: en mekanisk retinal skade, en transgen linje som tillater nitroreduktase-mediert fotoreceptor betinget ablasjon, en retinitis pigmentosa-modell basert på CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout, og en cytotoksisk modell drevet av intraokulære CoCl2-injeksjoner . Fremhever deres fordeler og ulemper, beskriver vi her denne serien av protokoller som genererer ulike degenerative forhold og tillater studiet av retinal regenerering i Xenopus.
Introduction
Millioner av mennesker over hele verden er rammet av ulike retinal degenerative sykdommer som fører til blindhet, som retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati eller aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Til dags dato forblir disse forholdene stort sett uhelbredelige. Nåværende terapeutiske tilnærminger under evaluering inkluderer genterapi, celle- eller vevstransplantasjoner, nevrobeskyttende behandlinger, optogenetikk og proteser. En annen fremvoksende strategi er basert på selvregenerering gjennom aktivering av endogene celler med stamcellepotensial. Müller gliaceller, den viktigste gliacelletypen av netthinnen, er blant cellulære kilder av interesse i denne sammenhengen. Ved skade kan de dedifferensiere, spre seg og generere nevroner 1,2,3. Selv om denne prosessen er svært effektiv i sebrafisk eller Xenopus, er den i stor grad ineffektiv hos pattedyr.
Ikke desto mindre har det vist seg at passende behandlinger med mitogene proteiner eller overekspresjon av ulike faktorer kan indusere pattedyrs Müller gliacellesyklus-re-entry og i noen tilfeller utløse deres påfølgende neurogeneseforpliktelse 1,2,3,4,5. Dette forblir imidlertid i stor grad utilstrekkelig for behandlinger. Derfor er det nødvendig å øke kunnskapen om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for regenerering for å identifisere molekyler som effektivt kan omdanne Müllers stamlignende celleegenskaper til nye cellulære terapeutiske strategier.
Med dette målet utviklet vi flere skadeparadigmer i Xenopus som utløser retinalcelledegenerasjon. Her presenterer vi (1) en mekanisk retinal skade som ikke er celletypespesifikk, (2) en betinget og reversibel celleablasjonsmodell ved bruk av NTR-MTZ-systemet som retter seg mot stavceller, (3) en CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout, en modell av retinitis pigmentosa som utløser progressiv stavcelledegenerasjon, og (4) en CoCl2-indusert cytotoksisk modell som i henhold til dosen spesifikt kan målrette tapper eller føre til bredere retinal celledegenerasjon. Vi fremhever særegenheter, fordeler og ulemper ved hvert paradigme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestell og forsøk ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, under institusjonell lisens A91272108. Studieprotokollene ble godkjent av den institusjonelle dyrepleiekomiteen CEEA #59 og fikk autorisasjon av Direction Départementale de la Protection des Populations under referansenummeret APAFIS #32589-2021072719047904 v4 og APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i disse protokollene.
1. Mekanisk retinal skade
MERK: Skadeparadigmeprotokollen beskrevet her består av en mekanisk retinal punktering av et rumpetroll fra stadium 45 og utover. Det er derfor ikke rettet mot noen bestemt retinal celletype, men skader hele tykkelsen av netthinnen på punkteringsstedet.
- Forberedelse av bedøvelse for tadpoles
- Forbered en 10% stamløsning av benzokain. For et totalt volum på 10 ml, tilsett 1 g benzokain, 2 ml dimetylsulfoksid (DMSO) og 8 ml propylenglykol. Konserverer stamløsningen i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mot lys med aluminiumsfolie.
- Klargjør 0,005 % benzokainoppløsning ved bruk ved å tilsette 25 μL 10 % benzokainoppløsning til 50 ml rumpetrolloppdrettsvann (filtrert og deklorert vann fra springen). Bland godt.
MERK: Konsentrasjonen av benzokain er spesielt lav fordi rumpetroll er svært følsomme for anestesi sammenlignet med voksne.
- Pin forberedelse
- Fest en steril stift med diameter på 0,2 mm til en sterilisert stiftholder (figur 1A).
- Tadpole anestesi
- Bruk et dyppnett for å fange rumpetroll i tankene deres. Overfør dem til en ny tank som inneholder 0,005% benzokainoppløsning. Vent noen minutter til rumpetrollene slutter å reagere på stimuli (banke på tanken eller direkte kontakt).
MERK: Flere rumpetroll kan bedøves samtidig, men tiden i bedøvelsesløsningen bør være mindre enn 30 minutter.
- Bruk et dyppnett for å fange rumpetroll i tankene deres. Overfør dem til en ny tank som inneholder 0,005% benzokainoppløsning. Vent noen minutter til rumpetrollene slutter å reagere på stimuli (banke på tanken eller direkte kontakt).
- Netthinne-punktering
- Bruk en skje til å fange et rumpetroll og legg det forsiktig på et lite petriskål (55 mm diameter) som inneholder et vått vev. Plasser rumpetrollsiden opp midt på petriskålen.
- Under et stereomikroskop punkterer du netthinnen ved forsiktig å sette stiften på dorsalsiden av øyet, til den passerer gjennom netthinnen (figur 1A). Hvis det er behov for flere stikk, gjenta denne prosedyren på forskjellige steder. Etter å ha punktert høyre øye, vri petriskålen 180° for å punktere venstre øye.
- Overfør det lesjonerte rumpetrollet til en stor tank som inneholder 1 liter oppdrettsvann ved å senke petriskålen forsiktig. Overvåk rumpetrollene til de er helt vekket.
2. Betinget stavcelleablasjon ved bruk av NTR-MTZ-systemet
Protokollen tar sikte på å indusere spesifikk stavcelleablasjon i Xenopus Tg (rho: GFP-NTR) transgen linje6, tilgjengelig på TEFOR Paris-Saclays zooteknikktjeneste, som er vert for det franske Xenopus ressurssenter. Dette kjemogenetiske systemet utnytter kapasiteten til nitroreduktase (NTR) enzym for å konvertere prodrug metronidazol (MTZ) til et cytotoksisk DNA kryssbindingsmiddel, for spesifikt å ablate NTR-uttrykkende staver (figur 1B). To detaljerte protokoller for å lage Tg (rho: GFP-NTR) eller Tg (rho: NTR) transgene dyr og indusere degenerasjon har blitt publisert tidligere 7,8. Her beskriver vi ganske enkelt induksjonen av retinal degenerasjon og hvordan man overvåker degenerasjonsprosessen in vivo.
- Fremstilling av metronidazoloppløsning
- Forbered 10 mM MTZ-oppløsning ved bruk ved å oppløse 1,67 g MTZ-pulver i en mørk flaske i 1 liter rumpetrolloppdrettsvann inneholdende 0,1% DMSO, ved hjelp av en magnetisk rørestang og en magnetisk agitator.
MERK: MTZ er lysfølsom. Fullstendig oppløsning kan ta opptil 10 minutter.
- Forbered 10 mM MTZ-oppløsning ved bruk ved å oppløse 1,67 g MTZ-pulver i en mørk flaske i 1 liter rumpetrolloppdrettsvann inneholdende 0,1% DMSO, ved hjelp av en magnetisk rørestang og en magnetisk agitator.
- Generering av transgene rumpetroll ved naturlig parring fra Tg(rho:GFP-NTR)- linjen
MERK: Siden transgene hanner representerer en dyrebar bestand, foretrekker vi å generere embryoer via naturlig parring for ikke å ofre hannen og å bruke den gjentatte ganger.- Hormon administrasjon
- Injiser 600 IE humant choriongonadotropinhormon (hCG) med 25G nåler i dorsale lymfesekken hos Xenopus laevis villtype kvinner. Injiser transgene menn med 100-200 IE av hCG i dorsale lymfesekken. For levende overvåking av stavdegenerasjon (trinn 2.4), bruk albino Xenopus i stedet for pigmenterte, for bedre å visualisere fluorescensvariasjoner over øyet til de genererte transgene rumpetrollene.
MERK: Xenopus kvinner kan primes med 50 IE av hCG 1 til 7 dager før planlagt eggløsning, men dette er valgfritt.
- Injiser 600 IE humant choriongonadotropinhormon (hCG) med 25G nåler i dorsale lymfesekken hos Xenopus laevis villtype kvinner. Injiser transgene menn med 100-200 IE av hCG i dorsale lymfesekken. For levende overvåking av stavdegenerasjon (trinn 2.4), bruk albino Xenopus i stedet for pigmenterte, for bedre å visualisere fluorescensvariasjoner over øyet til de genererte transgene rumpetrollene.
- Parring og eggsamling
- Umiddelbart etter hCG-injeksjonen, legg i en tank en Tg (rho: GFP-NTR) transgen mann sammen med en hCG-injisert kvinne ved 20 ° C til neste dag. Bruk et stort volum (minst 10 L) og tilsett små gjenstander som eggene skal feste seg til, slik at eggene ikke blir skadet av de voksnes bevegelser. Neste dag, når froskene ikke lenger er i amplexus, fjern de voksne fra tanken og samle embryoer.
- Oppdrett av embryoer og rumpetroll
- Stage embryoer og rumpetroll i henhold til normal tabell over Xenopus utvikling9.
- Oppdrett embryoer i en tank fylt med rumpetrolloppdrettsvann. Fra stadium 45, mate rumpetroll med pulverisert yngelmat og oksygenere vannet med en bubbler. Tilsett vann daglig om nødvendig for å kompensere for fordampning og bytt hele tankvannet ukentlig.
MERK: Alternativt er det også mulig å bytte 50% av volumet to ganger i uken. En detaljert protokoll finner du i10.
- Transgen embryosortering
- Fra stadium 37/38, sorter og velg transgene embryoer under et fluorescensstereomikroskop ved å visualisere GFP direkte (figur 1C).
- Hormon administrasjon
- Tadpole MTZ behandling
- Overfør Tg (rho: GFP-NTR) transgene rumpetroll til en tank som inneholder 10 mM MTZ-løsning og bak dem ved 20 ° C i mørke i 1 uke. Bruk transgene søsken oppvokst i rumpetrolloppdrettsvann som inneholder 0,1% DMSO som kontroller.
- Bytt MTZ og kontrollløsning annenhver dag i behandlingsperioden. Fôr rumpetrollene som vanlig under MTZ-behandlingen.
- For individuell fluorescensovervåking (trinn 2.4), plasser hvert rumpetroll i den lille beholderen med 30 ml MTZ eller kontrolloppløsning fra trinn 2.3.1 og fremover.
MERK: MTZ-behandling kan utføres når som helst fra stadium 45 og utover.
- Live overvåking av stavdegenerasjon
MERK: Den progressive degenerasjonen av stengene kan overvåkes i sanntid. Utfør derfor trinn 2.4.1. til 2.4.4. før MTZ-behandling og deretter regelmessig etter behandling.- Følg trinn 1.1 og 1.3 for fremstilling av henholdsvis bedøvelsen og rumpetrollbedøvelsen.
- Bruk en skje til å fange en rumpetroll og legg den forsiktig på et vått papirlommetørkle i en liten petriskål (55 mm diameter). Observer GFP-fluorescensen under et fluorescerende stereomikroskop (eksitasjonsbølgelengde = 488 nm og emisjonsbølgelengde = 509 nm) og ta bilder av øyet. En redusert fluorescensintensitet gjenspeiler nedbrytningen av stenger.
MERK: For å gjøre kvantitative sammenligninger, må de samme innstillingene opprettholdes for avbildning av alle rumpetroll. - Overfør det avbildede rumpetrollet til en stor tank som inneholder 1 liter oppdrettsvann ved å senke petriskålen forsiktig. Overvåk rumpetrollene til de er helt vekket.
- Sammenlign fluorescensintensiteten mellom MTZ-behandlede og kontrollrumpetrolløyne for å overvåke og vurdere effekten av degenerasjonsprosessen.
3. Stavcelledegenerasjon ved CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout
MERK: Denne protokollen er etablert for å generere en modell av retinitis pigmentosa i Xenopus laevis ved å indusere spesifikk stavcelledegenerasjon ved bruk av CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout. % av innsetting-sletting (indels) i F0 er gitt i11 og er ~ 75%. En slik CRISPR/Cas9-mediert rhodopsin knockout kan også utføres i Xenopus tropicalis rumpetroll 11.
- Fremstilling av løsninger og reagenser
- crRNA og tracrRNA bestilling
- Kjøp det syntetiske CRISPR RNA (crRNA) rettet mot rhodopsin (rho) genet og standard transaktiverende crRNA (tracrRNA). CRRNA består av en rho målspesifikk region (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) og en annen (GUUUUAGAGCUAUGCU) som hybridiserer til tracrRNA.
- crRNA:tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
- Resuspendere crRNA og tracrRNA ved 100 μM i den nukleasefrie dupleksbufferen.
- Forbered gRNA duplex ved å blande 3 μL av 100 μM rho crRNA, 3 μL av 100 μM tracrRNA og 94 μL dupleksbuffer. De endelige konsentrasjonene er 36 ng/μL rho crRNA og 67 ng/μL tracrRNA.
- Anneal oligoene ved å varme dem opp ved 95 °C i 5 minutter og avkjøl dem sakte til romtemperatur. Lag alikoter og oppbevar dem ved -20 °C.
- CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleks (dvs. gRNA duplex / Cas9 protein)
- På tidspunktet for bruk, lag blandingen av rho gRNA duplex og Cas9-proteinet. For 20 μL, tilsett 10 μL av rho gRNA dupleksoppløsningen, 2 μL Cas9-protein (lager ved 5 mg/ml), 2 μL fluoresceinlysindextran (lager ved 10 mg/ml) og 6 μL RNasefritt vann.
- For å danne ribonukleoproteinkomplekset, inkuber i 10 minutter ved 37 °C og la løsningen avkjøles til romtemperatur.
- For 20 mikrol av kontrollløsningen blandes 2 μL Cas9-protein, 2 μL fluoresceinlysindekstran og 16 μL RNasefritt vann.
- Klargjøring av 10x, 1x og 0,1x MBS-løsninger
- Forbered modifisert Barths saltoppløsning (10x MBS) ved å tilsette 11,92 g HEPES, 51,43 g natriumklorid (NaCl), 0,75 g kaliumklorid (KCl), 2,1 g natriumbikarbonat (NaHCO3) og 2,46 g magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4, 7H2O) i 800 ml type II vann. Juster pH til 7,8 med 30 % natriumhydroksid (NaOH). Tilsett type II vann til volumet er 1 L og steriliser ved autoklavering. Oppbevares i romtemperatur.
- Klargjør 1 liter 1x MBS-oppløsning ved å fortynne 100 ml 10x MBS saltoppløsning og 7 ml 0,1 M kalsiumkloriddihydrat (CaCl2,2H2O) i type II vann. Oppbevares i romtemperatur.
- Klargjør 0,1x MBS-oppløsning ved å fortynne 1x MBS-oppløsning i vann type II. Oppbevares i romtemperatur.
- Benzokainløsning for voksne
- Tilbered 0,05 % benzokainoppløsning ved å tilsette 5 ml 10 % benzokainoppløsning (se trinn 1.1.1.) til 1 liter rumpetrolloppdrettsvann. Bland godt.
MERK: Konserverer denne oppløsningen i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mot lys med aluminiumsfolie. Bring oppløsningen til romtemperatur før den brukes på dyr.
- Tilbered 0,05 % benzokainoppløsning ved å tilsette 5 ml 10 % benzokainoppløsning (se trinn 1.1.1.) til 1 liter rumpetrolloppdrettsvann. Bland godt.
- L-cystein løsning
- Forbered dejellyingoppløsningen på brukstidspunktet ved å tilsette 2 g L-cysteinsaltmonohydrat til 100 ml 0,1x MBS-løsning. Juster pH til 7,8 med 30 % NaOH.
- Polysukrose løsning
- Forbered den tette polysukroseoppløsningen ved å tilsette 3 g polysukrose til 100 ml 0,1x MBS-løsning. Oppbevar denne oppløsningen i noen uker ved 4 °C.
- crRNA og tracrRNA bestilling
- In vitro fertilisering og dejellying
MERK: Flere detaljer om Xenopus in vitro fertilisering finnes i en detaljert dedikert protokoll i12.- Hormonbehandling til Xenopus laevis kvinner for å indusere eggløsning
- Ca. 15 timer før oocytthøsting, injiser 600 IE hCG i hunnens dorsale lymfesekk og hold den over natten ved 18 °C.
- Testis disseksjon
- Avlive Xenopus-hannen med en dødelig dose på 0,05% benzokainoppløsning i 10-15 minutter. Som en komplementær eutanasimetode, kutt ryggraden umiddelbart bakre til skallen med skarp og solid saks. Åpne bukhulen med disseksjonssaks, klipp testiklene ut og trim bort festet fett og kapillærer. Legg hver testis umiddelbart på is i 1 ml 1x MBS.
- Sperm forberedelse
- Knus en testis ved hjelp av en støt for mikrosentrifugerør og fortynn suspensjonen i et 15 ml rør inneholdende 9 ml 1x MBS. Tilsett 10 μg / ml gentamicin til det andre testisrøret og hold det ved 4 ° C i noen dager for ytterligere befruktningseksperimenter.
- In vitro fertilisering
- Masser forsiktig baksiden av den hormoninjiserte kvinnen og samle oocyttene i en petriskål (100 mm diameter). Spred noen dråper sædoppløsning til oocytter. Vent 5 min og dekk dem med 0,1x MB. Vent 10 min før du fortsetter med dejellying.
- Befruktet egg dejellying
- Bytt ut 0,1x MBS-løsningen med den geléaktige løsningen for å fjerne gelébelegget fra de befruktede eggene (~5 min). Skyll embryoene grundig 5-6 ganger med 0,1x MBS og overfør dem til en ny 100 mm petriskål fylt med 0,1x MBS.
- Hormonbehandling til Xenopus laevis kvinner for å indusere eggløsning
- Klargjøring av mikroinjeksjonssystemet
- Slip glasskapillærene med en mikropipettetrekker13.
- Fyll en skjerpet kapillær med 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleks eller kontrollløsningen ved hjelp av en mikrolasterspiss og plasser kapillæren i mikroinjektorbehandleren.
- Ved den høyeste forstørrelsen av et stereomikroskop, bryt av kapillærspissen med fine tang, og juster injeksjonstiden (~ 400 ms) for å oppnå et utstøtingsvolum på 10 nL per puls. Sett utkastetrykket til rundt 40 PSI.
- Ettcelle-stadium embryomikroinjeksjon med CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset
- Plasser embryoer i ett celletrinn på et rutenett (1 mm nylonvev) limt i en 100 mm petriskål fylt med 3% polysukroseoppløsning (figur 1D).
- Bruk mikroinjektoren og under et stereomikroskop, injiser 10 nL av CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset (som tilsvarer 500 pg gRNA duplex + 5 ng Cas9-protein per embryo) eller kontrollløsning på nivået av dyrepolen, i kortikal region, like under cytoplasmatisk membran.
MERK: Fluoresceinlysindextran inneholdt i løsningen tillater etterfølgende sortering av de injiserte embryoene. - Overfør de injiserte embryoene til en ny 100 mm petriskål inneholdende en ren polysukroseoppløsning og plasser dem ved 21 °C.
- På den første dagen, sorter regelmessig ut de velutviklede embryoene og erstatt polysukroseoppløsningen med 0,1x MBS rundt 5 timer etter mikroinjeksjon.
- Vent i 24 timer etter injeksjon for å sortere og velge godt injiserte rho crispant embryoer under et fluorescerende stereomikroskop ved å visualisere fluoresceinlysin dextran (figur 1E).
MERK: Jo tidligere mikroinjeksjon etter befruktning, jo mer effektiv knockout.
- Oppdrett av embryoer og rumpetroll
- Hev rho crispant embryoer i 0,1x MBS i petriskåler til trinn 37/38. Fjern døde embryoer daglig og endre 0,1x MBS-oppløsningen. Fra stadium 37/38, heve embryoer i en tank fylt med rumpetroll-oppdrett vann, og fra trinn 45 fortsette som i trinn 2.2.3.
4. Netthinnecelledegenerasjon ved cytotoksiske intraokulære CoCl 2-injeksjoner
MERK: Denne protokollen er etablert for å indusere retinal celledegenerasjon ved intraokulære injeksjoner av koboltklorid (CoCl2) i Xenopus laevis rumpetroll. Ifølge dosen kan det utløse en keglespesifikk degenerasjon eller en bredere degenerasjon14. Vi bruker denne protokollen i Xenopus laevis rumpetroll i alderen fra stadium 48 og utover. Den kan også brukes i Xenopus tropicalis rumpetroll.
- Fremstilling av buffer og reagenser
- Klargjør 0,005 % benzokainoppløsning på brukstidspunktet som i trinn 1.1.
- Klargjør 100 mM CoCl2 stamløsning ved å tilsette 118,5 mg til 5 ml 0,1x MBS (se trinn 3.1.4 for å klargjøre 0,1x MBS). Bevar denne stamløsningen i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mot lys med aluminiumsfolie.
FORSIKTIG: CoCl2 er klassifisert som en giftig forbindelse for mennesker og dyr. Følg nøye instruksjonene for håndtering, lagring og avfallshåndtering på sikkerhetsdatabladet. - For keglespesifikk degenerasjon, lag en 10 mM CoCl2-løsning ved bruk fra 100 mM stamoppløsning fortynnet i 0,1x MBS. For bredere retinal celle degenerasjon, lag en 25 mM CoCl2 løsning.
- Klargjøring av injeksjonssystemet
- Slip glasskapillærene med en mikropipettetrekker 13.
- Fyll en skjerpet kapillær med 2-10 μL CoCl2-oppløsningpå 10 eller 25 mM eller kontrollløsningen (0,1x MBS) ved hjelp av en mikrolasterspiss og plasser kapillæren i mikroinjektorbehandleren.
- Ved den høyeste forstørrelsen av et stereomikroskop, bryt av kapillærspissen med fine tang, og juster injeksjonstiden (ca. 100 ms) for å oppnå et utkastingsvolum på 15-40 nL per puls. Sett utkastetrykket til ~40 PSI.
MERK: Størrelsen på dråpen skal tilpasses rumpetrollstadiet og størrelsen på øyet. For eksempel, i trinn 48-49, er dråpestørrelsen ~ 15-20 nL, mens den er 30-40 nL i trinn 52-56. Visuelt er størrelsen på dråpen litt større enn linsestørrelsen.
- CoCl2 intraokulære injeksjoner
- Bruk et dyppnett for å fange rumpetroll i tankene deres. Overfør dem til 50 ml 0,005% benzokainoppløsning. Vent noen minutter til rumpetrollene slutter å reagere på stimuli.
MERK: Flere rumpetroll kan bedøves samtidig, men tiden i bedøvelsen bør være mindre enn 30 minutter. - Bruk en skje til å fange et rumpetroll og legg det forsiktig i en liten petriskål (55 mm diameter) som inneholder et vått papirlommetørkle. Plasser rumpetrollsiden med ryggsiden opp midt på petriskålen (figur 1F,G).
- Bruk mikroinjektoren under et stereomikroskop for å injisere CoCl2-løsningen intraokulært. Sett kapillæren forsiktig inn i øyet over linsen. Når kapillærspissen er inne i øyet, kast ut to dråper per øye. Etter å ha injisert høyre øye, vri petriskålen manuelt 180° for å injisere venstre øye.
MERK: Forsikre deg om at injeksjonen skjer inne i øyet, slik at en liten hevelse i øyet må ses etter hver utstøting av oppløsningen. Rumpetrollet bør holde seg minst mulig ute i vannet. Injeksjonen av begge øynene skal ta mindre enn 1 min. - Overfør det injiserte rumpetrollet til en stor tank som inneholder 1 liter bakvann ved å senke det forsiktig ned i petriskålen (figur 1H). Overvåk rumpetrollene til de er helt vekket.
- Bruk et dyppnett for å fange rumpetroll i tankene deres. Overfør dem til 50 ml 0,005% benzokainoppløsning. Vent noen minutter til rumpetrollene slutter å reagere på stimuli.
5. Farging for å vurdere retinal skade eller retinal degenerasjon
- Tadpolefiksering og dehydrering
- Klargjør 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning ved å fortynne 100 ml 32% PFA-oppløsning i 700 ml 1x PBS. Juster pH til 7,4 med NaOH. Aliquot denne stamoppløsningen og konserver den i flere måneder ved -20 °C.
- Avlive rumpetrollene i 0,01 % benzokain og overfør dem til et hetteglass med 4 % PFA i 2 timer ved romtemperatur under omrøring eller over natten ved 4 °C. Skyll 3 x 5 min i 1x PBS.
- Gradvis dehydrere rumpetroll ved suksessive 30 min inkubasjoner i 70% og 95% etanol (fortynnet i type II vann), etterfulgt av ytterligere tre 1 time inkubasjoner i 100% etanol. Oppbevar rumpetrollhodene på dette trinnet ved -20 °C eller overfør dem direkte til 100 % butanol over natten for videre trinn.
- Parafin seksjonering
- Bytt ut 100 % butanol med smeltet parafin i 2 timer ved 62 °C. Bytt ut parafinen i 2 x 2 timer ekstra inkubasjoner ved 62 °C.
- Overfør rumpetrollhoder i engangs parafininnebyggingsformer og orienter dem slik at øynene deres er godt justert, og la deretter parafinen herdes. Oppbevar blokkene ved romtemperatur.
- Trim overflødig parafin og monter blokken med den innebygde rumpetrollet/rumpetrollene på mikrotomstøtten.
- Seksjoner blokken med en mikrotome i riktig tykkelse (10-12 μm). Overfør båndene med seksjoner på et lysbilde som tidligere er dekket med 3% glyserinalbumin (fortynnet i vann).
- Plasser lysbildet på en lysbildevarmer ved 42 °C i noen minutter, og fjern deretter overskuddet av glyserinalbumin. La skliene tørke over natten i ovn på 37 °C.
- Devoks ved å senke lysbildene i 2 x 15 minutter i en Coplin krukke fylt med 100% xylen. Rehydrer seksjonene med graderte etanolserier: 100% to ganger, 70%, 50% (fortynnet i type II vann), ~ 5 min hver, etterfulgt av 2 x 5 min i vann.
- Merking av immunfluorescens
- Klargjør 100 mM natriumsitrat (CiNa) stamløsning ved å tilsette 29,4 g natriumcitrattrinatriumsaltdihydrat (C6H5Na3O7, 2H2O) til 1 liter type II vann; juster pH til 6 med saltsyre (HCl). Steriliser ved autoklavering og oppbevar ved romtemperatur i flere måneder. Forbered avmaskeringsløsningen på brukstidspunktet ved å tilsette 25 ml 100 mM CiNa stamløsning til 225 ml type II vann. Tilsett 125 μL Tween-20 og bland godt (endelig konsentrasjon er 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
- Tilbered Hoechst stamløsning ved 10 mg/ml ved å tilsette 100 mg bisBenzimid H 33258 til 10 ml type I vann. Konserverer denne stamløsningen i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mot lys med aluminiumsfolie. Forbered Hoechst-oppløsning ved 7,5 μg/ml ved å tilsette 300 μL Hoechst-stamløsning til 400 ml 1x PBS.
MERK: Denne oppløsningen kan brukes opptil 10 ganger og konserveres i ca. 6 måneder ved 4 °C, beskyttet mot lys med aluminiumsfolie. - Etter avvoksing av seksjoner, utfør antigenuthenting ved å koke seksjonene i avmaskeringsløsningen i 9 minutter. La oppløsningen avkjøles i 20 min.
- Skyll en gang i type II vann og en gang i 1x PBS. Sett lysbildene flate i et fuktig kammer og tilsett 400-600 μL blokkeringsløsning per lysbilde (antistofffortynningsmiddel + 0,2% Triton X100) i 30 minutter.
- Erstatt blokkeringsløsningen med 200 μL per lysbilde av det primære antistoffet fortynnet i blokkeringsoppløsningen. Bruk en dekkseddel for å spre løsningen over seksjonene, unngå bobledannelse. Ruges over natten ved 4 °C i et fuktig kammer.
- Overfør skliene til en Coplin krukke og skyll i 3 x 10 min i 1x PBS tilsatt 0,1 % Triton X100. Sett lysbildene flate, tilsett 400 μL per lysbilde av det sekundære antistoffet fortynnet i blokkeringsløsning, og la det stå i 2 timer ved romtemperatur i et fuktig kammer.
- Overfør skliene til en Coplin krukke og skyll i 3 x 5 min med 1x PBS supplert med 0,1% Triton X100.
- Motflekkcellekjerner med Hoechst-løsningen i 10 min og skyll 3 x 5 min med 1x PBS.
- Plasser deksler over lysbilder i et vandig monteringsmedium som er spesielt utformet for å bevare fluorescens. La skliene tørke i 1 time ved romtemperatur og oppbevar dem ved 4 °C.
- Se lysbildene for eksempel med et fluorescensmikroskop.
- Hematoksylin og eosin (H &E) farging for å vurdere retinal skade
MERK: I stedet for å merke en bestemt celletype ved immunfarging, kan generell retinal histologi vurderes med H &E-farging.- Etter avvoksningsseksjoner, utfør nukleinsyremerking ved å senke lysbilder i hematoksylinoppløsning i 2 minutter. Skyll godt med vann fra springen.
- Utfør cytoplasmamerking ved å senke lysbilder i 1% eosinoppløsning i 1 min. Skyll raskt med vann.
MERK: Eosin er veldig løselig; Hvis skliene blir liggende for lenge i vannet, forsvinner alt fargestoffet. - Skyll 2 x 5 min i 100% etanol og 2 x 5 min i xylen.
- Under hetten, plasser deksler over lysbildene i 4-5 dråper monteringsmedium. La lysbildene tørke under en hette og bilde neste dag med et mikroskop.
- Påvisning av apoptotiske celler
- Etter avvoksing av seksjoner (se pkt. 5.2.6), følg settprodusentens protokoll for å oppdage apoptotisk DNA-fragmentering.
- Utfør kjernefarging ved å senke lysbilder i Hoechst-løsning (se pkt. 5.3.8) og monter med et vandig monteringsmedium som er spesielt designet for å bevare fluorescens. La skliene tørke i 1 time ved romtemperatur og oppbevar dem ved 4 °C.
- Se lysbildene for eksempel med et fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk netthinneskade
Netthinnesnitt av rumpetroll utsatt for den mekaniske skaden beskrevet i protokoll avsnitt 1 viser at retinallesjonen omfatter alle lag av vevet mens den er begrenset til stikkstedet (figur 2A,B).
Betinget stavcelleablasjon ved bruk av NTR-MTZ-systemet
Øynene til bedøvede Tg(rho:GFP-NTR) transgene rumpetroll behandlet med MTZ-behandling, som beskrevet i protokollavsnitt 2, ble analysert under stereomikroskopet (figur 3A,B). Reduksjonen i GFP-fluorescens avslører den progressive målrettede stavcelleablasjonen sammenlignet med kontrollene (figur 3B), bekreftet på retinale seksjoner ved GFP-immunfarging, som beskrevet i protokollavsnitt 5 (figur 3C).
Stavcelledegenerasjon ved CRISPR/Cas9-mediert rhodopsin-knockout
Netthinner av rho crispant rumpetroll, oppnådd som beskrevet i protokoll pkt. 3, ble analysert som beskrevet i protokollavsnitt 5 (figur 4A). Caspase 3 og Rhodopsin-merking fremhever at noen staver gjennomgår apoptose (figur 4B). H&E-farging avslører global bevaring av kjernefysiske lag, men en alvorlig forkortelse av fotoreceptorens ytre segmenter (figur 4C). Videre immunfargingsanalyse med fotoreseptormarkører viser degenerasjon av staver og påfølgende kjegledefekter (figur 4D og ikke vist). Fenotypen begynner å være synlig fra stadium 40 og fremover, og de ytre segmentene av staver forsvinner gradvis til de er fraværende fra den sentrale netthinnen fra stadium 47.
Retinal celledegenerasjon ved cytotoksiske intraokulære CoCl 2-injeksjoner
Netthinner fra rumpetroll eksponert for CoCl2 intraokulære injeksjoner, som beskrevet i protokoll pkt. 4, ble analysert ved immunfarging og TUNEL-analyse, som beskrevet i protokoll pkt. 5 (figur 5A). Dette viser at 10 mM CoCl2-injeksjon fører til spesifikk celledød av kjeglefotoreseptorer (figur 5B,C), mens 25 mM fører til bred retinal celledød (figur 5E). Immunfargingsanalyse, som beskrevet i protokollavsnitt 5, viste videre fravær av tapper i 10 mM CoCl 2-injiserte retinaer (figur 5D) og alvorlig tap av både bipolare celler og fotoreseptorer etter 25 mM CoCl2-injeksjoner (figur 5F).
Figur 1: Illustrasjoner av noen eksperimentelle prosedyrer. (A) En pinne med diameter på 0,2 mm festet til en pinholder brukes til å punktere netthinnen. Diagrammene over rumpetrollets dorsale, laterale og frontale bilder illustrerer hvor tappen (i rødt) er satt inn. (B) Skjematisk fremstilling av den transgene modellen for betinget stavcelleablasjon. Rhodopsinpromotoren driver ekspresjonen av et GFP-Nitroreduktase-fusjonsprotein i stavceller. Når det legges til Xenopus-oppdrettsvannet , omdanner NTR metronidazol til et cytotoksin, spesielt ablating GFP-NTR-stenger. (C ) Hodet til et Tg(rho:GFP-NTR) transgent rumpetroll vises i hvitt lys eller under fluorescens. GFP-fargingen i øyet tillater sortering av transgene rumpetroll. (D) Encellede embryoer på et nylongitter under et stereomikroskop klar til å injiseres med et Picospritzer-mikroinjeksjonssystem. (E) Embryoer på neurulastadiet (skjematisk i innfelt) etter injeksjon på encellestadiet i CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset som inneholder fluoresceinlysin, dextran. Godt injiserte fluorescerende embryoer (grønne piler) kan skilles fra uinjiserte (hvite piler). (F) Bilde som viser skjeen som brukes til å overføre de bedøvede rumpetrollene. (G) Bedøvet rumpetroll i en petriskål over et vått vev. Kapillæren som er satt inn i mikroinjektoren tillater intraokulære injeksjoner av CoCl2-oppløsningen . (H) Bilde som viser overføring av et rumpetroll til en 1 l tank hvor dyret kan overvåkes til oppvåkning. Skalastenger = 2 mm (C), 1 mm (E). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; NTR = nitroreduktase; MTZ = metronidazol; NF = Nieuwkoop og Faber scenen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mekanisk netthinneskade. (A) Oversikt over eksperimentell prosedyre brukt i (B). Xenopus laevis rumpetrolløyne punkteres og analyseres på netthinnesnitt 7 dager etter skaden. Den stiplede boksen angir det avbildede området. (B) Cellekjerner er motfarget med Hoechst. Tre forskjellige netthinner vises. Pilene peker på det skadde stedet som krysser alle netthinnelag. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: dpi = dager etter skade; GCL = ganglioncellelag; INL = indre nukleært lag; ONL = ytre nukleært lag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Betinget stavcelleablasjon ved bruk av NTR-MTZ-systemet. (A) Oversikt over eksperimentell prosedyre brukt i (B,C). Tg(rho:GFP-NTR) transgene Xenopus laevis rumpetroll behandles med MTZ i 7-9 dager. Den progressive degenerasjonen av de GFP-merkede stavene kan overvåkes i sanntid under et fluorescensstereomikroskop som illustrert ved 7 dager i (B). Stavcelledød kan også analyseres på netthinnesnitt som illustrert etter 14 dager i (C), den stiplede boksen som indikerer det avbildede området. (B) Etter 7 dagers behandling reduseres GFP-intensiteten i netthinnen med tiden i transgene rumpetrollbehandlede rumpetroll sammenlignet med kontrollpersoner. (C) Reduksjonen i GFP-fluorescens bekreftes på retinalseksjoner etter 14 dager ved GFP-immunfarging. Cellekjerner er motfarget i blått med Hoechst. Skalastenger = 500 μm (B), 50 μm (C). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; NTR = nitroreduktase; MTZ = metronidazol; L = linse; R = netthinnen; GCL = ganglioncellelag; INL = indre nukleært lag; ONL = ytre kjernefysisk lag; OS = ytre segmenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Stavdegenerasjon i Xenopus laevis rho crispants. (A) Oversikt over eksperimentell prosedyre brukt i (B-D). Embryoer i ett cellestadium injiseres med ribonukleoproteinkomplekset CRISPR-Cas9 (gRNA duplex/Cas9-protein) som inneholder fluorescerende lysin-dekstran. På neurulastadiet kan fluorescerende injiserte embryoer sorteres og få lov til å utvikle seg til forskjellige stadier for å utføre (B) spaltet Caspase 3-immunfarging for celledødsanalyse, eller (C) hematoksylin- og eosinfarging for anatomisk analyse, eller (D) immunfarging med stavmarkører for fotoreceptorcelledegenerasjonsanalyse. Den stiplede boksen angir det avbildede området. (B) Dobbel merking av spaltet Caspase 3 (en markør for apoptotiske celler) og Rhodopsin (en markør for stavens ytre segmenter) på retinale seksjoner av kontroll eller rho crispants Xenopus laevis embryoer på stadium 39 viser et fravær av døende celler i kontrollene og at døende celler i rho crispants er stavfotoreceptorer. (C) H&E-farging på retinale seksjoner av rho crispants Xenopus laevis rumpetroll på stadium 48 avslører den reduserte størrelsen på fotoreceptorenes ytre segmenter sammenlignet med kontroller. (D) Recoverin (en markør for stavens indre segmenter) og Rhodopsin samtidig immunfarging på retinale seksjoner av rho crispants Xenopus laevis rumpetroll i stadium 48 avslører en alvorlig degenerasjon sammenlignet med kontroller. Cellekjerner er motfarget i blått med Hoechst. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: gRNA = guide RNA; H&E = hematoksylin og eosin; GCL = ganglioncellelag; INL = indre nukleært lag; ONL = ytre kjernefysisk lag; OS = ytre segmenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Netthinnecelledegenerasjon ved cytotoksiske intraokulære CoCl2-injeksjoner. (A) Oversikt over eksperimentell prosedyre brukt i (B-F). Den stiplede boksen angir det avbildede området. En oppløsning på 10 mM eller 25 mMCoCl2 injiseres intraokulært i rumpetrolløyet. Celleapoptose analyseres ved en TUNEL-analyse 2 dager etter skade (dpi) (B,C,E), mens retinalcelledegenerasjon analyseres 7 til 14 dpi ved immunfarging med forskjellige markører (D,F). (VG Nett) Retinale seksjoner av rumpetroll injisert med en saltoppløsning (kontroller) eller med en 10 mM CoCl2-løsning i trinn 51-54. (B) Celledødsanalyse ved 2 dpi avslører tilstedeværelsen av døende celler etter CoCl2-injeksjon, hovedsakelig i det fotoreceptornukleære laget. (C) Kobling av celledødsfarging med S/M Opsin (en markør for kjegler) immunfarging avslører at disse døende cellene hovedsakelig er kjegler; Pilene peker på dobbeltmerkede celler. (D) S/M Opsin (en markør for kjegler) og Rhodopsin (en markør for staver) samtidig immunfarging avslører en alvorlig reduksjon av kjeglecellemerking i CoCl2-injiserte retina sammenlignet med kontroller ved 14 dpi. (E,F) Retinale seksjoner av rumpetroll injisert med en 25 mM CoCl2-løsning i trinn 51-54. (E) Celledødsanalyse ved 2 dpi avslører tilstedeværelsen av døende celler i både fotoreseptoren og de indre kjernelagene. (F) Otx2 (en markør for både fotoreseptorer og bipolare celler) immunfarging avslører en alvorlig reduksjon av fargingen i begge lag i CoCl 2-injiserte retina sammenlignet med kontroller ved 7 dpi, noe som indikerer CoCl2-indusert celledød av både fotoreseptorer og bipolare celler. Cellekjerner er motfarget i blått med Hoechst. Skala barer: 25 μm. Forkortelser: ONL = Ytre nukleært lag; INL = indre nukleært lag; GCL = ganglioncellelag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordeler og ulemper ved ulike retinal skade paradigmer i Xenopus rumpetroll
Mekanisk netthinneskade
Ulike kirurgiske skader i nevrale netthinnen er utviklet i Xenopus rumpetroll. Den nevrale netthinnen kan enten fjernes helt 15,16 eller bare delvis skåret ut16,17. Den mekaniske skaden som presenteres her innebærer ingen retinal eksisjon, men en enkel øyepunktering som vi tidligere utviklet i Xenopus rumpetroll6. Gitt den manuelle prosedyren til en slik mekanisk retinal skademodell, kan fenotypen variere betydelig fra en rumpetroll til en annen. Videre kan reproduserbarheten og omfanget av skaden også variere avhengig av hvem som utfører eksperimentet. Vi anbefaler derfor at samme person utfører alle skadeprosedyrene.
Betinget stavcelleablasjon ved bruk av NTR-MTZ-systemet
NTR-MTZ-systemet har blitt brukt til å ablate stavceller i den transgene Xenopus retina 6,7,8,18. Varigheten av MTZ-behandlingen varierer betydelig fra en studie til en annen, fra 2 til 7 dager. Dette kan gjenspeile forskjellige aktiviteter av NTR avhengig av kromosominnsetting i de forskjellige transgene linjene. Videre la vi merke til en viss variasjon i responsen til Tg (rho: GFP-NTR) rumpetroll for en gitt tid med MTZ-behandling, med noen som opplever alvorlig stavdegenerasjon mens andre viser svært liten skade. Utvidelse av MTZ-behandlingen fra 7 til 9-10 dager med denne transgene linjen ser ut til å redusere slik variabilitet. Forsiktighet bør imidlertid utvises på grunn av de potensielt toksiske effektene av MTZ. De åpenbare fordelene med denne modellen er at den tillater betinget og reversibel stavcelleablasjon og for levende overvåking av stavdegenerasjon.
Stavcelledegenerasjon ved CRISPR/Cas9-mediert rhodopsin-knockout
CRISPR-Cas9 rho-genredigeringsmodellen av retinitis pigmentosa fører til stavcelledegenerasjon i Xenopus rumpetroll11. Imidlertid, i motsetning til NTR-MTZ-modellen, er stavcelleablasjon konstituerende og ikke reversibel. Interessant, den høye effektiviteten til denne tilnærmingen (vi oppnår nå regelmessig >90% av rumpetroll som viser alvorlig stangdegenerasjon) gjør det mulig å jobbe med denne modellen på F0-generasjonen. Vi jobbet opprinnelig med sgRNA, men la merke til variasjon fra forskjellige partier av RNA-preparater. Vi har nylig funnet ut at bestilling av syntetisk crRNA og tracrRNA og klargjøring av gRNA duplex som beskrevet i denne protokollen gir mer pålitelige resultater.
Retinal celledegenerasjon ved cytotoksiske intraokulære CoCl2-injeksjoner
Denne modellen har flere fordeler i forhold til de andre modellene som er beskrevet her. Det tillater ikke bare å indusere ablation av retinale celletyper betinget, men også å modulere alvorlighetsgraden av skaden14. Videre representerer det så vidt vi vet den eneste modellen for spesifikk kjegledegenerasjon i Xenopus. Til slutt genererer det lav variabilitet i den degenerative fenotypen.
Effekt av de fire retinale lesjonsparadigmene
For å ta hensyn til den potensielle variabiliteten av fenotyper fra en gruppe rumpetroll til en annen, anbefales det å kontrollere effekten av retinal degenerasjon på 8-10 rumpetroll. Ved mekanisk skade må skaden analyseres dagene etter skade, da lesjonen ikke lenger er synlig en uke senere. I NTR-MTZ-modellen er stangdegenerasjon tydelig synlig 1 uke etter slutten av MTZ-behandlingen. For rho crispants, som stavcelledød begynner når fotoreceptorene fullt differensiere, anbefaler vi å analysere degenerativ effektivitet fra stadium 45 og utover. I CoCl2-modellen inntreffer celledød innen en uke etter injeksjon. Når det gjelder forventet % overlevelse for hver metode, vil vi merke oss at CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleksinjeksjoner fører til høyere dødelighet de første 48 timene enn konvensjonelle RNA-injeksjoner (ingen vekst- eller overlevelsesproblemer vedvarer etter disse første 48 timene), og derfor bør flere embryoer injiseres etter behov. I motsetning til dette utgjør andre prosedyrer (mekaniske skader, MTZ-behandling eller intraokulære CoCl2-injeksjoner ) ingen overlevelsesproblemer.
Potensielle anvendelser av disse skadeparadigmene for å studere retinal regenerering
En potensiell anvendelse av denne serien av retinal skademodeller er studiet av retinal regenerering. Ulike kilder til retinal stamme eller stamlignende celler kan rekrutteres i en patologisk sammenheng, inkludert CMZ-celler, Müller gliaceller og RPE-celler. Vi har rapportert at den mekaniske skademodellen, NRT/MTZ-modellen og CRISPR/Cas9-modellen, alle er attraktive modeller for å studere Müllercelleaktivering ved skade 6,11. Interessant, i CoCl2-modellen kan alle tre cellulære kilder rekrutteres14, noe som gir en ny modell for å studere mekanismene som ligger til grunn for rekruttering og omprogrammering av forskjellige retinale celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd til MP fra Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) og UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) i samarbeid med ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
