Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65771
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay
* These authors contributed equally

Summary

We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.

Abstract

Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid. Van de vele therapeutische strategieën die worden onderzocht, is het stimuleren van zelfherstel onlangs bijzonder aantrekkelijk gebleken. Een cellulaire bron van belang voor herstel van het netvlies is de Müller-gliacel, die stamcelpotentieel en een buitengewoon regeneratief vermogen in anamniotes herbergt. Dit potentieel is echter zeer beperkt bij zoogdieren. Het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het netvlies in diermodellen met regeneratieve vermogens zou inzicht moeten geven in hoe het latente vermogen van Müller-cellen van zoogdieren om het netvlies te regenereren kan worden ontsloten. Dit is een belangrijke stap voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. Om dit doel te bereiken, ontwikkelden we verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging in Xenopus: een mechanisch netvliesletsel, een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt, een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , en een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire CoCl2-injecties . Door hun voor- en nadelen te benadrukken, beschrijven we hier deze reeks protocollen die verschillende degeneratieve aandoeningen genereren en de studie van retinale regeneratie bij Xenopus mogelijk maken.

Introduction

Miljoenen mensen over de hele wereld lijden aan verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies die leiden tot blindheid, zoals retinitis pigmentosa, diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Tot op heden blijven deze aandoeningen grotendeels onbehandelbaar. De huidige therapeutische benaderingen die worden geëvalueerd, omvatten gentherapie, cel- of weefseltransplantaties, neuroprotectieve behandelingen, optogenetica en protheses. Een andere opkomende strategie is gebaseerd op zelfregeneratie door de activering van endogene cellen met stamcelpotentieel. Müller-gliacellen, het belangrijkste gliaceltype van het netvlies, behoren tot de cellulaire bronnen die in deze context van belang zijn. Bij letsel kunnen ze dedifferentiëren, prolifereren en neuronen genereren 1,2,3. Hoewel dit proces zeer effectief is bij zebravissen of Xenopus, is het grotendeels inefficiënt bij zoogdieren.

Desalniettemin is aangetoond dat geschikte behandelingen met mitogene eiwitten of overexpressie van verschillende factoren de terugkeer van de Müller-gliacelcyclus van zoogdieren kunnen induceren en, in sommige gevallen, hun daaropvolgende neurogenese-verbintenis kunnen veroorzaken 1,2,3,4,5. Dit blijft echter grotendeels onvoldoende voor behandelingen. Daarom is het vergroten van onze kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan regeneratie noodzakelijk om moleculen te identificeren die in staat zijn om de eigenschappen van Müller-stamcellen efficiënt om te zetten in nieuwe cellulaire therapeutische strategieën.

Met dit doel voor ogen ontwikkelden we verschillende letselparadigma's in Xenopus die retinale celdegeneratie veroorzaken. Hier presenteren we (1) een mechanisch netvliesletsel dat niet specifiek is voor het celtype, (2) een voorwaardelijk en omkeerbaar celablatiemodel met behulp van het NTR-MTZ-systeem dat zich richt op staafcellen, (3) een CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , een model van retinitis pigmentosa dat progressieve staafceldegeneratie veroorzaakt, en (4) een CoCl2-geïnduceerd cytotoxisch model dat, afhankelijk van de dosis, zich specifiek op kegeltjes kan richten of kan leiden tot bredere degeneratie van retinale cellen. We belichten de bijzonderheden, voor- en nadelen van elk paradigma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierverzorging en dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, onder de institutionele licentie A91272108. De onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging CEEA #59 en kregen toestemming van de Direction Départementale de la Protection des Populations onder het referentienummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 en APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en reagentia die in deze protocollen worden gebruikt.

1. Mechanisch netvliesletsel

OPMERKING: Het hier beschreven letselparadigmaprotocol bestaat uit een mechanische retinale punctie van een kikkervisje vanaf stadium 45. Het richt zich daarom niet op een bepaald type netvliescel, maar beschadigt de hele dikte van het netvlies op de prikplaats.

  1. Bereiding van de verdoving voor kikkervisjes
    1. Bereid een 10% stockoplossing van benzocaïne. Voeg voor een totaal volume van 10 ml 1 g benzocaïne, 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en 8 ml propyleenglycol toe. Bewaar de stockoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
    2. Bereid 0,005% benzocaïne-oplossing op het moment van gebruik door 25 μL 10% benzocaïne-stockoplossing toe te voegen aan 50 ml kikkervisjeskweekwater (gefilterd en gedechloreerd leidingwater). Goed mengen.
      OPMERKING: De concentratie benzocaïne is bijzonder laag omdat kikkervisjes zeer gevoelig zijn voor anesthesie in vergelijking met volwassenen.
  2. Pin voorbereiding
    1. Bevestig een steriele pin met een diameter van 0.2 mm aan een gesteriliseerde pinhouder (Figuur 1A).
  3. Kikkervisje anesthesie
    1. Gebruik een schepnet om kikkervisjes in hun aquarium te vangen. Breng ze over in een nieuwe tank met de 0,005% benzocaïne-oplossing. Wacht een paar minuten tot de kikkervisjes niet meer reageren op prikkels (tikken op de tank of direct contact).
      NOTITIE: Meerdere kikkervisjes kunnen tegelijkertijd worden verdoofd, maar de tijd die in de verdovingsoplossing wordt doorgebracht, moet minder dan 30 minuten zijn.
  4. Netvliespunctie
    1. Gebruik een lepel om een kikkervisje te vangen en leg het voorzichtig op een kleine petrischaal (55 mm diameter) met daarin een natte tissue. Plaats het kikkervisje met de dorsale kant naar boven in het midden van de petrischaal.
    2. Prik onder een stereomicroscoop in het netvlies door de pin voorzichtig aan de dorsale zijde van het oog in te brengen, totdat deze door het netvlies gaat (Figuur 1A). Als er meerdere porren nodig zijn, herhaal deze procedure dan op verschillende plaatsen. Nadat u het rechteroog hebt doorboord, draait u de petrischaal 180° om het linkeroog te doorboren.
    3. Breng het tadvisje over in een grote bak met 1 L kweekwater door de petrischaal voorzichtig onder te dompelen. Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.

2. Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem

Het protocol heeft tot doel specifieke staafcelablatie te induceren in de Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) transgene lijn6, beschikbaar bij de zoötechnische dienst van TEFOR Paris-Saclay, waar het Franse Xenopus resource center is gevestigd. Dit chemogenetische systeem maakt gebruik van de capaciteit van het nitroreductase (NTR)-enzym om de prodrug metronidazol (MTZ) om te zetten in een cytotoxisch DNA-verknopingsmiddel, om specifiek NTR-expressiestaafjes te ablateren (Figuur 1B). Twee gedetailleerde protocollen om Tg(rho:GFP-NTR) of Tg(rho:NTR) transgene dieren te maken en degeneratie te induceren zijn eerder gepubliceerd 7,8. Hier beschrijven we eenvoudig de inductie van retinale degeneratie en hoe het degeneratieproces in vivo kan worden gevolgd.

  1. Bereiding van metronidazol-oplossing
    1. Bereid 10 mM MTZ-oplossing op het moment van gebruik door 1,67 g MTZ-poeder op te lossen in een donkere fles in 1 l kikkervisjeskweekwater met 0,1% DMSO, met behulp van een magnetische roerstaaf en een magnetisch roerwerk.
      LET OP: MTZ is lichtgevoelig. Volledige oplossing kan tot 10 minuten duren.
  2. Het genereren van transgene kikkervisjes door natuurlijke paring van de Tg(rho:GFP-NTR) lijn
    OPMERKING: Aangezien transgene mannetjes een kostbaar ras vertegenwoordigen, geven we er de voorkeur aan om embryo's te genereren via natuurlijke paring om het mannetje niet op te offeren en herhaaldelijk te gebruiken.
    1. Toediening van hormonen
      1. Injecteer 600 I.E. humaan choriongonadotrofinehormoon (hCG) met naalden van 25 G in de dorsale lymfezak van Xenopus laevis wildtype vrouwtjes. Injecteer transgene mannetjes met 100-200 IE hCG in de dorsale lymfezak. Gebruik voor het live monitoren van staafdegeneratie (stap 2.4) albino Xenopus in plaats van gepigmenteerde, om fluorescentievariaties in het oog van de gegenereerde transgene kikkervisjes beter te visualiseren.
        OPMERKING: Xenopus-vrouwtjes kunnen 1 tot 7 dagen voor de geplande eisprong worden geprimed met 50 IE hCG, maar dit is optioneel.
    2. Paring en eicelverzameling
      1. Onmiddellijk na de hCG-injectie een Tg(rho:GFP-NTR) transgeen mannetje samen met een met hCG geïnjecteerd vrouwtje bij 20 °C in een tank doen tot de volgende dag. Gebruik een groot volume (minimaal 10 L) en voeg kleine voorwerpen toe waar de eieren zich aan kunnen hechten, zodat de eieren niet worden beschadigd door de bewegingen van de volwassenen. De volgende dag, wanneer de kikkers niet meer in amplexus zijn, haalt u de volwassenen uit de tank en verzamelt u embryo's.
    3. Opfok van embryo's en kikkervisjes
      1. Stadium embryo's en kikkervisjes volgens de normale tabel van de ontwikkeling van Xenopus 9.
      2. Kweek embryo's in een tank gevuld met water voor het kweken van kikkervisjes. Voer vanaf stadium 45 kikkervisjes met bakvoer in poedervorm en voorzie het water van zuurstof met een bubbler. Voeg indien nodig dagelijks water toe om de verdamping te compenseren en ververs het hele tankwater wekelijks.
        OPMERKING: Als alternatief is het ook mogelijk om twee keer per week 50% van het volume te vervangen. Een gedetailleerd protocol is te vinden in10.
    4. Transgene embryo's sorteren
      1. Sorteer en selecteer transgene embryo's vanaf stadium 37/38 onder een fluorescentie-stereomicroscoop door GFP direct te visualiseren (Figuur 1C).
  3. Kikkervisje MTZ behandeling
    1. Breng Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes over in een tank met 10 mM MTZ-oplossing en kweek ze gedurende 1 week bij 20 °C in het donker. Gebruik transgene broers en zussen die zijn grootgebracht in kikkervisjeskweekwater met 0,1% DMSO als controle.
    2. Vervang de MTZ en de controlevloeistof om de dag tijdens de behandelingsperiode. Voer de kikkervisjes zoals gewoonlijk tijdens de MTZ-behandeling.
    3. Voor individuele fluorescentiebewaking (stap 2.4) plaatst u elk kikkervisje vanaf stap 2.3.1 in een kleine container met 30 ml MTZ of controlevloeistof.
      OPMERKING: MTZ-behandeling kan op elk moment worden uitgevoerd vanaf stadium 45.
  4. Live monitoring van staafdegeneratie
    OPMERKING: De progressieve degeneratie van de staven kan in realtime worden gevolgd. Voer daarom stap 2.4.1 uit. tot en met 2.4.4. voor de MTZ-behandeling en daarna regelmatig na de behandeling.
    1. Volg stap 1.1 en 1.3 voor de bereiding van respectievelijk de verdoving en de kikkervisjesanesthesie.
    2. Gebruik een lepel om een kikkervisje te vangen en leg het voorzichtig op een natte tissue in een kleine petrischaal (diameter 55 mm). Observeer de GFP-fluorescentie onder een fluorescerende stereomicroscoop (excitatiegolflengte = 488 nm en emissiegolflengte = 509 nm) en maak foto's van het oog. Een verminderde fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de degradatie van staafjes.
      OPMERKING: Om kwantitatieve vergelijkingen te maken, moeten dezelfde instellingen worden aangehouden voor het afbeelden van alle kikkervisjes.
    3. Breng het afgebeelde kikkervisje over naar een grote tank met 1 L kweekwater door de petrischaal voorzichtig onder te dompelen. Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.
    4. Vergelijk de fluorescentie-intensiteit tussen MTZ-behandelde en controlekikkervisogen om de werkzaamheid van het degeneratieproces te bewaken en te beoordelen.

3. Rodceldegeneratie door CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out

OPMERKING: Dit protocol is opgesteld om een model van retinitis pigmentosa in Xenopus laevis te genereren door specifieke staafceldegeneratie te induceren met behulp van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out. Het % insertie-deletie (indels) in F0 wordt gegeven in11 en is ~75%. Zo'n CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out kan ook worden uitgevoerd in Xenopus tropicalis-kikkervisjes 11.

  1. Bereiding van oplossingen en reagentia
    1. crRNA en tracrRNA bestellen
      1. Koop het synthetische CRISPR-RNA (crRNA) dat zich richt op het rodopsine (rho)-gen en het standaard transactiverende crRNA (tracrRNA). Het crRNA is samengesteld uit een rho-doelwitspecifiek gebied (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) en een ander (GUUUUAGAGCUAUGCU) dat hybridiseert met het tracrRNA.
    2. crRNA: tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
      1. Resuspendeer crRNA en tracrRNA bij 100 μM in de nucleasevrije duplexbuffer.
      2. Bereid het gRNA-duplex voor door 3 μL 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA en 94 μL duplexbuffer te mengen. De uiteindelijke concentraties zijn 36 ng/μL rho crRNA en 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Gloei de oligo's door ze 5 minuten op 95 °C te verwarmen en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur. Maak aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
    3. CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex (d.w.z. gRNA duplex/Cas9-eiwit)
      1. Bereid op het moment van gebruik het mengsel van rho-gRNA-duplex en het Cas9-eiwit. Voeg voor 20 μL 10 μL van de rho-gRNA-duplexoplossing, 2 μL Cas9-eiwit (voorraad van 5 mg/ml), 2 μL fluoresceïnelysine-dextran (voorraad van 10 mg/ml) en 6 μL RNasevrij water toe.
      2. Om het ribonucleoproteïnecomplex te vormen, incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
      3. Meng voor 20 μL van de controleoplossing 2 μL Cas9-eiwit, 2 μL fluoresceïnelysinedextran en 16 μL RNasevrij water.
    4. Voorbereiding van 10x, 1x en 0,1x MBS-oplossingen
      1. Bereid de zoutoplossing van Modified Barth (10x MBS) door 11,92 g HEPES, 51,43 g natriumchloride (NaCl), 0,75 g kaliumchloride (KCl), 2,1 g natriumbicarbonaat (NaHCO3) en 2,46 g magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4, 7 H2O) toe te voegen aan 800 ml type II water. Pas de pH aan naar 7,8 met 30% natriumhydroxide (NaOH). Voeg type II water toe tot het volume 1 L is en steriliseer door middel van autoclaveren. Bewaren bij kamertemperatuur.
      2. Bereid 1 l 1x MBS-oplossing door 100 ml 10x MBS-zoutoplossing en 7 ml 0,1 M calciumchloridedihydraat (CaCl 2, 2H2O) te verdunnen in water van type II. Bewaren bij kamertemperatuur.
      3. Bereid 0,1x MBS-oplossing door 1x MBS-oplossing te verdunnen in type II water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    5. Benzocaïne-oplossing voor volwassenen
      1. Bereid 0,05% benzocaïne-oplossing door 5 ml 10% benzocaïne-stockoplossing (zie stap 1.1.1.) toe te voegen aan 1 l kikkervisjeskweekwater. Goed mengen.
        NOTITIE: Bewaar deze oplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie. Breng de oplossing op kamertemperatuur voordat u het op dieren gebruikt.
    6. L-cysteïne-oplossing
      1. Bereid de dejellying-oplossing op het moment van gebruik door 2 g L-cysteïnezoutmonohydraat toe te voegen aan 100 ml 0,1x MBS-oplossing. Pas de pH aan naar 7,8 met 30% NaOH.
    7. Polysucrose-oplossing
      1. Bereid de dichte polysucrose-oplossing door 3 g polysucrose toe te voegen aan 100 ml 0,1x MBS-oplossing. Bewaar deze oplossing enkele weken bij 4 °C.
  2. In-vitrofertilisatie en dejellying
    OPMERKING: Meer details over Xenopus in-vitrofertilisatie zijn te vinden in een gedetailleerd speciaal protocol in12.
    1. Toediening van hormonen aan Xenopus laevis-vrouwtjes om de eisprong op te wekken
      1. Injecteer ongeveer 15 uur voor het oogsten van de eicel 600 I.E. hCG in de dorsale lymfezak van het vrouwtje en houd dit een nacht bij 18 °C.
    2. Testis dissectie
      1. Euthanaseer het Xenopus-mannetje met een dodelijke dosis 0,05% benzocaïne-oplossing gedurende 10-15 minuten. Als aanvullende euthanasiemethode snijdt u de wervelkolom direct achter de schedel door met een scherpe en stevige schaar. Open de buikholte met een dissectieschaar, knip de teelballen uit en knip eventueel aangehecht vet en haarvaten weg. Plaats elke testis onmiddellijk op ijs in 1 ml 1x MBS.
    3. Voorbereiding van het sperma
      1. Plet een testis met een stamper voor microcentrifugebuisjes en verdun de suspensie in een buisje van 15 ml met 9 ml 1x MBS. Voeg 10 μg/ml gentamicine toe aan de tweede testisbuis en houd deze een paar dagen op 4 °C voor verdere bevruchtingsexperimenten.
    4. In-vitrofertilisatie
      1. Masseer zachtjes de rug van het met hormoon geïnjecteerde vrouwtje en vang de eicellen op in een petrischaal (diameter 100 mm). Verspreid een paar druppels van de sperma-oplossing over de eicellen. Wacht 5 minuten en bedek ze met 0.1x MBS. Wacht 10 minuten voordat u verder gaat met dejellyen.
    5. Bevruchte eicel dejellying
      1. Vervang de 0.1x MBS-oplossing door de dejellying-oplossing om de geleilaag van de bevruchte eieren te verwijderen (~5 min). Spoel de embryo's 5-6 keer grondig af met 0,1x MBS en plaats ze over in een nieuwe petrischaal van 100 mm gevuld met 0,1x MBS.
  3. Voorbereiding van het micro-injectiesysteem
    1. Slijp glazen capillairen met een micropipettrekker13.
    2. Vul een geslepen capillair met 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex of de controleoplossing met behulp van een microloader-tip en plaats het capillair in de microinjectorhandler.
    3. Breek bij de hoogste vergroting van een stereomicroscoop de capillaire punt af met een fijne pincet en pas de injectietijd (~400 ms) aan om een uitwerpvolume van 10 nL per puls te verkrijgen. Stel de uitwerpdruk in op ongeveer 40 PSI.
  4. Embryo-micro-injectie in één celstadium met het CRISPR-Cas9-ribonucleoproteïnecomplex
    1. Plaats de embryo's in het eencellige stadium op een rooster (1 mm nylonweefsel) dat is vastgelijmd in een petrischaal van 100 mm gevuld met 3% polysucrose-oplossing (figuur 1D).
    2. Injecteer met behulp van de microinjector en onder een stereomicroscoop 10 nL van het CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex (wat overeenkomt met 500 pg gRNA duplex + 5 ng Cas9-eiwit per embryo) of controleoplossing op het niveau van de dierlijke pool, in het corticale gebied, net onder het cytoplasmatische membraan.
      OPMERKING: De fluoresceïne lysine dextran in de oplossing maakt het mogelijk om de geïnjecteerde embryo's vervolgens te sorteren.
    3. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een nieuwe petrischaal van 100 mm met een schone polysaccharose-oplossing en plaats ze bij 21 °C.
    4. Sorteer op de eerste dag regelmatig de goed ontwikkelde embryo's en vervang de polysucrose-oplossing ongeveer 5 uur na micro-injectie door 0,1x MBS.
    5. Wacht 24 uur na injectie om goed geïnjecteerde rho-crispante embryo's te sorteren en te selecteren onder een fluorescerende stereomicroscoop door fluoresceïne lysine-dextran te visualiseren (Figuur 1E).
      OPMERKING: Hoe eerder de micro-injectie na de bevruchting, hoe effectiever de knock-out.
  5. Opfok van embryo's en kikkervisjes
    1. Kweek rho crispante embryo's in 0,1x MBS in petrischaaltjes tot stadium 37/38. Verwijder dagelijks dode embryo's en vervang de 0.1x MBS-oplossing. Kweek vanaf stadium 37/38 embryo's in een bak gevuld met kikkervisjeskweekwater en ga vanaf stadium 45 te werk zoals in stap 2.2.3.

4. Degeneratie van netvliescellen door cytotoxische intraoculaire CoCl 2-injecties

OPMERKING: Dit protocol is opgesteld om netvliesceldegeneratie te induceren door intraoculaire injecties van kobaltchloride (CoCl2) in Xenopus laevis-kikkervisjes . Afhankelijk van de dosis kan het een kegelspecifieke degeneratie of een bredere degeneratieveroorzaken14. We gebruiken dit protocol bij Xenopus laevis kikkervisjes vanaf stadium 48 jaar. Het kan ook worden gebruikt in Xenopus tropicalis kikkervisjes.

  1. Bereiding van buffer en reagentia
    1. Bereid 0,005% benzocaïne-oplossing op het moment van gebruik zoals in stap 1.1.
    2. Bereid 100 mM CoCl2 stockoplossing door 118,5 mg toe te voegen aan 5 ml 0,1x MBS (zie stap 3.1.4 voor de bereiding van 0,1x MBS). Bewaar deze voorraadoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
      LET OP: CoCl2 is geclassificeerd als een giftige verbinding voor het leven van mens en dier. Volg zorgvuldig de instructies voor hantering, opslag en afvalverwijdering op het veiligheidsinformatieblad.
    3. Voor kegelspecifieke degeneratie bereidt u op het moment van gebruik een 10 mM CoCl2-oplossing uit de 100 mM stockoplossing verdund in 0,1x MBS. Voor bredere degeneratie van netvliescellen bereidt u een 25 mM CoCl2-oplossing voor.
  2. Voorbereiding van het injectiesysteem
    1. Slijp glazen capillairen met een micropipettrekker 13.
    2. Vul een geslepen capillair met 2-10 μL 10 of 25 mM CoCl2-oplossing of de controlevloeistof (0,1x MBS) met behulp van een microloader-tip en plaats het capillair in de micro-injectorhandler.
    3. Breek bij de hoogste vergroting van een stereomicroscoop de capillaire punt af met een fijne pincet en pas de injectietijd aan (ongeveer 100 ms) om een uitwerpvolume van 15-40 nL per puls te verkrijgen. Stel de uitwerpdruk in op ~40 PSI.
      OPMERKING: De grootte van de druppel moet worden aangepast aan het stadium van de kikkervisjes en de grootte van hun oog. In de stadia 48-49 is de druppelgrootte bijvoorbeeld ~15-20 nL, terwijl deze 30-40 nL is in de stadia 52-56. Visueel is de grootte van de druppel iets groter dan de lensmaat.
  3. CoCl2 intraoculaire injecties
    1. Gebruik een schepnet om kikkervisjes in hun aquarium te vangen. Breng ze over naar 50 ml 0,005% benzocaïne-oplossing. Wacht een paar minuten tot de kikkervisjes niet meer reageren op de prikkels.
      OPMERKING: Meerdere kikkervisjes kunnen tegelijkertijd worden verdoofd, maar de tijd die in de verdoving wordt doorgebracht, moet minder dan 30 minuten zijn.
    2. Vang met een lepel een kikkervisje op en leg het voorzichtig in een kleine petrischaal (55 mm diameter) met daarin een natte tissue. Plaats het kikkervisje met de dorsale kant naar boven in het midden van de petrischaal (Figuur 1F,G).
    3. Gebruik de microinjector onder een stereomicroscoop om de CoCl2-oplossing intraoculair te injecteren. Steek het capillair voorzichtig in het oog over de lens. Wanneer de capillaire punt zich in het oog bevindt, werpt u twee druppels per oog uit. Draai na het injecteren van het rechteroog de petrischaal handmatig 180° om het linkeroog te injecteren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de injectie in het oog wordt uitgevoerd, dus na elke uitwerping van de oplossing moet een lichte zwelling van het oog worden gezien. Het kikkervisje moet zo min mogelijk buiten het water blijven. De injectie van beide ogen duurt minder dan 1 minuut.
    4. Breng het geïnjecteerde kikkervisje over in een grote tank met 1 L kweekwater door het voorzichtig onder te dompelen in de petrischaal (figuur 1H). Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.

5. Kleuring om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te beoordelen

  1. Kikkervisfixatie en uitdroging
    1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing door 100 ml 32% PFA-oplossing te verdunnen tot 700 ml 1x PBS. Pas de pH aan naar 7,4 met NaOH. Aliquot deze stockoplossing en bewaar deze gedurende enkele maanden bij -20 °C.
    2. Euthanaseer de kikkervisjes in 0,01% benzocaïne en breng ze over in een injectieflacon met 4% PFA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met roeren of een nacht bij 4 °C. Spoel 3 x 5 min in 1x PBS.
    3. Kikkervisjes geleidelijk uitdrogen door opeenvolgende incubaties van 30 minuten in 70% en 95% ethanol (verdund in type II-water), gevolgd door nog drie incubaties van 1 uur in 100% ethanol. Bewaar de kikkervisjes bij deze stap bij -20 °C of breng ze een nacht direct over op 100% butanol voor verdere stappen.
  2. Paraffine secties
    1. Vervang 100% butanol door gesmolten paraffine gedurende 2 uur bij 62 °C. Vervang de paraffine gedurende 2 x 2 uur extra incubaties bij 62 °C.
    2. Breng kikkerviskoppen over in wegwerpvormen voor paraffine en oriënteer ze zo dat hun ogen goed zijn uitgelijnd en laat de paraffine vervolgens uitharden. Bewaar de blokken bij kamertemperatuur.
    3. Knip de overtollige paraffine af en monteer het blok met de ingebedde kikkervisje(s) op de microtoomsteun.
    4. Verdeel het blok met een microtoom met de juiste dikte (10-12 μm). Breng de linten over met secties op een objectglaasje dat eerder is bedekt met 3% glycerine-albumine (verdund in water).
    5. Plaats het glaasje een paar minuten op een diawarmer op 42 °C en verwijder daarna het teveel aan glycerinealbumine. Laat de glaasjes een nacht drogen in een oven van 37 °C.
    6. Dewax door de glaasjes 2 x 15 min onder te dompelen in een Coplin-pot gevuld met 100% xyleen. Rehydrateer de secties met gesorteerde ethanolreeksen: 100% tweemaal, 70%, 50% (verdund in type II water), ~5 min elk, gevolgd door 2 x 5 min in water.
  3. Etikettering van immunofluorescentie
    1. Bereid 100 mM natriumcitraat (CiNa) stockoplossing door 29,4 g natriumcitraattrinatriumzoutdihydraat (C6H, 5 Na,3, O7,2H,2O) toe te voegen aan 1 l water van type II; pas de pH aan tot 6 met zoutzuur (HCl). Steriliseer door middel van autoclaveren en bewaar enkele maanden bij kamertemperatuur. Bereid de ontmaskeringsoplossing op het moment van gebruik door 25 ml 100 mM CiNa-voorraadoplossing toe te voegen aan 225 ml type II-water. Voeg 125 μL Tween-20 toe en meng goed (eindconcentratie is 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
    2. Bereid Hoechst stockoplossing in een dosis van 10 mg/ml door 100 mg bisBenzimide H 33258 toe te voegen aan 10 ml water type I. Bewaar deze stockoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie. Bereid de Hoechst-oplossing in een verhouding van 7,5 μg/ml door 300 μl Hoechst-stockoplossing toe te voegen aan 400 ml 1x PBS.
      NOTITIE: Deze oplossing kan tot 10 keer worden gebruikt en ongeveer 6 maanden worden bewaard bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
    3. Voer na het ontwaxen van secties antigeenextractie uit door de secties gedurende 9 minuten in de ontmaskeringsoplossing te koken. Laat de oplossing 20 minuten afkoelen.
    4. Spoel één keer in type II water en één keer in 1x PBS. Leg de objectglaasjes plat in een vochtige kamer en voeg 400-600 μL blokkeringsoplossing per glaasje toe (antilichaamverdunningsmiddel + 0,2% Triton X100) gedurende 30 min.
    5. Vervang de blokkerende oplossing door 200 μL per glaasje van het primaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing. Gebruik een dekglaasje om de oplossing over de secties te verdelen, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer een nacht bij 4 °C in een vochtige kamer.
    6. Doe de glaasjes in een Coplin-pot en spoel ze 3 x 10 min in 1x PBS aangevuld met 0,1 % Triton X100. Leg de objectglaasjes plat, voeg 400 μL per glaasje van het secundaire antilichaam verdund in blokkeringsoplossing toe en laat 2 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer staan.
    7. Breng de glaasjes over in een Coplin-pot en spoel ze 3 x 5 min met 1x PBS aangevuld met 0,1% Triton X100.
    8. Celkernen 10 minuten tegenkleuren met de Hoechst-oplossing en 3 x 5 minuten spoelen met 1x PBS.
    9. Plaats dekglaasjes over de objectglaasjes in een waterig montagemedium dat speciaal is ontworpen om de fluorescentie te behouden. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze bij 4 °C.
    10. Breng de objectglaasjes in beeld met een fluorescentiemicroscoop.
  4. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) om schade aan het netvlies te beoordelen
    OPMERKING: In plaats van een bepaald celtype te labelen door middel van immunokleuring, kan de algemene histologie van het netvlies worden beoordeeld met H&E-kleuring.
    1. Voer na het verwijderen van secties nucleïnezuuretikettering uit door objectglaasjes gedurende 2 minuten onder te dompelen in hematoxyline-oplossing. Goed afspoelen met kraanwater.
    2. Voer cytoplasma-etikettering uit door objectglaasjes gedurende 1 minuut onder te dompelen in 1% eosine-oplossing. Spoel snel af met water.
      LET OP: Eosine is zeer goed oplosbaar; Als de glijbanen te lang in het water blijven liggen, verdwijnt alle kleurstof.
    3. Spoel 2 x 5 min in 100% ethanol en 2 x 5 min in xyleen.
    4. Plaats onder de motorkap dekglaasjes over de geleiders in 4-5 druppels van een montagemedium. Laat de objectglaasjes drogen onder een kap en fotografeer ze de volgende dag met een microscoop.
  5. Detectie van apoptotische cellen
    1. Volg na het ontwaxen van secties (zie rubriek 5.2.6) het protocol van de fabrikant van de kit om apoptotische DNA-fragmentatie te detecteren.
    2. Voer de kleuring van de kernen uit door objectglaasjes onder te dompelen in de Hoechst-oplossing (zie punt 5.3.8) en monteer met een waterig montagemedium dat speciaal is ontworpen om de fluorescentie te behouden. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze bij 4 °C.
    3. Breng de objectglaasjes in beeld met een fluorescentiemicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mechanisch netvliesletsel
Retinale secties van kikkervisjes die onderhevig zijn aan de mechanische verwonding beschreven in protocolsectie 1 tonen aan dat de retinale laesie alle lagen van het weefsel omvat, terwijl het beperkt blijft tot de punctieplaats (Figuur 2A,B).

Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem
De ogen van verdoofde Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes die werden behandeld met MTZ-behandeling, zoals beschreven in protocolsectie 2, werden geanalyseerd onder de stereomicroscoop (Figuur 3A,B). De afname van GFP-fluorescentie toont de progressieve gerichte ablatie van staafcellen in vergelijking met de controles (Figuur 3B), bevestigd op netvliescoupes door GFP-immunokleuring, zoals beschreven in protocolsectie 5 (Figuur 3C).

Rodopsine-degeneratie door CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out
Netvliezen van rho crispant kikkervisjes, verkregen zoals beschreven in protocol sectie 3, werden geanalyseerd zoals beschreven in protocol sectie 5 (Figuur 4A). De etikettering van Caspase 3 en Rhodopsine benadrukt dat sommige staven apoptose ondergaan (Figuur 4B). H&E-kleuring onthult een globaal behoud van nucleaire lagen, maar een ernstige verkorting van de buitenste segmenten van de fotoreceptor (Figuur 4C). Verdere immunokleuringsanalyse met fotoreceptormarkers toont de degeneratie van staafjes en daaropvolgende kegeldefecten (figuur 4D en niet getoond). Het fenotype begint zichtbaar te worden vanaf stadium 40 en de buitenste segmenten van de staafjes verdwijnen geleidelijk tot ze vanaf stadium 47 afwezig zijn op het centrale netvlies.

Degeneratie van netvliescellen door cytotoxische intraoculaire CoCl 2-injecties
Netvliezen van kikkervisjes die werden onderworpen aan CoCl2 intraoculaire injecties, zoals beschreven in protocolsectie 4, werden geanalyseerd door middel van immunokleuring en TUNEL-assay, zoals beschreven in protocolsectie 5 (Figuur 5A). Hieruit blijkt dat 10 mM CoCl2-injectie leidt tot specifieke celdood van kegelfotoreceptoren (Figuur 5B,C), terwijl 25 mM leidt tot brede celdood van het netvlies (Figuur 5E). Immunokleuringsanalyse, zoals beschreven in protocolsectie 5, onthulde verder de afwezigheid van kegeltjes in 10 mM CoCl 2-geïnjecteerde netvliezen (Figuur 5D) en een ernstig verlies van zowel bipolaire cellen als fotoreceptoren na 25 mM CoCl2-injecties (Figuur 5F).

Figure 1
Figuur 1: Illustraties van enkele experimentele procedures. (A) Een pin met een diameter van 0,2 mm die aan een pinhouder is bevestigd, wordt gebruikt om het netvlies te doorboren. De diagrammen van de dorsale, laterale en frontale aanzichten van een kikkervisje illustreren waar de pin (in rood) is ingebracht. (B) Schematische weergave van het transgene model van voorwaardelijke staafcelablatie. De rodopsinepromotor stimuleert de expressie van een GFP-nitroreductase-fusie-eiwit in staafcellen. Wanneer NTR wordt toegevoegd aan het Xenopus-kweekwater , zet het metronidazol om in een cytotoxine, met name het ablateren van GFP-NTR-staafjes. (C) De kop van een Tg(rho:GFP-NTR) transgeen kikkervisje wordt getoond in wit licht of onder fluorescentie. De GFP-kleuring in het oog maakt het sorteren van transgene kikkervisjes mogelijk. (D) Eencellige embryo's op een nylon rooster onder een stereomicroscoop, klaar om te worden geïnjecteerd met een Picospritzer-micro-injectiesysteem. (E ) Embryo's in het neurulastadium (schema in de inzet) na injectie in het eencellige stadium van het CRISPR-Cas9-ribonucleoproteïnecomplex dat fluoresceïnelysinedextran bevat. Goed geïnjecteerde fluorescerende embryo's (groene pijlen) kunnen worden onderscheiden van niet-geïnjecteerde embryo's (witte pijlen). (F) Afbeelding van de lepel die is gebruikt om de verdoofde kikkervisjes over te brengen. (G) Verdoofde kikkervisjes in een petrischaaltje boven een natte tissue. Het capillair dat in de microinjector wordt ingebracht, maakt intraoculaire injecties van de CoCl2-oplossing mogelijk. (H) Afbeelding van de overbrenging van een kikkervisje naar een tank van 1 liter waar het dier kan worden gevolgd tot het ontwaken. Schaalbalken = 2 mm (C), 1 mm (E). Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; NTR = nitroreductase; MTZ = metronidazol; NF = Nieuwkoop en Faber podium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Mechanisch netvliesletsel. (A) Overzicht van de experimentele procedure die wordt gebruikt onder (B). De ogen van Xenopus laevis kikkervisjes worden 7 dagen na het letsel doorboord en geanalyseerd op netvliescoupes. Het gestippelde vak geeft het afgebeelde gebied aan. (B) Celkernen worden tegengekleurd met Hoechst. Er worden drie verschillende netvliezen getoond. De pijlen wijzen naar de gewonde plaats die alle lagen van het netvlies doorkruist. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; GCL = ganglion cellaag; INL = binnenste kernlaag; ONL = buitenste kernlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem. (A) Overzicht van de experimentele procedure die in (B,C) wordt gebruikt. Tg(rho:GFP-NTR) transgene Xenopus laevis kikkervisjes worden gedurende 7-9 dagen behandeld met MTZ. De progressieve degeneratie van de GFP-gelabelde staafjes kan in real-time worden gevolgd onder een fluorescentie-stereomicroscoop, zoals geïllustreerd op 7 dagen in (B). Staafceldood kan ook worden geanalyseerd op netvliessecties, zoals geïllustreerd na 14 dagen in (C), het gestippelde vak dat het afgebeelde gebied aangeeft. (B) Na 7 dagen behandeling neemt de GFP-intensiteit in het netvlies met de tijd af bij transgene MTZ-behandelde kikkervisjes in vergelijking met controles. (C) De afname van GFP-fluorescentie wordt bevestigd op netvliescoupes na 14 dagen door GFP-immunokleuring. Celkernen worden in blauw gekleurd met Hoechst. Schaalbalken = 500 μm (B), 50 μm (C). Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; NTR = nitroreductase; MTZ = metronidazol; L = lens; R = netvlies; GCL = ganglion cellaag; INL = binnenste kernlaag; ONL = buitenste kernlaag; OS = buitenste segmenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Roddegeneratie in Xenopus laevis rho crispants. (A) Overzicht van de experimentele procedure die in (B-D) wordt gebruikt. Eencellige embryo's worden geïnjecteerd met het CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex (gRNA duplex/Cas9-eiwit) dat het fluorescerende lysine dextran bevat. In het neurulastadium kunnen fluorescerende geïnjecteerde embryo's worden gesorteerd en zich laten ontwikkelen tot verschillende stadia om (B) gespleten Caspase 3-immunokleuring uit te voeren voor celdoodanalyse, of (C) hematoxyline- en eosinekleuring voor anatomische analyse, of (D) immunokleuring met staafmarkers voor analyse van fotoreceptorceldegeneratie. Het gestippelde vak geeft het afgebeelde gebied aan. (B) Dubbele etikettering van gespleten Caspase 3 (een marker van apoptotische cellen) en Rhodopsine (een marker van buitenste segmenten van de staafjes) op retinale secties van controle- of rho-crispanten Xenopus laevis-embryo's in stadium 39 toont een afwezigheid van stervende cellen in de controlegroepen en dat stervende cellen in rho-crispanten staaffotoreceptoren zijn. (C) H&E-kleuring op retinale secties van rho-crispants Xenopus laevis kikkervisjes in stadium 48 onthult de verminderde grootte van de buitenste segmenten van fotoreceptoren in vergelijking met controles. (D) Recoverine (een marker van de binnenste segmenten van de staafjes) en Rhodopsine co-immunokleuring op retinale secties van rho-crispanten Xenopus laevis kikkervisjes in stadium 48 toont een ernstige degeneratie in vergelijking met controles. Celkernen worden in blauw gekleurd met Hoechst. Schaalbalken = 50 μm. Afkortingen: gRNA = gids-RNA; H&E = hematoxyline en eosine; GCL = ganglion cellaag; INL = binnenste kernlaag; ONL = buitenste kernlaag; OS = buitenste segmenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Degeneratie van netvliescellen door cytotoxische intraoculaire CoCl 2-injecties. (A) Overzicht van de experimentele procedure die in (B-F) wordt gebruikt. Het gestippelde vak geeft het afgebeelde gebied aan. Een oplossing van 10 mM of 25 mM CoCl2 wordt intraoculair in het kikkervisoog geïnjecteerd. Celapoptose wordt geanalyseerd door een TUNEL-assay 2 dagen na het letsel (dpi) (B,C,E), terwijl retinale celdegeneratie 7 tot 14 dpi wordt geanalyseerd door immunokleuring met verschillende markers (D,F). (B-D) Netvliescoupes van kikkervisjes geïnjecteerd met een zoutoplossing (controles) of met een 10 mM CoCl2-oplossing in stadia 51-54. (B) Celdoodanalyse bij 2 dpi toont de aanwezigheid van stervende cellen na injectie van CoCl2, voornamelijk in de kernlaag van de fotoreceptor. (C) Door celdoodkleuring te koppelen aan S/M Opsin (een marker van kegeltjes) immunokleuring blijkt dat deze stervende cellen voornamelijk kegeltjes zijn; Pijlen wijzen naar dubbel gelabelde cellen. (D) S/M Opsin (een marker van kegeltjes) en Rhodopsine (een marker van staafjes) co-immunokleuring onthult een ernstige afname van kegelcellabeling in CoCl2 geïnjecteerde netvliezen in vergelijking met controles bij 14 dpi. (E,F) Netvliescoupes van kikkervisjes geïnjecteerd met een 25 mM CoCl2-oplossing in stadia 51-54. (E) Celdoodanalyse bij 2 dpi onthult de aanwezigheid van stervende cellen in zowel de fotoreceptor als de binnenste kernlagen. (F) Otx2 (een marker van zowel fotoreceptoren als bipolaire cellen) immunokleuring onthult een ernstige afname van de kleuring in beide lagen in CoCl 2-geïnjecteerde netvliezen in vergelijking met controles bij 7 dpi, wat wijst op CoCl2-geïnduceerde celdood van zowel fotoreceptoren als bipolaire cellen. Celkernen worden in blauw gekleurd met Hoechst. Schaalbalken: 25 μm. Afkortingen: ONL = Outer Nuclear Layer; INL = binnenste kernlaag; GCL = Ganglion Cel Laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor- en nadelen van verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging bij Xenopus-kikkervisjes

Mechanisch netvliesletsel
Verschillende chirurgische verwondingen van het neurale netvlies zijn ontwikkeld bij Xenopus-kikkervisjes. Het neurale netvlies kan ofwel volledig worden verwijderd15,16 of slechts gedeeltelijk worden weggesneden 16,17. De hier gepresenteerde mechanische verwonding omvat geen retinale excisie, maar een eenvoudige oogpunctie die we eerder hebben ontwikkeld in Xenopus kikkervisjes6. Gezien de handmatige procedure van een dergelijk model voor mechanisch netvliesletsel, kan het fenotype aanzienlijk verschillen van het ene kikkervisje tot het andere. Bovendien kunnen de reproduceerbaarheid en de omvang van de schade ook variëren, afhankelijk van wie het experiment uitvoert. We raden daarom aan om alle letselprocedures door dezelfde persoon uit te voeren.

Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem
Het NTR-MTZ-systeem is gebruikt om staafcellen in het transgene Xenopus-netvlies 6,7,8,18 te ablateren. De duur van de MTZ-behandeling varieert aanzienlijk van onderzoek tot onderzoek, van 2 tot 7 dagen. Dit kan een weerspiegeling zijn van verschillende activiteiten van de NTR, afhankelijk van de chromosomale insertie in de verschillende transgene lijnen. Bovendien merkten we enige variabiliteit op in de respons van Tg(rho:GFP-NTR) kikkervisjes gedurende een bepaalde tijd van MTZ-behandeling, waarbij sommige ernstige staafdegeneratie ervoeren, terwijl andere zeer weinig schade vertoonden. Het verlengen van de MTZ-behandeling van 7 naar 9-10 dagen met deze transgene lijn lijkt een dergelijke variabiliteit te verminderen. Voorzichtigheid is echter geboden gezien de potentieel toxische effecten van MTZ. De voor de hand liggende voordelen van dit model zijn dat het voorwaardelijke en omkeerbare staafcelablatie mogelijk maakt en dat de degeneratie van staafjes live kan worden gevolgd.

Rodopsine-degeneratie door CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out
Het CRISPR-Cas9 rho-genbewerkingsmodel van retinitis pigmentosa leidt tot staafceldegeneratie in Xenopus kikkervisje11. In tegenstelling tot het NTR-MTZ-model is staafcelablatie echter constitutief en niet omkeerbaar. Interessant is dat de hoge efficiëntie van deze aanpak (we krijgen nu regelmatig >90% van de kikkervisjes die ernstige staafdegeneratie vertonen) het mogelijk maakt om aan dit model op de F0-generatie te werken. We werkten aanvankelijk met sgRNA, maar merkten variabiliteit op van verschillende batches RNA-preparaten. We hebben onlangs ontdekt dat het bestellen van synthetisch crRNA en tracrRNA en het bereiden van gRNA-duplex zoals beschreven in dit protocol betrouwbaardere resultaten oplevert.

Degeneratie van netvliescellen door cytotoxische intraoculaire CoCl2-injecties
Dit model heeft verschillende voordelen ten opzichte van de andere modellen die hier worden beschreven. Het maakt het niet alleen mogelijk om de ablatie van retinale celtypen voorwaardelijk te induceren, maar ook om de ernst van de schade te moduleren14. Bovendien vertegenwoordigt het, voor zover wij weten, het enige model van specifieke kegeldegeneratie in Xenopus. Ten slotte genereert het een lage variabiliteit in het degeneratieve fenotype.

Werkzaamheid van de vier paradigma's van retinale laesies
Om rekening te houden met de mogelijke variabiliteit van fenotypes van de ene partij kikkervisjes tot de andere, wordt aanbevolen om de werkzaamheid van retinale degeneratie op 8-10 kikkervisjes te controleren. In het geval van mechanisch letsel moet de schade op de dagen na het letsel worden geanalyseerd, aangezien de laesie een week later niet meer zichtbaar is. In het NTR-MTZ-model is staafdegeneratie 1 week na het einde van de MTZ-behandeling duidelijk zichtbaar. Voor rho-crispants , aangezien de celdood van de staafjes begint wanneer de fotoreceptoren volledig differentiëren, raden we aan om de degeneratieve efficiëntie vanaf stadium 45 te analyseren. In het CoCl2-model treedt celdood op binnen een week na injectie. Met betrekking tot het verwachte percentage overleving voor elke methode, willen we opmerken dat CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne complex injecties leiden tot hogere sterftecijfers in de eerste 48 uur dan conventionele RNA-injecties (er blijven geen groei- of overlevingsproblemen bestaan na deze eerste 48 uur), en daarom moeten meer embryo's worden geïnjecteerd als dat nodig is. Andere procedures (mechanische verwondingen, MTZ-behandeling of intraoculaire CoCl2-injecties ) leveren daarentegen geen overlevingsproblemen op.

Mogelijke toepassingen van deze letselparadigma's om retinale regeneratie te bestuderen
Een mogelijke toepassing van deze reeks modellen voor netvliesbeschadiging is de studie van de regeneratie van het netvlies. Verschillende bronnen van retinale stam- of stamachtige cellen kunnen worden gerekruteerd in een pathologische context, waaronder CMZ-cellen, Müller-gliacellen en RPE-cellen. We hebben gerapporteerd dat het mechanische letselmodel, het NRT/MTZ-model en het CRISPR/Cas9-model allemaal aantrekkelijke modellen zijn voor het bestuderen van Müller-celactivering bij letsel 6,11. Interessant is dat in het CoCl2-model alle drie de cellulaire bronnen kunnen worden gerekruteerd14, wat een nieuw model biedt voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de rekrutering en herprogrammering van verschillende retinale celtypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan M.P. van de Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) en UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in samenwerking met ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Tags

Modellen voor netvliesletsel xenopuskikkervisjes neurodegeneratieve ziekten van het netvlies blindheid zelfherstel M&252; ller gliacel stamcelpotentiaal regeneratief vermogen moleculaire mechanismen diermodellen zoogdier M& 252; ller-cellen Retina-regeneratie Therapeutische strategieën Regeneratieve geneeskunde Retinale letselparadigma's Mechanisch netvliesletsel Nitroreductase-gemedieerde fotoreceptor voorwaardelijke ablatie Retinitis Pigmentosa-model CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out cytotoxisch model CoCl2-injecties
Modellen voor netvliesletsel genereren bij <em>xenopus-kikkervisjes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parain, K., Donval, A., Chesneau,… More

Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter