Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

udvikling og anvendelse af biofysiske assays til evaluering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

Her beskriver vi protokoller for den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS), der involverer ubiquitin ligaserne Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) og Cereblon (CRBN). Biofysiske metoder illustreret heri omfatter overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, kan induceres til dannelse af komplekser af heterobifunktionelle molekyler i en flertrinsproces. Kinetikken og termodynamikken af de involverede interaktioner bidrager til effektiviteten af ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet. Biofysiske teknikker såsom overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) giver værdifuld information, der kan bruges til optimering af disse interaktioner. Ved hjælp af to modelsystemer blev der etableret et biofysisk assayværktøjssæt til forståelse af kooperativiteten af ternær kompleks dannelse og virkningen af 'krogeffekten' på bindingskinetikken. I et tilfælde blev et proteolyse rettet mod kimær (PROTAC) molekyle, der inducerede ternær kompleks dannelse mellem Brd4BD2 og VHL, evalueret. Det heterobifunktionelle molekyle, MZ1, har nM-affiniteter for både Brd4BD2-proteinet (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) og VHL-komplekset (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Til dette system blev der udviklet robuste SPR-, BLI- og ITC-assays, der gengav offentliggjorte resultater, der demonstrerede samarbejdsevnen af ternær kompleks dannelse. I det andet tilfælde blev et molekyle, der inducerede ternære komplekser mellem et 46,0 kDa-protein, PPM1D og cereblon [CRBN (319-442)] undersøgt. Det heterobifunktionelle molekyle, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM for PPM1D, men meget svagere binding mod det afkortede CRBN (319-442) kompleks (SPR KD = ~ 3 μM). I dette tilfælde var bindingen for CRBN i SPR ikke mættet, hvilket resulterede i en "krogeffekt". Krav til gennemløb og reagens for SPR, BLI og ITC blev evalueret, og der blev givet generelle anbefalinger til deres anvendelse på PROTAC-projekter.

Introduction

Polyubiquitinering af proteiner i cellen er en stramt reguleret proces, der involverer enzymer i Ubiquitin Ligase-familien 1,2. De terminale enzymer i vejen er E3 ubiquitin ligaser, der kovalent binder ubiquitinmolekyler til deres proteinbindende partnere3. Polyubiquitinationen af disse proteinbindende partnere er rettet mod dem til proteolytisk nedbrydning af proteasomet4. Dette system er en del af proteinhomeostaseprocessen, der er blevet terapeutisk udnyttet til at fremkalde nedbrydning af proteiner involveret i sygdom5. Små molekyler, der inducerer interaktionen mellem E3 ubiquitinligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) eller cereblon (CRBN), består typisk af et E3-ligasebindende sprænghoved forbundet med en fleksibel linker til et sprænghoved, der binder til proteinet, der er målrettet mod nedbrydning. Disse heterobifunktionelle molekyler kaldes almindeligvis proteolyse rettet mod kimærer eller PROTACS6.

Udviklingen af PROTACS indebærer evaluering af molekylers evne til at inducere nedbrydning af proteiner i celler. Mange cellulære analysesystemer er blevet udviklet, der overvåger den inducerede interaktion mellem målproteinet og E3-ligasekomponenterne, såsom VHL eller CRBN, efter behandling af cellerne med et PROTAC-molekyle. Et sådant cellulært assay, nanoluc-Halotag-systemet7, involverer en E3-ligase fusioneret til Halotag-acceptoren og et målprotein mærket med en nanoluc-donor. Ternær kompleks dannelse bringer nanolucdonoren og Halotag-acceptoren i nærhed, hvilket muliggør overførsel af energi fra donoren til acceptoren, hvilket resulterer i udsendelse af lys. Variationer af dette system kan bruges til at vurdere den cellulære permeabilitet af PROTACS-molekyler8 eller ændringer i det relative niveau af målproteinubiquitination9. Mens disse cellulære systemer er afgørende for at drive optimeringen af PROTACS, er dannelsen af komplekser mellem E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, en flertrinsproces10,11. Kinetikken og termodynamikken i de involverede binære og ternære interaktioner bidrager til effektivitet, ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet12,13,14.

Heri beskrives protokoller, der kan tilpasses til den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af PROTACS ved anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). SPR- og ITC-protokoller for MZ1 PROTAC-molekylet, der inducerer ternær kompleks dannelse mellem Brd4BD2 og VHL afledt af litteraturrapporter13,15 og beskrevet her, var i stand til at rekapitulere de rapporterede resultater med en vis ændring af de rapporterede procedurer, som vil blive diskuteret. En beskrivelse af et BLI-assay, der anvendes til at evaluere ternær kompleks dannelse mellem MZI, Brd4BD2 og VHL, er inkluderet i denne rapport. Affinitetsmålinger fra BLI var konsistente med dem, der blev observeret i SPR og ITC. En tidligere offentliggjort protokol, hvori der blev udviklet et SPR-assay til vurdering af den PROTAC-inducerede ternære komplekse dannelse mellem PPM1D, en Ser/Thr-proteinphosphatase, hvis ekspression induceres på en p53-afhængig måde16, og CRBN, beskrives også. I dette tilfælde har PROTAC-molekylet en nanomolær affinitet for PPM1D, men kun en mikromolær affinitet for CRBN. I dette tilfælde er bindingen af PROTAC-molekylet til CRBN ikke mættet, hvilket resulterer i den almindeligt observerede "krogeffekt". Krogeffekten er en egenskab ved tre kropssystemer, hvor der er to arter, der kan danne et heterotrimerisk kompleks, når begge er bundet til et bromolekyle (figur 1)17. Krogeffekten observeres, når brobygningsarten er i overskydende koncentration i forhold til de to andre arter. Den resulterende tilstand er en, hvor de binære interaktioner udkonkurrerer de ternære interaktioner. De systemer, hvor krogeffekten observeres, kræver specifikke eksperimentelle designovervejelser, der diskuteres i denne rapport. Generelle begreber og reagenskrav til evaluering af anvendelsen af biofysiske assays til evaluering af PROTAC-induceret ternær kompleks dannelse er tilvejebragt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle proteinerne blev overudtrykt i E. coli med godt udbytte og renhed (>80%) efter litteraturprotokollerne18. Biotinylering blev udført under anvendelse af en BirA-katalyseret reaktion18. Alle små molekyler blev fremstillet ved 1 mM stamopløsninger i 100% DMSO. De procedurer, der er beskrevet heri, kræver ikke specialiseret laboratoriesikkerhedsudstyr eller forholdsregler. Standard laboratorie personlige værnemidler (PPE) bør anvendes (dvs. lab coat, sikkerhedsbriller og handsker).

Proteiner anvendt i denne undersøgelse er anført nedenfor:
VHL: biotinyleret VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) kompleks med Avi-tag ved C-terminalen på ElonginB.
Brd4BD2: Ikke-mærket Brd4BD2(333-460)
CRBN: biotinyleret CRBN(319-442) med Avi-tag ved N-terminalen
PPM1D: ikke-mærket eller dobbelt His8-mærket PPM1D (1-420) ved N-terminalen

Små molekyler anvendt i denne undersøgelse er anført nedenfor:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC, der binder til VHL og Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN KD ~3 μM, binder ikke til PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): binder ikke til CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM

1. Metode 1: ITC (isotermisk titreringskalorimetri)

BEMÆRK: Titreringer udføres ved hjælp af et mikrokalorimeter med automatisk injektion.

  1. Bufferpræparat: Forbered 3 liter buffer indeholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Dialyse: Dialyser VHL og Brd4BD2 (~ 500 μL ved 150 μM hver) mod 1 liter buffer fremstillet i trin 1.1, 3 gange ved 4 °C, i henholdsvis 4 timer, 2 timer og ca. 16 timer. Gem bufferen efter sidste dialyse til brug i efterfølgende trin.
  3. Forbered prøver på en 96-brøndplade med et plastikdæksel.
    1. Til hver titrering fremstilles 400 μL opløsning til cellen, 125 μL til sprøjten og 400 μL buffer til rengøring. Der tilsættes prøver til tre på hinanden følgende brønde på pladen. Da sammensat stamme fremstilles ved 1 mM i 100% DMSO, tilsættes den samme procentdel DMSO til proteinopløsningerne for at sikre den matchende buffer i cellen og sprøjten. Tilsæt 2% DMSO til de endelige løsninger.
      1. Prøve til titrering af VHL til MZ1: Forbered celleopløsning indeholdende 392 μL buffer, 4 μL MZ1 ved 1 mM (10 μM slutkoncentration) og 4 μL 100% DMSO. Klargør en sprøjteopløsning indeholdende 122,5 μL VHL ved 85,7 μM, 2,5 μL 100% DMSO (84 μM slutkoncentration).
      2. Prøver til titrering af VHL i bufferen (data vil blive anvendt til baggrundssubtraktion af data genereret fra prøve 1.3.1.1): Der fremstilles celleopløsning indeholdende 392 μL buffer, 8 μL 100% DMSO. Klargør en sprøjteopløsning indeholdende 122,5 μL VHL ved 85,7 μM (84 μM slutkoncentration) og tilsæt 2,5 μL 100% DMSO.
      3. Prøver til titrering af VHL i MZ1 og Brd4 BD2: Forbered celleopløsning indeholdende 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM slutkoncentration), 3,36 μL MZ1 ved 1 mM (8,4 μM slutkoncentration) og 4,64 μL 100% DMSO. Klargør en sprøjteopløsning indeholdende 122,5 μL VHL ved 85,7 μM (84 μM slutkoncentration) og 2,5 μL 100 % DMSO.
      4. Prøver til titrering af VHL til Brd4 BD2 (baggrund 1.3.1.3): Der fremstilles celleopløsning indeholdende 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM slutkoncentration) og 8 μL 100 % DMSO. Klargør en sprøjteopløsning indeholdende 122,5 μL VHL ved 85,7 μM (84 μM slutkoncentration) og 2,5 μL 100 % DMSO.
  4. Kør alle fire titreringer på mikrokalorimeteret. Hver består af 19 injektioner af 2 μL sprøjteopløsning med en hastighed på 2 μL/s med 120 s tidsintervaller. Foretag en indledende injektion af protein (0,4 μL) og kassér det under dataanalyse. Alle forsøg udføres ved 25 °C under omrøring ved 600 o/min.
  5. Dataanalyse: Tilpas dataene til en model med et enkelt bindingssted for at opnå støkiometri (n), dissociationskonstant (KD) og entalpi af binding (ΔH) ved hjælp af analysesoftwaren leveret af producenten (figur 2).

2. Metode 2: BLI (biolayer interferometry)

  1. Udfør BLI-eksperimenter ved hjælp af streptavidin (SA) belagte sensorer ved stuetemperatur (RT) med en anskaffelseshastighed på 5 Hz. Under det automatiserede BLI-eksperiment skal du sikre dig, at sensorerne er stationære inden for en enkelt søjle og bevæge sig mellem forskellige kolonner i en 96-brønds, flad bund, sort plade med et maksimalt brøndvolumen på 392 μL. Fyld hvert hul på pladen, der blev brugt i eksperimentet, med 200 μL opløsning.
    BEMÆRK: BLI er kun nyttigt til at detektere protein-proteininteraktioner (dvs. ternær kompleks dannelse). Det er ikke følsomt nok til at detektere interaktioner mellem proteiner og små molekyler.
    1. Bufferpræparation: Forbered 100 ml buffer indeholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Optimering til immobiliseringstrinnet: Indlæs testsensoren til 1-3 nm, som anbefalet af producenten. En belastning på ~ 1,0 nm bruges til de procedurer, der er beskrevet her. For at opnå dette dyppes sensoren i en opløsning indeholdende VHL ved 1,5 μg/ml i 80 sekunder.
    3. Udfør kinetiske BLI-målinger ved at anvende syv SA-sensorer ved hjælp af følgende sekvens:
      1. I den første baselinefase dyppes ned i bufferen i 60 s.
      2. Til immobiliseringsfasen dyppes ned i en opløsning af VHL ved 1,5 μg/ml i 80 s.
      3. I den anden basisfase dyppes ned i bufferen i 60 s.
      4. I associeringsfasen dyppes i opløsning af en fast koncentration af Brd4BD2 ved 2 μM, fast koncentration af DMSO ved 2% og varierende koncentrationer af MZ1 ved 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM og 0 nM (referencesensor) i 300 s.
      5. I dissociationsfasen dyppes i buffer i 600 s.
    4. Udfør dataanalyse ved hjælp af producentens software. k on, k off og kD rapporteres for datatilpasning (figur 3).

3. Metode 3: SPR (overfladeplasmonresonans)

BEMÆRK: Alle SPR-eksperimenter udføres ved hjælp af streptavidin (SA) belagte sensorchips ved RT. Selvom NTA-chippen bruges til påvisning mellem protein og små molekyler, skal den bruges med forsigtighed, når den påføres det ternære kompleks, da der observeres en meget højere baggrund end SA-chippen, muligvis på grund af elektrostatiske interaktioner mellem den ladede chipoverflade og protein i analytten.

  1. SPR til VHL-MZ1-interaktion
    1. Forberedelse af buffer.
      1. Forbered en 1 L buffer indeholdende 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5, og før den gennem en 0,2 μm filterenhed.
      2. Fjern 20 ml buffer til fremtidig brug (DMSO-fri buffer) og genopfyld med 20 ml DMSO (2% DMSO i den endelige løbende buffer). Hold DMSO på 2% i alle prøverne beskrevet nedenfor (trin 3.1 og 3.2)
    2. Aktivér SA-chippen efter producentens protokol, og immobiliser VHL til ~2000 RU (injicer proteinopløsning på 5 μg/ml ved 5 μL/min).
    3. Forbered MZ1 i en 3-fold, 8-punkts seriel fortynding med den øverste koncentration ved 10 μM på en 384-brønds, konisk bund, gennemskinnelig polypropylenplade med et maksimalt volumen på 130 μL. Dæk pladen med selvklæbende, gennemsigtige plastfolier, der er kompatible med polypropylenmikroplader.
      1. Forbered den øverste koncentration med den DMSO-fri buffer for at sikre 2% DMSO ved den endelige koncentration. Til 147 μL DMSO-fri buffer tilsættes 1,5 μL MZ1-lager ved 1 mM og 1,5 μL 100% DMSO.
      2. Forbered den 3-foldige serielle fortynding med løbebufferen indeholdende 2% DMSO. Til 100 μL af løbebufferen tilsættes 50 μL opløsning ved den øverste koncentration fremstillet i trin 3.1.3.1, og der blandes godt for at forberede den 2. højeste koncentration .
      3. Derefter overføres 50 μL af opløsningen fremstillet i trin 3.1.3.2 til de næste 100 μL løbende buffer, blandes godt for at forberede den 3. højeste koncentration osv.
    4. Kør SPR ved hjælp af multicyklusopsætningen: Mode: High-performance; kontakttid: 120 s; dissociationstid: 300 s; strømningshastighed: 50 μL / min.
    5. Udfør dataanalyse ved hjælp af instrumentproducentens evalueringssoftware. Steady-state-analyse indikerede, at KD = 26 (± 3) nM og Rmax på ~91% (± 5%) binding opnået (figur 4A)
  2. SPR for VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks
    1. Bufferen klargøres som beskrevet i trin 3.1.1.
    2. Aktivér SA-chippen efter producentens protokol, og immobiliser VHL til ~ 100 RU. Injicer en proteinopløsning på 0,5 μg/ml VHL med en strømningshastighed på 5 μL/min og kontakttid mellem 1-5 min, indtil en overfladetæthed på ~100 RU er nået.
    3. Der fremstilles prøver til to 5-punktsinjektioner med 5 gange etcyklus i en rund bundplade med 96 brønde, klare polystyren med et maksimalt volumen på 323 μL, og den dækkes med selvklæbende, gennemsigtige plastfolier, der er kompatible med polystyrenmikroplader som beskrevet i trin 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Negativ kontrol: Analysanden indeholder kun Brd4BD2 .
        1. Der fremstilles topkoncentration ved 25 μM i løbende buffer med et volumen på 200 μL (#A5)
        2. Der tilsættes 160 μL hver af Brd4BD2 ved 2 μM i løbebufferen til de næste 4 huller til venstre (#A1-A4)
        3. Der overføres 40 μL A5 til A4. Bland godt.
        4. Der overføres 40 μL A4 til A3. Bland godt. Bliv ved med at gøre det indtil A1.
      2. Ternær kompleks dannelse: analyt indeholder MZ1 og Brd4BD2.
        1. Den øverste koncentration fremstilles ved at tilsætte 4 μL MZ1 ved 20 μM i 100 % DMSO-opløsning til 196 μL indeholdende 25,5 μM Brd4BD2 i DMSO-fri buffer (#B5). De endelige koncentrationer er 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 og 2% DMSO.
        2. Der tilsættes 160 μL hver af Brd4BD2 ved 2 μM i løbebufferen til de næste 4 huller til venstre (#B1-B4)
        3. Der overføres 40 μL B5 til B4. Bland godt.
        4. Der overføres 40 μL B4 til B3. Bland godt. Bliv ved med at gøre det indtil B1.
    4. Kør SPR ved hjælp af enkeltcyklusopsætningen: Kontakttid: 100 s; dissociationstid: 720 s; strømningshastighed: 50 μL / min. Der anvendes tre bufferinjektioner før hver prøve for at sikre en stabil baggrund.
    5. Dataanalyse: Anvend den tredje injektion af bufferen som baggrund for subtraktion. Som den negative kontrol, når MZ1 ikke er til stede, er SPR-responsen mellem VHL og Brd4BD2 ubetydelig. Når MZ1 er til stede, indikerer kinetisk tilpasning interaktionen mellem VHL og MZ1-Brd4BD2-komplekset har k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 og KD = 1 nM. (figur 4B)
  3. SPR for CRBN- og små molekyleinteraktioner
    1. Forberedelse af buffer.
      1. Forbered en 1 L buffer indeholdende 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, og før den gennem en0,2 μm filterenhed.
      2. Fjern 20 ml buffer og genopfyld 20 ml 100% DMSO (2% DMSO i den endelige løbende buffer). Det er vigtigt at holde DMSO på 2% i alle prøverne beskrevet nedenfor (trin 3.3, 3.4 og 3.5).
    2. Aktivér SA-chippen efter producentens protokol, og immobiliser CRBN til ~ 800 RU.
    3. Der fremstilles forbindelser i 3 gange 6 pt seriel fortynding på en plade med 384 huller med en topkoncentration på 30 μM som beskrevet i 3.1.3.
    4. Kør SPR ved hjælp af multicyklusopsætningen: Tilstand: Høj ydeevne, kontakttid: 60 s, dissociationstid: 90 s; strømningshastighed: 50 μL / min. For dette system er tre bufferinjektioner tilstrækkelige til at opnå en stabil baggrund. For andre analysesystemer kan det være nødvendigt at udføre yderligere bufferinjektioner.
    5. Udfør dataanalyse ved hjælp af producentens software.
      BEMÆRK: Steady-state-analyse indikerer, at KD af BRD-2512 og BRD-5110 begge er omkring 3 μM. Imidlertid nåede bindingen kun ~ 70% Rmax binding ved den øverste koncentration. Både svag affinitet og sensorgrammets form indikerer, at sammensat uopløselighed ved høje koncentrationer sandsynligvis vil forekomme. Således kan den faktiske KD være højere end 3 μM. BRD-4761, som ikke binder til CRBN, blev inkluderet som en negativ kontrol.
  4. SPR til PPM1D og små molekyleinteraktioner
    1. Forbered buffer som beskrevet i trin 3.3.1. Brug en nitriloeddikesyre (NTA) sensorchip.
    2. Anvend enkeltcyklus, fordi PPM1D-sprænghovedet har en langsom k til ogfra k. NTA-chippen regenereres ved hjælp af producentens standardopsætning, og PPM1D immobiliseres til ~ 1000 RU efter hver sammensat injektion (injicer proteinopløsning på 5 μg/ml ved 5 μL/min).
    3. Der fremstilles forbindelser i 3 gange 5-punkts seriel fortynding med topkoncentrationen ved 400 nM som beskrevet i 3.1.3.
    4. Kør SPR ved hjælp af enkeltcyklusopsætningen: Mode: høj ydeevne; kontakttid: 90 s; dissociationstid: 600 s; strømningshastighed: 50 μL / min. Påfør tre injektioner af buffer før hver forbindelse for at sikre en stabil baggrund.
    5. Dataanalyse. Anvend den tredje injektion af bufferen som baggrund for subtraktion. Som den negative kontrol viser BRD-2512 ikke binding til PPM1D. For BRD-4761 og BRD-5110 angav kinetisk tilpasning KD for begge at være 1-2 nM.
  5. SPR for CRBN:PROTAC: PPM1D ternært kompleks
    1. Forbered buffer som beskrevet i trin 3.3.1.
    2. Aktivér SA-chippen efter producentens protokol, og immobiliser CRBN til ~35 RU (injicer en proteinopløsning på 0,5 μg/ml ved 5 μL/min).
    3. Der fremstilles tre forbindelser i 3 gange 6-punkts seriel fortynding med en topkoncentration på 30 μM, mens [PPM1D] holdes på 1 μM i alle prøver, herunder blindprøver, ved hjælp af metoden beskrevet i trin 3.2.3.
    4. Kør SPR ved hjælp af multicyklusopsætningen: Mode: High-performance; kontakttid: 60 s; dissociationstid: 90 s; strømningshastighed: 50 μL / min.
    5. Udfør dataanalyse ved hjælp af producentens software.
      BEMÆRK: Mens BRD-2512 og BRD-4761 viser ingen/ubetydelig respons, viser BRD-5110 tydeligt "krogeffekten" ved steady state med hurtig tænd/sluk-kinetik (figur 5A-C). Det eksperimentelle bindingsrespons fra BRD-5110 (figur 5C) ligger mellem det forudsagte respons fra simuleringen, når man antager, at K D (CRBN, CPD) er 3 eller 10 μM (figur 5E), hvilket tyder på, at den ternære K D og binære KD er meget ens. Der er ingen tilsyneladende samarbejdsevne af PPM1D: BRD-5110: CRBN-kompleks dannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering af VHL: MZ1 binært kompleks og VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks kan findes i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) og figur 4 (SPR) ved hjælp af en meget lignende buffer. KD ekstraheret fra ortogonale assays er konsistent. Kooperativiteten kan beregnes af K D (binær) / KD (ternær), hvilket er meget positivt (15 fra ITC eller 26 fra SPR).

Karakterisering af CRBN:PROTAC: PPM1D-systemet blev udført af SPR (figur 5A-D). CRBN blev immobiliseret til ~ 35 RU'er for at lette observationen af ternær kompleks dannelse. Bindingen af PROTAC alene resulterede i et signal på <2 jernbanevirksomheder, som ligger under støjen. PPM1D i analysanden giver et højt baggrundssignal på SA-chippens overflade, og den højeste koncentration, der kan påføres, er omkring 1 μM. Denne værdi er lavere end KD mellem CRBN og dens sprænghoved ≥3 μM), således at der forventes "krogeffekt". SPR er følsom nok til at detektere det, hvilket har god overensstemmelse med simuleringen (figur 5E). Simuleringen blev udført ved hjælp af de ikke-samarbejdsvillige ligevægte i litteratur19 kombineret med den klassiske SPR-beregning [Responsmax = (Responsligand ×masseimmobilisering)/Masseligand]. Da KD mellem CRBN og forbindelsen ikke bestemmes nøjagtigt på grund af forbindelsens uopløselighed ved høj koncentration, blev simulering udført ved hjælp af fire formodede KD'er: 1 μM, 3 μM, 10 μM eller 30 μM. De eksperimentelle resultater faldt mellem de simulerede 3 μM og 10 μM kurver, hvilket er næsten identisk med KD i det binære system, hvilket tyder på, at der ikke er nogen samarbejdsevne.

Figure 1
Figur 1: Illustration af tre bindingsscenarier og definition af forskellige KD'er. (A) Klassiske tokomponentsystemer. (B) Trekomponentsystem, hvor den ene ende af PROTAC kan mættes, således at den kan evalueres som et tokomponentsystem. (C) Trekomponentsystem, hvor "krogeffekten" observeres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: ITC-resultater. Titrering af VHL i MZ1 (venstre) eller MZ1:Brd4BD2-kompleks (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: BLI-resultater. MZ1 formidler dannelsen af VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks. (A) Rådata. (B) Subtraktion af baggrundssignaler, hvor [MZ1] = 0. (C) Kinetisk tilpasning af B til ekstraktion af k on, koff og KD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SPR-resultater . (A) MZ1-binding til VHL. (B) MZ1:Brd4BD2 binær kompleks binding til VHL. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: SPR-resultater, der viser "krogeffekten" af en repræsentativ PPM1D-PROTAC. CRBN blev immobiliseret på SA-chippens overflade, mens [PPM1D] blev holdt på 1 μM i analysanden i alle tilfælde. (A) BRD-2512, en forbindelse, der kun binder til CRBN, giver næsten intet svar. (B) BRD-4761, en forbindelse, der kun binder til PPM1D, giver heller ikke noget svar. (C,D) BRD-5110, en PROTAC med sprænghovedet af CRBN i BRD-2512 og sprænghovedet af PPM1D i BRD-4761, inducerede dannelsen af det ternære kompleks. (E) En simulering af SPR-resultater, hvor KD mellem CRBN og forbindelsen antages at være 1 μM (sort), 3 μM (blå), 10 μM (rød) eller 30 μM (grøn). BRD-2512-kurven er mellem 3 μM og 10 μM, hvilket er meget tæt på den målte binære KD, hvilket tyder på ingen kooperativitet (kooperativitet = 1). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofysisk karakterisering af de binære og ternære interaktioner mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere kan give unik og komplementær indsigt i forhold til udbredte cellulære systemer. Forståelse af affiniteten mellem hvert sprænghoved af et PROTAC-molekyle og dets proteinbindende partnere kan hjælpe med at guide medicinalkemiske bestræbelser mod optimering af disse interaktioner. Tidligere publicerede krystalstrukturer af ternære PROTAC-komplekser har afsløret, at atomer i linkerregionen kan danne interaktioner med en eller begge proteinbindingspartnere 16,20. Eksperimentelt bestemmelse af kooperativiteten af ternær kompleks dannelse kan understøtte linkeroptimering.

Beskrevet i denne rapport er brugen af tre forskellige biofysiske teknikker, der kan give information om bindingsaffiniteterne mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindingspartnere. Metode 1 beskriver den isotermiske titreringskalorimetri (ITC) eksperimentelle opsætning for PROTAC-molekylet, MZ1, VHL E3-ligasekomplekset og Brd4BD2-bromdomænet. ITC-resultater viste KD'er på 59 nM for den binære interaktion mellem MZ1 og VHL og 4 nM for den ternære interaktion mellem VHL og forblandet MZ1 og Brd4BD2. Affiniteterne var i overensstemmelse med dem, der blev observeret i SPR (immobiliseret VHL-binding til MZ1 K D = 26 nM, immobiliseret VHL-binding til forblandet MZ1 og Brd4BD2 K D = 1 nM) og BLI (K D = 2,8 nM). Mens ITC KD-resultaterne for VHL-binding til MZ1 er i overensstemmelse med rapporterede værdier16, er den opnåede støkiometri forskellig. En mulig forklaring på dette resultat er den dårlige opløselighed af MZ1 i den HEPES-baserede buffer, der anvendes i protokollen beskrevet her, mens resultaterne fra litteraturen blev genereret ved hjælp af en Bis-tris-baseret buffer. Forfatterne foretrak at bruge de samme bufferkomponenter på tværs af SPR, ITC og BLI.

Metode 2 beskriver den eksperimentelle opsætning for BLI-analysen af interaktionen mellem immobiliseret VHL, en fast koncentration af Brd4BD2 og varierende koncentrationer af MZ1. På grund af teknikkens følsomhedsbegrænsninger kunne KD, k on og koff værdier for ternær kompleks dannelse genereres, men ikke for den binære interaktion mellem MZ1 og proteinerne.

Metode 3 beskriver flere SPR-assays. SPR er mere følsom end BLI og kan anvendes til at observere både protein-lille molekyle (binær) og protein-protein (ternær) interaktioner. I sidstnævnte tilfælde bør baggrundssignaler overvåges nøje, da protein i analysanden kan give høje og ustabile signaler. SPR er meget følsom over for reagenser med et højt brydningsindeks, herunder DMSO, glycerol og rengøringsmidler. Hvis proteinet opbevares i bufferen indeholdende glycerol eller vaske- og rengøringsmiddel, skal løbebufferen indeholde tilsvarende koncentrationer af disse komponenter. Alternativt fjerner anvendelse af størrelsesekskluderingskromatografi dem fuldstændigt før ethvert SPR-eksperiment. Der bør udvises omhu for nøje at matche DMSO-koncentrationerne mellem buffer- og analysandprøver. DMSO-opløsningsmiddelkorrektionerne udføres i henhold til producentens anvisninger.

Metoden i trin 3.1 beskriver SPR-analysen for den binære VHL-MZ1-interaktion. Metode 3.2 beskriver SPR-analysen for VHL: MZ1: Brd4 BD2 ternært kompleks, hvor VHL er immobiliseret, og analysanden enten er Brd4 BD2 alene eller MZ1:Brd4BD2-komplekset. I dette system er interaktionen mellem Brd4BD2 og VHL ubetydelig. Den ternære komplekse dannelse er meget samarbejdsvillig (ɑ = 26). Off-rate for ternær kompleks dannelse er 0, 014 s-1, hvilket kræver anvendelse af enkeltcykluskinetik. Resultater fra ITC viser også en meget kooperativ ternær kompleks formation (ɑ = 15). SPR-metoder i trin 3.3, 3.4 og 3.5 beskriver assays til evaluering af dannelsen af et kompleks mellem CRBN og PPM1D induceret ved tilstedeværelsen af et PROTAC-molekyle, BRD-5110. PROTAC-molekylet har en svag affinitet for CRBN (K D ~ 3 μM) og en stærk affinitet for PPM1D (KD = 1-2 nM). Som følge heraf er den svage binding til CRBN ikke mættet og resulterer i en observeret "krogeffekt". Selvom det er muligt at øge ligandopløseligheden ved at øge DMSO-koncentrationen, der anvendes i eksperimentet, er det vigtigt i disse tilfælde nøje at overvåge proteinstabiliteten, som kan påvirkes negativt af høje koncentrationer af DMSO. Derudover har DMSO en høj opløsningsvarme, som kan skjule varmen ved binding af ligander til protein. Der skal udvises forsigtighed med DMSO-koncentrationerne af opløsningen i sprøjten og opløsningen i cellen. Forfatterne anbefaler dialyse af de to opløsninger mod det samme bufferpræparat.

Generelle anbefalinger og retningslinjer gives baseret på de eksperimenter, der udføres og rapporteres her. Når affiniteterne af binære interaktioner mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere er stærke (KD <1 μM), giver SPR pålidelige og reproducerbare affiniteter sammen med værdifuld information om kooperativiteten af ternær kompleks dannelse. Når affiniteterne af den binære interaktion mellem en af proteinbindingspartnerne og PROTAC-molekylet er svage (KD >1 μM), skal analyseopsætningen ændres. I disse tilfælde kan brugen af molekylære simuleringer, hvor bindingskonstanterne er faste, og koncentrationerne af ligand og analysand varieres, være værdifuld til at styre assaydesign og fortolke eksperimentelle resultater. ITC-assays giver vigtig information om bindingens støkiometri, men kræver betydeligt flere protein- og sammensatte reagenser i forhold til SPR og BLI. Derudover kan opløseligheden af PROTAC-molekylet være begrænsende for ITC-eksperimenter. BLI har højere gennemstrømning end ITC og kræver mindre protein og sammensatte reagenser. På grund af følsomhedsbegrænsninger kan BLI imidlertid kun bruges til at vurdere den ternære komplekse dannelse og ikke binære interaktioner mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindingspartnere. Det anbefales, at SPR anvendes til rutinemæssig afprøvning af både binære og ternære PROTAC-bindingsassays og BLI- og ITC-assays, der anvendes til ortogonal validering af resultater fra SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en innovations- og teknologiudviklingspris fra Center for udvikling af terapi ved Broad Institute of MIT og Harvard. Forfatterne ønsker at takke medlemmerne af den øverste ledelse og bedømmelsesudvalget for deres støtte til dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 203
udvikling og anvendelse af biofysiske assays til evaluering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter