Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn. Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

Abstract

E3-ligases en eiwitten die voor afbraak zijn bestemd, kunnen door heterobifunctionele moleculen in een meerstapsproces worden geïnduceerd om complexen te vormen. De kinetiek en thermodynamica van de betrokken interacties dragen bij aan de efficiëntie van ubiquitinatie en de daaruit voortvloeiende afbraak van het eiwit. Biofysische technieken zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) leveren waardevolle informatie op die kan worden gebruikt bij de optimalisatie van die interacties. Met behulp van twee modelsystemen werd een biofysische testtoolkit opgesteld voor het begrijpen van de coöperatie van ternaire complexvorming en de impact van het 'haakeffect' op de bindingkinetiek. In één geval werd een proteolyse-gericht op chimaera-molecuul (PROTAC) geëvalueerd dat de vorming van ternaire complexen tussen Brd4BD2 en VHL induceerde. Het heterobifunctionele molecuul, MZ1, heeft nM-affiniteiten voor zowel het Brd4BD2-eiwit (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) als het VHL-complex (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Voor dit systeem werden robuuste SPR-, BLI- en ITC-assays ontwikkeld die gepubliceerde resultaten reproduceerden die de coöperatie van ternaire complexvorming aantoonden. In het andere geval werd een molecuul bestudeerd dat ternaire complexen induceerde tussen een 46,0 kDa-eiwit, PPM1D en cereblon [CRBN (319-442)]. Het heterobifunctionele molecuul, BRD-5110, heeft een SPR K D = 1 nM voor PPM1D maar een veel zwakkere binding tegen het afgeknotte CRBN (319-442) complex (SPR KD = ~ 3 μM). In dat geval was de binding voor CRBN in SPR niet verzadigbaar, wat resulteerde in een "haak-effect". De doorvoer- en reagensvereisten voor SPR, BLI en ITC werden geëvalueerd en er werden algemene aanbevelingen gedaan voor de toepassing ervan op PROTAC-projecten.

Introduction

De polyubiquitinatie van eiwitten in de cel is een strak gereguleerd proces waarbij enzymen uit de Ubiquitine Ligase-familie betrokkenzijn1,2. De terminale enzymen in de route zijn de E3-ubiquitine-ligasen die covalent ubiquitinemoleculen hechten aan hun eiwitbindende partners3. De polyubiquitinatie van die eiwitbindende partners richt zich op proteolytische afbraak door het proteasoom4. Dit systeem maakt deel uit van het eiwithomeostaseproces dat therapeutisch is gebruikt om de afbraak van eiwitten die betrokken zijn bij ziekte te induceren5. Kleine moleculen die de interactie tussen E3-ubiquitineligasen induceren, zoals Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) of cereblon (CRBN), zijn meestal samengesteld uit een E3-ligase-bindende kernkop die door een flexibele linker is verbonden met een kernkop die bindt aan het eiwit dat het doelwit is van afbraak. Deze heterobifunctionele moleculen worden gewoonlijk aangeduid als proteolyse gericht op chimeren of PROTACS6.

De ontwikkeling van PROTACS omvat het evalueren van het vermogen van moleculen om de afbraak van eiwitten in cellen te induceren. Er zijn veel cellulaire testsystemen ontwikkeld die de geïnduceerde interactie tussen het doeleiwit en E3-ligasecomponenten, zoals VHL of CRBN, bewaken bij behandeling van de cellen met een PROTAC-molecuul. Een van die cellulaire tests, het nanoluc-Halotag-systeem7, omvat een E3-ligase dat is gefuseerd met de Halotag-acceptor en een doeleiwit dat is gelabeld met een nanoluc-donor. Ternaire complexvorming brengt de nanoluc-donor en de Halotag-acceptor in de buurt waardoor de overdracht van energie van de donor naar de acceptor mogelijk wordt, wat resulteert in de emissie van licht. Variaties van dit systeem kunnen worden gebruikt om de cellulaire permeabiliteit van PROTACS-moleculen8 of veranderingen in het relatieve niveau van ubiquitinatie van doeleiwitten9 te beoordelen. Hoewel deze cellulaire systemen essentieel zijn voor het stimuleren van de optimalisatie van PROTACS, is de vorming van complexen tussen E3-ligasen en eiwitten die gericht zijn op afbraak een proces in meerdere stappen10,11. De kinetiek en thermodynamica van de betrokken binaire en ternaire interacties dragen bij aan efficiëntie, ubiquitinatie en de daaruit voortvloeiende afbraak van het eiwit12,13,14.

Hierin worden protocollen beschreven die kunnen worden aangepast voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door PROTACS met behulp van oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). SPR- en ITC-protocollen voor het MZ1 PROTAC-molecuul dat ternaire complexvorming tussen Brd4BD2 en VHL induceert, afgeleid van literatuurrapporten13,15 en hier beschreven, waren in staat om de gerapporteerde resultaten samen te vatten met enige wijziging van de gerapporteerde procedures, die zullen worden besproken. Een beschrijving van een BLI-test die wordt gebruikt om de vorming van ternaire complexen tussen MZI, Brd4,BD2 en VHL te evalueren, is opgenomen in dit rapport. Affiniteitsmetingen van BLI waren consistent met die waargenomen in SPR en ITC. Een eerder gepubliceerd protocol waarin een SPR-test werd ontwikkeld voor het beoordelen van de PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming tussen PPM1D, een Ser/Thr-eiwitfosfatase waarvan de expressie op een p53-afhankelijke manier wordt geïnduceerd16, en CRBN wordt ook beschreven. In dit geval heeft het PROTAC-molecuul een nanomolaire affiniteit voor PPM1D, maar alleen een micromolaire affiniteit voor CRBN. In dit geval is de binding van het PROTAC-molecuul aan CRBN niet verzadigbaar, wat resulteert in het algemeen waargenomen "haakeffect". Het haakeffect is een eigenschap van drie lichaamssystemen waarin er twee soorten zijn die een heterotrimer complex kunnen vormen wanneer beide gebonden zijn aan een overbruggend molecuul (Figuur 1)17. Het haakeffect wordt waargenomen wanneer de overbruggingssoort in overconcentratie is ten opzichte van de twee andere soorten. De resulterende toestand is er een waarin de binaire interacties de ternaire interacties overtreffen. De systemen waarbij het haakeffect wordt waargenomen, vereisen specifieke experimentele ontwerpoverwegingen die in dit rapport worden besproken. Er worden algemene concepten en reagensvereisten gegeven voor het evalueren van het gebruik van biofysische assays voor de evaluatie van PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eiwitten werden tot overexpressie gebracht in E.coli met een goede opbrengst en zuiverheid (>80%) volgens de literatuurprotocollen18. Biotinylering werd uitgevoerd met behulp van een BirA-gekatalyseerde reactie18. Alle kleine moleculen werden bereid op 1 mM stockoplossingen in 100% DMSO. De hierin beschreven procedures vereisen geen gespecialiseerde laboratoriumveiligheidsapparatuur of voorzorgsmaatregelen. Er moeten standaard persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) voor laboratoria worden gebruikt (d.w.z. laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen).

De eiwitten die in dit onderzoek zijn toegepast, staan hieronder vermeld:
VHL: gebiotinyleerd VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112)-complex met Avi-tag aan de C-terminus van ElonginB.
Brd4BD2: Niet-gelabeld Brd4BD2 (333-460)
CRBN: gebiotinyleerde CRBN(319-442) met Avi-tag aan het N-eindpunt
PPM1D: niet-gelabeld of dubbel His8-gelabeld PPM1D(1-420) aan het N-eindpunt

Kleine moleculen die in dit onderzoek zijn toegepast, staan hieronder vermeld:
MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC dat bindt aan VHL en Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN K D ~3 μM, bindt niet aan PPM1D
BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN K D ~ 3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): bindt niet aan CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM

1. Methode 1: ITC (isothermische titratiecalorimetrie)

OPMERKING: Titraties worden uitgevoerd met behulp van een microcalorimeter met automatische injectie.

  1. Buffervoorbereiding: Bereid 3 L buffer met 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Dialyse: Dialyse VHL en Brd4BD2 (~ 500 μL bij elk 150 μM) tegen 1 L van de in stap 1.1 bereide buffer, 3 keer bij 4 °C, respectievelijk gedurende 4 uur, 2 uur en ongeveer 16 uur. Bewaar de buffer na de laatste dialyse voor gebruik in volgende stappen.
  3. Bereid monsters voor op een plaat met 96 putjes en een plastic deksel.
    1. Bereid voor elke titratie 400 μl oplossing voor de cel, 125 μl voor de spuit en 400 μl buffer voor reiniging. Voeg monsters toe aan drie opeenvolgende putjes op de plaat. Aangezien de samengestelde voorraad wordt bereid bij 1 mM in 100% DMSO, voegt u hetzelfde percentage DMSO toe aan de eiwitoplossingen om de bijpassende buffer in de cel en de spuit te garanderen. Voeg 2% DMSO toe aan de uiteindelijke oplossingen.
      1. Monster voor de titratie van VHL in MZ1: Bereid een celoplossing met 392 μL buffer, 4 μL MZ1 bij 1 mM (10 μM eindconcentratie) en 4 μL 100% DMSO. Bereid een spuitoplossing met 122,5 μl VHL bij 85,7 μM, 2,5 μl 100% DMSO (eindconcentratie van 84 μM).
      2. Monsters voor de titratie van VHL in de buffer (de gegevens worden gebruikt voor het aftrekken op de achtergrond van de gegevens die zijn gegenereerd uit monster 1.3.1.1): Bereid een celoplossing met een buffer van 392 μl, 8 μl 100% DMSO. Bereid een spuitoplossing met 122,5 μl VHL bij 85,7 μM (eindconcentratie van 84 μM) en voeg 2,5 μl 100% DMSO toe.
      3. Monsters voor de titratie van VHL in MZ1 en Brd4 BD2: Bereid een celoplossing met 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM eindconcentratie), 3,36 μL MZ1 bij 1 mM (8,4 μM eindconcentratie) en 4,64 μL 100% DMSO. Bereid een spuitoplossing met 122,5 μl VHL bij 85,7 μM (eindconcentratie van 84 μM) en 2,5 μl 100% DMSO.
      4. Monsters voor de titratie van VHL in Brd4 BD2 (achtergrond van 1.3.1.3): Bereid een celoplossing met 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM eindconcentratie) en 8 μl 100% DMSO. Bereid een spuitoplossing met 122,5 μl VHL bij 85,7 μM (eindconcentratie van 84 μM) en 2,5 μl 100% DMSO.
  4. Voer alle vier de titraties uit op de microcalorimeter. Elk bestaat uit 19 injecties met 2 μL spuitoplossing met een snelheid van 2 μL/s met tussenpozen van 120 s. Voer een eerste injectie van eiwit (0,4 μL) uit en gooi het weg tijdens de gegevensanalyse. Voer alle experimenten uit bij 25 °C, onder roeren op 600 tpm.
  5. Gegevensanalyse: Pas de gegevens aan op een model met één bindingsplaats om de stoichiometrie (n), de dissociatieconstante (KD) en de enthalpie van binding (ΔH) te verkrijgen met behulp van de analysesoftware die door de fabrikant wordt geleverd (Figuur 2).

2. Methode 2: BLI (biolaaginterferometrie)

  1. Voer BLI-experimenten uit met behulp van streptavidine (SA) gecoate sensoren bij kamertemperatuur (RT) met een acquisitiesnelheid van 5 Hz. Zorg er tijdens het geautomatiseerde BLI-experiment voor dat de sensoren stationair zijn in een enkele kolom en beweeg tussen verschillende kolommen van een zwarte plaat met een platte bodem met een maximale putinhoud van 96 putjes en een maximaal putvolume van 392 μL. Vul elk putje van de plaat die in het experiment is gebruikt met 200 μL oplossing.
    OPMERKING: BLI is alleen nuttig om eiwit-eiwitinteracties te detecteren (d.w.z. ternaire complexvorming). Het is niet gevoelig genoeg om interacties tussen eiwitten en kleine moleculen te detecteren.
    1. Buffervoorbereiding: Bereid 100 ml buffer met 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Optimalisatie voor de immobilisatiestap: Laad de testsensor tot 1-3 nm, zoals aanbevolen door de fabrikant. Een belasting van ~1,0 nm wordt gebruikt voor de hier beschreven procedures. Om dit te bereiken, dompelt u de sensor gedurende 80 s in een oplossing die VHL bevat in een dosis van 1,5 μg/ml.
    3. Voer BLI-kinetische metingen uit door zeven SA-sensoren toe te passen met behulp van de volgende volgorde:
      1. Dompel voor de eerste basislijnfase 60 s in de buffer.
      2. Dompel voor de immobilisatiefase gedurende 80 s in een oplossing van VHL van 1,5 μg/ml.
      3. Dompel voor de tweede basislijnfase 60 s in de buffer.
      4. Dompel voor de associatiefase gedurende 300 s in een oplossing van een vaste concentratie Brd4BD2 bij 2 μM, een vaste DMSO-concentratie bij 2% en variërende concentraties MZ1 bij 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM en 0 nM (referentiesensor).
      5. Dompel voor de dissociatiefase 600 s in de buffer.
    4. Voer gegevensanalyse uit met behulp van de software van de fabrikant. k aan, kuit en KD worden gerapporteerd voor het aanpassen van de gegevens (Figuur 3).

3. Methode 3: SPR (oppervlakteplasmonresonantie)

OPMERKING: Alle SPR-experimenten worden uitgevoerd met behulp van streptavidine (SA) gecoate sensorchips bij RT. Hoewel de NTA-chip wordt gebruikt voor de detectie tussen eiwit en kleine moleculen, moet deze met voorzichtigheid worden gebruikt wanneer deze wordt toegepast op het ternaire complex, aangezien een veel hogere achtergrond dan de SA-chip wordt waargenomen, mogelijk als gevolg van elektrostatische interacties tussen het geladen chipoppervlak en eiwit in de analyt.

  1. SPR voor VHL-MZ1-interactie
    1. Buffer voorbereiding.
      1. Bereid een buffer van 1 l met 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5 en haal deze door een filtereenheid van 0,2 μm.
      2. Verwijder 20 ml buffer voor toekomstig gebruik (DMSO-vrije buffer) en vul opnieuw met 20 ml DMSO (2% DMSO in de uiteindelijke lopende buffer). Houd de DMSO op 2% in alle hieronder beschreven monsters (stappen 3.1 en 3.2)
    2. Activeer de SA-chip volgens het protocol van de fabrikant en immobiliseer VHL tot ~2000 RU (injecteer eiwitoplossing van 5 μg/ml bij 5 μL/min).
    3. Bereid MZ1 in een 3-voudige, 8-punts seriële verdunning met de hoogste concentratie van 10 μM op een conische bodem met 384 putjes, doorschijnende, polypropyleen plaat met een maximaal volume van 130 μL. Bedek de plaat met zelfklevende, transparante plastic folies die compatibel zijn met polypropyleen microplaten.
      1. Bereid de topconcentratie voor met de DMSO-vrije buffer om de 2% DMSO bij de eindconcentratie te garanderen. Voeg aan 147 μL DMSO-vrije buffer 1,5 μL MZ1-voorraad bij 1 mM en 1,5 μL 100% DMSO toe.
      2. Bereid de 3-voudige seriële verdunning voor met de lopende buffer die 2% DMSO bevat. Voeg aan 100 μl van de lopende buffer 50 μl oplossing toe in de hoogste concentratie die in stap 3.1.3.1 is bereid, en meng goed om de 2e hoogste concentratie te bereiden.
      3. Breng vervolgens 50 μl van de in stap 3.1.3.2 bereide oplossing over naar de volgende 100 μl lopende buffer, meng goed om de 3e hoogste concentratie te bereiden, enzovoort.
    4. Voer SPR uit met behulp van de opstelling met meerdere cycli: Modus: Hoge prestaties; contacttijd: 120 s; dissociatietijd: 300 s; debiet: 50 μL/min.
    5. Voer gegevensanalyses uit met behulp van de evaluatiesoftware die door de fabrikant van het instrument wordt geleverd. Steady-state analyse gaf aan dat KD = 26 (± 3) nM en Rmax van ~91% (± 5%) binding bereikt (Figuur 4A)
  2. SPR voor VHL: MZ1: Brd4BD2 ternair complex
    1. Bereid de buffer voor zoals beschreven in stap 3.1.1.
    2. Activeer de SA-chip volgens het protocol van de fabrikant en immobiliseer VHL tot ~100 RU. Injecteer een eiwitoplossing van 0,5 μg/ml VHL met een stroomsnelheid van 5 μL/min en een contacttijd tussen 1-5 min totdat een oppervlaktedichtheid van ~100 RU is bereikt.
    3. Bereid monsters voor op twee 5-voudige, 5-punts injecties met één cyclus in een ronde bodemplaat met 96 putjes, helder polystyreen met een maximaal volume van 323 μl en bedek deze met zelfklevende, transparante, plastic folies die compatibel zijn met polystyreenmicroplaten, zoals beschreven in de stappen 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Negatieve controle: analyt bevat alleen Brd4BD2 .
        1. Bereid een topconcentratie van 25 μM voor in een lopende buffer met een volume van 200 μL (#A5)
        2. Voeg 160 μL Brd4BD2 bij 2 μM in de lopende buffer toe aan de volgende 4 putjes aan de linkerkant (#A1-A4)
        3. Breng 40 μL A5 over naar A4. Goed mengen.
        4. Breng 40 μL A4 over naar A3. Goed mengen. Blijf dit doen tot A1.
      2. Ternaire complexvorming: analyt bevat MZ1 en Brd4BD2.
        1. Bereid de hoogste concentratie voor door 4 μL MZ1 bij 20 μM in 100%-DMSO-oplossing toe te voegen aan 196 μL met 25,5 μM Brd4BD2 in DMSO-vrije buffer (#B5). De uiteindelijke concentraties zijn 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 en 2% DMSO.
        2. Voeg 160 μL Brd4BD2 bij 2 μM in de lopende buffer toe aan de volgende 4 putjes aan de linkerkant (#B1-B4)
        3. Breng 40 μL B5 over naar B4. Goed mengen.
        4. Breng 40 μL B4 over naar B3. Goed mengen. Blijf dit doen tot B1.
    4. Voer SPR uit met behulp van de opstelling met één cyclus: Contacttijd: 100 s; dissociatietijd: 720 s; debiet: 50 μL/min. Breng voor elk monster drie injecties buffer aan om een stabiele achtergrond te garanderen.
    5. Data-analyse: Pas de derde injectie van de buffer toe als achtergrond voor aftrekken. Als negatieve controle, wanneer MZ1 niet aanwezig is, is de SPR-respons tussen VHL en Brd4BD2 verwaarloosbaar. Wanneer MZ1 aanwezig is, geeft kinetische aanpassing de interactie aan tussen VHL en MZ1-Brd4BD2-complex heeft k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 en KD = 1 nM. (Figuur 4B)
  3. SPR voor CRBN en interacties met kleine moleculen
    1. Buffer voorbereiding.
      1. Bereid een buffer van 1 l met 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 en haal deze door een filtereenheid van0,2 μm.
      2. Verwijder 20 ml buffer en vul 20 ml 100% DMSO (2% DMSO in de uiteindelijke lopende buffer). Het is belangrijk om de DMSO op 2% te houden in alle hieronder beschreven steekproeven (stappen 3.3, 3.4 en 3.5).
    2. Activeer de SA-chip volgens het protocol van de fabrikant en immobiliseer CRBN tot ~800 RU.
    3. Bereid verbindingen in 3-voudige, 6-pt seriële verdunning op een plaat met 384 putjes met een topconcentratie van 30 μM, zoals beschreven in 3.1.3.
    4. Voer SPR uit met behulp van de opstelling met meerdere cycli: modus: hoge prestaties, contacttijd: 60 s, dissociatietijd: 90 s; debiet: 50 μL/min. Voor dit systeem zijn drie bufferinjecties voldoende om een stabiele achtergrond te verkrijgen. Voor andere testsystemen kan het nodig zijn om extra bufferinjecties uit te voeren.
    5. Voer gegevensanalyse uit met behulp van de software van de fabrikant.
      OPMERKING: Steady-state analyse geeft aan dat KD van BRD-2512 en BRD-5110 beide rond de 3 μM liggen. De binding bereikte echter slechts ~ 70% Rmax binding bij de hoogste concentratie. Zowel de zwakke affiniteit als de vorm van het sensorgram geven aan dat de onoplosbaarheid van verbindingen bij hoge concentraties waarschijnlijk zal optreden. De werkelijke KD kan dus hoger zijn dan 3 μM. BRD-4761, dat niet bindt aan CRBN, werd opgenomen als een negatieve controle.
  4. SPR voor PPM1D en interacties met kleine moleculen
    1. Bereid de buffer voor zoals beschreven in stap 3.3.1. Gebruik een nitriloazijnzuur (NTA) sensorchip.
    2. Pas een enkele cyclus toe omdat de PPM1D-kernkop een langzame k aan en kuit heeft. Regenereer de NTA-chip met behulp van de standaardinstellingen van de fabrikant en immobiliseer PPM1D tot ~ 1000 RU na elke injectie van de verbinding (injecteer eiwitoplossing van 5 μg/ml bij 5 μL/min).
    3. Bereid verbindingen in een drievoudige, 5-punts seriële verdunning met de hoogste concentratie bij 400 nM, zoals beschreven in 3.1.3.
    4. Voer SPR uit met behulp van de opstelling met één cyclus: Modus: hoge prestaties; contacttijd: 90 s; dissociatietijd: 600 s; debiet: 50 μL/min. Breng drie injecties buffer aan voor elke verbinding om een stabiele achtergrond te garanderen.
    5. Data-analyse. Pas de derde injectie van de buffer toe als achtergrond voor aftrekken. Als negatieve controle vertoont BRD-2512 geen binding aan PPM1D. Voor BRD-4761 en BRD-5110 gaf kinetische fitting aan dat de KD voor beide 1-2 nM was.
  5. SPR voor CRBN:PROTAC: PPM1D ternair complex
    1. Bereid de buffer voor zoals beschreven in stap 3.3.1.
    2. Activeer de SA-chip volgens het protocol van de fabrikant en immobiliseer CRBN tot ~35 RU (injecteer een eiwitoplossing van 0,5 μg/ml bij 5 μL/min).
    3. Bereid drie verbindingen in drievoudige, 6-punts seriële verdunning met een topconcentratie van 30 μM, waarbij [PPM1D] op 1 μM wordt gehouden in alle monsters, met inbegrip van blanco's, volgens de in stap 3.2.3 beschreven methode.
    4. Voer SPR uit met behulp van de opstelling met meerdere cycli: Modus: Hoge prestaties; contacttijd: 60 s; dissociatietijd: 90 s; debiet: 50 μL/min.
    5. Voer gegevensanalyse uit met behulp van de software van de fabrikant.
      OPMERKING: Terwijl BRD-2512 en BRD-4761 geen/verwaarloosbare respons vertonen, toont BRD-5110 duidelijk het "haakeffect" in de stationaire toestand met snelle aan/uit-kinetiek (Figuur 5A-C). De experimentele bindingsrespons van BRD-5110 (Figuur 5C) ligt tussen de voorspelde respons van de simulatie in wanneer wordt aangenomen dat K D (CRBN, cpd) 3 of 10 μM is (Figuur 5E), wat suggereert dat de ternaire K D en binaire KD erg op elkaar lijken. Er is geen duidelijke coöperatie van PPM1D: BRD-5110: CRBN-complexvorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering van VHL: MZ1 binair complex en VHL: MZ1: Brd4BD2 ternair complex is te vinden in Figuur 2 (ITC), Figuur 3 (BLI) en Figuur 4 (SPR) met behulp van een zeer vergelijkbare buffer. De KD geëxtraheerd uit orthogonale assays is consistent. De coöperatie kan worden berekend door K D (binair) / KD (ternair), wat zeer positief is (15 van ITC of 26 van SPR).

Karakterisering van het CRBN:PROTAC: PPM1D-systeem werd uitgevoerd door SPR (Figuur 5A-D). CRBN werd geïmmobiliseerd tot ~35 RU's om de observatie van ternaire complexvorming te vergemakkelijken. Alleen al de binding van PROTAC resulteerde in een signaal van <2 RU's dat onder de ruis ligt. PPM1D in de analyt geeft een hoog achtergrondsignaal op het oppervlak van de SA-chip en de hoogste concentratie die kan worden toegepast is ongeveer 1 μM. Deze waarde is lager dan de KD tussen CRBN en zijn kernkop ≥3 μM), dus "haakeffect" wordt verwacht. SPR is gevoelig genoeg om het te detecteren, wat goed overeenkomt met de simulatie (Figuur 5E). De simulatie werd uitgevoerd met behulp van de niet-coöperatieve evenwichten in literatuur19 in combinatie met de klassieke SPR-berekening [Responsemax = (Response Ligand × MassImmobilization)/MassLigand]. Aangezien de KD tussen CRBN en verbinding niet nauwkeurig wordt bepaald vanwege de onoplosbaarheid van de verbinding bij hoge concentratie, werd simulatie uitgevoerd met behulp van vier aannames KD's: 1 μM, 3 μM, 10 μM of 30 μM. De experimentele resultaten vielen tussen de gesimuleerde 3 μM- en 10 μM-curves, wat bijna identiek is aan de KD in het binaire systeem, wat suggereert dat er geen coöperatie is.

Figure 1
Figuur 1: Illustratie van drie bindingsscenario's en definitie van verschillendeKd's. (A) Klassieke tweecomponentensystemen. (B) Driecomponentensysteem waarin één uiteinde van PROTAC kan worden verzadigd, zodat het kan worden geëvalueerd als een systeem met twee componenten. (C) Driecomponentensysteem waarin het "haakeffect" wordt waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: ITC-resultaten. VHL titreren in MZ1 (links) of MZ1:Brd4BD2-complex (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: BLI-resultaten. MZ1 bemiddelt de vorming van VHL: MZ1: Brd4BD2 ternair complex. (A) Ruwe gegevens. (B) Aftrekken van achtergrondsignalen waarbij [MZ1] = 0. (C) Kinetische aanpassing van B om k on, koff en KD te extraheren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: SPR-resultaten . (A) MZ1 binding aan VHL. (B) MZ1:Brd4BD2 binair complex dat bindt aan VHL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: SPR-resultaten die het "haakeffect" van een representatief PPM1D-PROTAC laten zien. CRBN werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van de SA-chip, terwijl [PPM1D] in alle gevallen op 1 μM in de analyt werd gehouden. (A) BRD-2512, een verbinding die alleen bindt aan CRBN, geeft bijna geen respons. (B) BRD-4761, een verbinding die alleen bindt aan PPM1D, geeft ook geen respons. (C,D) BRD-5110, een PROTAC met de kernkop van CRBN in BRD-2512 en de kernkop van PPM1D in BRD-4761, induceerde de vorming van het ternaire complex. (E) Een simulatie van SPR-resultaten, ervan uitgaande dat de KD tussen CRBN en verbinding 1 μM (zwart), 3 μM (blauw), 10 μM (rood) of 30 μM (groen) is. De BRD-2512-curve ligt tussen 3 μM en 10 μM, wat zeer dicht bij de gemeten dubbelster KD ligt, wat suggereert dat er geen coöperatie is (coöperatie = 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofysische karakterisering van de binaire en ternaire interacties tussen PROTAC-moleculen en hun eiwitbindende partners kan unieke en complementaire inzichten opleveren met betrekking tot veelgebruikte cellulaire systemen. Inzicht in de affiniteit tussen elke kernkop van een PROTAC-molecuul en zijn eiwitbindende partners kan helpen bij het begeleiden van medicinale chemische inspanningen in de richting van de optimalisatie van die interacties. Eerder gepubliceerde kristalstructuren van ternaire PROTAC-complexen hebben aangetoond dat atomen in het linkergebied interacties kunnen vormen met een of beide eiwitbindingspartners16,20. Het experimenteel bepalen van de coöperatie van ternaire complexvorming kan de optimalisatie van de linker ondersteunen.

In dit rapport wordt het gebruik van drie verschillende biofysische technieken beschreven die informatie kunnen verschaffen over de bindingsaffiniteiten tussen PROTAC-moleculen en hun eiwitbindende partners. Methode 1 beschrijft de experimentele opstelling van de isothermische titratiecalorimetrie (ITC) voor het PROTAC-molecuul, MZ1, het VHL E3-ligasecomplex en het Brd4BD2-broomdomein. ITC-resultaten toonden KD's van 59 nM voor de binaire interactie tussen MZ1 en VHL en 4 nM voor de ternaire interactie tussen VHL en voorgemengde MZ1 en Brd4BD2. De affiniteiten kwamen overeen met die waargenomen bij SPR (geïmmobiliseerde VHL-binding aan MZ1 KD = 26 nM, geïmmobiliseerde VHL-binding aan voorgemengde MZ1 en Brd4BD2 K D=1 nM) en BLI (KD= 2,8 nM). Hoewel de ITC KD-resultaten voor VHL-binding aan MZ1 consistent zijn met gerapporteerde waarden16, is de verkregen stoichiometrie anders. Een mogelijke verklaring voor dit resultaat is de slechte oplosbaarheid van MZ1 in de op HEPES gebaseerde buffer die wordt gebruikt in het hier beschreven protocol, terwijl de resultaten uit de literatuur zijn gegenereerd met behulp van een op Bis-tris gebaseerde buffer. De auteurs gaven er de voorkeur aan om dezelfde buffercomponenten te gebruiken voor SPR, ITC en BLI.

Methode 2 beschrijft de experimentele opzet voor de BLI-analyse van de interactie van geïmmobiliseerd VHL, een vaste concentratie van Brd4BD2 en variërende concentraties van MZ1. Vanwege de gevoeligheidsbeperkingen van de techniek konden KD, kaan en kuit waarden voor ternaire complexvorming worden gegenereerd, maar niet voor de binaire interactie tussen MZ1 en de eiwitten.

Methode 3 beschrijft meerdere SPR-assays. SPR is gevoeliger dan BLI en kan worden toegepast om zowel de eiwit-klein molecuul (binair) als eiwit-eiwit (ternair) interacties te observeren. In het laatste geval moeten achtergrondsignalen zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat eiwit in de analyt hoge en onstabiele signalen kan geven. SPR is erg gevoelig voor reagentia met een hoge brekingsindex, waaronder DMSO, glycerol en wasmiddelen. Als het eiwit wordt opgeslagen in de buffer die glycerol of wasmiddel bevat, moet de lopende buffer overeenkomende concentraties van die componenten bevatten. Als alternatief kan worden gebruikt door het toepassen van grootte-uitsluitingschromatografie ze volledig te verwijderen vóór een SPR-experiment. Er moet voor worden gezorgd dat de DMSO-concentraties tussen buffer- en analytmonsters nauwkeurig op elkaar zijn afgestemd. De DMSO-oplosmiddelcorrecties worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

De methode in stap 3.1 beschrijft de SPR-test voor de binaire VHL-MZ1-interactie. Methode 3.2 beschrijft de SPR-test voor het VHL: MZ1: Brd4 BD2 ternair complex waarbij VHL is geïmmobiliseerd en de analyt ofwel Brd4 BD2 alleen of het MZ1:Brd4BD2-complex is. In dit systeem is de interactie tussen Brd4BD2 en VHL verwaarloosbaar. De vorming van het ternair complex is zeer coöperatief (ɑ = 26). De off-rate voor ternaire complexvorming is 0,014 s-1, wat het gebruik van kinetiek met één cyclus vereist. Resultaten van ITC tonen ook een zeer coöperatieve ternaire complexvorming (ɑ=15). SPR-methoden in de stappen 3.3, 3.4 en 3.5 beschrijven assays voor het evalueren van de vorming van een complex tussen CRBN en PPM1D geïnduceerd door de aanwezigheid van een PROTAC-molecuul, BRD-5110. Het PROTAC-molecuul heeft een zwakke affiniteit voor CRBN (K D ~3 μM) en een sterke affiniteit voor PPM1D (KD = 1-2 nM). Als gevolg hiervan is de zwakke binding aan CRBN niet verzadigd en resulteert dit in een waargenomen "haakeffect". Hoewel het mogelijk is om de oplosbaarheid van ligand te verhogen door de DMSO-concentratie die in het experiment wordt gebruikt te verhogen, is het in die gevallen belangrijk om de eiwitstabiliteit zorgvuldig te controleren, wat negatief kan worden beïnvloed door hoge concentraties DMSO. Bovendien heeft DMSO een hoge oplossingshitte die de hitte van binding van liganden aan eiwitten kan verdoezelen. Er moet voor worden gezorgd dat de DMSO-concentraties van de oplossing in de spuit overeenkomen met de oplossing in de cel. De auteurs bevelen dialyse van de twee oplossingen aan tegen hetzelfde bufferpreparaat.

Algemene aanbevelingen en richtlijnen worden gegeven op basis van de uitgevoerde en gerapporteerde experimenten hier. Wanneer de affiniteiten van binaire interacties tussen PROTAC-moleculen en hun eiwitbindende partners sterk zijn (KD <1 μM), biedt SPR betrouwbare en reproduceerbare affiniteiten samen met waardevolle informatie over de coöperatie van ternaire complexvorming. Wanneer de affiniteiten van de binaire interactie tussen een van de eiwitbindingspartners en het PROTAC-molecuul zwak zijn (KD >1 μM), moet de testopstelling worden aangepast. In die gevallen kan het gebruik van moleculaire simulaties waarbij de bindingsconstanten zijn vastgelegd en de concentraties van ligand en analyt worden gevarieerd, waardevol zijn bij het begeleiden van het ontwerp van de test en het interpreteren van experimentele resultaten. ITC-assays bieden belangrijke informatie over de stoichiometrie van binding, maar vereisen aanzienlijk meer eiwit- en verbindingsreagentia in vergelijking met SPR en BLI. Bovendien kan de oplosbaarheid van het PROTAC-molecuul beperkend zijn voor ITC-experimenten. BLI heeft een hogere doorvoer dan ITC en vereist minder eiwitten en samengestelde reagentia. Vanwege gevoeligheidsbeperkingen kan BLI echter alleen worden gebruikt om de vorming van ternaire complexen te beoordelen en niet om binaire interacties tussen PROTAC-moleculen en hun eiwitbindende partners te beoordelen. Het wordt aanbevolen om SPR te gebruiken voor routinematige tests van zowel binaire als ternaire PROTAC-bindingstests en BLI- en ITC-tests die worden gebruikt voor orthogonale validatie van resultaten van SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een Innovation and Technology Development Award van het Center for the Development of Therapeutics van het Broad Institute van MIT en Harvard. De auteurs willen de leden van het senior leiderschapsteam en de beoordelingscommissie bedanken voor hun steun aan dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 203
De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter