Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utvikling og anvendelse av biofysiske analyser for evaluering av ternær kompleksdannelse indusert av proteolyse rettet mot kimærer (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

Her beskriver vi protokoller for biofysisk karakterisering av ternær kompleksdannelse indusert av proteolyse rettet mot kimærer (PROTACS) som involverer ubiquitinligasene Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) og Cereblon (CRBN). Biofysiske metoder illustrert her inkluderer overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser og proteiner målrettet for nedbrytning kan induseres til å danne komplekser av heterobifunksjonelle molekyler i en flertrinnsprosess. Kinetikken og termodynamikken til de involverte interaksjonene bidrar til effektiviteten av ubiquitinering og resulterende nedbrytning av proteinet. Biofysiske teknikker som overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) gir verdifull informasjon som kan brukes til optimalisering av disse interaksjonene. Ved hjelp av to modellsystemer ble det etablert et biofysisk analyseverktøy for å forstå kooperativiteten til ternær kompleksdannelse og virkningen av "krokeffekten" på bindingskinetikken. I ett tilfelle ble en proteolyse rettet mot kimærer (PROTAC) molekyl som induserte ternær kompleksdannelse mellom Brd4BD2 og VHL evaluert. Det heterobifunksjonelle molekylet, MZ1, har nM-affiniteter for både Brd4BD2-proteinet (SPR K D = 1 NM, ITC K D = 4 nM) og VHL-komplekset (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). For dette systemet ble det utviklet robuste SPR-, BLI- og ITC-analyser som reproduserte publiserte resultater som demonstrerte kooperativiteten til ternær kompleksdannelse. I det andre tilfellet ble et molekyl som induserte ternære komplekser mellom et 46,0 kDa protein, PPM1D og cereblon [CRBN (319-442)] studert. Det heterobifunksjonelle molekylet, BRD-5110, har en SPRK D = 1 nM for PPM1D, men mye svakere binding mot det avkortede CRBN (319-442) komplekset (SPR KD = ~ 3 μM). I så fall var bindingen for CRBN i SPR ikke mettet, noe som resulterte i en "krokeffekt". Gjennomstrømnings- og reagenskrav for SPR, BLI og ITC ble evaluert, og generelle anbefalinger for deres anvendelse på PROTAC-prosjekter ble gitt.

Introduction

Polyubiquitinering av proteiner i cellen er en tett regulert prosess som involverer enzymer i Ubiquitin Ligase-familien 1,2. De terminale enzymene i banen er E3 ubiquitin-ligasene som kovalent fester ubiquitinmolekyler til deres proteinbindende partnere3. Polyubiquitinering av disse proteinbindende partnerne retter seg mot dem for proteolytisk nedbrytning av proteasomet4. Dette systemet er en del av proteinhomeostaseprosessen som har blitt terapeutisk utnyttet for å indusere nedbrytning av proteiner involvert i sykdom5. Små molekyler som induserer samspillet mellom E3 ubiquitin ligaser, slik som Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) eller cereblon (CRBN), er vanligvis sammensatt av et E3 ligasebindende stridshode forbundet med en fleksibel linker til et stridshode som binder seg til proteinet som er målrettet for nedbrytning. Disse heterobifunksjonelle molekylene blir ofte referert til som proteolyse rettet mot kimærer eller PROTACS6.

Utviklingen av PROTACS innebærer å evaluere molekylers evne til å indusere nedbrytning av proteiner i celler. Mange cellulære analysesystemer er utviklet som overvåker den induserte interaksjonen mellom målproteinet og E3-ligasekomponentene, slik som VHL eller CRBN, ved behandling av cellene med et PROTAC-molekyl. En slik cellulær analyse, nanoluc-Halotag-systemet7, involverer en E3-ligase smeltet til Halotag-akseptoren og et målprotein merket med en nanoluc-donor. Ternær kompleksdannelse bringer nanoluc-donoren og Halotag-akseptoren i nærheten, noe som tillater overføring av energi fra giveren til akseptoren, noe som resulterer i utslipp av lys. Variasjoner av dette systemet kan brukes til å vurdere den cellulære permeabiliteten til PROTACS-molekyler8 eller endringer i det relative nivået av målprotein ubiquitinering9. Selv om disse cellulære systemene er avgjørende for å drive optimaliseringen av PROTACS, er dannelsen av komplekser mellom E3-ligaser og proteiner målrettet for nedbrytning en flertrinnsprosess10,11. Kinetikken og termodynamikken til de involverte binære og ternære interaksjonene bidrar til effektivitet ubiquitinering og resulterende nedbrytning av proteinet12,13,14.

Her beskrives protokoller som kan tilpasses for biofysisk karakterisering av ternær kompleksdannelse indusert av PROTACS ved bruk av overflateplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). SPR og ITC protokoller for MZ1 PROTAC molekylet som induserer ternær kompleksdannelse mellom Brd4BD2 og VHL avledet fra litteratur rapporter13,15 og beskrevet her var i stand til å rekapitulere de rapporterte resultatene med noen modifikasjoner av de rapporterte prosedyrene, som vil bli diskutert. En beskrivelse av en BLI-analyse brukt til å evaluere ternær kompleksdannelse mellom MZI, Brd4BD2 og VHL er inkludert i denne rapporten. Affinitetsmålinger fra BLI var konsistente med de som ble observert i SPR og ITC. En tidligere publisert protokoll der en SPR-analyse ble utviklet for å vurdere den PROTAC-induserte ternære kompleksdannelsen mellom PPM1D, en Ser / Thr proteinfosfatase hvis uttrykk er indusert på en p53-avhengig måte16, og CRBN er også beskrevet. I dette tilfellet har PROTAC-molekylet en nanomolar affinitet for PPM1D, men bare en mikromolar affinitet for CRBN. I dette tilfellet er bindingen av PROTAC-molekylet til CRBN ikke mettet, noe som resulterer i den ofte observerte "krokeffekten". Krokeffekten er en egenskap ved tre kroppssystemer der det er to arter som kan danne et heterotrimerisk kompleks når begge er bundet til et bromolekyl (figur 1)17. Krokeffekten observeres når broarten er i overkonsentrasjon i forhold til de to andre artene. Den resulterende tilstanden er en der de binære interaksjonene utkonkurrerer de ternære interaksjonene. Systemene der krokeffekten observeres krever spesifikke eksperimentelle designhensyn som diskuteres i denne rapporten. Generelle konsepter og reagenskrav for evaluering av bruken av biofysiske analyser for evaluering av PROTAC-indusert ternær kompleksdannelse er gitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle proteinene ble overuttrykt i E.coli med godt utbytte og renhet (>80%) etter litteraturprotokollene18. Biotinylering ble utført ved hjelp av en BirA-katalysert reaksjon18. Alle små molekyler ble fremstilt ved 1 mM stamløsninger i 100% DMSO. Prosedyrene beskrevet her krever ikke spesialisert laboratoriesikkerhetsutstyr eller forholdsregler. Standard personlig verneutstyr for laboratorier (PPE) skal brukes (dvs. laboratoriefrakk, vernebriller og hansker).

Proteiner anvendt i denne studien er oppført nedenfor:
VHL: biotinylert VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112)-kompleks med Avi-tag ved C-terminalen av ElonginB.
Brd4BD2: Ikke-merket Brd4BD2 (333-460)
CRBN: biotinylert CRBN (319-442) med Avi-tag på N-terminalen
PPM1D: ikke-merket eller dobbel His8-merket PPM1D (1-420) på N terminalen

Små molekyler anvendt i denne studien er oppført nedenfor:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC som binder seg til VHL og Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~ 3 μM, binder seg ikke tilPPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~ 3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): binder seg ikke til CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM

1. Metode 1: ITC (isotermisk titreringskalorimetri)

MERK: Titreringer utføres ved hjelp av et mikrokalorimeter med automatisk injeksjon.

  1. Bufferpreparasjon: Forbered 3 liter buffer inneholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Dialyse: Dialyser VHL og Brd4BD2 (~ 500 μL ved 150 μM hver) mot 1 liter av bufferen tilberedt i trinn 1,1, 3 ganger ved 4 °C, i henholdsvis 4 timer, 2 timer og ca. 16 timer. Lagre bufferen etter siste dialyse for bruk i påfølgende trinn.
  3. Forbered prøver på en 96-brønnplate med plastdeksel.
    1. For hver titrering, lag 400 μL oppløsning for cellen, 125 μL for sprøyten og 400 mikrol buffer for rengjøring. Legg prøver til tre påfølgende brønner på platen. Siden sammensatt lager fremstilles ved 1 mM i 100% DMSO, tilsett samme prosentandel DMSO til proteinløsningene for å sikre matchende buffer i cellen og sprøyten. Legg til 2% DMSO til de endelige løsningene.
      1. Prøve for titrering av VHL til MZ1: Klargjør celleoppløsning inneholdende 392 μL buffer, 4 μL MZ1 ved 1 mM (10 μM sluttkonsentrasjon) og 4 μL 100 % DMSO. Klargjør en sprøyteoppløsning som inneholder 122,5 mikrol VHL ved 85,7 μM, 2,5 mikrol 100 % DMSO (84 μM endelig konsentrasjon).
      2. Prøver for titrering av VHL i bufferen (data vil bli brukt til bakgrunnssubtraksjon av data generert fra prøve 1.3.1.1): Forbered celleoppløsning inneholdende 392 μL buffer, 8 μL 100% DMSO. Klargjør en sprøyteoppløsning inneholdende 122,5 mikrol VHL ved 85,7 μM (84 μM endelig konsentrasjon) og tilsett 2,5 μL 100 % DMSO.
      3. Prøver for titrering av VHL i MZ1 og Brd4 BD2: Klargjør celleoppløsning inneholdende 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM endelig konsentrasjon), 3,36 μL MZ1 ved 1 mM (8,4 μM endelig konsentrasjon) og 4,64 μL 100 % DMSO. Klargjør en sprøyteoppløsning som inneholder 122,5 mikrol VHL ved 85,7 μM (84 μM endelig konsentrasjon) og 2,5 mikrol 100 % DMSO.
      4. Prøver for titrering av VHL i Brd4 BD2 (bakgrunn av 1.3.1.3): Klargjør celleoppløsning inneholdende 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM endelig konsentrasjon) og 8 μL 100 % DMSO. Klargjør en sprøyteoppløsning som inneholder 122,5 mikrol VHL ved 85,7 μM (84 μM endelig konsentrasjon) og 2,5 mikrol 100 % DMSO.
  4. Kjør alle fire titreringene på mikrokalorimeteret. Hver består av 19 injeksjoner med 2 μL sprøyteoppløsning med en hastighet på 2 μL/s med 120 s tidsintervaller. Gjør en første injeksjon av protein (0,4 μL) og kast det under dataanalysen. Utfør alle eksperimenter ved 25 °C, mens du rører ved 600 o / min.
  5. Dataanalyse: Tilpass dataene til en enkeltbindingsstedsmodell for å oppnå støkiometri (n), dissosiasjonskonstanten (KD) og bindingentalpi (ΔH) ved hjelp av analyseprogramvaren levert av produsenten (figur 2).

2. Metode 2: BLI (biolags interferometri)

  1. Utfør BLI-eksperimenter med streptavidin (SA) belagte sensorer ved romtemperatur (RT) med en innsamlingshastighet på 5 Hz. Under det automatiserte BLI-eksperimentet, sørg for at sensorene er stasjonære i en enkelt kolonne og flytt mellom forskjellige kolonner i en 96-brønn, flat bunn, svart plate med et maksimalt brønnvolum på 392 μL. Fyll hver brønn på platen som ble brukt i forsøket med 200 μL løsning.
    MERK: BLI er bare nyttig for å oppdage protein-protein-interaksjoner (dvs. ternær kompleksdannelse). Det er ikke følsomt nok til å oppdage interaksjoner mellom proteiner og små molekyler.
    1. Bufferpreparasjon: Forbered 100 ml buffer inneholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Optimalisering for immobiliseringstrinnet: Sett testsensoren i 1-3 nm, som anbefalt av produsenten. En belastning på ~ 1,0 nm brukes til prosedyrene beskrevet her. For å oppnå dette, dypp sensoren i en oppløsning som inneholder VHL ved 1,5 μg/ml i 80 s.
    3. Utfør BLI-kinetiske målinger ved å bruke syv SA-sensorer ved hjelp av følgende sekvens:
      1. For den første basisfasen, dypp i buffer i 60 s.
      2. For immobiliseringsfasen, dypp inn i en løsning av VHL ved 1,5 μg / ml i 80 s.
      3. For den andre basisfasen, dypp i buffer i 60 s.
      4. For assosiasjonsfasen, dypp i oppløsning av en fast konsentrasjon av Brd4BD2 ved 2 μM, fast konsentrasjon av DMSO ved 2% og varierende konsentrasjoner av MZ1 ved 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM og 0 nM (referansesensor) i 300 s.
      5. For dissosiasjonsfasen, dypp i buffer i 600 s.
    4. Utfør dataanalyse ved hjelp av produsentens programvare. k on, koff og KD er rapportert for datatilpasning (figur 3).

3. Metode 3: SPR (overflateplasmonresonans)

MERK: Alle SPR-eksperimenter utføres ved hjelp av streptavidin (SA) belagte sensorbrikker på RT. Selv om NTA-brikken brukes til deteksjon mellom protein og små molekyler, skal den brukes med forsiktighet når den påføres det ternære komplekset, da en mye høyere bakgrunn enn SA-brikken observeres, muligens på grunn av elektrostatiske interaksjoner mellom den ladede chipoverflaten og protein i analytten.

  1. SPR for VHL-MZ1-interaksjon
    1. Buffer forberedelse.
      1. Forbered en 1 l buffer inneholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7.5, og før den gjennom en 0,2 μm filterenhet.
      2. Fjern 20 ml buffer for fremtidig bruk (DMSO-fri buffer) og fyll på med 20 ml DMSO (2% DMSO i den endelige løpende bufferen). Hold DMSO på 2% i alle prøvene beskrevet nedenfor (trinn 3.1 og 3.2)
    2. Aktiver SA-brikken etter produsentens protokoll og immobiliser VHL til ~2000 RU (injiser proteinoppløsning på 5 μg / ml ved 5 μL / min).
    3. Forbered MZ1 i en 3-fold, 8-punkts seriell fortynning med toppkonsentrasjonen ved 10 μM på en 384-brønn, konisk bunn, gjennomsiktig, polypropylenplate med et maksimalt volum på 130 μL. Dekk platen med selvklebende, gjennomsiktige plastfolier som er kompatible med polypropylenmikroplater.
      1. Forbered toppkonsentrasjonen med DMSO-fri buffer for å sikre 2% DMSO ved den endelige konsentrasjonen. Til 147 μL DMSO-fri buffer, tilsett 1,5 μL MZ1-lager ved 1 mM og 1,5 μL 100 % DMSO.
      2. Klargjør den 3 ganger serielle fortynningen med løpebufferen som inneholder 2 % DMSO. Til 100 μL av løpebufferen, tilsett 50 μL oppløsning ved den øverste konsentrasjonen fremstilt i trinn 3.1.3.1, og bland godt for å forberede den 2. høyeste konsentrasjonen.
      3. Overfør deretter 50 μL av løsningen fremstilt i trinn 3.1.3.2 til neste 100 μL løpende buffer, bland godt for å forberede den 3. høyeste konsentrasjonen, og så videre.
    4. Kjør SPR ved hjelp av flersyklusoppsettet: Modus: Høy ytelse; kontakt tid: 120 s; dissosiasjonstid: 300 s; strømningshastighet: 50 μL/min.
    5. Utfør dataanalyse ved hjelp av evalueringsprogramvaren levert av instrumentprodusenten. Steady-state analyse indikerte KD = 26 (± 3) nM og Rmax på ~ 91% (± 5%) binding oppnådd (figur 4A)
  2. SPR for VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks
    1. Klargjør bufferen som beskrevet i trinn 3.1.1.
    2. Aktiver SA-brikken etter produsentens protokoll og immobiliser VHL til ~100 RU. Injiser en proteinoppløsning på 0,5 μg/ml VHL med en strømningshastighet på 5 μL/min og kontakttid mellom 1-5 minutter til en overflatetetthet på ~100 RU er nådd.
    3. Forbered prøver for to 5 ganger, 5-punkts enkeltsyklusinjeksjoner i en 96-brønn, klar, polystyren, rund bunnplate med et maksimalt volum på 323 μL og dekk den med selvklebende, gjennomsiktige plastfolie som er kompatible med polystyrenmikroplater som beskrevet i trinn 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Negativ kontroll: analytt inneholder kun Brd4BD2 .
        1. Forbered toppkonsentrasjonen ved 25 μM i løpende buffer med et volum på 200 μL (#A5)
        2. Legg til 160 μL hver Brd4BD2 ved 2 μM i løpebufferen til de neste 4 brønnene til venstre (#A1-A4)
        3. Overfør 40 μL A5 til A4. Bland godt.
        4. Overfør 40 μL A4 til A3. Bland godt. Fortsett å gjøre det til A1.
      2. Ternær kompleksdannelse: analytt inneholder MZ1 og Brd4BD2.
        1. Forbered toppkonsentrasjonen ved å tilsette 4 μL MZ1 ved 20 μM i 100%-DMSO-oppløsning til 196 μL inneholdende 25,5 μM Brd4BD2 i DMSO-fri buffer (#B5). De endelige konsentrasjonene er 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 og 2% DMSO.
        2. Legg til 160 μL hver av Brd4BD2 ved 2 μM i løpebufferen til de neste 4 brønnene til venstre (#B1-B4)
        3. Overfør 40 μL B5 til B4. Bland godt.
        4. Overfør 40 μL B4 til B3. Bland godt. Fortsett å gjøre det til B1.
    4. Kjør SPR ved hjelp av enkeltsyklusoppsettet: Kontakttid: 100 s; dissosiasjonstid: 720 s; strømningshastighet: 50 μL/min. Påfør tre injeksjoner med buffer før hver prøve for å sikre en stabil bakgrunn.
    5. Dataanalyse: Bruk den tredje injeksjonen av bufferen som bakgrunn for subtraksjon. Som den negative kontrollen, når MZ1 ikke er til stede, er SPR-responsen mellom VHL og Brd4BD2 ubetydelig. Når MZ1 er til stede, indikerer kinetisk tilpasning interaksjonen mellom VHL og MZ1-Brd4BD2-komplekset har k på = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, kav = 0,014 s-1 og KD = 1 nM. (Figur 4B)
  3. SPR for CRBN og småmolekylære interaksjoner
    1. Buffer forberedelse.
      1. Forbered en 1 l buffer som inneholder 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, og før den gjennom en0,2 μm filterenhet.
      2. Fjern 20 ml buffer og fyll på 20 ml 100% DMSO (2% DMSO i den endelige løpende bufferen). Det er viktig å holde DMSO på 2% i alle prøvene beskrevet nedenfor (trinn 3.3, 3.4 og 3.5).
    2. Aktiver SA-brikken etter produsentens protokoll og immobiliser CRBN til ~800 RU.
    3. Forbered forbindelser i 3-fold, 6-pt seriell fortynning på en 384-brønnplate med en toppkonsentrasjon på 30 μM som beskrevet i 3.1.3.
    4. Kjør SPR ved hjelp av flersyklusoppsettet: Modus: Høy ytelse, kontakttid: 60 s, dissosiasjonstid: 90 s; strømningshastighet: 50 μL/min. For dette systemet er tre bufferinjeksjoner tilstrekkelig til å oppnå en stabil bakgrunn. For andre analysesystemer kan det være nødvendig å utføre ytterligere bufferinjeksjoner.
    5. Utfør dataanalyse ved hjelp av produsentens programvare.
      MERK: Steady-state analyse indikerer KD av BRD-2512 og BRD-5110 er begge rundt 3 μM. Imidlertid nådde bindingen bare ~ 70% Rmaks binding ved toppkonsentrasjonen. Både svak affinitet og formen på sensorgrammet indikerer at det er sannsynlig at sammensatt uløselighet ved høye konsentrasjoner vil skje. Dermed kan den faktiske KD være høyere enn 3 μM. BRD-4761, som ikke binder seg til CRBN, ble inkludert som en negativ kontroll.
  4. SPR for PPM1D og små molekylære interaksjoner
    1. Forbered buffer som beskrevet i trinn 3.3.1. Bruk en sensorbrikke for nitriloeddiksyre (NTA).
    2. Bruk enkeltsyklus fordi PPM1D-stridshodet har en langsom k på og kav. Regenerer NTA-brikken ved hjelp av produsentens standardoppsett og immobiliser PPM1D til ~ 1000 RU etter hver sammensatt injeksjon (injiser proteinoppløsning på 5 μg / ml ved 5 μL / min).
    3. Fremstill forbindelser i 3-fold, 5-punkts seriell fortynning med toppkonsentrasjonen ved 400 nM som beskrevet i 3.1.3.
    4. Kjør SPR ved hjelp av enkeltsyklusoppsettet: Modus: høy ytelse; kontakt tid: 90 s; dissosiasjonstid: 600 s; strømningshastighet: 50 μL/min. Påfør tre injeksjoner av buffer før hver forbindelse for å sikre en stabil bakgrunn.
    5. Dataanalyse. Bruk den tredje injeksjonen av bufferen som bakgrunn for subtraksjon. Som den negative kontrollen viser BRD-2512 ikke binding til PPM1D. For BRD-4761 og BRD-5110 indikerte kinetisk montering KD for begge å være 1-2 nM.
  5. SPR for CRBN:PROTAC: PPM1D ternærkompleks
    1. Forbered buffer som beskrevet i trinn 3.3.1.
    2. Aktiver SA-brikken etter produsentens protokoll og immobiliser CRBN til ~35 RU (injiser en proteinoppløsning på 0,5 μg / ml ved 5 μL / min).
    3. Forbered tre forbindelser i 3 ganger, 6-punkts seriell fortynning med en toppkonsentrasjon på 30 μM mens du holder [PPM1D] ved 1 μM i alle prøver, inkludert emner, ved hjelp av metoden beskrevet i trinn 3.2.3.
    4. Kjør SPR ved hjelp av flersyklusoppsettet: Modus: Høy ytelse; kontakt tid: 60 s; dissosiasjonstid: 90 s; strømningshastighet: 50 μL/min.
    5. Utfør dataanalyse ved hjelp av produsentens programvare.
      MERK: Mens BRD-2512 og BRD-4761 viser ingen/ubetydelig respons, viser BRD-5110 tydelig "krokeffekten" ved steady state med rask av/på-kinetikk (figur 5A-C). Den eksperimentelle bindingsresponsen fra BRD-5110 (figur 5C) er mellom den predikerte responsen fra simuleringen når man antar at K D (CRBN, cpd) er 3 eller 10 μM (figur 5E), noe som tyder på at den ternære K D og binære K D er svært like. Det er ingen tilsynelatende kooperativitet av PPM1D: BRD-5110: CRBN-kompleksdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering av VHL: MZ1 binært kompleks og VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks finnes i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) og figur 4 (SPR) ved hjelp av en veldig lik buffer. KD ekstrahert fra ortogonale analyser er konsistent. Kooperativiteten kan beregnes med K D (binær) / KD (ternær), som er svært positiv (15 fra ITC eller 26 fra SPR).

Karakterisering av CRBN:PROTAC: PPM1D-systemet ble utført av SPR (figur 5A-D). CRBN ble immobilisert til ~ 35 RU for å lette observasjonen av ternær kompleksdannelse. Bindingen av PROTAC alene resulterte i et signal på <2 RU som er under støyen. PPM1D i analytten gir et høyt bakgrunnssignal på SA-brikkeoverflaten, og den høyeste konsentrasjonen som kan påføres er rundt 1 μM. Denne verdien er lavere enn KD mellom CRBN og stridshodet ≥3 μM), og dermed forventes "krokeffekt". SPR er følsom nok til å oppdage det, noe som stemmer godt overens med simuleringen (figur 5E). Simuleringen ble gjort ved hjelp av ikke-kooperative likevekter i litteratur19 kombinert med den klassiske SPR-beregningen [Responsemax = (Response Ligand ×Mass Immobilization)/MassLigand]. Siden KD mellom CRBN og forbindelsen ikke er nøyaktig bestemt på grunn av uoppløseligheten av forbindelsen ved høy konsentrasjon, ble simulering gjort ved bruk av fire antagende KD: 1 μM, 3 μM, 10 μM eller 30 μM. De eksperimentelle resultatene falt mellom de simulerte 3 μM og 10 μM kurvene, som er nesten identisk med KD i det binære systemet, noe som tyder på at det ikke er noen kooperativitet.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av tre bindingsscenarier og definisjon av ulikeKD-er. (A) Klassiske tokomponentsystemer. (B) Trekomponentsystem der den ene enden av PROTAC kan bli mettet, slik at den kan evalueres som et tokomponentsystem. (C) Trekomponentsystem der "krokeffekten" observeres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: ITC-resultater. Titrering av VHL til MZ1 (venstre) eller MZ1:Brd4BD2-kompleks (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: BLI-resultater. MZ1 formidler dannelsen av VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks. (A) Rådata. (B) Subtraksjon av bakgrunnssignaler der [MZ1] = 0. (C) Kinetisk tilpasning av B for å trekke ut k på, kav og KD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SPR-resultater . (A) MZ1 binding til VHL. (B) MZ1: Brd4BD2 binær kompleks binding til VHL. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: SPR-resultater som viser "krokeffekten" av en representativ PPM1D-PROTAC. CRBN ble immobilisert på SA-brikkeoverflaten mens [PPM1D] ble holdt på 1 μM i analytten for alle tilfeller. (A) BRD-2512, en forbindelse som bare binder seg til CRBN, gir nesten ingen respons. (B) BRD-4761, en forbindelse som bare binder seg til PPM1D, gir heller ingen respons. (C,D) BRD-5110, en PROTAC med stridshodet til CRBN i BRD-2512 og stridshodet til PPM1D i BRD-4761, induserte dannelsen av det ternære komplekset. (E) En simulering av SPR-resultater forutsatt at KD mellom CRBN og forbindelse er 1 μM (svart), 3 μM (blå), 10 μM (rød) eller 30 μM (grønn). BRD-2512-kurven er mellom 3 μM og 10 μM, som er svært nær den målte binæreK D, noe som tyder på ingen kooperativitet (kooperativitet = 1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofysisk karakterisering av binære og ternære interaksjoner mellom PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere kan gi unik og komplementær innsikt i forhold til mye brukte cellulære systemer. Å forstå affiniteten mellom hvert stridshode i et PROTAC-molekyl og dets proteinbindende partnere kan bidra til å veilede medisinsk kjemiinnsats mot optimalisering av disse interaksjonene. Tidligere publiserte krystallstrukturer av ternære PROTAC-komplekser har avslørt at atomer i linkerregionen kan danne interaksjoner med en eller begge proteinbindingspartnerne16,20. Eksperimentell bestemmelse av kooperativiteten til ternær kompleksdannelse kan støtte linkeroptimalisering.

Beskrevet i denne rapporten er bruken av tre forskjellige biofysiske teknikker som kan gi informasjon om bindingsaffinitetene mellom PROTAC-molekyler og deres proteinbindingspartnere. Metode 1 beskriver det eksperimentelle oppsettet for isotermisk titreringskalorimetri (ITC) for PROTAC-molekylet, MZ1, VHL E3-ligasekomplekset og Brd4BD2-bromdomenet. ITC-resultater visteKD-er på 59 nM for den binære interaksjonen mellom MZ1 og VHL og 4 nM for den ternære interaksjonen mellom VHL og ferdigblandet MZ1 og Brd4BD2. Affinitetene var konsistente med de som ble observert i SPR (immobilisert VHL-binding til MZ1 K D = 26 nM, immobilisert VHL-binding til ferdigblandet MZ1 og Brd4BD2 KD = 1 nM) og BLI (KD = 2,8 nM). Mens ITCK D-resultatene for VHL-binding til MZ1 er konsistente med rapporterte verdier16, er støkiometrien som oppnås forskjellig. En mulig forklaring på dette resultatet er den dårlige løseligheten av MZ1 i den HEPES-baserte bufferen som brukes i protokollen beskrevet her, mens resultatene fra litteraturen ble generert ved hjelp av en Bis-tris-basert buffer. Forfatterne foretrakk å bruke de samme bufferkomponentene på tvers av SPR, ITC og BLI.

Metode 2 beskriver det eksperimentelle oppsettet for BLI-analysen av samspillet mellom immobilisert VHL, en fast konsentrasjon av Brd4BD2 og varierende konsentrasjoner av MZ1. På grunn av sensitivitetsbegrensningene til teknikken kunne K,D, kpå og kav-verdier for ternær kompleksdannelse genereres, men ikke for den binære interaksjonen mellom MZ1 og proteinene.

Metode 3 beskriver flere SPR-analyser. SPR er mer følsom enn BLI og kan brukes til å observere både protein-lite molekyl (binær) og protein-protein (ternær) interaksjoner. I sistnevnte tilfelle bør bakgrunnssignaler overvåkes nøye, da protein i analytten kan gi høye og ustabile signaler. SPR er svært følsom for reagenser med høy brytningsindeks, inkludert DMSO, glyserol og vaskemidler. Hvis proteinet er lagret i bufferen som inneholder glyserol eller vaskemiddel, må løpebufferen inneholde tilsvarende konsentrasjoner av disse komponentene. Alternativt fjerner bruk av størrelsesekskluderingskromatografi dem helt før et SPR-eksperiment. Det bør utvises forsiktighet for å matche DMSO-konsentrasjonene mellom buffer- og analyttprøver nøye. DMSO-løsningsmiddelkorreksjoner utføres i henhold til produsentens instruksjoner.

Metoden i trinn 3.1 beskriver SPR-analysen for den binære VHL-MZ1-interaksjonen. Metode 3.2 beskriver SPR-analysen for VHL: MZ1: Brd4 BD2 ternærkompleks hvor VHL er immobilisert, og analytten er enten Brd4 BD2 alene eller MZ1: Brd4BD2-komplekset. I dette systemet er samspillet mellom Brd4BD2 og VHL ubetydelig. Den ternære kompleksdannelsen er svært samarbeidsvillig (ɑ = 26). Off-rate for ternær kompleksdannelse er 0, 014 s-1, som krever bruk av enkeltsykluskinetikk. Resultater fra ITC viser også en svært samarbeidende ternær kompleksdannelse (ɑ=15). SPR-metoder i trinn 3.3, 3.4 og 3.5 beskriver analyser for å evaluere dannelsen av et kompleks mellom CRBN og PPM1D indusert av tilstedeværelsen av et PROTAC-molekyl, BRD-5110. PROTAC-molekylet har en svak affinitet for CRBN (K, D ~ 3 μM) og en sterk affinitet for PPM1D (K,D = 1-2 nM). Som et resultat er den svake bindingen til CRBN ikke mettet og resulterer i en observert "krok-effekt". Selv om det er mulig å øke ligandløseligheten ved å øke DMSO-konsentrasjonen som brukes i forsøket, er det i slike tilfeller viktig å nøye overvåke proteinstabilitet som kan påvirkes negativt av høye konsentrasjoner av DMSO. I tillegg har DMSO en høy oppløsningsvarme som kan skjule varmen ved binding av ligander til protein. Det må utvises forsiktighet for å tilpasse DMSO-konsentrasjonene av oppløsningen i sprøyten og oppløsningen i cellen. Forfatterne anbefaler dialyse av de to løsningene mot samme bufferpreparat.

Generelle anbefalinger og retningslinjer er gitt basert på forsøkene som er utført og rapportert her. Når affiniteten til binære interaksjoner mellom PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere er sterke (KD < 1 μM), gir SPR pålitelige og reproduserbare affiniteter sammen med verdifull informasjon om kooperativiteten til dannelse av ternære komplekser. Når affinitetene til den binære interaksjonen mellom en av proteinbindingspartnerne og PROTAC-molekylet er svake (KD > 1 μM), må analyseoppsettet endres. I slike tilfeller kan bruken av molekylære simuleringer der bindingskonstantene er faste, og konsentrasjonene av ligand og analytt varieres, være verdifulle for å veilede analysedesign og tolke eksperimentelle resultater. ITC-analyser gir viktig informasjon om bindingens støkiometri, men krever signifikant flere protein- og forbindelsesreagenser i forhold til SPR og BLI. I tillegg kan løseligheten av PROTAC-molekylet være begrensende for ITC-eksperimenter. BLI har høyere gjennomstrømning enn ITC og krever mindre protein og sammensatte reagenser. På grunn av følsomhetsbegrensninger kan BLI imidlertid bare brukes til å vurdere dannelsen av det ternære komplekset og ikke binære interaksjoner mellom PROTAC-molekyler og deres proteinbindingspartnere. Det anbefales at SPR brukes til rutinemessig testing av både binære og ternære PROTAC-bindingsanalyser og BLI- og ITC-analyser som brukes til ortogonal validering av resultater fra SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en innovasjons- og teknologiutviklingspris fra Center for the Development of Therapeutics ved Broad Institute of MIT og Harvard. Forfatterne takker medlemmene av toppledelsen og granskningskomiteen for deres støtte til dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Utvikling og anvendelse av biofysiske analyser for evaluering av ternær kompleksdannelse indusert av proteolyse rettet mot kimærer (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter