Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65771
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay
* These authors contributed equally

Summary

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

Abstract

מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.

Introduction

מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3. למרות שתהליך זה יעיל מאוד בדגי זברה או בקסנופוס, הוא אינו יעיל במידה רבה ביונקים.

עם זאת, הוכח כי טיפולים מתאימים עם חלבונים מיטוגניים או ביטוי יתר של גורמים שונים יכולים לגרום לכניסה מחודשת של מחזור תאי גליה של יונקים, ובמקרים מסוימים, לעורראת מחויבותם לנוירוגנזה 1,2,3,4,5. עם זאת, זה עדיין לא מספיק במידה רבה לטיפולים. לפיכך, הרחבת הידע שלנו על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתחדשות נחוצה כדי לזהות מולקולות המסוגלות להפוך ביעילות תכונות תאים דמויי גזע של מולר לאסטרטגיות טיפוליות תאיות חדשות.

במטרה זו, פיתחנו מספר פרדיגמות פציעה ב - Xenopus המעוררות ניוון תאי רשתית. כאן, אנו מציגים (1) פגיעה רשתית מכנית שאינה ספציפית לסוג התא, (2) מודל אבלציה מותנה והפיך של תאים באמצעות מערכת NTR-MTZ המכוונת לתאי מוט, (3) נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה המעורר ניוון מתקדם של תאי מוט, ו-(4) CoCl2-מודל ציטוטוקסי המושרה שעל פי המינון יכול להתמקד ספציפית בקונוסים או להוביל לניוון רחב יותר של תאי הרשתית. אנו מדגישים את הייחודיות, היתרונות והחסרונות של כל פרדיגמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיים, תחת רישיון מוסדי A91272108. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים CEEA #59 וקיבלו אישור על ידי Direction Départementale de la Protection des Populations תחת מספר הסימוכין APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ו- APAFIS #21474-2019071210549691 v2. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים אלה.

1. פגיעה ברשתית מכנית

הערה: פרוטוקול פרדיגמת הפציעה המתואר כאן מורכב מניקוב רשתית מכני של ראשנים משלב 45 ואילך. לכן, הוא אינו מכוון לסוג מסוים של תאי רשתית אלא פוגע בכל עובי הרשתית באתר הניקוב.

  1. הכנת חומר הרדמה לראשנים
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10% בנזוקאין. לקבלת נפח כולל של 10 מ"ל, להוסיף 1 גרם של בנזוקאין, 2 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO), ו 8 מ"ל של פרופילן גליקול. שמור על תמיסת המלאי למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    2. הכינו תמיסת 0.005% בנזוקאין בזמן השימוש על ידי הוספת 25 μL של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין ל-50 מ"ל מים לגידול ראשנים (מי ברז מסוננים ונטולי כלור). מערבבים היטב.
      הערה: ריכוז הבנזוקאין נמוך במיוחד מכיוון שהראשנים רגישים מאוד להרדמה בהשוואה למבוגרים.
  2. הכנת סיכות
    1. חברו פין סטרילי בקוטר 0.2 מ"מ למחזיק סיכות מעוקר (איור 1A).
  3. הרדמת ראשנים
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם למיכל חדש המכיל את תמיסת הבנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים (הקשה על המיכל או מגע ישיר).
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך הזמן המושקע בתמיסת ההרדמה צריך להיות פחות מ -30 דקות.
  4. ניקוב רשתית
    1. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על צלחת פטרי קטנה (בקוטר 55 מ"מ) המכילה רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה באמצע צלחת הפטרי.
    2. תחת סטריאומיקרוסקופ, נקבו את הרשתית על-ידי החדרה עדינה של הסיכה בצד הגבי של העין, עד שהיא תעבור דרך הרשתית (איור 1A). אם יש צורך במספר חיטוטים, חזור על הליך זה במקומות שונים. לאחר ניקוב עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ב-180 מעלות כדי לנקב את עין שמאל.
    3. מעבירים את הראשנים הפגועים למיכל גדול המכיל 1 ליטר מים לגידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

2. אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ

הפרוטוקול נועד לגרום לאבלציה ספציפית של תאי מוט בקו6 המהונדס Xenopus Tg (rho:GFP-NTR), הזמין בשירות הזואוטכני של TEFOR Paris-Saclay, המארח את מרכז המשאבים הצרפתי Xenopus. המערכת הכימוגנטית הזו משתמשת ביכולת של אנזים ניטרורדוקטאז (NTR) כדי להמיר את התרופה מטרונידזול (MTZ) לחומר צילב-קישור ציטוטוקסי של דנ"א, כדי לעבד באופן ספציפי מוטות המבטאים NTR (איור 1B). שני פרוטוקולים מפורטים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) או Tg (rho:NTR) ולגרום לניוון פורסמו בעבר 7,8. כאן, אנו פשוט מפרטים את השראת ניוון הרשתית וכיצד לפקח על תהליך הניוון in vivo.

  1. הכנת פתרון metronidazole
    1. הכינו תמיסת MTZ של 10 mM בזמן השימוש על ידי המסת 1.67 גרם אבקת MTZ בבקבוק כהה ב-1 ליטר מים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO, באמצעות מוט ערבוב מגנטי ותסיסה מגנטית.
      הערה: MTZ רגיש לאור. פירוק מלא עשוי להימשך עד 10 דקות.
  2. יצירת ראשנים טרנסגניים על ידי הזדווגות טבעית מקו Tg (rho:GFP-NTR)
    הערה: מכיוון שזכרים טרנסגניים מייצגים מלאי יקר, אנו מעדיפים ליצור עוברים באמצעות הזדווגות טבעית כדי לא להקריב את הזכר ולהשתמש בו שוב ושוב.
    1. מתן הורמונים
      1. הזריקו 600 יב"ל של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עם מחטים של 25 גרם לתוך שק הלימפה הגבי של נקבות מסוג Xenopus laevis Wild. להזריק זכרים טרנסגניים עם 100-200 IU של hCG לתוך שק הלימפה הגבי. לניטור חי של ניוון מוטות (שלב 2.4), השתמש בקסנופוס לבקנים ולא בפיגמנטים, כדי לדמיין טוב יותר שינויים פלואורסצנטיים על פני העין של הראשנים הטרנסגניים שנוצרו.
        הערה: נקבות קסנופוס יכולות להיות מוקדנות עם 50 IU של hCG 1 עד 7 ימים לפני הביוץ המתוכנן, אבל זה אופציונלי.
    2. הזדווגות ואיסוף ביצים
      1. מיד לאחר הזרקת hCG, לשים במיכל אחד Tg (rho:GFP-NTR) זכר טרנסגני אחד יחד עם נקבה אחת hCG מוזרק ב 20 ° C עד למחרת. השתמשו בנפח גדול (לפחות 10 ליטר) והוסיפו חפצים קטנים כדי שהביצים יידבקו אליהם, כך שהביצים לא ייפגעו מתנועות הבוגרים. למחרת, כאשר הצפרדעים כבר לא באמפלקסוס, הוציאו את הבוגרים מהמכל ואספו עוברים.
    3. גידול עוברים וראשנים
      1. שלב עוברים וראשנים על פי הטבלה הרגילה של התפתחות קסנופוס 9.
      2. לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים. משלב 45, להאכיל ראשנים עם אבקת מזון מטגנים ולחמצן את המים עם bubbler. יש להוסיף מים מדי יום במידת הצורך כדי לפצות על האידוי ולהחליף את כל מי המיכל מדי שבוע.
        הערה: לחלופין, ניתן גם להחליף 50% מהנפח פעמיים בשבוע. פרוטוקול מפורט ניתן למצואב-10.
    4. מיון עוברים טרנסגניים
      1. משלב 37/38, מיין ובחר עוברים טרנסגניים תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הדמיה ישירה של GFP (איור 1C).
  3. טיפול MTZ ראשנים
    1. העבר ראשנים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) למיכל המכיל תמיסת MTZ של 10 mM ומאחוריהם ב 20 ° C בחושך למשך שבוע אחד. השתמשו באחים טרנסגניים שגדלו במים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO כאמצעי ביקורת.
    2. החליפו את תמיסת ה-MTZ והבקרה אחת ליומיים במהלך תקופת הטיפול. האכילו את הראשנים כרגיל במהלך טיפול MTZ.
    3. לניטור פלואורסצנטי פרטני (שלב 2.4), הניחו כל ראשנים במיכל הקטן שלו עם 30 מ"ל MTZ או פתרון בקרה משלב 2.3.1 ואילך.
      הערה: טיפול MTZ יכול להתבצע בכל עת משלב 45 ואילך.
  4. ניטור חי של ניוון מוטות
    הערה: ניתן לעקוב אחר הניוון ההדרגתי של המוטות בזמן אמת. לכן, בצע את שלבים 2.4.1. ל-2.4.4. לפני טיפול MTZ ולאחר מכן באופן קבוע לאחר הטיפול.
    1. בצע את השלבים 1.1 ו -1.3 להכנת חומר ההרדמה וההרדמה ראשנים, בהתאמה.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על רקמה רטובה בצלחת פטרי קטנה (קוטר 55 מ"מ). התבונן בפלואורסצנטיות GFP תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי (אורך גל עירור = 488 ננומטר ואורך גל פליטה = 509 ננומטר) וצלם את העין. ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות משקפת את השפלת המוטות.
      הערה: כדי לבצע השוואות כמותיות, יש לשמור על אותן הגדרות לצורך הדמיה של כל הראשנים.
    3. העבירו את הראשנים המצולמים למיכל גדול המכיל 1 ליטר של מי גידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.
    4. השווה את עוצמת הפלואורסצנטיות בין עיני ראשנים שטופלו ב- MTZ לבין עיני ראשנים בבקרה כדי לפקח ולהעריך את יעילות תהליך הניוון.

3. ניוון תאי מוט על ידי נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9

הערה: פרוטוקול זה הוקם כדי ליצור מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה ב- Xenopus laevis על ידי גרימת ניוון ספציפי של תאי מוט באמצעות נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9. % ההחדרה-מחיקה (indels) ב- F0 מסופק ב-11 והוא ~ 75%. נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9 כזה יכול להתבצע גם בראשנים של Xenopus tropicalis 11.

  1. הכנת פתרונות וריאגנטים
    1. הזמנת crRNA ו-tracrRNA
      1. קנה את ה- CRISPR RNA הסינתטי (crRNA) המכוון לגן רודופסין (rho) ול- crRNA הטרנסאקטיבי הסטנדרטי (tracrRNA). ה-crRNA מורכב מאזור ספציפי למטרה של rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ואזור נוסף (GUUUUAGAGCUAUGCU) שעובר הכלאה ל-tracrRNA.
    2. crRNA:דופלקס tracrRNA (דופלקס rho gRNA)
      1. השהה מחדש את crRNA ואת tracrRNA ב- 100 מיקרומטר במאגר הדו-צדדי נטול הנוקלאז.
      2. הכן את דופלקס gRNA על ידי ערבוב 3 μL של 100 μM rho crRNA, 3 μL של 100 μM tracrRNA, ו 94 μL של חיץ דופלקס. הריכוזים הסופיים הם 36 ng/μL rho crRNA, ו-67 ng/μL tracrRNA.
      3. אנקו את האוליגוס על ידי חימום שלהם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ומקררים אותם לאט לטמפרטורת החדר. הפוך aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    3. קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (כלומר, חלבון דופלקס gRNA/Cas9)
      1. בזמן השימוש, להכין את התערובת של דופלקס gRNA rho ואת חלבון Cas9. עבור 20 μL, הוסף 10 μL של תמיסת דופלקס rho gRNA, 2 μL של חלבון Cas9 (מלאי ב 5 מ"ג / מ"ל), 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (מלאי ב 10 מ"ג / מ"ל), ו 6 μL של מים ללא RNase.
      2. כדי ליצור את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין, יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ולתת לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
      3. לקבלת 20 μL של תמיסת הבקרה, לערבב 2 μL של חלבון Cas9, 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן, ו 16 μL של מים ללא RNase.
    4. הכנת פתרונות MBS 10x, 1x ו- 0.1x
      1. הכינו את תמיסת מלאי המלח של Barth שונה (10x MBS) על ידי הוספת 11.92 גרם HEPES, 51.43 גרם נתרן כלורי (NaCl), 0.75 גרם אשלגן כלורי (KCl), 2.1 גרם סודיום ביקרבונט (NaHCO3), ו-2.46 גרם מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4, 7 H2O) ב-800 מ"ל מים מסוג II. כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם 30% נתרן הידרוקסידי (NaOH). מוסיפים מים מסוג II עד שהנפח הוא 1 L ומעקרים על ידי autoclaving. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      2. הכינו 1 ליטר של תמיסת 1x MBS על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת מלח 10x MBS ו-7 מ"ל של 0.1 מ"ל סידן כלורי דיהידרט (CaCl 2, 2H2O) במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      3. הכן פתרון 0.1x MBS על ידי דילול תמיסת 1x MBS במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. פתרון בנזוקאין למבוגרים
      1. הכינו תמיסת 0.05% בנזוקאין על ידי הוספת 5 מ"ל של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין (ראה שלב 1.1.1.) לליטר אחד של מים לגידול ראשנים. מערבבים היטב.
        הערה: שמור תמיסה זו למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. הביאו את התמיסה לטמפרטורת החדר לפני השימוש על בעלי חיים.
    6. תמיסת L-ציסטאין
      1. הכן את תמיסת dejellying בזמן השימוש על ידי הוספת 2 גרם של מונוהידראט הידרוכלורי L-ציסטאין ל 100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. כוונן את רמת החומציות ל-7.8 עם 30% NaOH.
    7. תמיסת פוליסוכרוז
      1. הכינו את תמיסת הרב-סוכרוז הצפופה על ידי הוספת 3 גרם רב-סוכרוז ל-100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. אחסן פתרון זה למשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4°C.
  2. הפריה חוץ גופית ו dejellying
    הערה: פרטים נוספים על הפריה חוץ גופית של Xenopus ניתן למצוא בפרוטוקול ייעודי מפורטב-12.
    1. מתן הורמונים לנקבות Xenopus laevis לגרימת ביוץ
      1. כ-15 שעות לפני קצירת הביציות, יש להזריק 600 יחב"ל של hCG לשק הלימפה הגבי של הנקבה ולשמור אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 18°C.
    2. דיסקציה של האשכים
      1. הרדימו את זכר הקסנופוס במינון קטלני של 0.05% תמיסת בנזוקאין למשך 10-15 דקות. כשיטת המתת חסד משלימה, יש לחתוך את עמוד השדרה מיד אחורית לגולגולת בעזרת מספריים חדים וחזקים. פתחו את חלל הבטן בעזרת מספריים לדיסקציה, גזרו את האשכים החוצה וקצצו את כל השומן והנימים המחוברים. מניחים כל אשך מיד על קרח ב 1 מ"ל של 1x MBS.
    3. הכנת זרע
      1. מרסקים אשך אחד באמצעות מזיק לצינורות מיקרוצנטריפוגות ומדללים את המתלה בצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של 1x MBS. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין לצינור האשכים השני ושמור אותו על 4 ° C למשך כמה ימים לניסויי הפריה נוספים.
    4. הפריה חוץ גופית
      1. עסו בעדינות את גב הנקבה המוזרקת בהורמונים ואספו את הביציות בצלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ). מורחים כמה טיפות מתמיסת הזרע על הביציות. המתן 5 דקות וכסה אותם עם 0.1x MBS. המתן 10 דקות לפני שתמשיך עם dejellying.
    5. דג'לינג ביציות מופרות
      1. החלף את תמיסת 0.1x MBS בתמיסת dejellying כדי להסיר את ציפוי הג'לי מהביצים המופרות (~ 5 דקות). שטפו היטב את העוברים 5-6 פעמים עם 0.1x MBS והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ מלאה ב-0.1x MBS.
  3. הכנת מערכת המיקרו-הזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה13.
    2. מלאו נימים מושחזים ב-2-10 מיקרוליטר של קומפלקס ריבונוקלפרוטאין CRISPR-Cas9 או בתמיסת הבקרה באמצעות קצה מיקרו-מטעין והכניסו את הנימים למטפל במיקרו-מזרק.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (~400 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 10 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה לסביבות 40 PSI.
  4. מיקרו-הזרקה של עובר בשלב חד-תאי עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9
    1. הניחו עוברים חד-תאיים על רשת (רקמת ניילון בקוטר 1 מ"מ) מודבקים בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ מלאה בתמיסת רב-סוכרוז 3% (איור 1D).
    2. באמצעות המיקרו-מזרק ותחת סטריאומיקרוסקופ, הזריקו 10 nL של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (המתאים ל-500 pg של דופלקס gRNA + 5 ng של חלבון Cas9 לעובר) או תמיסת בקרה ברמת קוטב החי, באזור קליפת המוח, ממש מתחת לקרום הציטופלזמי.
      הערה: פלואורסצאין ליזין דקסטרן הכלול בתמיסה מאפשר מיון לאחר מכן של העוברים המוזרקים.
    3. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה תמיסת פוליסוקרוז נקייה ומניחים אותם בטמפרטורה של 21°C.
    4. ביום הראשון, מיין באופן קבוע את העוברים המפותחים היטב והחלף את תמיסת הרב-סוכרוז ב- 0.1x MBS כ- 5 שעות לאחר מיקרו-הזרקה.
    5. המתינו 24 שעות לאחר ההזרקה כדי למיין ולבחור עוברים פריכים של rho שהוזרקו היטב תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי על-ידי הדמיה של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (איור 1E).
      הערה: ככל שהמיקרו-הזרקה לאחר ההפריה מוקדמת יותר, כך הנוקאאוט יעיל יותר.
  5. גידול עוברים וראשנים
    1. יש לגדל עוברים פריכים של רו ב-0.1x MBS בצלחות פטרי עד לשלב 37/38. הסר עוברים מתים מדי יום ושנה את תמיסת 0.1x MBS. משלב 37/38 יש לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים, ומשלב 45 להמשיך כמו בשלב 2.2.3.

4. ניוון תאי רשתית על ידי זריקות CoCl 2 תוך עיניות ציטוטוקסיות

הערה: פרוטוקול זה נקבע כדי לגרום לניוון תאי רשתית על ידי הזרקות תוך עיניות של קובלט כלוריד (CoCl2) בראשנים של Xenopus laevis . על פי המינון, זה יכול לעורר ניוון ספציפי חרוט או ניוון רחב יותר14. אנו משתמשים בפרוטוקול זה בראשנים מסוג Xenopus laevis מגיל 48 ואילך. ניתן להשתמש בו גם בראשנים מסוג Xenopus tropicalis .

  1. הכנת חיץ וריאגנטים
    1. הכינו תמיסת בנזוקאין 0.005% בזמן השימוש כמו בשלב 1.1.
    2. הכן תמיסת מלאי CoCl2 של 100 מ"מ על ידי הוספת 118.5 מ"ג עד 5 מ"ל של 0.1x MBS (ראה שלב 3.1.4 להכנת 0.1x MBS). שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
      אזהרה: CoCl2 מסווג כתרכובת רעילה לחיי אדם ובעלי חיים. בצע בקפידה את ההוראות לטיפול, אחסון וסילוק פסולת בגיליון נתוני הבטיחות.
    3. עבור ניוון ספציפי לחרוט, הכן פתרון CoCl2 של 10 mM בזמן השימוש מתמיסת מלאי של 100 mM המדוללת ב- 0.1x MBS. לניוון רחב יותר של תאי הרשתית, הכינו תמיסת CoCl2 של 25 mM.
  2. הכנת מערכת ההזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה 13.
    2. מלא נימים מושחזים עם 2-10 μL של 10 או 25 mM תמיסת CoCl2 או פתרון הבקרה (0.1x MBS) באמצעות קצה microloader והנח את הנימים לתוך המטפל microinjector.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (כ-100 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 15-40 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה ל~40 PSI.
      הערה: יש להתאים את גודל הטיפה לשלב הראשנים ולגודל העין שלהם. לדוגמה, בשלבים 48-49, גודל הטיפה הוא ~ 15-20 nL, בעוד שהוא 30-40 nL בשלבים 52-56. מבחינה ויזואלית, גודל הטיפה מעט גדול יותר מגודל העדשה.
  3. CoCl2 הזרקות תוך עיניות
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם ל 50 מ"ל של תמיסת בנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים.
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך זמן ההרדמה צריך להיות פחות מ-30 דקות.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות בכלי פטרי קטן (קוטר 55 מ"מ) המכיל רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה במרכז צלחת הפטרי (איור 1F,G).
    3. השתמש במיקרו-מזרק תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להזריק תוך עינית את תמיסת CoCl2 . הכנס בעדינות את הנימים לעין מעל העדשה. כאשר קצה הנימים נמצא בתוך העין, יש להוציא שתי טיפות לכל עין. לאחר הזרקת עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ידנית ב-180 מעלות כדי להזריק לעין שמאל.
      הערה: יש לוודא כי ההזרקה נעשית בתוך העין, כך שיש לראות נפיחות קלה של העין לאחר כל פליטה של התמיסה. הראשנים צריכים להישאר מחוץ למים כמה שפחות. ההזרקה של שתי העיניים צריכה לקחת פחות מ 1 דקה.
    4. העבירו את הראשנים המוזרקים למכל גדול שמכיל 1 ליטר של מים לגידול על-ידי טבילתם בזהירות בצלחת הפטרי (איור 1H). עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

5. צביעה להערכת נזק ברשתית או ניוון רשתית

  1. קיבוע ראשנים והתייבשות
    1. הכן תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת PFA 32% ל-700 מ"ל של PBS אחד. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaOH. Aliquot פתרון מלאי זה ולשמר אותו במשך מספר חודשים ב -20 ° C.
    2. הרדימו את הראשנים ב-0.01% בנזוקאין והעבירו אותם לבקבוקון המכיל 4% PFA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה או לילה ב-4°C. יש לשטוף 3 x 5 דקות ב-PBS אחד.
    3. מייבשים בהדרגה ראשנים על ידי דגירות רצופות של 30 דקות באתנול 70% ו-95% אתנול (מדולל במים מסוג II), ולאחר מכן שלוש דגירות נוספות של שעה אחת באתנול 100%. אחסנו את ראשי הראשנים בשלב זה בטמפרטורה של -20°C או העבירו אותם ישירות ל-100% בוטנול למשך הלילה לצעדים נוספים.
  2. חתך פרפין
    1. החליפו 100% בוטנול בפרפין מומס למשך שעתיים ב-62°C. החלף את הפרפין במשך 2 x 2 שעות של דגירות נוספות ב 62 ° C.
    2. מעבירים את ראשי הראשנים בתבניות הטבעה חד פעמיות של פרפין ומכוונים אותם כך שעיניהם מיושרות היטב, ואז מאפשרים לפרפין להתקשות. אחסנו את הבלוקים בטמפרטורת החדר.
    3. חתכו את עודפי הפרפין והרכיבו את הבלוק עם הראשנים המוטבעים על תמיכת המיקרוטום.
    4. חותכים את הבלוק עם מיקרוטום בעובי המתאים (10-12 מיקרומטר). העבירו את הסרטים עם מקטעים בשקופית שכוסה בעבר באלבומין גליצרין 3% (מדולל במים).
    5. הניחו את המגלשה על מגלשה חמה יותר בטמפרטורה של 42°C למשך מספר דקות ולאחר מכן הסירו את עודפי אלבומין הגליצרין. תנו למגלשות להתייבש לילה בתנור ב-37°C.
    6. ניתן לטבול את המגלשות במשך 2X15 דקות בצנצנת קופלין מלאה ב-100% קסילן. התייבשו מחדש את החלקים עם סדרת אתנול מדורגת: 100% פעמיים, 70%, 50% (מדולל במים מסוג II), ~ 5 דקות כל אחד, ואחריו 2 x 5 דקות במים.
  3. תיוג Immunofluorescence
    1. הכן תמיסת מלאי נתרן ציטראט (CiNa) של 100 מ"מ על ידי הוספת 29.4 גרם של נתרן ציטראט מלח טריסודיום דיהידרט (C6H5Na3O7, 2H2O) ל 1 ליטר של מים מסוג II; כוונן את ה- pH ל- 6 עם חומצה הידרוכלורית (HCl). יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. הכן את פתרון הסרת המסיכה בזמן השימוש על ידי הוספת 25 מ"ל של 100 מ"ל תמיסת מלאי CiNa ל 225 מ"ל של מים מסוג II. מוסיפים 125 μL של Tween-20 ומערבבים היטב (הריכוז הסופי הוא 10 mM CiNa, 0.05% Tween-20).
    2. הכן תמיסת מלאי Hoechst ב 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 100 מ"ג של bisBenzimide H 33258 ל 10 מ"ל של מים מסוג I. שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום. הכן את תמיסת Hoechst ב-7.5 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Hoechst ל-400 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: ניתן להשתמש בתמיסה זו עד 10 פעמים ולשמר אותה למשך כ-6 חודשים בטמפרטורה של 4°C, כשהיא מוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    3. לאחר הסרת החלקים יש לבצע שליפת אנטיגן על ידי הרתחת החלקים בתמיסת הסרת המסכה למשך 9 דקות. תנו לתמיסה להתקרר במשך 20 דקות.
    4. יש לשטוף פעם אחת במים מסוג II ופעם אחת ב-1x PBS. הניחו את המגלשות שטוחות בתא לח והוסיפו 400-600 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שקופית (דילול נוגדנים + 0.2% טריטון X100) למשך 30 דקות.
    5. החלף את פתרון החסימה ב- 200 μL לכל שקופית של הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת החסימה. השתמש ב- coverslip כדי לפזר את התמיסה על פני המקטעים, הימנעות היווצרות בועות. יש לדגור למשך הלילה ב-4 °C (75 °F) בתא לח.
    6. מעבירים את המגלשות לצנצנת Coplin ושוטפים במשך 3 x 10 דקות ב-1x PBS בתוספת 0.1% Triton X100. הניחו את המגלשות שטוחות, הוסיפו 400 מיקרוליטר לכל שקופית של הנוגדן המשני המדולל בתמיסת חסימה, והשאירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא לח.
    7. העבירו את המגלשות לצנצנת Coplin ושטפו במשך 3 x 5 דקות עם PBS אחד בתוספת 0.1% Triton X100.
    8. גרעיני תאים נגד כתמים עם תמיסת Hoechst למשך 10 דקות ושטפו 3 x 5 דקות עם 1x PBS.
    9. הניחו את הכיסויים מעל מגלשות באמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    10. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. צביעת Hematoxylin ו-eosin (H&E) להערכת נזק לרשתית
    הערה: במקום לתייג סוג תא מסוים על ידי immunostaining, היסטולוגיה רשתית כללית ניתן להעריך עם צבע H&E.
    1. לאחר הסרת השעווה, יש לבצע תיוג חומצות גרעין על ידי טבילת שקופיות בתמיסת המטוקסילין למשך 2 דקות. יש לשטוף היטב במי ברז.
    2. בצע תיוג ציטופלסמה על ידי טבילת שקופיות בתמיסת eosin 1% למשך דקה אחת. יש לשטוף במהירות במים.
      הערה: אאוסין מסיס מאוד; אם המגלשות נשארות זמן רב מדי במים, כל הצבע נעלם.
    3. יש לשטוף 2 x 5 דקות באתנול 100% ו-2 x 5 דקות בקסילן.
    4. מתחת למכסה המנוע, הניחו את הכיסויים מעל המגלשות ב-4-5 טיפות של מדיום הרכבה. תנו לשקופיות להתייבש מתחת למכסה המנוע ודמיינו למחרת עם מיקרוסקופ.
  5. איתור תאים אפופטוטיים
    1. לאחר הסרת שעווה (ראה סעיף 5.2.6), פעל לפי פרוטוקול יצרן הערכה כדי לזהות פיצול DNA אפופטוטי.
    2. בצע צביעת גרעינים על ידי טבילת שקופיות בתמיסת Hoechst (ראה סעיף 5.3.8) והרכבה עם אמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    3. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פגיעה מכנית ברשתית
קטעי רשתית של ראשנים הנתונים לפגיעה המכנית המתוארת בפרוטוקול סעיף 1 מראים שהנגע ברשתית מקיף את כל שכבות הרקמה תוך שהוא נשאר מוגבל לאתר הניקוב (איור 2A,B).

אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ
העיניים של ראשנים טרנסגניים מורדמים Tg (rho:GFP-NTR) שטופלו בטיפול MTZ, כמתואר בסעיף 2 של פרוטוקול, נותחו תחת הסטריאומיקרוסקופ (איור 3A,B). הירידה בפלואורסצנטיות GFP חושפת אבלציה מתקדמת ממוקדת של תאי מוט בהשוואה לבקרות (איור 3B), שאושרה על מקטעי רשתית על-ידי GFP immunostaining, כמתואר בסעיף 5 של פרוטוקול (איור 3C).

ניוון תאי מוט על ידי נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9
רשתיות של ראשנים פריכים מסוג rho , שהתקבלו כמתואר בסעיף 3 של פרוטוקול, נותחו כמתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול (איור 4A). תיוג קספז 3 ורודופסין מדגיש שחלק מהמוטות עוברים אפופטוזיס (איור 4B). צביעת H&E חושפת שימור גלובלי של שכבות גרעיניות, אך קיצור חמור של מקטעים חיצוניים של קולטני אור (איור 4C). ניתוח נוסף של אימונוסטיין עם סמנים פוטורצפטורים מראה את התנוונות המוטות ואת פגמי החרוט הבאים (איור 4D ולא מוצג). הפנוטיפ מתחיל להיראות משלב 40 ואילך, והחלקים החיצוניים של המוטות נעלמים בהדרגה עד שהם נעדרים מהרשתית המרכזית משלב 47.

ניוון תאי רשתית על ידי זריקות CoCl 2 תוך עיניות ציטוטוקסיות
רשתיות של ראשנים שעברו זריקות תוך-עיניות של CoCl2, כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול, נותחו על-ידי immunostaining ו-TUNEL assay, כמתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול (איור 5A). זה מגלה שהזרקת CoCl2 של 10 מילימטר מובילה למוות תאי ספציפי של פוטורצפטורים של חרוט (איור 5B,C), בעוד ש-25 מילימטר מובילה למוות רחב של תאי רשתית (איור 5E). ניתוח אימונוסטיינג, כפי שמתואר בסעיף 5 של פרוטוקול, חשף גם היעדר מדוכים ברשתית 10 mM CoCl 2 (איור 5D) ואובדן חמור של תאים דו-קוטביים וקולטני אור לאחר זריקות CoCl2 של 25 מילימטר (איור 5F).

Figure 1
איור 1: איורים של כמה הליכים ניסיוניים. (A) סיכה בקוטר 0.2 מ"מ המחוברת למחזיק סיכות משמשת לניקוב הרשתית. התרשימים של התצוגה הגבית, הצידית והקדמית של ראשנים ממחישים היכן מוכנסת הסיכה (באדום). (B) ייצוג סכמטי של המודל המהונדס של אבלציה מותנית של תאי מוט. מקדם רודופסין מניע את הביטוי של חלבון היתוך GFP-Nitroreductase בתאי מוט. כאשר מוסיפים אותו למים המגדלים של Xenopus , NTR ממיר מטרונידזול לציטוטוטוקסין, במיוחד מוטות GFP-NTR. (C ) ראשו של ראשן טרנסגני Tg (rho:GFP-NTR) מוצג באור לבן או תחת פלואורסצנטיות. צביעת GFP בעין מאפשרת מיון ראשנים טרנסגניים. (D) עוברים בשלב חד-תאי על רשת ניילון תחת סטריאומיקרוסקופ המוכנים להזרקה עם מערכת מיקרו-הזרקה של פיקושפריצר. (E ) עוברים בשלב הנוירולה (סכמטי בהתחלה) לאחר הזרקה בשלב תא אחד של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 המכיל פלואורסצאין ליזין דקסטרן. ניתן להבדיל בין עוברים פלואורסצנטיים מוזרקים היטב (חיצים ירוקים) לבין עוברים חד-פעמיים (חיצים לבנים). (F) תמונה המציגה את הכפית המשמשת להעברת הראשנים המורדמים. (G) ראשנים מורדמים בצלוחית פטרי מעל רקמה רטובה. הנימים המוחדרים למזרק המיקרו מאפשרים הזרקות תוך עיניות של תמיסת CoCl2 . (H) תמונה המראה את העברת הראשנים לתוך מכל 1 ליטר שבו ניתן לעקוב אחר בעל החיים עד להתעוררות. פסי קנה מידה = 2 מ"מ (C), 1 מ"מ (E). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; NTR = nitroreductase; MTZ = metronidazole; NF = שלב ניוקופ ופבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פגיעה מכנית ברשתית. (א) מתווה ההליך הניסיוני הנהוג ב-(ב). עיני ראשנים של Xenopus laevis מנוקבות ומנותחות על חלקי הרשתית 7 ימים לאחר הפציעה. התיבה המנוקדת מציינת את האזור המצולם. (B) גרעיני התא מוכתמים ב-Hoechst. מוצגות שלוש רשתיות שונות. החיצים מצביעים על המקום הפגוע החוצה את כל שכבות הרשתית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: dpi = ימים לאחר פציעה; GCL = שכבת תאי גנגליון; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ. (א) מתווה ההליך הניסיוני המשמש ב-(ב,ג). Tg(rho:GFP-NTR) ראשנים טרנסגניים Xenopus laevis מטופלים עם MTZ במשך 7-9 ימים. ניתן לנטר את הניוון המתקדם של המוטות המסומנים ב-GFP בזמן אמת תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שמודגם ב-7 ימים ב-(B). ניתן לנתח מוות של תאי מוט גם על קטעי רשתית כפי שמודגם לאחר 14 יום ב-(C), התיבה המנוקדת המציינת את האזור המצולם. (B) לאחר 7 ימי טיפול, עוצמת ה-GFP ברשתית יורדת עם הזמן בראשנים טרנסגניים שטופלו ב-MTZ בהשוואה לקבוצת הביקורת. (C) הירידה בפלואורסצנטיות GFP מאושרת במקטעי הרשתית לאחר 14 יום על ידי GFP immunostaining. גרעיני התא מוכתמים בכחול עם Hoechst. מוטות קנה מידה = 500 מיקרומטר (B), 50 מיקרומטר (C). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; NTR = nitroreductase; MTZ = metronidazole; L = עדשה; R = רשתית; GCL = שכבת תאי גנגליון; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; OS = מקטעים חיצוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניוון מוטות ב-Xenopus laevis rho crispants. (א) מתווה ההליך הניסויי הנהוג ב-(ב-ד). לעוברים בשלב חד-תאי מוזרק קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (חלבון gRNA דופלקס/Cas9) המכיל ליזין דקסטרן פלואורסצנטי. בשלב הנוירולה, ניתן למיין עוברים מוזרקים פלואורסצנטיים ולאפשר להם להתפתח עד לשלבים שונים כדי לבצע (B) קספזה 3 שסע עבור ניתוח מוות תאי, או (C) צביעת hematoxylin ו eosin לניתוח אנטומי, או (D) immunostaining עם סמני מוט עבור ניתוח ניוון תאים photoreceptor. התיבה המנוקדת מציינת את האזור המצולם. (B) תיוג כפול של קספז 3 (סמן של תאים אפופטוטיים) ורודופסין (סמן של מקטעים חיצוניים של מוט) על קטעי בקרה ברשתית או קריספי רו עוברי Xenopus laevis בשלב 39 מראה היעדר תאים גוססים בקבוצת הביקורת, ושתאים גוססים בקריספי רו הם פוטורצפטורים. (C) צביעת H&E על קטעי רשתית של ראשנים מסוג rho crispants Xenopus laevis בשלב 48 חושפת את הגודל המופחת של המקטעים החיצוניים של קולטני האור בהשוואה לבקרות. (D ) Recoverin (סמן של מקטעים פנימיים של מוטות) ו-Rhodopsin co-immunostaining על קטעי רשתית של rho crispants ראשנים Xenopus laevis בשלב 48 מגלה ניוון חמור בהשוואה לבקרות. גרעיני התא מוכתמים בכחול עם Hoechst. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: gRNA = RNA מנחה; H&E = hematoxylin ו eosin; GCL = שכבת תאי גנגליון; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; OS = מקטעים חיצוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניוון תאי רשתית על-ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות ציטוטוקסיות. (A) מתווה ההליך הניסויי המשמש ב-(B-F). התיבה המנוקדת מציינת את האזור המצולם. תמיסה של 10 mM או 25 mM CoCl2 מוזרקת תוך עינית לעין הראשנים. אפופטוזיס של תאים מנותח על ידי בדיקת טונל יומיים לאחר הפציעה (DPI) (B,C,E), בעוד ניוון תאי הרשתית מנותח 7 עד 14 dpi על ידי immunostaining עם סמנים שונים (D,F). (ב-ד) קטעי רשתית של ראשנים מוזרקים עם תמיסת מלח (Controls) או עם תמיסת CoCl2 10 mM בשלבים 51-54. (B) ניתוח מוות תאי ב-2 dpi מגלה נוכחות של תאים גוססים לאחר הזרקת CoCl2 בעיקר בשכבה הגרעינית של קולטני האור. (C) צימוד צביעת מוות של תאים עם S/M Opsin (סמן של מדוכים) immunostaining מגלה כי תאים גוססים אלה הם בעיקר מדוכים; החצים מצביעים על תאים בעלי תווית כפולה. (D) S/M Opsin (סמן של מדוכים) ו-Rhodopsin (סמן של מוטות) Co-immunostaining מגלה ירידה חמורה של תיוג תאי חרוט ברשתית מוזרק CoCl2 בהשוואה לבקרות ב 14 dpi. (ה,ו) קטעי רשתית של ראשנים מוזרקים עם תמיסת CoCl2 25 mM בשלבים 51-54. (E) ניתוח מוות תאי ברזולוציה של 2 dpi מגלה את נוכחותם של תאים גוססים הן בפוטורצפטור והן בשכבות הגרעין הפנימיות. (F) Otx2 (סמן הן של פוטורצפטורים והן של תאים דו-קוטביים) מראה ירידה חמורה של הכתמים בשתי השכבות ברשתית המוזרקת CoCl 2 בהשוואה לקבוצת ביקורת ב-7 dpi, מה שמצביע על מוות תאי המושרה על ידי CoCl2 הן של פוטורצפטורים והן של תאים דו-קוטביים. גרעיני התא מוכתמים בכחול עם Hoechst. פסי קנה מידה: 25 מיקרומטר. קיצורים: ONL = שכבה גרעינית חיצונית; INL = שכבה גרעינית פנימית; GCL = שכבת תא גנגליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס

פגיעה מכנית ברשתית
פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית 16,17. הפגיעה המכנית המוצגת כאן אינה כרוכה בכריתת רשתית אלא ניקוב עין פשוט שפיתחנו בעבר בראשנים מסוג Xenopus 6. בהתחשב בהליך הידני של מודל פגיעה ברשתית מכני כזה, הפנוטיפ עשוי להשתנות באופן משמעותי מראשן אחד למשנהו. יתר על כן, יכולת השכפול והיקף הנזק עשויים להשתנות גם בהתאם למי שמבצע את הניסוי. לכן, אנו ממליצים לאותו אדם לבצע את כל הליכי הפציעה.

אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ
מערכת NTR-MTZ שימשה לעיבוד תאי מוט ברשתית הקסנופוס המהונדסת 6,7,8,18. משך הטיפול ב- MTZ משתנה באופן משמעותי ממחקר אחד למשנהו, בין 2 ל -7 ימים. זה עשוי לשקף פעילויות שונות של NTR בהתאם להחדרה הכרומוזומלית בקווים הטרנסגניים השונים. יתר על כן, שמנו לב לשונות מסוימת בתגובה של ראשנים Tg(rho:GFP-NTR) למשך זמן נתון של טיפול MTZ, כאשר חלקם חוו ניוון מוטות חמור בעוד שאחרים הציגו נזק קטן מאוד. הארכת הטיפול MTZ מ 7 ל 9-10 ימים עם קו מהונדס זה נראה להפחית שונות כזו. עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות בהתחשב בהשפעות הרעילות הפוטנציאליות של MTZ. היתרונות הברורים של מודל זה הם שהוא מאפשר אבלציה מותנית והפיכה של תאי מוט ולניטור חי של ניוון מוט.

ניוון תאי מוט על ידי נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9
מודל עריכת הגנים CRISPR-Cas9 rho של רטיניטיס פיגמנטוזה מוביל לניוון תאי מוט בראשנים מסוג Xenopus 11. עם זאת, בניגוד למודל NTR-MTZ, אבלציה של תאי מוט היא מכוננת ואינה הפיכה. מעניין לציין כי היעילות הגבוהה של גישה זו (כיום אנו משיגים באופן קבוע >90% מהראשנים המציגים ניוון מוטות חמור) מאפשרת לעבוד על מודל זה בדור F0. בתחילה עבדנו עם sgRNA אבל שמנו לב לשונות מאצוות שונות של תכשירי RNA. לאחרונה מצאנו כי הזמנת crRNA סינתטי ו-tracrRNA והכנת דופלקס gRNA כמתואר בפרוטוקול זה מספקים תוצאות אמינות יותר.

ניוון תאי רשתית על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות ציטוטוקסיות
למודל זה מספר יתרונות על פני הדגמים האחרים המתוארים כאן. זה מאפשר לא רק לגרום אבלציה של סוגי תאי רשתית מותנה, אלא גם לווסת את חומרת הנזק14. יתר על כן, הוא מייצג למיטב ידיעתנו את המודל היחיד של ניוון חרוט ספציפי בקסנופוס. לבסוף, הוא יוצר שונות נמוכה בפנוטיפ הניווני.

יעילות ארבע פרדיגמות הנגע ברשתית
כדי לקחת בחשבון את השונות הפוטנציאלית של פנוטיפים מאצווה אחת של ראשנים לאחרת, מומלץ לבדוק את היעילות של ניוון הרשתית על 8-10 ראשנים. במקרה של פגיעה מכנית, יש לנתח את הנזק בימים שלאחר הפגיעה, שכן הנגע כבר אינו נראה כעבור שבוע. במודל NTR-MTZ, ניוון מוטות נראה בבירור שבוע לאחר סיום הטיפול ב- MTZ. עבור קריספי רו , כאשר מוות של תאי מוט מתחיל כאשר הפוטורצפטורים מתמיינים באופן מלא, אנו ממליצים לנתח יעילות ניוונית משלב 45 ואילך. במודל CoCl2 , מוות תאי מתרחש תוך שבוע מרגע ההזרקה. באשר לאחוזי ההישרדות הצפויים בכל שיטה, ברצוננו לציין כי זריקות קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 מובילות לשיעורי תמותה גבוהים יותר ב-48 השעות הראשונות מאשר זריקות RNA קונבנציונליות (אין בעיות גדילה או הישרדות נמשכות לאחר 48 השעות הראשונות), ולכן יש להזריק יותר עוברים לפי הצורך. לעומת זאת, הליכים אחרים (פציעות מכניות, טיפול MTZ או זריקות CoCl2 תוך עיניות) אינם מהווים בעיות הישרדות.

יישומים פוטנציאליים של פרדיגמות פציעה אלה לחקר התחדשות הרשתית
יישום פוטנציאלי אחד של סדרה זו של מודלים של פגיעה ברשתית הוא המחקר של התחדשות הרשתית. ניתן לגייס מקורות שונים של גזע רשתית או תאים דמויי גזע בהקשר פתולוגי, כולל תאי CMZ, תאי גליה מולר ותאי RPE. דיווחנו כי מודל הפציעה המכנית, מודל NRT/MTZ ומודל CRISPR/Cas9, הם כולם מודלים אטרקטיביים לחקר הפעלת תאי מולר בעת פציעה 6,11. באופן מעניין, במודל CoCl2 ניתן לגייס את כל שלושת המקורות התאיים14, מה שמספק מודל חדשני לחקר המנגנונים העומדים בבסיס הגיוס והתכנות מחדש של סוגי תאי רשתית שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Tags

מודלים של פגיעות ברשתית ראשנים של קסנופוס מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית עיוורון תיקון עצמי M&252; תא גליה פוטנציאל תאי גזע יכולת רגנרטיבית מנגנונים מולקולריים מודלים של בעלי חיים M&252 של יונקים; תאי לר התחדשות הרשתית אסטרטגיות טיפוליות רפואה רגנרטיבית פרדיגמות של פגיעה ברשתית פגיעה מכנית ברשתית אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז מודל רטיניטיס פיגמנטוזה נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9 מודל ציטוטוקסי זריקות CoCl2
יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של <em>קסנופוס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parain, K., Donval, A., Chesneau,… More

Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter