Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

В данной работе мы описываем протоколы биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS), в которых участвуют убиквитин-лигазы фон Хиппеля-Линдау E3-лигазы (VHL) и цереблона (CRBN). Биофизические методы, проиллюстрированные здесь, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойную интерферометрию (BLI) и изотермическую титрованную калориметрию (ITC).

Abstract

Е3-лигазы и белки, предназначенные для деградации, могут быть индуцированы для образования комплексов гетеробифункциональными молекулами в многоступенчатом процессе. Кинетика и термодинамика взаимодействий способствуют эффективности убиквитинирования и, как следствие, деградации белка. Биофизические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и изотермическая титровательная калориметрия (ITC), предоставляют ценную информацию, которую можно использовать для оптимизации этих взаимодействий. С помощью двух модельных систем был создан биофизический инструментарий для понимания кооперативности формирования тройных комплексов и влияния «эффекта крюка» на кинетику связывания. В одном случае был оценен протеолиз, нацеленный на молекулу химеры (PROTAC), которая индуцировала образование тройного комплекса между Brd4BD2 и VHL. Гетеробифункциональная молекула MZ1 обладает нМ сродством как к белку Brd4BD2 (SPR K D = 1 нМ, ITC K D = 4 нМ), так и к комплексу VHL (SPR K D = 29 нМ, ИТК K D = 66 нМ). Для этой системы были разработаны надежные анализы SPR, BLI и ITC, которые воспроизводили опубликованные результаты, демонстрирующие кооперативность образования тройных комплексов. В другом случае была изучена молекула, которая индуцировала тройные комплексы между белком PPM1D с молекулярной массой 46,0 кДа и цереблоном [CRBN (319-442)]. Гетеробифункциональная молекула BRD-5110 имеет SPR KD = 1 нМ для PPM1D, но гораздо более слабое связывание с усеченным комплексом CRBN (319-442) (SPR KD= ~ 3 мкМ). В этом случае связывание CRBN в SPR не насыщалось, что приводило к «хуковому эффекту». Была проведена оценка требований к пропускной способности и реагентам для SPR, BLI и ITC, а также даны общие рекомендации по их применению к проектам PROTAC.

Introduction

Полиубиквитинирование белков в клетке является жестко регулируемым процессом, в котором участвуют ферменты семейства убиквитин-лигаз 1,2. Концевыми ферментами в этом пути являются убиквитин-лигазы E3, которые ковалентно присоединяют молекулы убиквитина к своим белок-связывающим партнерам3. Полиубиквитинирование этих партнеров, связывающих белки, нацелено на их протеолитическую деградацию протеасомой4. Эта система является частью процесса белкового гомеостаза, который был терапевтически использован для индукции деградации белков, участвующих в заболевании5. Малые молекулы, которые индуцируют взаимодействие между убиквитин-лигазами E3, такие как E3-лигаза фон Хиппеля-Линдау (VHL) или церебблон (CRBN), обычно состоят из боеголовки, связывающей E3-лигазу, соединенной гибким линкером с боеголовкой, которая связывается с белком, предназначенным для деградации. Эти гетеробифункциональные молекулы обычно называют протеолизом, нацеленным на химеры, или PROTACS6.

Разработка PROTACS включает в себя оценку способности молекул индуцировать деградацию белков в клетках. Было разработано множество систем клеточного анализа, которые отслеживают индуцированное взаимодействие между белком-мишенью и компонентами E3-лигазы, такими как VHL или CRBN, при обработке клеток молекулой PROTAC. Один из таких клеточных анализов, система nanoluc-Halotag7, включает в себя E3-лигазу, сплавленную с акцептором Halotag, и белок-мишень, помеченный донором нанолюка. Образование тройного комплекса сближает донор нанолюка и акцептор галотага, что позволяет передавать энергию от донора к акцептору, что приводит к излучению света. Вариации этой системы могут быть использованы для оценки клеточной проницаемости молекул PROTACS8 или изменения относительного уровня убиквитинирования целевого белка9. В то время как эти клеточные системы необходимы для оптимизации PROTACS, образование комплексов между E3-лигазами и белками, предназначенными для деградации, является многоступенчатымпроцессом. Кинетика и термодинамика бинарных и троичных взаимодействий способствуют эффективному убиквитинированию и, как следствие, деградации белка12,13,14.

Описаны протоколы, которые могут быть адаптированы для биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных PROTACS, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), биослойной интерферометрии (BLI) и изотермической титрующей калориметрии (ITC). Протоколы SPR и ITC для молекулы MZ1 PROTAC, которая индуцирует образование тройных комплексов между Brd4BD2 и VHL, полученные из литературных сообщений13,15 и описанные здесь, позволили повторить полученные результаты с некоторой модификацией описанных процедур, которые будут обсуждаться. В настоящий отчет включено описание анализа BLI, используемого для оценки образования тройного комплекса между MZI, Brd4,BD2 и VHL. Измерения сродства с помощью BLI согласуются с теми, которые наблюдались в SPR и ITC. Также описан ранее опубликованный протокол, в котором был разработан SPR-анализ для оценки образования тройного комплекса, индуцированного PROTAC, между PPM1D, протеинфосфатазой Ser/Thr, экспрессия которой индуцируется p53-зависимым образом16, и CRBN. В этом случае молекула PROTAC имеет наномолярное сродство к PPM1D и только микромолярное сродство к CRBN. В этом случае связывание молекулы PROTAC с CRBN не является насыщаемым, что приводит к часто наблюдаемому «эффекту крюка». Крюковый эффект является свойством трех систем организма, в которых есть два вида, которые могут образовывать гетеротримерный комплекс, когда оба связаны с молекулой-мостом (рис. 1)17. Эффект крючка наблюдается, когда перемычка находится в избыточной концентрации по сравнению с двумя другими видами. Результирующее состояние — это состояние, в котором бинарные взаимодействия вытесняют троичные взаимодействия. Системы, в которых наблюдается эффект крюка, требуют специальных соображений по планированию экспериментов, обсуждаемых в этом отчете. Приведены общие понятия и требования к реагентам для оценки использования биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных PROTAC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все белки были гиперэкспрессированы в E.coli с хорошей продуктивностью и чистотой (>80%) в соответствии с литературными протоколами18. Биотинилирование проводили с помощью BirA-катализируемой реакции18. Все малые молекулы получали в исходных растворах 1 мМ в 100% ДМСО. Процедуры, описанные в настоящем документе, не требуют специального лабораторного оборудования или мер предосторожности. Следует использовать стандартные лабораторные средства индивидуальной защиты (СИЗ) (например, лабораторный халат, защитные очки и перчатки).

Белки, применяемые в этом исследовании, перечислены ниже:
VHL: биотинилированный комплекс VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) с Avi-меткой на С-конце ElonginB.
Brd4BD2: немаркированный Brd4BD2(333-460)
CRBN: биотинилированный CRBN(319-442) с Avi-меткой на N-конце
PPM1D: немаркированный или двойной тег His8 PPM1D(1-420) на конце N

Ниже перечислены малые молекулы, примененные в этом исследовании:
MZ1 (МВт = 1002,6 Да): PROTAC, который связывается с VHL и Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~3 мкМ, не связывается с PPM1D
BRD-5110 (МВт = 872,0 Да): CRBN K D ~3 мкМ, PPM1D KD = 1-2 нМ
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): не связывается с CRBN, PPM1D KD = 1-2 нМ

1. Метод 1: ITC (изотермическая титрование, калориметрия)

ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование проводится с помощью микрокалориметра с автоматическим введением.

  1. Приготовление буфера: Приготовьте 3 л буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, pH 7,5.
  2. Диализ: Диализ VHL и Brd4BD2 (~ 500 мкл по 150 мкМ каждый) против 1 л буфера, приготовленного на стадии 1.1, 3 раза при 4 °C, в течение 4 ч, 2 ч и примерно 16 ч соответственно. Сохраните буфер после последнего диализа для использования на последующих этапах.
  3. Готовят образцы на 96-луночном планшете с пластиковой крышкой.
    1. Для каждого титрования приготовьте 400 мкл раствора для клетки, 125 мкл для шприца и 400 мкл буфера для очистки. Добавьте образцы в три последовательные лунки на пластине. Поскольку исходное вещество готовится при концентрации 1 мМ в 100% ДМСО, добавьте такое же процентное содержание ДМСО в белковые растворы, чтобы обеспечить соответствующий буфер в клетке и шприце. Добавьте 2% ДМСО в конечные растворы.
      1. Образец для титрования VHL в MZ1: Приготовьте клеточный раствор, содержащий 392 мкл буфера, 4 мкл MZ1 при 1 мМ (конечная концентрация 10 мкМ) и 4 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при 85,7 мкМ, 2,5 мкл 100% ДМСО (конечная концентрация 84 мкМ).
      2. Образцы для титрования VHL в буфер (данные будут использоваться для фонового вычитания данных, полученных из образца 1.3.1.1): Приготовьте клеточный раствор, содержащий буфер 392 мкл, 8 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и добавьте 2,5 мкл 100% ДМСО.
      3. Образцы для титрования VHL в MZ1 и Brd4 BD2: Приготовьте клеточный раствор, содержащий 392 мкл 17,1 мкМ Brd4BD2 (конечная концентрация 16,8 мкМ), 3,36 мкл MZ1 при 1 мМ (конечная концентрация 8,4 мкМ) и 4,64 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при концентрации 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и 2,5 мкл 100% ДМСО.
      4. Образцы для титрования VHL в Brd4 BD2 (фон 1.3.1.3): Готовят клеточный раствор, содержащий 392 мкл 17,1 мкМ Brd4BD2 (конечная концентрация 16,8 мкМ) и 8 мкл 100%ДМСО . Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при концентрации 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и 2,5 мкл 100% ДМСО.
  4. Запустите все четыре титрования на микрокалориметре. Каждый из них состоит из 19 инъекций шприцевого раствора объемом 2 мкл со скоростью 2 мкл/с с интервалом 120 с. Сделайте первичную инъекцию белка (0,4 мкл) и выбросьте его во время анализа данных. Проводите все эксперименты при температуре 25 °C, при перемешивании при 600 об/мин.
  5. Анализ данных: Подгонка данных к модели с одним сайтом связывания для получения стехиометрии (n), константы диссоциации (KD) и энтальпии связывания (ΔH) с помощью аналитического программного обеспечения, предоставленного производителем (рис. 2).

2. Метод 2: BLI (биослойная интерферометрия)

  1. Проводите эксперименты BLI с использованием датчиков, покрытых стрептавидином (SA), при комнатной температуре (RT) с частотой сбора данных 5 Гц. Во время автоматизированного эксперимента BLI убедитесь, что датчики неподвижны в пределах одной колонны и перемещаются между различными колоннами 96-луночной черной пластины с плоским дном и максимальным объемом лунки 392 мкл. Заполните каждую лунку планшета, используемого в эксперименте, 200 мкл раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BLI полезен только для обнаружения белок-белковых взаимодействий (т.е. образования тройных комплексов). Он недостаточно чувствителен, чтобы обнаруживать взаимодействия между белками и малыми молекулами.
    1. Приготовление буфера: Приготовьте 100 мл буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Оптимизация для шага иммобилизации: Нагружайте тестовый датчик на длину волны 1-3 нм, как рекомендует производитель. Для описанных здесь процедур используется нагрузка ~1,0 нм. Для этого опустите датчик в раствор, содержащий VHL в концентрации 1,5 мкг/мл, на 80 с.
    3. Выполняйте кинетические измерения BLI с помощью семи датчиков SA в следующей последовательности:
      1. Для первой базовой фазы погрузитесь в буфер на 60 с.
      2. Для фазы иммобилизации погружают в раствор VHL в концентрации 1,5 мкг/мл на 80 с.
      3. Для второй фазы базового уровня погрузитесь в буфер на 60 с.
      4. Для фазы ассоциации погружают в раствор с фиксированной концентрацией Brd4BD2 при 2 мкМ, фиксированной концентрацией ДМСО при 2% и различными концентрациями MZ1 при 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ, 6,3 нМ, 3,1 нМ и 0 нМ (эталонный датчик) в течение 300 с.
      5. Для фазы диссоциации погрузитесь в буфер на 600 с.
    4. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя. k on, k off и KD сообщаются для подгонки данных (рис. 3).

3. Способ 3: SPR (поверхностный плазмонный резонанс)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты SPR проводятся с использованием сенсорных чипов с покрытием из стрептавидина (SA) на RT. Несмотря на то, что чип NTA используется для детектирования между белком и малыми молекулами, его следует использовать с осторожностью при применении к тройному комплексу, так как наблюдается гораздо более высокий фон, чем у SA-чипа, возможно, из-за электростатических взаимодействий между поверхностью заряженного чипа и белком в анализируемом веществе.

  1. SPR для взаимодействия VHL-MZ1
    1. Подготовка буфера.
      1. Приготовьте буфер объемом 1 л, содержащий 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 0,005% P20, pH7,5, и пропустите его через фильтрующий блок 0,2 мкм.
      2. Удалите 20 мл буфера для дальнейшего использования (буфер без ДМСО) и наполните 20 мл ДМСО (2% ДМСО в окончательном прогонном буфере). Поддерживайте содержание ДМСО на уровне 2% во всех образцах, описанных ниже (шаги 3.1 и 3.2)
    2. Активируйте SA-чип в соответствии с протоколом производителя и иммобилизуйте VHL до ~2000 RU (введите раствор белка 5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
    3. Приготовьте MZ1 в 3-кратном 8-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией 10 мкМ на 384-луночном коническом дне, полупрозрачном полипропиленовом планшете с максимальным объемом 130 мкл. Накройте пластину самоклеящейся прозрачной пластиковой пленкой, совместимой с полипропиленовыми микропластинами.
      1. Приготовьте верхнюю концентрацию с помощью буфера, не содержащего ДМСО, чтобы обеспечить конечную концентрацию 2% ДМСО. К 147 мкл буфера, не содержащего ДМСО, добавьте 1,5 мкл запаса MZ1 на 1 мМ и 1,5 мкл 100% ДМСО.
      2. Приготовьте 3-кратное серийное разбавление с помощью погонного буфера, содержащего 2% ДМСО. К 100 мкл проточного буфера добавляют 50 мкл раствора в максимальной концентрации, приготовленного на стадии 3.1.3.1, и хорошо перемешивают до получения2-й самой высокой концентрации.
      3. Затем переносят 50 мкл раствора, приготовленного на стадии 3.1.3.2, в следующие 100 мкл проточного буфера, хорошо перемешивают до получения3-й наибольшей концентрации и т. д.
    4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокая производительность; время контакта: 120 с; время диссоциации: 300 с; Расход: 50 мкл/мин.
    5. Выполните анализ данных с помощью оценочного программного обеспечения, предоставленного производителем прибора. Стационарный анализ показал, что KD = 26 (± 3) нМ и Rmax ~91% (± 5%) связывания (рис. 4A)
  2. SPR для VHL: MZ1: тройной комплекс Brd4BD2
    1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.1.1.
    2. Активируйте микросхему SA по протоколу производителя и иммобилизуйте VHL до ~100 RU. Вводят белковый раствор 0,5 мкг/мл VHL со скоростью потока 5 мкл/мин и временем контакта 1-5 мин до достижения поверхностной плотности ~100 RU.
    3. Подготовьте образцы для двух 5-кратных 5-точечных однотактных инъекций в 96-луночную прозрачную полистирольную круглую нижнюю пластину с максимальным объемом 323 мкл и накройте ее самоклеящейся прозрачной пластиковой пленкой, совместимой с полистирольными микропланшетами, как описано в шагах 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Отрицательный контроль: аналит содержит только Brd4BD2 .
        1. Приготовьте максимальную концентрацию при 25 мкМ в поточном буфере объемом 200 мкл (#A5)
        2. Добавьте по 160 мкл Brd4BD2 на 2 мкМ в работающем буфере к следующим 4 лункам слева (#A1-A4)
        3. Перелейте 40 мкл А5 в А4. Хорошо перемешайте.
        4. Перенесите 40 мкл А4 в А3. Хорошо перемешайте. Продолжайте делать это до A1.
      2. Тройное комплексообразование: аналит содержит MZ1 и Brd4BD2.
        1. Приготовьте верхнюю концентрацию, добавив 4 мкл MZ1 при 20 мкМ в 100%-ном растворе ДМСО к 196 мкл, содержащему 25,5 мкМ Brd4BD2 в буфере без ДМСО (#B5). Конечные концентрации: 25 мкМ Brd4 BD2, 100 нМ MZ1 и 2%ДМСО.
        2. Добавьте по 160 мкл Brd4BD2 при 2 мкМ в работающем буфере к следующим 4 лункам слева (#B1-B4)
        3. Перелейте 40 мкл B5 в B4. Хорошо перемешайте.
        4. Перелейте 40 мкл B4 в B3. Хорошо перемешайте. Продолжайте делать это до B1.
    4. Запуск SPR с помощью однотактной установки: Время контакта: 100 с; время диссоциации: 720 с; Расход: 50 мкл/мин. Нанесите три инъекции буфера перед каждым образцом, чтобы обеспечить стабильный фон.
    5. Анализ данных: Примените третью инъекцию буфера в качестве фона для вычитания. В качестве отрицательного контроля, когда MZ1 отсутствует, отклик SPR между VHL и Brd4BD2 пренебрежимо мал. При наличии MZ1 кинетическая подгонка указывает на взаимодействие между VHL и комплексом MZ1-Brd4BD2 имеет k on = 7,9 (± 1,5) * 107 /M/s, koff = 0,014 с-1 и KD = 1 нМ. (Рисунок 4Б)
  3. SPR для CRBN и маломолекулярных взаимодействий
    1. Подготовка буфера.
      1. Приготовьте буфер объемом 1 л, содержащий 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2, 0,5 мМ TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, и пропустите его через фильтрующий блок0,2 мкм.
      2. Удалите 20 мл буфера и залейте 20 мл 100% ДМСО (2% ДМСО в конечном рабочем буфере). Важно поддерживать содержание ДМСО на уровне 2% во всех образцах, описанных ниже (шаги 3.3, 3.4 и 3.5).
    2. Активируйте микросхему SA по протоколу производителя и иммобилизуйте CRBN до ~800 RU.
    3. Готовят соединения в 3-кратном последовательном разведении по 6 точек на 384-луночном планшете с максимальной концентрацией 30 мкМ, как описано в 3.1.3.
    4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокопроизводительный, время контакта: 60 с, время диссоциации: 90 с; Расход: 50 мкл/мин. Для этой системы достаточно трех буферных инъекций для получения стабильного фона. Для других пробирных систем может потребоваться выполнение дополнительных буферных инъекций.
    5. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стационарный анализ показывает, что KD BRD-2512 и BRD-5110 составляют около 3 мкМ. Однако связывание достигало только ~ 70%Rmax связывания при максимальной концентрации. Как слабое сродство, так и форма сенсорной диаграммы указывают на вероятность нерастворимости соединений при высоких концентрациях. Таким образом, фактическое значение KD может быть выше 3 мкМ. BRD-4761, который не связывается с CRBN, был включен в качестве отрицательного контроля.
  4. SPR для PPM1D и низкомолекулярных взаимодействий
    1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.3.1. Используйте чип датчика нитрилоуксусной кислоты (NTA).
    2. Применяйте однотактный, потому что боеголовка PPM1D имеет медленное включение k и выключение k. Регенерируйте чип NTA, используя настройки производителя по умолчанию, и иммобилизуйте PPM1D до ~ 1000 RU после каждой инъекции соединения (вводите белковый раствор 5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
    3. Готовят соединения в 3-кратном 5-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией при 400 нМ, как описано в 3.1.3.
    4. Запустите SPR с помощью однотактной настройки: Режим: высокопроизводительный; время контакта: 90 с; время диссоциации: 600 с; Расход: 50 мкл/мин. Нанесите три инъекции буфера перед каждым соединением, чтобы обеспечить стабильный фон.
    5. Анализ данных. Примените третью инъекцию буфера в качестве фона для вычитания. Как отрицательный контроль, BRD-2512 не проявляет связывания с PPM1D. Для BRD-4761 и BRD-5110 кинетическая подгонка показала, что KD для обоих составляет 1-2 нМ.
  5. SPR для CRBN:PROTAC: тройной комплекс PPM1D
    1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.3.1.
    2. Активировать SA-чип в соответствии с протоколом производителя и иммобилизовать CRBN до ~35 RU (ввести белковый раствор 0,5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
    3. Приготовьте три соединения в 3-кратном 6-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией 30 мкМ при сохранении [PPM1D] на уровне 1 мкМ во всех образцах, включая заготовки, используя метод, описанный в шаге 3.2.3.
    4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокая производительность; время контакта: 60 с; время диссоциации: 90 с; Расход: 50 мкл/мин.
    5. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как BRD-2512 и BRD-4761 демонстрируют нулевую/незначительную реакцию, BRD-5110 отчетливо демонстрирует «эффект крюка» в установившемся состоянии с быстрой кинетикой включения/выключения (рис. 5A-C). Экспериментальная реакция связывания BRD-5110 (рис. 5C) находится между предсказанными результатами моделирования реакциями при предположении, что K D (CRBN, cpd) составляет 3 или 10 мкМ (рис. 5E), что позволяет предположить, что троичный K D и бинарный K D очень похожи. Отсутствует явная кооперативность PPM1D:BRD-5110:CRBN комплексообразования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Характеристику бинарного комплекса VHL:MZ1 и тройного комплекса VHL:MZ1:Brd4BD2 можно найти на рисунке 2 (ITC), рисунке 3 (BLI) и рисунке 4 (SPR) с использованием очень похожего буфера. K D, извлеченный из ортогональных анализов, является последовательным. Кооперативность может быть рассчитана по формуле K D (двоичная) / KD (троичная), что является весьма положительным показателем (15 из ITC или 26 из SPR).

Определение характеристик системы CRBN:PROTAC:PPM1D проводилось с помощью SPR (рис. 5A-D). CRBN был иммобилизован до ~35 RU, чтобы облегчить наблюдение за образованием тройного комплекса. Привязка только PROTAC привела к сигналу <2 RU, что ниже шума. PPM1D в анализируемом веществе дает высокий фоновый сигнал на поверхности микросхемы SA, а максимальная концентрация, которая может быть применена, составляет около 1 мкМ. Это значение ниже, чем KD между КРБН и его боевой частью ≥3 мкМ), поэтому ожидается «эффект крюка». SPR достаточно чувствителен, чтобы обнаружить его, что хорошо согласуется с моделированием (рис. 5E). Моделирование проводилось с использованием некооперативных равновесий, описанных в литературе19, в сочетании с классическим расчетом SPR [Response max = (ResponseLigand × MassImmobilization)/MassLigand]. Поскольку K D между CRBN и соединением не определяется точно из-за нерастворимости соединения в высоких концентрациях, моделирование проводилось с использованием четырех предполагаемых KD: 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ или 30 мкМ. Экспериментальные результаты оказались между смоделированными кривыми 3 мкМ и 10 мкМ, что почти идентично KD в бинарной системе, что позволяет предположить отсутствие кооперативности.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация трех сценариев связывания и определение различных KD. (A) Классические двухкомпонентные системы. (B) Трехкомпонентная система, в которой один конец PROTAC может быть насыщен таким образом, ее можно оценить как двухкомпонентную систему. (В) Трехкомпонентная система, в которой наблюдается «эффект крюка». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Результаты ИТК. Титрование VHL в комплекс MZ1 (слева) или MZ1:Brd4BD2 (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Результаты BLI. MZ1 опосредует образование тройного комплекса VHL:MZ1:Brd4BD2. (А) Необработанные данные. (B) Вычитание фоновых сигналов, где [MZ1] = 0. (C) Кинетическая подгонка B для извлечения k on, koff и KD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты SPR . (A) Привязка MZ1 к VHL. (B) Связывание бинарного комплекса MZ1:Brd4BD2 с VHL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Результаты SPR, показывающие «эффект крючка» репрезентативного PPM1D-PROTAC. CRBN иммобилизовали на поверхности SA-чипа, в то время как [PPM1D] поддерживали на уровне 1 мкМ в аналите во всех случаях. (A) BRD-2512, соединение, которое связывается только с CRBN, почти не дает ответа. (B) BRD-4761, соединение, которое связывается только с PPM1D, также не дает ответа. (С,Д) BRD-5110, PROTAC с боевой частью CRBN в BRD-2512 и боевой частью PPM1D в BRD-4761, индуцировал образование троичного комплекса. (E) Моделирование результатов SPR, предполагающее, что KD между CRBN и соединением составляет 1 мкМ (черный), 3 мкМ (синий), 10 мкМ (красный) или 30 мкМ (зеленый). Кривая BRD-2512 находится в диапазоне от 3 мкМ до 10 мкМ, что очень близко к измеренному бинарному KD, что указывает на отсутствие кооперативности (кооперативность = 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Биофизическая характеристика бинарных и троичных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками может дать уникальную и дополняющую информацию о широко используемых клеточных системах. Понимание сродства между каждой боеголовкой молекулы PROTAC и ее партнерами по связыванию с белками может помочь направить усилия медицинской химии на оптимизацию этих взаимодействий. Ранее опубликованные кристаллические структуры тройных комплексов PROTAC показали, что атомы в области линкера могут образовывать взаимодействия с одним или обоими партнерами по связыванию белков16,20. Экспериментальное определение кооперативности образования тройных комплексов может способствовать оптимизации линкера.

В этом отчете описано использование трех различных биофизических методов, которые могут предоставить информацию о сродстве связывания между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками. В методе 1 подробно описана экспериментальная установка изотермической калориметрии титрования (ITC) для молекулы PROTAC, MZ1, комплекса лигазы VHL E3 и бромодомена Brd4BD2. Результаты ITC показали, что KD составляет 59 нМ для бинарного взаимодействия между MZ1 и VHL и 4 нМ для троичного взаимодействия между VHL и предварительно смешанными MZ1 и Brd4BD2. Сродство соответствовало таковым, наблюдаемым при SPR (иммобилизованное связывание VHL с MZ1 KD = 26 нМ, иммобилизованное связывание VHL с предварительно смешанными MZ1 и Brd4BD2 K D=1 нМ) и BLI (KD= 2,8 нМ). В то время как результаты ITC KD для связывания VHL с MZ1 согласуются с зарегистрированными значениями16, полученная стехиометрия отличается. Одним из возможных объяснений этого результата является плохая растворимость MZ1 в буфере на основе HEPES, используемом в протоколе, описанном здесь, в то время как результаты из литературы были получены с использованием буфера на основе Bis-tris. Авторы предпочли использовать одни и те же буферные компоненты для SPR, ITC и BLI.

Метод 2 описывает экспериментальную установку для BLI-анализа взаимодействия иммобилизованного VHL, фиксированной концентрации Brd4BD2 и изменяющейся концентрации MZ1. Из-за ограничений чувствительности метода могут быть получены значения KD, kon и koff для образования тройных комплексов, но не для бинарного взаимодействия между MZ1 и белками.

Метод 3 описывает несколько анализов SPR. SPR более чувствителен, чем BLI, и может применяться для наблюдения как белок-мелкомолекулярный (бинарный), так и белок-белковый (тройной) взаимодействия. В последнем случае следует тщательно контролировать фоновые сигналы, так как белок в анализируемом веществе может давать высокие и нестабильные сигналы. SPR очень чувствителен к реагентам с высоким показателем преломления, включая ДМСО, глицерин и моющие средства. Если белок хранится в буфере, содержащем глицерин или детергент, то работающий буфер должен содержать соответствующие концентрации этих компонентов. В качестве альтернативы, применение эксклюзионной хроматографии полностью удаляет их перед любым экспериментом SPR. Следует следить за тем, чтобы концентрации ДМСО в буферных образцах и образцах аналита были точно согласованы. Коррекция растворителя ДМСО выполняется в соответствии с инструкциями производителя.

Метод, описанный на шаге 3.1, описывает SPR-анализ бинарного взаимодействия VHL-MZ1. Метод 3.2 описывает SPR-анализ для тройного комплекса VHL: MZ1: Brd4 BD2, в котором VHL иммобилизован, а анализируемым веществом является либо только Brd4 BD2, либо комплекс MZ1:Brd4BD2. В этой системе взаимодействие между Brd4BD2 и VHL пренебрежимо мало. Формирование троичного комплекса отличается высокой кооперативностью (ɑ = 26). Коэффициент отклонения для образования тройного комплекса составляет 0,014 с-1, что требует использования однотактной кинетики. Результаты, полученные с помощью МТК, также показывают высококооперативное формирование троичного комплекса (ɑ=15). Методы SPR на этапах 3.3, 3.4 и 3.5 описывают анализы для оценки образования комплекса между CRBN и PPM1D, индуцированного присутствием молекулы PROTAC, BRD-5110. Молекула PROTAC имеет слабое сродство к CRBN (K D ~3 мкМ) и сильное сродство к PPM1D (KD = 1-2 нМ). В результате слабое связывание с CRBN не насыщается и приводит к наблюдаемому «хук-эффекту». Несмотря на то, что можно увеличить растворимость лигандов путем увеличения концентрации ДМСО, используемой в эксперименте, в таких случаях важно тщательно контролировать стабильность белка, на которую могут негативно повлиять высокие концентрации ДМСО. Кроме того, ДМСО имеет высокую температуру растворения, которая может затмить теплоту связывания лигандов с белком. Следует следить за тем, чтобы концентрация ДМСО раствора в шприце и раствора в клетке соответствовала друг другу. Авторы рекомендуют диализ двух растворов на фоне одного и того же буферного препарата.

Общие рекомендации и указания приведены на основе проведенных и представленных здесь экспериментов. Когда сродство бинарных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками велико (KD <1 мкМ), SPR обеспечивает надежное и воспроизводимое сродство наряду с ценной информацией о кооперативности образования тройных комплексов. Когда сродство бинарного взаимодействия между одним из партнеров по связыванию белка и молекулой PROTAC слабое (KD >1 мкМ), необходимо изменить схему анализа. В таких случаях использование молекулярного моделирования, в котором константы связывания фиксированы, а концентрации лиганда и анализируемого вещества варьируются, может быть полезным для разработки анализа и интерпретации экспериментальных результатов. Анализы ITC предоставляют важную информацию о стехиометрии связывания, но требуют значительно большего количества белковых и сложных реагентов по сравнению с SPR и BLI. Кроме того, растворимость молекулы PROTAC может быть предельной для экспериментов ITC. BLI имеет более высокую пропускную способность, чем ITC, и требует меньшего количества белковых и сложных реагентов. Однако из-за ограничений чувствительности BLI может быть использован только для оценки образования тройного комплекса, а не бинарных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками. Рекомендуется использовать SPR для рутинного тестирования как бинарных, так и тройных анализов связывания PROTAC, а также анализов BLI и ITC, используемых для ортогональной валидации результатов SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или иных конфликтов интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана премией за инновации и развитие технологий от Центра развития терапии при Институте Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда. Авторы хотели бы поблагодарить членов высшего руководства и комитет по рассмотрению за поддержку этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 203
Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter