Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN). שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

Abstract

ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק יכולים להיווצר קומפלקסים על ידי מולקולות הטרוביפונקציונאליות בתהליך רב-שלבי. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות המעורבות תורמות ליעילות היוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון. טכניקות ביופיזיקליות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) מספקות מידע רב ערך שניתן להשתמש בו באופטימיזציה של אינטראקציות אלה. באמצעות שתי מערכות מודל, הוקמה ערכת כלים לבדיקה ביופיזית להבנת הקואופרטיביות של היווצרות מרוכבים טרינריים והשפעת "אפקט הוו" על קינטיקה קשירה. במקרה אחד, נבדקה מולקולת פרוטאוליזה המכוונת לכימרה (PROTAC) שגרמה להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, MZ1, יש זיקות nM הן לחלבון Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) והן לקומפלקס VHL (SPR KD = 29 nM, itc k d = 66 nM). עבור מערכת זו, פותחו מבחני SPR, BLI ו- ITC חזקים ששיחזרו תוצאות שפורסמו המדגימות את הקואופרטיביות של היווצרות מורכבת טרינרית. במקרה השני, נחקרה מולקולה שגרמה לקומפלקסים טרינריים בין חלבון 46.0 kDa PPM1D וצרבלון [CRBN (319-442)]. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, BRD-5110, יש SPR K D = 1 ננומטר עבור PPM1D אך קשירה חלשה בהרבה כנגד קומפלקס CRBN קטוע (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). במקרה זה, הכריכה עבור CRBN ב- SPR לא הייתה רוויה, וכתוצאה מכך נוצר "אפקט וו". הוערכו דרישות התפוקה והמגיבים עבור SPR, BLI ו-ITC, וניתנו המלצות כלליות ליישומן בפרויקטים של PROTAC.

Introduction

polyubiquitination של חלבונים בתא הוא תהליך מווסת היטב המערב אנזימים ממשפחת Ubiquitin Ligase 1,2. האנזימים הסופיים במסלול הם ליגאזות יוביקוויטין E3 המצמידות באופן קוולנטי מולקולות יוביקוויטין לשותפיהן קושרי החלבונים3. הפוליוביקוויטינציה של אותם שותפים קושרי חלבונים מכוונת אותם לפירוק פרוטאוליטי על ידי פרוטאזום4. מערכת זו היא חלק מתהליך הומאוסטזיס חלבונים אשר מונף טיפולית כדי לגרום לפירוק של חלבונים המעורבים במחלה5. מולקולות קטנות הגורמות לאינטראקציה בין ליגאזות יוביקוויטין E3, כגון Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) או cereblon (CRBN), מורכבות בדרך כלל מראש קרב קושר ליגאז E3 המחובר על ידי מקשר גמיש לראש קרב שנקשר לחלבון המיועד לפירוק. מולקולות הטרוביפונקציונאליות אלה מכונות בדרך כלל פרוטאוליזה המכוונת לכימרות או פרוטאקים6.

הפיתוח של PROTACS כרוך בהערכת היכולת של מולקולות לגרום לפירוק של חלבונים בתאים. פותחו מערכות בדיקה תאיות רבות המנטרות את האינטראקציה המושרה בין חלבון המטרה לבין רכיבי ליגאז E3, כגון VHL או CRBN, בעת הטיפול בתאים במולקולת PROTAC. ניסוי תאי אחד כזה, מערכת ננולוק-הלוטג7, כולל ליגאז E3 המאוחה למקבל ההלוטאג וחלבון מטרה המתויג עם תורם ננולוק. היווצרות מורכבת טרינרית מביאה את תורם ננולוק ומקבל הלוטג לקרבה ומאפשרת העברת אנרגיה מהתורם למקבל וכתוצאה מכך פליטת אור. ניתן להשתמש בווריאציות של מערכת זו כדי להעריך את החדירות התאית של מולקולות PROTACS8 או שינויים ברמה היחסית של יוביקוויטינציה של חלבון המטרה9. בעוד שמערכות תאיות אלה חיוניות להנעת אופטימיזציה של PROTACS, היווצרות קומפלקסים בין ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק היא תהליך רב-שלבי10,11. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות הבינאריות והטרינריות המעורבות תורמות ליעילות יוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון12,13,14.

להלן מתוארים פרוטוקולים שניתן להתאים לאפיון ביופיזי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTACS באמצעות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC). פרוטוקולי SPR ו-ITC עבור מולקולת MZ1 PROTAC הגורמת להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL שנגזרו מדוחות ספרות13,15 ומתוארים כאן הצליחו לשחזר את התוצאות המדווחות עם שינוי מסוים של ההליכים המדווחים, אשר יידונו. תיאור של בדיקת BLI המשמשת להערכת היווצרות מורכבת טרינרית בין MZI, Brd4BD2 ו- VHL נכלל בדוח זה. מדידות הזיקה מ-BLI היו עקביות עם אלה שנצפו ב-SPR וב-ITC. פרוטוקול שפורסם בעבר ובו פותחה בדיקת SPR להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC בין PPM1D, חלבון Ser/Thr פוספטאז שביטויו מושרה באופן תלוי p5316, לבין CRBN מתואר גם כן. במקרה זה, למולקולת PROTAC יש זיקה ננו-מולרית ל-PPM1D אך רק זיקה מיקרומולרית ל-CRBN. במקרה זה, הקישור של מולקולת PROTAC ל-CRBN אינו רווי, וכתוצאה מכך נוצר "אפקט הוו" הנפוץ. אפקט הקרס הוא תכונה של שלוש מערכות גוף שבהן ישנם שני מינים שיכולים ליצור קומפלקס הטרוטרימרי כאשר שניהם קשורים למולקולת גישור (איור 1)17. אפקט הקרס נצפה כאשר המין המגשר נמצא בריכוז עודף ביחס לשני המינים האחרים. המצב המתקבל הוא מצב שבו האינטראקציות הבינאריות עולות על האינטראקציות הטרינריות. המערכות שבהן נצפה אפקט הוו דורשות שיקולי תכנון ניסוייים ספציפיים שנדונו בדו"ח זה. מושגים כלליים ודרישות מגיב להערכת השימוש בבדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC מסופקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל החלבונים בוטאו יתר על המידה ב- E.coli עם תפוקה טובה וטוהר (>80%) בהתאם לפרוטוקולי הספרות18. ביוטינילציה בוצעה באמצעות תגובה זרזי BirA18. כל המולקולות הקטנות הוכנו בתמיסות מלאי של 1 מילימטר ב-100% DMSO. הנהלים המתוארים כאן אינם דורשים ציוד בטיחות מיוחד במעבדה או אמצעי זהירות. יש להשתמש בציוד מגן אישי סטנדרטי למעבדה (PPE) (כלומר, מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות).

חלבונים שיושמו במחקר זה מפורטים להלן:
VHL: קומפלקס VHL ביוטינילציה (53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC (17-112) עם Avi-tag במסוף C של ElonginB.
Brd4BD2: לא מתויג Brd4BD2(333-460)
CRBN: CRBN ביוטינילציה (319-442) עם תג Avi במסוף N
PPM1D: PPM1D ללא תיוג או עם תיוג כפול של His8(1-420) במסוף N

מולקולות קטנות שיושמו במחקר זה מפורטות להלן:
MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC שנקשר ל-VHL ול-Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN KD ~ 3 μM, אינו נקשר ל- PPM1D
BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN K D ~ 3 μM, PPM1D KD = 1-2 ננומטר
BRD-4761 (MW = 476.6 Da): אינו נקשר ל-CRBN, PPM1D KD = 1-2 ננומטר

1. שיטה 1: ITC (קלורימטריה טיטרציה איזותרמית)

הערה: הטיטרציות מבוצעות באמצעות מיקרו-קלורימטר עם הזרקה אוטומטית.

  1. הכנת חיץ: להכין 3 ליטר של חיץ המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5.
  2. דיאליזה: Dialyze VHL ו- Brd4BD2 (~ 500 μL ב- 150 מיקרומטר כל אחד) כנגד 1 ליטר של החיץ שהוכן בשלב 1.1, 3 פעמים ב- 4 ° C, למשך 4 שעות, שעתיים וכ- 16 שעות, בהתאמה. שמור את המאגר לאחר הדיאליזה האחרונה לשימוש בשלבים הבאים.
  3. הכינו דוגמאות על צלחת 96 בארות עם כיסוי פלסטיק.
    1. עבור כל טיטרציה, להכין 400 μL של פתרון עבור התא, 125 μL עבור מזרק, ו 400 μL של חיץ לניקוי. מוסיפים דוגמאות לשלוש בארות רצופות בצלחת. מכיוון שמלאי התרכובת מוכן ב-1 מילימטר ב-100% DMSO, הוסיפו את אותו אחוז של DMSO לתמיסות החלבונים כדי להבטיח את החיץ התואם בתא ובמזרק. הוסף 2% DMSO לפתרונות הסופיים.
      1. דוגמה לטיטרציה של VHL לתוך MZ1: הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של חיץ, 4 μL של MZ1 ב 1 mM (ריכוז סופי של 10 μM), ו 4 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר, 2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר).
      2. דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך המאגר (הנתונים ישמשו לחיסור רקע של נתונים שנוצרו מדגם 1.3.1.1): הכן תמיסת תא המכילה מאגר 392 μL, 8 μL 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרו-מטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) והוסיפו 2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.
      3. דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך MZ1 ו- Brd4 BD2: הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של 17.1 μM Brd4BD2 (ריכוז סופי של 16.8 μM), 3.36 μL של MZ1 ב- 1 mM (ריכוז סופי של 8.4 μM) ו- 4.64 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) ו-2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.
      4. דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך Brd4 BD2 (רקע של 1.3.1.3): הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של 17.1 μM Brd4BD2 (ריכוז סופי של 16.8 μM) ו- 8 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) ו-2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.
  4. הפעל את כל ארבעת הטיטרציות על המיקרו-קלורימטר. כל אחת מהן מורכבת מ-19 זריקות של תמיסת מזרק 2 μL בקצב של 2 μL/s במרווחי זמן של 120 שניות. בצע הזרקה ראשונית של חלבון (0.4 μL) והשליך אותו במהלך ניתוח הנתונים. בצע את כל הניסויים ב 25 ° C, תוך ערבוב ב 600 סל"ד.
  5. ניתוח נתונים: התאימו את הנתונים למודל של אתר קשירה יחיד כדי לקבל את הסטויכיומטריה (n), קבוע הדיסוציאציה (KD) ואנתלפיה של קשירה (ΔH) באמצעות תוכנת הניתוח שסופקה על-ידי היצרן (איור 2).

2. שיטה 2: BLI (אינטרפרומטריה biolayer)

  1. בצע ניסויי BLI באמצעות חיישנים מצופים סטרפטווידין (SA) בטמפרטורת החדר (RT) עם קצב רכישה של 5 הרץ. במהלך ניסוי BLI אוטומטי, ודא שהחיישנים נייחים בתוך עמודה אחת ועוברים בין עמודות שונות של לוח שחור בעל 96 בארות, תחתית שטוחה, עם נפח באר מרבי של 392 μL. מלא כל באר של הצלחת ששימשה בניסוי עם 200 μL של תמיסה.
    הערה: BLI שימושי רק כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון (כלומר, היווצרות קומפלקס טרינרי). הוא אינו רגיש מספיק כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים ומולקולות קטנות.
    1. הכנת חיץ: להכין 100 מ"ל של חיץ המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.05% P20, pH 7.5.
    2. אופטימיזציה לשלב האימוביליזציה: טען את חיישן הבדיקה ל- 1-3 ננומטר, בהתאם להמלצת היצרן. טעינה של ~1.0 ננומטר משמשת להליכים המתוארים כאן. כדי להשיג זאת, טבלו את החיישן בתמיסה המכילה VHL ב-1.5 מיקרוגרם/מ"ל למשך 80 שניות.
    3. בצע מדידות קינטיות BLI על ידי הפעלת שבעה חיישני SA באמצעות הרצף הבא:
      1. בשלב הבסיס הראשון, יש לטבול במאגר למשך 60 שניות.
      2. לשלב האימוביליזציה, יש לטבול בתמיסה של VHL במינון של 1.5 מיקרוגרם/מ"ל למשך 80 שניות.
      3. בשלב הבסיס השני, יש לטבול במאגר למשך 60 שניות.
      4. עבור שלב האסוציאציה, יש לטבול בתמיסה של ריכוז קבוע של Brd4BD2 ב-2 מיקרומטר, ריכוז קבוע של DMSO ב-2%, וריכוזים משתנים של MZ1 ב-100 ננומטר, 50 ננומטר, 25 ננומטר, 12.5 ננומטר, 6.3 ננומטר, 3.1 ננומטר ו-0 ננומטר (חיישן ייחוס) למשך 300 שניות.
      5. עבור שלב הדיסוציאציה, לטבול לתוך חיץ במשך 600 שניות.
    4. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן. k on, koff ו-KD מדווחים לצורך התאמת נתונים (איור 3).

3. שיטה 3: SPR (תהודה פלסמונית פני השטח)

הערה: כל ניסויי SPR מתבצעים באמצעות שבבי חיישנים מצופים סטרפטאבידין (SA) ב- RT. למרות ששבב נת"ע משמש לזיהוי בין חלבון למולקולות קטנות, יש להשתמש בו בזהירות כאשר מיישמים אותו על המכלול הטרינרי, שכן נצפה רקע גבוה בהרבה משבב החומצה הסליצילית, אולי בשל אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין משטח השבב הטעון לחלבון באנליט.

  1. SPR עבור אינטראקציה VHL-MZ1
    1. הכנת חיץ.
      1. הכינו חיץ 1 ליטר המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.005% P20, pH7.5, והעבירו אותו דרך יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר.
      2. הסר 20 מ"ל של מאגר לשימוש עתידי (מאגר ללא DMSO) ומלא מחדש ב- 20 מ"ל DMSO (2% DMSO במאגר הפועל הסופי). שמור על DMSO בשיעור של 2% בכל הדגימות המתוארות להלן (שלבים 3.1 ו-3.2)
    2. הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את VHL ל~2000 RU (הזרקת תמיסת חלבון של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-5 מיקרוליטר/דקה).
    3. הכינו את MZ1 בדילול טורי פי 3, 8 נקודות עם ריכוז עליון של 10 מיקרומטר על צלחת פוליפרופילן תחתונה חרוטית 384 באר, שקופה, עם נפח מרבי של 130 μL. כסו את הצלחת ברדידי פלסטיק שקופים ונצמדים מעצמם התואמים למיקרו-צלחות פוליפרופילן.
      1. הכן את הריכוז העליון עם מאגר ללא DMSO כדי להבטיח DMSO של 2% בריכוז הסופי. ל- 147 μL של מאגר ללא DMSO, הוסף 1.5 μL של מלאי MZ1 ב- 1 mM ו- 1.5 μL של 100% DMSO.
      2. הכן את הדילול הטורי פי 3 עם מאגר ריצה המכיל 2% DMSO. ל 100 μL של חיץ הריצה, להוסיף 50 μL של תמיסה בריכוז העליון מוכן בשלב 3.1.3.1, ולערבב היטב כדי להכין את הריכוזהשני הגבוה ביותר.
      3. לאחר מכן להעביר 50 μL של הפתרון מוכן בשלב 3.1.3.2 הבא 100 μL של חיץ ריצה, לערבב היטב כדי להכין את הריכוז הגבוה ביותר3 , וכן הלאה.
    4. הפעל SPR באמצעות ההגדרה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 120 שניות; זמן דיסוציאציה: 300 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה.
    5. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ההערכה שסופקה על-ידי יצרן המכשיר. ניתוח מצב יציב הצביע על KD = 26 (± 3) nM ו- Rmax של ~91% (± 5%) קשירה שהושגה (איור 4A)
  2. SPR עבור VHL: MZ1: קומפלקס טרנרי Brd4BD2
    1. הכן את המאגר כמתואר בשלב 3.1.1.
    2. הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את VHL ל~ 100 RU. הזריקו תמיסת חלבון של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל VHL בקצב זרימה של 5 מיקרוליטר/דקה וזמן מגע בין 1-5 דקות עד להגעה לצפיפות פני השטח של ~100 RU.
    3. הכינו דגימות לשתי הזרקות חד-מחזוריות של 5 קפלים, 5 נקודות בפלטה תחתונה עגולה מפוליסטירן 96 באר, שקופה בנפח מרבי של 323 מיקרוליטר וכסו אותה ברדידי פלסטיק שקופים ונצמדים עצמיים התואמים למיקרו-צלחות פוליסטירן כמתואר בשלבים 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. שליטה שלילית: analyte מכיל Brd4BD2 בלבד.
        1. הכן ריכוז עליון של 25 מיקרומטר במאגר ריצה עם נפח של 200 μL (#A5)
        2. הוסף 160 μL כל אחד של Brd4BD2 ב 2 μM במאגר הריצה ל 4 הבארות הבאות משמאל (#A1-A4)
        3. העבר 40 μL של A5 ל- A4. מערבבים היטב.
        4. העבר 40 μL של A4 ל- A3. מערבבים היטב. המשך לעשות זאת עד A1.
      2. היווצרות מורכבת טרינרית: אנליט מכיל MZ1 ו- Brd4BD2.
        1. הכן את הריכוז העליון על ידי הוספת 4 μL של MZ1 ב- 20 μM בתמיסת 100%-DMSO ל- 196 μL המכילה 25.5 μM Brd4BD2 במאגר ללא DMSO (#B5). הריכוזים הסופיים הם 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 ו-2% DMSO.
        2. הוסף 160 μL כל אחד של Brd4BD2 ב 2 μM בחיץ ריצה ל 4 הבארות הבאות משמאל (#B1-B4)
        3. העבר 40 μL של B5 ל B4. מערבבים היטב.
        4. העבר 40 μL של B4 ל B3. מערבבים היטב. המשך לעשות זאת עד B1.
    4. הפעל SPR באמצעות הגדרת מחזור יחיד: זמן יצירת קשר: 100 שניות; זמן דיסוציאציה: 720 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. יש למרוח שלוש זריקות חיץ לפני כל דגימה כדי להבטיח רקע יציב.
    5. ניתוח נתונים: החל את ההזרקה השלישית של המאגר כרקע לחיסור. כבקרה שלילית, כאשר MZ1 אינו קיים, תגובת SPR בין VHL ו- Brd4BD2 היא זניחה. כאשר MZ1 קיים, התאמה קינטית מציינת את האינטראקציה בין VHL ו- MZ1-Brd4קומפלקס BD2 יש kעל = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1, ו- KD = 1 nM. (איור 4B)
  3. SPR עבור אינטראקציות CRBN ומולקולות קטנות
    1. הכנת חיץ.
      1. הכינו מאגר 1 ליטר המכיל 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5, והעבירו אותו דרך יחידת מסנן0.2 מיקרומטר.
      2. הסר 20 מ"ל של מאגר ומלא מחדש 20 מ"ל של 100% DMSO (2% DMSO במאגר ההפעלה הסופי). חשוב לשמור על DMSO בשיעור של 2% בכל הדגימות המתוארות להלן (שלבים 3.3, 3.4 ו-3.5).
    2. הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את CRBN ל~800 RU.
    3. הכינו תרכובות בדילול טורי פי 3, 6 נק' על צלחת 384 בארות עם ריכוז עליון של 30 מיקרומטר כמתואר ב-3.1.3.
    4. הפעל SPR באמצעות ההתקנה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים, זמן מגע: 60 שניות, זמן ניתוק: 90 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. עבור מערכת זו, שלוש זריקות חיץ מספיקות כדי לקבל רקע יציב. עבור מערכות בדיקה אחרות, ייתכן שיהיה צורך לבצע הזרקות מאגר נוספות.
    5. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן.
      הערה: ניתוח מצב יציב מצביע על KD של BRD-2512 ו- BRD-5110 שניהם סביב 3 מיקרומטר. עם זאת, הקשירה הגיעה רק ל~ 70% Rקשירה מקסימלית בריכוז העליון. הן הזיקה החלשה והן צורת החיישן מצביעות על כך שסביר להניח שתתרחש אי-מסיסות מורכבת בריכוזים גבוהים. לפיכך, KD בפועל עשוי להיות גבוה מ -3 מיקרומטר. BRD-4761, שאינו נקשר ל- CRBN, נכלל כבקרה שלילית.
  4. SPR עבור אינטראקציות PPM1D ומולקולות קטנות
    1. הכן מאגר כמתואר בשלב 3.3.1. השתמש בשבב חיישן חומצה ניטרילואצטית (NTA).
    2. החל מחזור יחיד מכיוון שלראש הקרב PPM1D יש k מופעל ו-kכבוי איטי. צור מחדש את שבב NTA באמצעות הגדרת ברירת המחדל של היצרן ושתק PPM1D ל~ 1000 RU לאחר כל הזרקת תרכובת (הזרקת תמיסת חלבון של 5 מיקרוגרם / מ"ל ב 5 מיקרוליטר / דקה).
    3. הכינו תרכובות בדילול טורי פי 3, 5 נקודות עם ריכוז עליון של 400 ננומטר כמתואר ב-3.1.3.
    4. הפעל SPR באמצעות הגדרת מחזור יחיד: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 90 שניות; זמן דיסוציאציה: 600 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. יש למרוח שלוש זריקות חיץ לפני כל תרכובת כדי להבטיח רקע יציב.
    5. ניתוח נתונים. החל את הזריקה השלישית של המאגר כרקע לחיסור. כבקרה השלילית, BRD-2512 אינו מראה מחייב ל- PPM1D. עבור BRD-4761 ו- BRD-5110, התאמה קינטית הצביעה על KD עבור שניהם להיות 1-2 ננומטר.
  5. SPR עבור CRBN:PROTAC: קומפלקס טרנרי PPM1D
    1. הכן מאגר כמתואר בשלב 3.3.1.
    2. הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את CRBN ל~35 RU (הזריק תמיסת חלבון של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-5 מיקרוליטר/דקה).
    3. הכן שלוש תרכובות בדילול טורי פי 3, 6 נקודות עם ריכוז עליון של 30 מיקרומטר תוך שמירה על [PPM1D] על 1 מיקרומטר בכל הדגימות, כולל ריקות, באמצעות השיטה המתוארת בשלב 3.2.3.
    4. הפעל SPR באמצעות ההגדרה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 60 שניות; זמן דיסוציאציה: 90 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה.
    5. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן.
      הערה: בעוד BRD-2512 ו-BRD-4761 מראים תגובה אפסית/זניחה, BRD-5110 מראה בבירור את "אפקט הוו" במצב יציב עם קינטיקה של הפעלה/כיבוי מהירים (איור 5A-C). תגובת הקישור הניסיונית מ-BRD-5110 (איור 5C) נמצאת בין התגובה החזויה מהסימולציה כאשר מניחים ש-KD (CRBN, cpd) הוא 3 או 10 מיקרומטר (איור 5E), מה שמרמז על כך ש-K D הטרינרי ו-KD הבינארי דומים מאוד. אין שיתוף פעולה נראה לעין של PPM1D: BRD-5110: היווצרות קומפלקס CRBN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון של VHL: קומפלקס בינארי MZ1 ו-VHL: MZ1: Brd4BD2 terary complex ניתן למצוא באיור 2 (ITC), איור 3 (BLI) ואיור 4 (SPR) באמצעות מאגר דומה מאוד. ה- KD המופק מבדיקות אורתוגונליות הוא עקבי. הקואופרטיביות יכולה להיות מחושבת על ידי K D (בינארי) / KD (טרינרי), שהוא חיובי מאוד (15 מ ITC או 26 מ SPR).

אפיון מערכת CRBN:PROTAC: PPM1D בוצע על ידי SPR (איור 5A-D). CRBN היה משותק ~ 35 RU's כדי להקל על התצפית של היווצרות מורכבת טרינרית. הקשירה של PROTAC לבדה הביאה לאות של <2 RU's שנמצא מתחת לרעש. PPM1D באנליט נותן אות רקע גבוה על משטח שבב SA, והריכוז הגבוה ביותר שניתן ליישם הוא סביב 1 מיקרומטר. ערך זה נמוך מה-KD בין CRBN לראש הקרב שלו ≥3 מיקרומטר) ולכן צפוי "אפקט וו". SPR רגיש מספיק כדי לזהות אותו, מה שיש לו הסכמה טובה עם הסימולציה (איור 5E). הסימולציה נעשתה באמצעות שיווי משקל לא שיתופי בספרות19 בשילוב עם חישוב SPR קלאסי [Responsemax = (Response Ligand ×Mass Immobilization)/MassLigand]. מכיוון שה-KD בין CRBN לתרכובת אינו נקבע במדויק בשל חוסר המסיסות של התרכובת בריכוז גבוה, הסימולציה נעשתה באמצעות ארבעה KD מניחים: 1 μM, 3 μM, 10 μM או 30 μM. תוצאות הניסוי נפלו בין העקומות המדומות של 3 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר, שהן כמעט זהות ל-KD במערכת הבינארית, מה שמרמז על כך שאין קואופרטיביות.

Figure 1
איור 1: המחשה של שלושה תרחישי קשירה והגדרה של KD שונים . (A) מערכות קלאסיות בעלות שני רכיבים. (B) מערכת תלת-רכיבית שבה קצה אחד של PROTAC יכול להיות רווי ולכן ניתן להעריך אותו כמערכת דו-רכיבית. (C) מערכת תלת-רכיבית שבה נצפה "אפקט הוו". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות ITC. טיטרציה של VHL לקומפלקס MZ1 (משמאל) או MZ1:Brd4BD2 (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות BLI. MZ1 מתווך את היווצרות VHL: MZ1: Brd4BD2 קומפלקס טרינרי. (A) נתונים גולמיים. (B) חיסור אותות רקע כאשר [MZ1] = 0. (C) התאמה קינטית של B לחילוץ k on, koff ו-KD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות SPR . (A) MZ1 מחייב ל-VHL. (B) MZ1:Brd4BD2 בינארי מורכב מחייב VHL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות SPR המראות את "אפקט הוו" של PPM1D-PROTAC מייצג. CRBN היה משותק על משטח שבב SA בעוד [PPM1D] נשמר על 1 מיקרומטר בניתוח עבור כל המקרים. (A) BRD-2512, תרכובת שנקשרת רק ל-CRBN, כמעט ולא נותנת תגובה. (B) BRD-4761, תרכובת שנקשרת רק ל-PPM1D, גם היא אינה נותנת מענה. (ג,ד) BRD-5110, PROTAC עם ראש הקרב של CRBN ב-BRD-2512 וראש הקרב של PPM1D ב-BRD-4761, גרם להיווצרות הקומפלקס הטרינרי. (E) סימולציה של תוצאות SPR בהנחה שה-KD בין CRBN לתרכובת הוא 1 מיקרומטר (שחור), 3 מיקרומטר (כחול), 10 מיקרומטר (אדום) או 30 מיקרומטר (ירוק). עקומת BRD-2512 היא בין 3 מיקרומטר ל-10 מיקרומטר, שהיא קרובה מאוד ל-KD הבינארי הנמדד, מה שמרמז על כך שאין קואופרטיביות (קואופרטיביות = 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפיון ביופיזי של יחסי הגומלין הבינאריים והטרינריים בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים יכול לספק תובנות ייחודיות ומשלימות ביחס למערכות תאיות בשימוש נרחב. הבנת הזיקה בין כל ראש קרב של מולקולת PROTAC לבין שותפיה קושרי החלבונים יכולה לעזור להנחות את מאמצי הכימיה הרפואית לקראת אופטימיזציה של אינטראקציות אלה. מבנים גבישיים שפורסמו בעבר של קומפלקסים פרוטאק טרינריים גילו כי אטומים באזור המקשר יכולים ליצור אינטראקציות עם אחד או שני השותפים קושרי החלבונים16,20. קביעה ניסיונית של הקואופרטיביות של היווצרות מורכבת טרינרית יכולה לתמוך באופטימיזציה של המקשר.

בדו"ח זה מתוארות שלוש טכניקות ביופיזיקליות שונות שיכולות לספק מידע על זיקות הקישור בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים. שיטה 1 מפרטת את מערך הניסוי של קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) עבור מולקולת PROTAC, MZ1, קומפלקס ליגאז VHL E3 וברומודומייןBrd4 BD2. תוצאות ITC הראו KD של 59 ננומטר עבור האינטראקציה הבינארית בין MZ1 ו- VHL ו- 4 ננומטר עבור האינטראקציה הטרינרית בין VHL לבין MZ1 ו- Brd4BD2 מעורבבים מראש. הזיקות היו עקביות עם אלה שנצפו ב- SPR (קשירת VHL משותקת ל- MZ1 K D = 26 ננומטר, קשירת VHL משותקת ל- MZ1 מעורב מראש ו- Brd4BD2 K D = 1 nM) ו- BLI (KD = 2.8 nM). בעוד שתוצאות ITC KD עבור קשירת VHL ל- MZ1 עקביות עם הערכים המדווחים16, הסטויכיומטריה המתקבלת שונה. הסבר אפשרי אחד לתוצאה זו הוא המסיסות הירודה של MZ1 במאגר מבוסס HEPES המשמש בפרוטוקול המתואר כאן, בעוד שהתוצאות מהספרות נוצרו באמצעות מאגר מבוסס ביס-טריס. המחברים העדיפו להשתמש באותם רכיבי מאגר ב- SPR, ITC ו- BLI.

שיטה 2 מתארת את מערך הניסוי לניתוח BLI של האינטראקציה של VHL משותק, ריכוז קבוע של Brd4BD2, וריכוזים משתנים של MZ1. בגלל מגבלות הרגישות של הטכניקה, ניתן היה ליצור ערכי KD, kon ו-koff עבור היווצרות מרוכבים טרינריים, אך לא עבור האינטראקציה הבינארית בין MZ1 לבין החלבונים.

שיטה 3 מתארת מבחני SPR מרובים. SPR רגיש יותר מ-BLI וניתן ליישם אותו כדי לבחון הן את האינטראקציות חלבון-מולקולה קטנה (בינארית) והן חלבון-חלבון (טרינרי). במקרה האחרון, יש לעקוב בקפידה אחר אותות הרקע מכיוון שחלבון באנליט עלול לתת אותות גבוהים ולא יציבים. SPR רגיש מאוד לריאגנטים עם אינדקס שבירה גבוה, כולל DMSO, גליצרול ודטרגנטים. אם החלבון מאוחסן במאגר המכיל גליצרול או חומר ניקוי, מאגר ההפעלה חייב להכיל ריכוזים תואמים של רכיבים אלה. לחלופין, החלת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מסירה אותם לחלוטין לפני כל ניסוי SPR. יש להקפיד להתאים את ריכוזי DMSO בין דגימות חיץ וניתוח מקרוב. תיקוני הממס DMSO מבוצעים בהתאם להוראות היצרן.

השיטה בשלב 3.1 מתארת את בדיקת SPR עבור האינטראקציה הבינארית VHL-MZ1. שיטה 3.2 מתארת את בדיקת SPR עבור הקומפלקס הטרנרי VHL: MZ1: Brd4 BD2 שבו VHL משותק, והאנליטי הוא Brd4 BD2 בלבד או קומפלקס MZ1:Brd4BD2. במערכת זו, האינטראקציה בין Brd4BD2 ו- VHL היא זניחה. המבנה המורכב הטרינרי הוא מאוד שיתופי (ɑ = 26). שיעור החריגה להיווצרות קומפלקס טרינרי הוא 0.014 s-1, הדורש שימוש בקינטיקה חד-מחזורית. תוצאות ITC מראות גם היווצרות מורכבת טרינרית שיתופית מאוד (ɑ=15). שיטות SPR בשלבים 3.3, 3.4 ו-3.5 מתארות בדיקות להערכת היווצרות קומפלקס בין CRBN ו-PPM1D המושרה על ידי נוכחות של מולקולת PROTAC, BRD-5110. למולקולת PROTAC יש זיקה חלשה ל-CRBN (K D ~ 3 μM) וזיקה חזקה ל-PPM1D (KD = 1-2 nM). כתוצאה מכך, הקשירה החלשה ל-CRBN אינה רוויה וגורמת ל"אפקט וו". בעוד שניתן להגביר את מסיסות הליגנד על ידי הגדלת ריכוז DMSO המשמש בניסוי, חשוב במקרים אלה לעקוב בקפידה אחר יציבות החלבון, אשר יכולה להיות מושפעת לרעה על ידי ריכוזים גבוהים של DMSO. בנוסף, DMSO יש חום גבוה של המסה אשר יכול לטשטש את החום של קשירת ליגנדות לחלבון. יש להקפיד להתאים את ריכוזי DMSO של התמיסה במזרק לבין התמיסה בתא. המחברים ממליצים על דיאליזה של שתי התמיסות כנגד אותו תכשיר חיץ.

המלצות והנחיות כלליות ניתנות על סמך הניסויים שבוצעו ודווחו כאן. כאשר הזיקות של אינטראקציות בינאריות בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים חזקות (KD <1 μM), SPR מספק זיקות אמינות וניתנות לשחזור יחד עם מידע רב ערך על הקואופרטיביות של היווצרות קומפלקס טרינרי. כאשר הזיקות של האינטראקציה הבינארית בין אחד השותפים הקושרים חלבונים לבין מולקולת PROTAC חלשות (KD >1 μM), יהיה צורך לשנות את מערך הבדיקה. במקרים אלה, השימוש בסימולציות מולקולריות שבהן קבועי הקישור קבועים, וריכוזי הליגנד והאנליט מגוונים יכול להיות בעל ערך בהנחיית תכנון הבדיקות ובפענוח תוצאות הניסוי. מבחני ITC מספקים מידע חשוב על הסטויכיומטריה של הקשירה, אך דורשים הרבה יותר ריאגנטים של חלבון ותרכובות ביחס ל- SPR ו- BLI. בנוסף, המסיסות של מולקולת PROTAC יכולה להיות מגבילה עבור ניסויי ITC. ל-BLI יש תפוקה גבוהה יותר מאשר ITC והוא דורש פחות ריאגנטים של חלבון ותרכובות. עם זאת, בשל מגבלות רגישות, BLI יכול לשמש רק כדי להעריך את היווצרות קומפלקס טרינרי ולא אינטראקציות בינאריות בין מולקולות PROTAC לבין שותפיהן לקשירת חלבונים. מומלץ להשתמש ב- SPR לבדיקות שגרתיות של מבחני קישור PROTAC בינאריים וטרינריים ומבחני BLI ו- ITC המשמשים לאימות אורתוגונלי של תוצאות מ- SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרס חדשנות ופיתוח טכנולוגיה מהמרכז לפיתוח טיפולים במכון ברוד של MIT והרווארד. המחברים מבקשים להודות לחברי צוות ההנהגה הבכירה ולוועדת הביקורת על תמיכתם בעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 203
פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter