Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering af retinale skademodeller i Xenopus haletudser

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65771
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay
* These authors contributed equally

Summary

Vi har udviklet flere protokoller til at fremkalde retinal skade eller retinal degeneration i Xenopus laevis haletudser. Disse modeller giver mulighed for at studere retinale regenereringsmekanismer.

Abstract

Retinale neurodegenerative sygdomme er de førende årsager til blindhed. Blandt mange terapeutiske strategier, der udforskes, viste stimulering af selvreparation sig for nylig som særlig tiltalende. En cellulær kilde til retinal reparation er Müller gliacellen, som har stamcellepotentiale og en ekstraordinær regenerativ kapacitet i anamnioter. Dette potentiale er dog meget begrænset hos pattedyr. Undersøgelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for retinal regenerering i dyremodeller med regenerative evner, bør give indsigt i, hvordan man låser op for pattedyrs Müller-cellers latente evne til at regenerere nethinden. Dette er et vigtigt skridt i udviklingen af terapeutiske strategier inden for regenerativ medicin. Til dette formål udviklede vi flere retinale skadeparadigmer i Xenopus: en mekanisk nethindeskade, en transgen linje, der muliggør nitroreduktasemedieret fotoreceptorbetinget ablation, en retinitis pigmentosa-model baseret på CRISPR/Cas9-medieret rhodopsin-knockout og en cytotoksisk model drevet af intraokulære CoCl2-injektioner . Ved at fremhæve deres fordele og ulemper beskriver vi her denne serie protokoller, der genererer forskellige degenerative tilstande og tillader undersøgelse af retinal regenerering i Xenopus.

Introduction

Millioner af mennesker verden over er ramt af forskellige retinale degenerative sygdomme, der fører til blindhed, såsom retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati eller aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Hidtil er disse forhold stort set uhelbredelige. Nuværende terapeutiske tilgange under evaluering omfatter genterapi, celle- eller vævstransplantationer, neuroprotektive behandlinger, optogenetik og proteser. En anden ny strategi er baseret på selvregenerering gennem aktivering af endogene celler med stamcellepotentiale. Müller gliaceller, den vigtigste gliacelletype i nethinden, er blandt cellulære kilder af interesse i denne sammenhæng. Ved skade kan de dedifferentiere, proliferere og generere neuroner 1,2,3. Selvom denne proces er meget effektiv hos zebrafisk eller Xenopus, er den stort set ineffektiv hos pattedyr.

Ikke desto mindre har det vist sig, at passende behandlinger med mitogene proteiner eller overekspression af forskellige faktorer kan inducere pattedyrs Müller glia-cellecyklus genindtræden og i nogle tilfælde udløse deres efterfølgende neurogeneseforpligtelse 1,2,3,4,5. Dette er dog stort set utilstrækkeligt til behandlinger. Derfor er det nødvendigt at øge vores viden om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for regenerering, for at identificere molekyler, der effektivt kan omdanne Müllers stamlignende celleegenskaber til nye cellulære terapeutiske strategier.

Med dette mål udviklede vi flere skadeparadigmer i Xenopus , der udløser retinal celledegeneration. Her præsenterer vi (1) en mekanisk nethindeskade, der ikke er celletypespecifik, (2) en betinget og reversibel celleablationsmodel ved hjælp af NTR-MTZ-systemet, der er målrettet mod stangceller, (3) en CRISPR / Cas9-medieret rhodopsin-knockout , en model af retinitis pigmentosa, der udløser progressiv stangcelledegeneration, og (4) en CoCl2-induceret cytotoksisk model, der ifølge dosis specifikt kan målrette kegler eller føre til bredere retinal celledegeneration. Vi fremhæver de særlige forhold, fordele og ulemper ved hvert paradigme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleje og forsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer under den institutionelle licens A91272108. Undersøgelsesprotokollerne blev godkendt af den institutionelle dyreplejekomité CEEA #59 og modtog godkendelse fra Direction Départementale de la Protection des Populations under referencenummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 og APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i disse protokoller.

1. Mekanisk retinal skade

BEMÆRK: Skadeparadigmeprotokollen beskrevet her består af en mekanisk retinal punktering af en haletudse fra trin 45 og fremefter. Det er derfor ikke målrettet mod nogen bestemt retinal celletype, men beskadiger hele tykkelsen af nethinden på punkteringsstedet.

  1. Forberedelse af bedøvelsesmidlet til haletudser
    1. Forbered en 10% stamopløsning af benzocain. For et samlet volumen på 10 ml tilsættes 1 g benzocain, 2 ml dimethylsulfoxid (DMSO) og 8 ml propylenglycol. Opbevar stamopløsningen i flere måneder ved 4 °C beskyttet mod lys med aluminiumsfolie.
    2. Der fremstilles 0,005% benzocainopløsning på brugstidspunktet ved tilsætning af 25 μL 10% benzocainstamopløsning til 50 ml haletudseopdrætsvand (filtreret og dechloreret postevand). Bland godt.
      BEMÆRK: Koncentrationen af benzocain er særlig lav, fordi haletudser er meget følsomme over for anæstesi sammenlignet med voksne.
  2. Forberedelse af pins
    1. Fastgør en steril stift med en diameter på 0,2 mm til en steriliseret stiftholder (figur 1A).
  3. Tadpole anæstesi
    1. Brug et dyppenet til at fange haletudser i deres tanke. Overfør dem til en ny tank indeholdende 0,005% benzocainopløsningen. Vent et par minutter, indtil haletudserne holder op med at reagere på stimuli (tryk på tanken eller direkte kontakt).
      BEMÆRK: Flere haletudser kan bedøves samtidigt, men tiden brugt i bedøvelsesopløsningen skal være mindre end 30 min.
  4. Nethindepunktur
    1. Brug en ske til at fange en haletudse og læg den forsigtigt på en lille petriskål (55 mm diameter), der indeholder et vådt væv. Placer haletudsen med ryggen opad midt på petriskålen.
    2. Under et stereomikroskop punkteres nethinden ved forsigtigt at indsætte stiften på den dorsale side af øjet, indtil den passerer gennem nethinden (figur 1A). Hvis der er behov for flere pokes, skal du gentage denne procedure forskellige steder. Efter punktering af højre øje skal du dreje petriskålen 180 ° for at punktere venstre øje.
    3. Overfør haletudsen til en stor tank indeholdende 1 liter opdrætsvand ved forsigtigt at nedsænke petriskålen. Overvåg haletudserne, indtil de er helt vækket.

2. Betinget stangcelleablation ved hjælp af NTR-MTZ-systemet

Protokollen har til formål at inducere specifik stavcelleablation i Xenopus Tg (rho: GFP-NTR) transgene linje6, tilgængelig på TEFOR Paris-Saclays zootekniske service, som er vært for det franske Xenopus ressourcecenter. Dette kemogenetiske system bruger kapaciteten af nitroreduktase (NTR) enzym til at omdanne prodrug metronidazol (MTZ) til et cytotoksisk DNA-tværbindingsmiddel til specifikt ablate NTR-ekspressive stænger (figur 1B). To detaljerede protokoller til at gøre Tg(rho:GFP-NTR) eller Tg(rho:NTR) transgene dyr og fremkalde degeneration er tidligere blevet offentliggjort 7,8. Her beskriver vi simpelthen induktionen af retinal degeneration, og hvordan man overvåger degenerationsprocessen in vivo.

  1. Fremstilling af metronidazolopløsning
    1. Der fremstilles 10 mM MTZ-opløsning på brugstidspunktet ved at opløse 1,67 g MTZ-pulver i en mørk flaske i 1 liter haletudseopdrætsvand indeholdende 0,1% DMSO ved hjælp af en magnetisk omrører og en magnetisk omrører.
      BEMÆRK: MTZ er lysfølsom. Fuldstændig opløsning kan tage op til 10 min.
  2. Generering af transgene haletudser ved naturlig parring fra Tg (rho: GFP-NTR) linjen
    BEMÆRK: Da transgene hanner repræsenterer en dyrebar bestand, foretrækker vi at generere embryoner via naturlig parring for ikke at ofre hannen og bruge den gentagne gange.
    1. Administration af hormoner
      1. Injicer 600 IE humant choriongonadotropinhormon (hCG) med 25G nåle i dorsal lymfesæk hos Xenopus laevis vildtypehunner. Injicer transgene mænd med 100-200 IE hCG i dorsal lymfesæk. Til live overvågning af stangdegeneration (trin 2.4) skal du bruge albino Xenopus i stedet for pigmenterede for bedre at visualisere fluorescensvariationer over øjet på de genererede transgene haletudser.
        BEMÆRK: Xenopus hunner kan primes med 50 IE hCG 1 til 7 dage før planlagt ægløsning, men dette er valgfrit.
    2. Parring og ægopsamling
      1. Umiddelbart efter hCG-injektionen anbringes en Tg(rho:GFP-NTR) transgen han i en tank sammen med en hCG-injiceret hun ved 20 °C indtil næste dag. Brug et stort volumen (mindst 10 L) og tilsæt små genstande, som æggene kan klæbe til, så æggene ikke beskadiges af de voksnes bevægelser. Den følgende dag, når frøerne ikke længere er i amplexus, skal du fjerne de voksne fra tanken og samle embryoner.
    3. Opdræt af embryoner og haletudser
      1. Stadiet embryoner og haletudser i henhold til den normale tabel over Xenopus udvikling9.
      2. Opdræt embryoner i en tank fyldt med haletudseopdrætsvand. Fra trin 45 fodres haletudser med pulveriseret stegemad og iltes vandet med en bobler. Tilsæt vand dagligt, hvis det er nødvendigt for at kompensere for fordampning, og skift hele tankvandet ugentligt.
        BEMÆRK: Alternativt er det også muligt at udskifte 50% af volumen to gange om ugen. En detaljeret protokol findes i10.
    4. Transgen embryosortering
      1. Fra trin 37/38 sorteres og vælges transgene embryoner under et fluorescensstereomikroskop ved direkte visualisering af GFP (figur 1C).
  3. Tadpole MTZ behandling
    1. Overfør Tg(rho:GFP-NTR) transgene haletudser til en tank indeholdende 10 mM MTZ-opløsning, og bag dem ved 20 °C i mørke i 1 uge. Brug transgene søskende opdrættet i haletudseopdrætsvand, der indeholder 0,1% DMSO som kontrol.
    2. Skift MTZ og kontrolopløsning hver anden dag i behandlingsperioden. Foder haletudserne som normalt under MTZ-behandlingen.
    3. Til individuel fluorescensovervågning (trin 2.4) anbringes hver haletudse i sin lille beholder med 30 ml MTZ eller kontrolopløsning fra trin 2.3.1 og fremefter.
      BEMÆRK: MTZ-behandling kan udføres når som helst fra trin 45 og fremefter.
  4. Live overvågning af stangdegeneration
    BEMÆRK: Den progressive degeneration af stængerne kan overvåges i realtid. Udfør derfor trin 2.4.1. til 2.4.4. før MTZ-behandling og derefter regelmæssigt efter behandling.
    1. Følg trin 1.1 og 1.3 til fremstilling af henholdsvis bedøvelsesmidlet og haletudsebedøvelsen.
    2. Brug en ske til at fange en haletudse og læg den forsigtigt på et vådt væv i en lille petriskål (55 mm diameter). Overhold GFP-fluorescensen under et fluorescerende stereomikroskop (excitationsbølgelængde = 488 nm og emissionsbølgelængde = 509 nm) og tag billeder af øjet. En nedsat fluorescensintensitet afspejler nedbrydningen af stænger.
      BEMÆRK: For at foretage kvantitative sammenligninger skal de samme indstillinger opretholdes for billeddannelse af alle haletudser.
    3. Overfør den afbildede haletudse til en stor tank, der indeholder 1 liter opdrætsvand ved forsigtigt at nedsænke petriskålen. Overvåg haletudserne, indtil de er helt vækket.
    4. Sammenlign fluorescensintensiteten mellem MTZ-behandlede og kontrolhaletudseøjne for at overvåge og vurdere effektiviteten af degenerationsprocessen.

3. Stangcelledegeneration ved CRISPR / Cas9-medieret rhodopsin knockout

BEMÆRK: Denne protokol er etableret for at generere en model af retinitis pigmentosa i Xenopus laevis ved at inducere specifik stavcelledegeneration ved hjælp af CRISPR / Cas9-medieret rhodopsin knockout. Procentdelen af indsættelse-deletion (indels) i F0 er angivet i11 og er ~75%. En sådan CRISPR/Cas9-medieret rhodopsin knockout kan også udføres i Xenopus tropicalis haletudser 11.

  1. Fremstilling af opløsninger og reagenser
    1. crRNA og tracrRNA bestilling
      1. Køb det syntetiske CRISPR RNA (crRNA) målrettet rhodopsin (rho) genet og standard transaktiverende crRNA (tracrRNA). CRRNA'et består af en rho-målspecifik region (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) og en anden (GUUUUAGAGCUAUGCU), der hybridiserer til tracrRNA'et.
    2. crRNA:tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
      1. CRRnaP og tracrRNA resuspenderes ved 100 μM i den nukleasefri duplexbuffer.
      2. Forbered gRNA-duplexet ved at blande 3 μL 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA og 94 μL duplexbuffer. De endelige koncentrationer er 36 ng/μL rho crRNA og 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Anneal oligoerne ved at opvarme dem til 95 °C i 5 minutter og afkøl dem langsomt til stuetemperatur. Der laves alikvoter og opbevares ved -20 °C.
    3. CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleks (dvs. gRNA duplex/Cas9-protein)
      1. På brugstidspunktet fremstilles blandingen af rho gRNA duplex og Cas9-proteinet. Til 20 μL tilsættes 10 μL rho gRNA duplexopløsning, 2 μL Cas9-protein (lager ved 5 mg/ml), 2 μL fluorescein lysindextran (lager ved 10 mg/ml) og 6 μL RNasefrit vand.
      2. For at danne ribonukleoproteinkomplekset inkuberes i 10 minutter ved 37 °C og lades opløsningen afkøle til stuetemperatur.
      3. Til 20 μL af kontrolopløsningen blandes 2 μL Cas9-protein, 2 μL fluorescein lysindeextran og 16 μL RNasefrit vand.
    4. Fremstilling af 10x, 1x og 0,1x MBS løsninger
      1. Forbered modificeret Barths saltvandsstamopløsning (10x MBS) ved at tilsætte 11,92 g HEPES, 51,43 g natriumchlorid (NaCl), 0,75 g kaliumchlorid (KCl), 2,1 g natriumbicarbonat (NaHCO3) og 2,46 g magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4, 7 H2O) i 800 ml type II vand. Juster pH-værdien til 7,8 med 30% natriumhydroxid (NaOH). Tilsæt type II vand, indtil volumenet er 1 L og steriliser ved autoklavering. Opbevares ved stuetemperatur.
      2. Der fremstilles 1 liter 1x MBS-opløsning ved at fortynde 100 ml 10x MBS-saltopløsning og 7 ml 0,1 M calciumchloriddihydrat (CaCl2, 2H2O) i type II-vand. Opbevares ved stuetemperatur.
      3. Forbered 0,1x MBS-opløsning ved at fortynde 1x MBS-opløsning i type II-vand. Opbevares ved stuetemperatur.
    5. Benzocainopløsning til voksne
      1. Der fremstilles 0,05% benzocainopløsning ved tilsætning af 5 ml 10% benzocainstamopløsning (se trin 1.1.1.) til 1 liter haletudseopdræt. Bland godt.
        BEMÆRK: Opbevar denne opløsning i flere måneder ved 4 °C beskyttet mod lys med aluminiumsfolie. Bring opløsningen til stuetemperatur, før den anvendes på dyr.
    6. L-Cystein opløsning
      1. Opløsningen af dejellying fremstilles på brugstidspunktet ved at tilsætte 2 g L-cysteinsaltmonohydrat til 100 ml 0,1x MBS-opløsning. Juster pH-værdien til 7,8 med 30% NaOH.
    7. Polysaccharoseopløsning
      1. Den tætte polysaccharoseopløsning fremstilles ved tilsætning af 3 g polysaccharose til 100 ml 0,1x MBS-opløsning. Opbevar denne opløsning i et par uger ved 4 °C.
  2. In vitro befrugtning og dejellying
    BEMÆRK: Flere detaljer om Xenopus in vitro befrugtning kan findes i en detaljeret dedikeret protokol i12.
    1. Hormonadministration til Xenopus laevis hunner for at fremkalde ægløsning
      1. Ca. 15 timer før æghøstning injiceres 600 IE hCG i hunnens dorsale lymfesæk og opbevares natten over ved 18 °C.
    2. Testis dissektion
      1. Aflive Xenopus-hannen med en dødelig dosis på 0,05% benzocainopløsning i 10-15 minutter. Som en komplementær eutanasimetode skal du adskille rygsøjlen umiddelbart bagved kraniet med en skarp og robust saks. Åbn bughulen med dissektionssaks, skær testiklerne ud og trim eventuelt vedhæftet fedt og kapillærer væk. Placer hver testis straks på is i 1 ml 1x MBS.
    3. Sæd forberedelse
      1. En testikel knuses med en pistil, der anvendes til mikrocentrifugeglas, og suspensionen fortyndes i et 15 ml rør indeholdende 9 ml 1x MBS. Tilsæt 10 μg / ml gentamicin til det andet testisglas og hold det ved 4 ° C i et par dage til yderligere befrugtningsforsøg.
    4. In vitro befrugtning
      1. Massér forsigtigt bagsiden af den hormoninjicerede kvinde og saml oocytterne i en petriskål (100 mm diameter). Spred et par dråber af sædopløsningen til oocytterne. Vent 5 minutter og dæk dem med 0,1x MBS. Vent 10 minutter, før du fortsætter med dejellying.
    5. Befrugtet æg dejellying
      1. Udskift 0,1x MBS-opløsningen med afjellying-opløsningen for at fjerne gelébelægningen fra de befrugtede æg (~5 min). Skyl embryonerne grundigt 5-6 gange med 0,1x MBS og overfør dem til en ny 100 mm petriskål fyldt med 0,1x MBS.
  3. Fremstilling af mikroinjektionssystemet
    1. Skærp glaskapillærerne med en mikropipettetrækker13.
    2. Fyld en skærpet kapillær med 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleks eller kontrolopløsningen ved hjælp af en mikrolæsserspids, og placer kapillærrøret i mikroinjektorhåndtereren.
    3. Ved den højeste forstørrelse af et stereomikroskop afbrydes kapillærspidsen med fine pincet, og injektionstiden justeres (~ 400 ms) for at opnå et udkastningsvolumen på 10 nL pr. Puls. Indstil udskubningstrykket til omkring 40 PSI.
  4. En-celle-trins embryomikroinjektion med CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset
    1. Embryoner i etcellestadiet anbringes på et gitter (1 mm nylonvæv) limet i en 100 mm petriskål fyldt med 3% polysaccharoseopløsning (figur 1D).
    2. Brug mikroinjektoren og under et stereomikroskop til at injicere 10 nL af CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset (hvilket svarer til 500 pg gRNA duplex + 5 ng Cas9-protein pr. Embryo) eller kontrolopløsning på niveauet af dyrepolen i det kortikale område lige under den cytoplasmatiske membran.
      BEMÆRK: Fluorescein lysindexren indeholdt i opløsningen tillader efterfølgende sortering af de injicerede embryoner.
    3. De injicerede embryoner overføres til en ny 100 mm petriskål indeholdende en ren polysaccharoseopløsning, og de anbringes ved 21 °C.
    4. På den første dag sorteres de veludviklede embryoner regelmæssigt og udskiftes polysaccharoseopløsningen med 0,1x MBS ca. 5 timer efter mikroinjektion.
    5. Vent i 24 timer efter injektionen for at sortere og vælge godt injicerede rho crispant embryoner under et fluorescerende stereomikroskop ved at visualisere fluorescein lysin dextran (figur 1E).
      BEMÆRK: Jo tidligere mikroinjektion efter befrugtning, jo mere effektiv knockout.
  5. Opdræt af embryoner og haletudser
    1. Hæv rho crispant embryoner i 0,1x MBS i petriskåle indtil trin 37/38. Fjern døde embryoner dagligt, og skift 0,1x MBS-opløsningen. Fra trin 37/38 opdrættes embryoner i en tank fyldt med haletudseopdrætsvand, og fra trin 45 fortsættes som i trin 2.2.3.

4. Retinal celledegeneration ved cytotoksiske intraokulære CoCl 2-injektioner

BEMÆRK: Denne protokol er etableret for at inducere retinal celledegeneration ved intraokulære injektioner af koboltchlorid (CoCl2) i Xenopus laevis haletudser. Ifølge dosis kan det udløse en keglespecifik degeneration eller en bredere degeneration14. Vi bruger denne protokol i Xenopus laevis haletudser i alderen fra stadie 48 og fremefter. Det kan også bruges i Xenopus tropicalis haletudser.

  1. Fremstilling af buffer og reagenser
    1. Der fremstilles 0,005% benzocainopløsning på brugstidspunktet som i trin 1.1.
    2. Forbered 100 mM CoCl 2-stamopløsning ved at tilsætte 118,5 mg til 5 ml 0,1x MBS (se trin 3.1.4 for at klargøre 0,1x MBS). Opbevar denne stamopløsning i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mod lys med aluminiumsfolie.
      FORSIGTIG: CoCl2 er klassificeret som en giftig forbindelse for menneskers og dyrs liv. Følg omhyggeligt instruktionerne for håndtering, opbevaring og bortskaffelse af affald på sikkerhedsdatabladet.
    3. Til keglespecifik degeneration fremstilles en 10 mM CoCl2-opløsning på brugstidspunktet fra 100 mM stamopløsningen fortyndet i 0,1x MBS. For bredere retinal celledegeneration fremstilles en 25 mMCoCl2-opløsning .
  2. Klargøring af injektionssystemet
    1. Skærp glaskapillærerne med en mikropipettetrækker 13.
    2. Fyld en skærpet kapillær med 2-10 μL 10 eller 25 mM CoCl2-opløsning eller kontrolopløsningen (0,1x MBS) ved hjælp af en mikrolæsserspids, og placer kapillærrøret i mikroinjektorhåndtereren.
    3. Ved den højeste forstørrelse af et stereomikroskop afbrydes kapillærspidsen med fine pincet, og injektionstiden justeres (ca. 100 ms) for at opnå et udkastningsvolumen på 15-40 nL pr. Puls. Indstil udstødningstrykket til ~40 PSI.
      BEMÆRK: Dråbens størrelse skal tilpasses haletudsernes stadium og størrelsen på deres øje. For eksempel er dråbestørrelsen i trin 48-49 ~ 15-20 nL, mens den er 30-40 nL i trin 52-56. Visuelt er dråbens størrelse lidt større end linsestørrelsen.
  3. CoCl2 intraokulære injektioner
    1. Brug et dyppenet til at fange haletudser i deres tanke. Overfør dem til 50 ml 0,005% benzocainopløsning. Vent et par minutter, indtil haletudserne holder op med at reagere på stimuli.
      BEMÆRK: Flere haletudser kan bedøves på samme tid, men tiden i bedøvelsen skal være mindre end 30 min.
    2. Brug en ske til at fange en haletudse og læg den forsigtigt i en lille petriskål (55 mm diameter), der indeholder et vådt væv. Placer haletudsen med ryggen opad midt på petriskålen (figur 1F, G).
    3. Brug mikroinjektoren under et stereomikroskop til intraokulært at injicere CoCl2-opløsningen . Indsæt forsigtigt kapillærrøret i øjet over linsen. Når kapillærspidsen er inde i øjet, skubbes to dråber ud pr. Øje. Efter injektion af højre øje drejes petriskålen manuelt 180° for at injicere venstre øje.
      BEMÆRK: Sørg for, at injektionen udføres inde i øjet, så der skal ses en let hævelse af øjet efter hver udstødning af opløsningen. Haletudsen skal forblive uden for vandet så lidt som muligt. Injektionen af begge øjne bør tage mindre end 1 min.
    4. Overfør den indsprøjtede haletudse til en stor tank indeholdende 1 liter opdrætsvand ved at nedsænke det forsigtigt i petriskålen (figur 1H). Overvåg haletudserne, indtil de er helt vækket.

5. Farvning for at vurdere retinal skade eller retinal degeneration

  1. Tadpole fiksering og dehydrering
    1. Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning ved at fortynde 100 ml 32% PFA-opløsning til 700 ml 1x PBS. Juster pH til 7,4 med NaOH. Denne stamopløsning afhjælpes og opbevares i flere måneder ved -20 °C.
    2. Aflive haletudserne i 0,01% benzocain og overfør dem til et hætteglas indeholdende 4% PFA i 2 timer ved stuetemperatur med omrøring eller natten over ved 4 °C. Skyl 3 x 5 min i 1x PBS.
    3. Taletudser dehydreres gradvis ved successive 30 minutters inkubationer i 70% og 95% ethanol (fortyndet i type II vand), efterfulgt af yderligere tre 1 times inkubationer i 100% ethanol. Opbevar haletudsehovederne på dette trin ved -20 °C eller overfør dem direkte til 100% butanol natten over for yderligere trin.
  2. Paraffin sektionering
    1. 100% butanol erstattes med smeltet paraffin i 2 timer ved 62 °C. Paraffinen erstattes med yderligere 2 x 2 timers inkubationer ved 62 °C.
    2. Overfør haletudsehoveder i engangsparaffinindlejringsforme og orienter dem, så deres øjne er godt justeret, og lad derefter paraffinen hærde. Opbevar blokkene ved stuetemperatur.
    3. Trim den overskydende paraffin og monter blokken med de(n) indlejrede haletudse(r) på mikrotomstøtten.
    4. Skær blokken med et mikrotomt i den passende tykkelse (10-12 μm). Overfør båndene med sektioner på et dias, der tidligere er dækket med 3% glycerinalbumin (fortyndet i vand).
    5. Placer objektglasset på et objektglas varmere ved 42 °C i et par minutter, og fjern derefter overskydende glycerinalbumin. Lad rutsjebanerne tørre natten over i en ovn ved 37 °C.
    6. Afvoks ved at nedsænke diasene i 2 x 15 min i en Coplin krukke fyldt med 100% xylen. Rehydrer sektionerne med klassificeret ethanolserie: 100% to gange, 70%, 50% (fortyndet i type II vand), ~ 5 min hver, efterfulgt af 2 x 5 min i vand.
  3. Immunofluorescens mærkning
    1. Der fremstilles 100 mM stamopløsning af natriumcitrat (CiNa) ved tilsætning af 29,4 g natriumcitrattrinatriumsaltdihydrat (C6H5Na3O7, 2H2O) til 1 liter type II-vand; pH justeres til 6 med saltsyre (HCI). Steriliser ved autoklavering og opbevar ved stuetemperatur i flere måneder. Forbered afmaskningsopløsningen på brugstidspunktet ved at tilsætte 25 ml 100 mM CiNa-stamopløsning til 225 ml type II-vand. Tilsæt 125 μL Tween-20 og bland godt (slutkoncentration er 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
    2. Hoechst stamopløsning fremstilles ved 10 mg/ml ved tilsætning af 100 mg bisbenzimid H 33258 til 10 ml vand af type I. Opbevar denne stamopløsning i flere måneder ved 4 °C, beskyttet mod lys med en aluminiumsfolie. Hoechsts opløsning fremstilles ved 7,5 μg/ml ved tilsætning af 300 μl Hoechst-stamopløsning til 400 ml 1x PBS.
      BEMÆRK: Denne opløsning kan bruges op til 10 gange og opbevares i ca. 6 måneder ved 4 °C, beskyttet mod lys med aluminiumsfolie.
    3. Efter afvoksning af sektioner udføres antigenhentning ved at koge sektionerne i afmaskningsopløsningen i 9 minutter. Lad opløsningen køle af i 20 min.
    4. Skyl en gang i type II vand og en gang i 1x PBS. Sæt diasene fladt i et fugtigt kammer og tilsæt 400-600 μL blokeringsopløsning pr. dias (antistoffortyndingsmiddel + 0,2% Triton X100) i 30 minutter.
    5. Den blokerende opløsning erstattes med 200 μL pr. objektglas af det primære antistof, der er fortyndet i blokeringsopløsningen. Brug en dæksel til at sprede opløsningen over sektionerne, så du undgår bobledannelse. Der inkuberes natten over ved 4 °C i et fugtigt kammer.
    6. Overfør objektglassene til en Coplin-krukke og skyl i 3 x 10 min i 1x PBS suppleret med 0,1 % Triton X100. Objektglassene sættes fladt, der tilsættes 400 μL pr. objektglas af det sekundære antistof, der er fortyndet i blokerende opløsning, og henstår i 2 timer ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
    7. Overfør dias til en Coplin krukke og skyl i 3 x 5 min med 1x PBS suppleret med 0,1% Triton X100.
    8. Modbejdsede cellekerner med Hoechst-opløsningen i 10 minutter og skyl 3 x 5 minutter med 1x PBS.
    9. Dækslerne anbringes over objektglassene i et vandigt monteringsmedium, der er specielt konstrueret til at bevare fluorescens. Lad rutsjeglassene tørre i 1 time ved stuetemperatur og opbevar dem ved 4 °C.
    10. Billede diasene med et fluorescensmikroskop.
  4. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning for at vurdere retinal skade
    BEMÆRK: I stedet for at mærke en bestemt celletype ved immunfarvning kan generel retinal histologi vurderes med H&E-farve.
    1. Efter afvoksning af sektioner udføres nukleinsyremærkning ved at nedsænke dias i hæmatoxylinopløsning i 2 minutter. Skyl godt med ledningsvand.
    2. Udfør cytoplasmamærkning ved at nedsænke dias i 1% eosinopløsning i 1 min. Skyl hurtigt med vand.
      BEMÆRK: Eosin er meget opløseligt; Hvis diasene efterlades for længe i vandet, forsvinder alt farvestof.
    3. Skyl 2 x 5 min i 100% ethanol og 2 x 5 min i xylen.
    4. Under emhætten skal du placere dæksler over diasene i 4-5 dråber af et monteringsmedium. Lad lysbillederne tørre under en hætte og billede den følgende dag med et mikroskop.
  5. Påvisning af apoptotiske celler
    1. Efter afvoksning (se pkt. 5.2.6) skal du følge kitproducentens protokol til påvisning af apoptotisk DNA-fragmentering.
    2. Kernefarvning foretages ved nedsænkning i Hoechst-opløsningen (se punkt 5.3.8), og den monteres med et vandigt monteringsmedium, der er specielt konstrueret til at bevare fluorescens. Lad rutsjeglassene tørre i 1 time ved stuetemperatur og opbevar dem ved 4 °C.
    3. Billede diasene med et fluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mekanisk retinal skade
Retinale sektioner af haletudser, der udsættes for den mekaniske skade, der er beskrevet i protokolafsnit 1, viser, at retinal læsion omfatter alle lag af vævet, mens den forbliver begrænset til punkteringsstedet (figur 2A, B).

Betinget stavcelleablation ved hjælp af NTR-MTZ-systemet
Øjnene på bedøvede Tg (rho: GFP-NTR) transgene haletudser behandlet med MTZ-behandling, som beskrevet i protokolafsnit 2, blev analyseret under stereomikroskopet (figur 3A, B). Faldet i GFP-fluorescens afslører den progressive målrettede stavcelleablation sammenlignet med kontrollerne (figur 3B), bekræftet på retinale sektioner ved GFP-immunfarvning, som beskrevet i protokolafsnit 5 (figur 3C).

Stangcelledegeneration ved CRISPR/Cas9-medieret rhodopsin knockout
Nethinderne hos rho crispant haletudser, opnået som beskrevet i protokolafsnit 3, blev analyseret som beskrevet i protokolafsnit 5 (figur 4A). Caspase 3 og Rhodopsin mærkning fremhæver, at nogle stænger gennemgår apoptose (figur 4B). H&E-farvning afslører global bevarelse af nukleare lag, men en alvorlig forkortelse af fotoreceptorens ydre segmenter (figur 4C). Yderligere immunfarvningsanalyse med fotoreceptormarkører viser degeneration af stænger og efterfølgende kegledefekter (figur 4D og ikke vist). Fænotypen begynder at være synlig fra trin 40 og fremefter, og de ydre segmenter af stænger forsvinder gradvist, indtil de er fraværende fra den centrale nethinden fra trin 47.

Retinal celledegeneration ved cytotoksiske intraokulære CoCl 2-injektioner
Haletudsens nethinder, der blev udsatfor CoCl2 intraokulære injektioner, som beskrevet i protokolafsnit 4, blev analyseret ved immunfarvning og TUNEL-assay som beskrevet i protokolafsnit 5 (figur 5A). Dette afslører, at 10 mM CoCl2-injektion fører til specifik celledød af keglefotoreceptorer (figur 5B, C), mens 25 mM fører til bred retinal celledød (figur 5E). Immunfarvningsanalyse, som beskrevet i protokolafsnit 5, afslørede yderligere fraværet af kegler i 10 mM CoCl 2-injicerede nethinden (figur 5D) og et alvorligt tab af både bipolære celler og fotoreceptorer efter 25 mM CoCl2-injektioner (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Illustrationer af nogle eksperimentelle procedurer. (A) En stift med en diameter på 0,2 mm, der er fastgjort til en stiftholder, bruges til at punktere nethinden. Diagrammerne over dorsal, lateral og frontal visning af en haletudse illustrerer, hvor stiften (i rødt) er indsat. B) Skematisk gengivelse af den transgene model af betinget stavcelleablation. Rhodopsinpromotoren driver ekspressionen af et GFP-nitroreduktasefusionsprotein i stavceller. Når det tilsættes til Xenopus-opdrætsvandet , omdanner NTR metronidazol til et cytotoksin, specifikt ablerende GFP-NTR-stænger. (C) Hovedet af en Tg(rho:GFP-NTR) transgen haletudse vises i hvidt lys eller under fluorescens. GFP-farvningen i øjet tillader sortering af transgene haletudser. D) embryoner i etcellestadiet på et nylongitter under stereomikroskop, klar til injektion med et Picospritzer-mikroinjektionssystem. E ) Embryoner på neurulastadiet (skematisk i indsatsen) efter injektion på encellestadiet af ribonukleoproteinkomplekset CRISPR-Cas9 indeholdende fluoresceinlysindedextran. Velinjicerede fluorescerende embryoner (grønne pile) kan skelnes fra uinjicerede (hvide pile). (F) Billede, der viser skeen, der blev brugt til at overføre de bedøvede haletudser. (G) Bedøvede haletudser i en petriskål over et vådt væv. Kapillæret indsat i mikroinjektoren muliggør intraokulære injektioner afCoCl2-opløsningen . H) Billede, der viser overførsel af en haletudse til en 1 L tank, hvor dyret kan overvåges, indtil det vågner. Skalastænger = 2 mm (C), 1 mm (E). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; NTR = nitroreduktase; MTZ = metronidazol; NF = Nieuwkoop og Faber scenen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mekanisk nethindeskade. A) Oversigt over den forsøgsprocedure, der er anvendt i litra B). Xenopus laevis haletudse øjne punkteres og analyseres på retinale sektioner 7 dage efter skaden. Den stiplede boks angiver det afbildede område. (B) Cellekerner modfarves med Hoechst. Tre forskellige nethinden er vist. Pilene peger på det skadede sted, der krydser alle retinale lag. Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: dpi = dage efter skaden; GCL = ganglion cellelag; INL = indre kernelag; ONL = ydre kernelag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Betinget stavcelleablation ved hjælp af NTR-MTZ-systemet. (A) Oversigt over den forsøgsprocedure, der er anvendt i afsnit B,C. Tg (rho: GFP-NTR) transgene Xenopus laevis haletudser behandles med MTZ i 7-9 dage. Den progressive degeneration af de GFP-mærkede stænger kan overvåges i realtid under et fluorescensstereomikroskop som illustreret ved 7 dage i (B). Stangcelledød kan også analyseres på retinale sektioner som illustreret efter 14 dage i (C), den stiplede boks, der angiver det afbildede område. (B) Efter 7 dages behandling falder GFP-intensiteten i nethinden med tiden i transgene MTZ-behandlede haletudser sammenlignet med kontroller. (C) Faldet i GFP-fluorescens bekræftes på retinale sektioner efter 14 dage ved GFP-immunfarvning. Cellekerner modfarves i blåt med Hoechst. Skalastænger = 500 μm (B), 50 μm (C). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; NTR = nitroreduktase; MTZ = metronidazol; L = linse; R = nethinden; GCL = ganglion cellelag; INL = indre kernelag; ONL = ydre kernelag; OS = ydre segmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Stangdegeneration i Xenopus laevis rho sprøde midler. A) Oversigt over den anvendte forsøgsprocedure i afsnit B-D. Encellede embryoner injiceres med CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkomplekset (gRNA duplex/Cas9-proteinet), der indeholder det fluorescerende lysin dextran. På neurula-stadiet kan fluorescerende injicerede embryoner sorteres og få lov til at udvikle sig indtil forskellige stadier for at udføre (B) spaltet Caspase 3-immunfarvning til celledødsanalyse eller (C) hæmatoxylin- og eosinfarvning til anatomisk analyse eller (D) immunfarvning med stangmarkører til fotoreceptorcelledegenerationsanalyse. Den stiplede boks angiver det afbildede område. (B) Dobbeltmærkning af spaltede Caspase 3 (en markør for apoptotiske celler) og Rhodopsin (en markør for stavens ydre segmenter) på retinale sektioner af kontrol eller rho crispants Xenopus laevis embryoner på stadium 39 viser et fravær af døende celler i kontrollerne, og at døende celler i rho crispants er stangfotoreceptorer. (C) H&E-farvning på retinale sektioner af rho crispants Xenopus laevis haletudser i fase 48 afslører den reducerede størrelse af fotoreceptorernes ydre segmenter sammenlignet med kontroller. (D) Recoverin (en markør for stavens indre segmenter) og Rhodopsin co-immunfarvning på retinale sektioner af rho crispants Xenopus laevis haletudser i fase 48 afslører en alvorlig degeneration sammenlignet med kontroller. Cellekerner modfarves i blåt med Hoechst. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: gRNA = guide RNA; H&E = hæmatoxylin og eosin; GCL = ganglion cellelag; INL = indre kernelag; ONL = ydre kernelag; OS = ydre segmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Retinal celledegeneration ved cytotoksiske intraokulære CoCl 2-injektioner. (A) Oversigt over den anvendte forsøgsprocedure i (B-F). Den stiplede boks angiver det afbildede område. En opløsning på 10 mM eller 25 mMCoCl2 injiceres intraokulært i haletudseøjet. Celleapoptose analyseres ved et TUNEL-assay 2 dage efter skade (dpi) (B, C, E), mens retinal celledegeneration analyseres 7 til 14 dpi ved immunfarvning med forskellige markører (D, F). (B-D) Retinale sektioner af haletudser injiceret med en saltopløsning (kontroller) eller med en 10 mM CoCl2-opløsning i trin 51-54. (B) Celledødsanalyse ved 2 dpi afslører tilstedeværelsen af døende celler efter CoCl2-injektion, hovedsageligt i fotoreceptorkernelaget. (C) Kobling af celledødsfarvning med S / M Opsin (en markør for kegler) immunfarvning afslører, at disse døende celler hovedsageligt er kegler; Pile peger på dobbeltmærkede celler. (D) S / M Opsin (en markør af kegler) og Rhodopsin (en markør af stænger) co-immunfarvning afslører et alvorligt fald i keglecellemærkning i CoCl2 injicerede nethinden sammenlignet med kontroller ved 14 dpi. (E,F) Retinale sektioner af haletudser injiceret med en 25 mM CoCl2-opløsning i trin 51-54. (E) Celledødsanalyse ved 2 dpi afslører tilstedeværelsen af døende celler i både fotoreceptoren og de indre nukleare lag. (F) Otx2 (en markør for både fotoreceptorer og bipolære celler) immunfarvning afslører et alvorligt fald i farvningen i begge lag i CoCl 2-injicerede nethinden sammenlignet med kontroller ved 7 dpi, hvilket indikerer CoCl2-induceret celledød af både fotoreceptorer og bipolære celler. Cellekerner modfarves i blåt med Hoechst. Skalabjælker: 25 μm. Forkortelser: ONL = ydre nukleare lag; INL = indre kernelag; GCL = ganglion cellelag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordele og ulemper ved forskellige retinale skadeparadigmer i Xenopus haletudser

Mekanisk retinal skade
Forskellige kirurgiske skader på nethinden er blevet udviklet i Xenopus haletudser. Den neurale nethinde kan enten fjernes helt15,16 eller kun delvist udskæres16,17. Den mekaniske skade, der præsenteres her, involverer ikke nogen retinal excision, men en simpel øjenpunktering, som vi tidligere har udviklet i Xenopus haletudser6. I betragtning af den manuelle procedure for en sådan mekanisk retinal skademodel kan fænotypen variere betydeligt fra en haletudse til en anden. Desuden kan replikabiliteten og omfanget af skaden også variere afhængigt af, hvem der udfører eksperimentet. Vi anbefaler derfor, at den samme person udfører alle skadesprocedurerne.

Betinget stavcelleablation ved hjælp af NTR-MTZ-systemet
NTR-MTZ-systemet er blevet brugt til at ablate stangceller i den transgene Xenopus nethinden 6,7,8,18. Varigheden af MTZ-behandlingen varierer betydeligt fra en undersøgelse til en anden, fra 2 til 7 dage. Dette kan afspejle forskellige aktiviteter i NTR afhængigt af den kromosomale indsættelse i de forskellige transgene linjer. Desuden bemærkede vi en vis variation i responsen af Tg (rho: GFP-NTR) haletudser i et givet tidspunkt med MTZ-behandling, hvor nogle oplevede alvorlig stangdegeneration, mens andre udviser meget lidt skade. Udvidelse af MTZ-behandlingen fra 7 til 9-10 dage med denne transgene linje synes at reducere en sådan variabilitet. Der bør dog udvises forsigtighed i betragtning af MTZ's potentielt toksiske virkninger. De åbenlyse fordele ved denne model er, at den giver mulighed for betinget og reversibel stangcelleablation og for live overvågning af stangdegeneration.

Stangcelledegeneration ved CRISPR/Cas9-medieret rhodopsin knockout
CRISPR-Cas9 rho genredigeringsmodellen af retinitis pigmentosa fører til stavcelledegeneration i Xenopus haletudse11. I modsætning til NTR-MTZ-modellen er stangcelleablation imidlertid konstitutiv og ikke reversibel. Interessant nok tillader den høje effektivitet af denne tilgang (vi opnår nu regelmæssigt >90% af haletudser, der udviser alvorlig stangdegeneration) at arbejde på denne model på F0-generationen. Vi arbejdede oprindeligt med sgRNA, men bemærkede variabilitet fra forskellige batcher af RNA-præparater. Vi fandt for nylig, at bestilling af syntetisk crRNA og tracrRNA og forberedelse af gRNA-duplex som beskrevet i denne protokol giver mere pålidelige resultater.

Retinal celledegeneration ved cytotoksiske intraokulære CoCl2-injektioner
Denne model har flere fordele i forhold til de andre modeller, der er beskrevet her. Det tillader ikke kun at inducere ablation af retinale celletyper betinget, men også at modulere sværhedsgraden af skaden14. Desuden repræsenterer det, så vidt vi ved, den eneste model for specifik kegledegeneration i Xenopus. Endelig genererer det lav variabilitet i den degenerative fænotype.

Effekten af de fire retinale læsionsparadigmer
For at tage højde for den potentielle variabilitet af fænotyper fra et parti haletudser til et andet anbefales det at kontrollere effekten af retinal degeneration på 8-10 haletudser. I tilfælde af mekanisk skade skal skaden analyseres i dagene efter skaden, da læsionen ikke længere er synlig en uge senere. I NTR-MTZ-modellen er stangdegeneration tydeligt synlig 1 uge efter afslutningen af MTZ-behandlingen. For rho crispants, da stavcelledød begynder, når fotoreceptorerne er fuldt differentierede, anbefaler vi at analysere degenerativ effektivitet fra trin 45 og fremefter. I CoCl2-modellen forekommer celledød inden for en uge efter injektion. Med hensyn til den forventede procentvise overlevelse for hver metode vil vi gerne bemærke, at CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinkompleksinjektioner fører til højere dødelighed i de første 48 timer end konventionelle RNA-injektioner (ingen vækst- eller overlevelsesproblemer vedvarer efter disse første 48 timer), og derfor bør flere embryoner injiceres efter behov. I modsætning hertil udgør andre procedurer (mekaniske skader, MTZ-behandling eller intraokulære CoCl2-injektioner ) ingen overlevelsesproblemer.

Potentielle anvendelser af disse skadeparadigmer til at studere retinal regenerering
En potentiel anvendelse af denne serie af retinale skademodeller er undersøgelsen af retinal regenerering. Forskellige kilder til retinale stamceller eller stamlignende celler kan rekrutteres i en patologisk sammenhæng, herunder CMZ-celler, Müller-gliaceller og RPE-celler. Vi har rapporteret, at den mekaniske skademodel, NRT/MTZ-modellen og CRISPR/Cas9-modellen, alle er attraktive modeller til at studere Müller-celleaktivering ved skade 6,11. Interessant nok kan alle tre cellulære kilder i CoCl2-modellen rekrutteres14, hvilket giver en ny model til undersøgelse af mekanismerne bag rekruttering og omprogrammering af forskellige retinale celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af bevillinger til MP fra Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) og UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) i partnerskab med ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Tags

Retinale skademodeller Xenopus haletudser retinale neurodegenerative sygdomme blindhed selvreparation M& 252; ller gliacelle stamcellepotentiale regenerativ kapacitet molekylære mekanismer dyremodeller pattedyr M& 252; llerceller retina regenerering terapeutiske strategier regenerativ medicin retinale skade paradigmer mekanisk retinal skade nitroreduktase-medieret fotoreceptor betinget ablation retinitis pigmentosa model CRISPR / Cas9-medieret Rhodopsin knockout cytotoksisk model CoCl2 injektioner
Generering af retinale skademodeller i <em>Xenopus</em> haletudser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parain, K., Donval, A., Chesneau,… More

Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter