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Biochemistry

चिमेरस (PROTACS) को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस द्वारा प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन के मूल्यांकन के लिए बायोफिजिकल परख का विकास और अनुप्रयोग

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

यहां हम चिमेरस (PROTACS) को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस द्वारा प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन के बायोफिजिकल लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें ubiquitin ligases वॉन हिप्पेल-लिंडौ E3 लिगेज (VHL) और सेरेब्लोन (CRBN) शामिल हैं। यहां चित्रित बायोफिजिकल तरीकों में सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई), और इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) शामिल हैं।

Abstract

ई 3 लिगेस और गिरावट के लिए लक्षित प्रोटीन को एक बहु-चरण प्रक्रिया में हेटेरोबिफंक्शनल अणुओं द्वारा परिसरों को बनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। शामिल इंटरैक्शन के कैनेटीक्स और थर्मोडायनामिक्स सर्वव्यापकता की दक्षता में योगदान करते हैं और परिणामस्वरूप प्रोटीन का क्षरण होता है। सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई), और इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) जैसी बायोफिजिकल तकनीकें मूल्यवान जानकारी प्रदान करती हैं जिनका उपयोग उन इंटरैक्शन के अनुकूलन में किया जा सकता है। दो मॉडल प्रणालियों का उपयोग करते हुए, टर्नरी जटिल गठन की सहकारिता को समझने के लिए एक बायोफिजिकल परख टूल किट और बाध्यकारी कैनेटीक्स पर 'हुक प्रभाव' के प्रभाव की स्थापना की गई थी। एक मामले में, चिमेरा (PROTAC) अणु को लक्षित करने वाले एक प्रोटियोलिसिस का मूल्यांकन किया गया था जिसने Brd4BD2 और VHL के बीच टर्नरी जटिल गठन को प्रेरित किया था। विषम अणु, MZ1, में Brd4BD2 प्रोटीन (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) और VHL कॉम्प्लेक्स (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM) दोनों के लिए nM संबंध हैं। इस प्रणाली के लिए, मजबूत एसपीआर, बीएलआई और आईटीसी परख विकसित किए गए थे जो टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन की सहकारिता का प्रदर्शन करने वाले प्रकाशित परिणामों को पुन: प्रस्तुत करते थे। दूसरे मामले में, एक अणु जिसने 46.0 केडीए प्रोटीन, पीपीएम 1 डी और सेरेब्लोन [सीआरबीएन (319-442)] के बीच टर्नरी कॉम्प्लेक्स को प्रेरित किया, का अध्ययन किया गया। हेटेरोबिफंक्शनल अणु, BRD-5110, में PPM1D के लिए SPR K D = 1 nM है, लेकिन काटे गए CRBN (319-442) कॉम्प्लेक्स (SPR KD = ~ 3 μM) के खिलाफ बहुत कमजोर बंधन है। उस स्थिति में, एसपीआर में सीआरबीएन के लिए बाध्यकारी संतृप्त नहीं था, जिसके परिणामस्वरूप "हुक-प्रभाव" हुआ। एसपीआर, बीएलआई और आईटीसी के लिए थ्रूपुट और अभिकर्मक आवश्यकताओं का मूल्यांकन किया गया था, और प्रोटैक परियोजनाओं के लिए उनके आवेदन के लिए सामान्य सिफारिशें प्रदान की गई थीं।

Introduction

सेल में प्रोटीन के polyubiquitination एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है कि Ubiquitin Ligase परिवार 1,2 में एंजाइमों को शामिल है. मार्ग में टर्मिनल एंजाइम ई 3 यूबिकिटिन लिगेस हैं जो सहसंयोजक रूप से अपने प्रोटीन-बाध्यकारी भागीदारों को सर्वव्यापी अणुओं को संलग्न करते हैं3. उन प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों का पॉलीयूबिकिटिनेशन उन्हें प्रोटीसोम4 द्वारा प्रोटियोलिटिक गिरावट के लिए लक्षित करता है। यह प्रणाली प्रोटीन होमियोस्टेसिस प्रक्रिया का हिस्सा है जिसे रोग5 में शामिल प्रोटीन के क्षरण को प्रेरित करने के लिए चिकित्सीय रूप से लीवरेज किया गया है। छोटे अणु जो E3 ubiquitin ligases के बीच बातचीत को प्रेरित करते हैं, जैसे कि वॉन हिप्पेल-लिंडौ E3 लिगेज (VHL) या सेरेब्लोन (CRBN), आमतौर पर एक E3 लिगेज बाइंडिंग वारहेड से बने होते हैं जो एक लचीले लिंकर द्वारा एक वारहेड से जुड़े होते हैं जो प्रोटीन को बांधता है गिरावट के लिए लक्षित किया जा रहा है। इन विषम अणुओं को आमतौर पर काइमेरा या PROTACS6 को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस के रूप में जाना जाता है।

PROTACS के विकास में कोशिकाओं में प्रोटीन के क्षरण को प्रेरित करने के लिए अणुओं की क्षमता का मूल्यांकन करना शामिल है। कई सेलुलर परख प्रणाली विकसित की गई हैं जो PROTAC अणु के साथ कोशिकाओं के उपचार पर VHL या CRBN जैसे लक्ष्य प्रोटीन और E3 लिगेज घटकों के बीच प्रेरित बातचीत की निगरानी करती हैं। ऐसा ही एक सेलुलर परख, नैनोलुक-हेलोटैग सिस्टम7, में हेलोटैग स्वीकर्ता से जुड़े एक ई 3 लिगेज और एक नैनोलुक दाता के साथ टैग किया गया एक लक्ष्य प्रोटीन शामिल है। टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन नैनोलुक डोनर और हेलोटैग स्वीकर्ता को निकटता में लाता है, जिससे दाता से स्वीकर्ता तक ऊर्जा के हस्तांतरण की अनुमति मिलती है जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश का उत्सर्जन होता है। इस प्रणाली की विविधताओं PROTACS अणुओं8 या लक्ष्य प्रोटीनसर्वव्यापकता 9 के सापेक्ष स्तर में परिवर्तन की सेलुलर पारगम्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि ये सेलुलर सिस्टम PROTACS के अनुकूलन को चलाने के लिए आवश्यक हैं, E3 ligases और गिरावट के लिए लक्षित प्रोटीन के बीच परिसरों का गठन एक बहु-चरण प्रक्रिया10,11है। शामिल बाइनरी और टर्नरी इंटरैक्शन के कैनेटीक्स और थर्मोडायनामिक्स दक्षता सर्वव्यापकता में योगदान करते हैं और प्रोटीन12,13,14के परिणामस्वरूप गिरावट होती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल हैं जिन्हें सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई), और इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का उपयोग करके PROTACS द्वारा प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन के बायोफिजिकल लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। MZ1 PROTAC अणु के लिए SPR और ITC प्रोटोकॉल जो Brd4BD2 और VHL के बीच टर्नरी जटिल गठन को प्रेरित करता है, साहित्य रिपोर्ट13,15 से प्राप्त होता है और यहां वर्णित रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं के कुछ संशोधन के साथ रिपोर्ट किए गए परिणामों को पुन: प्रस्तुत करने में सक्षम था, जिस पर चर्चा की जाएगी। MZI, Brd4BD2 और VHL के बीच टर्नरी जटिल गठन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले BLI परख का विवरण इस रिपोर्ट में शामिल है। बीएलआई से आत्मीयता माप एसपीआर और आईटीसी में देखे गए लोगों के अनुरूप थे। एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल जिसमें पीपीएम 1 डी के बीच प्रोटैक-प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन का आकलन करने के लिए एक एसपीआर परख विकसित की गई थी, एक सेर / थ्र प्रोटीन फॉस्फेट जिसकी अभिव्यक्ति पी 53-निर्भर तरीके सेप्रेरित है 16, और सीआरबीएन का भी वर्णन किया गया है। इस उदाहरण में, PROTAC अणु में PPM1D के लिए एक नैनोमोलर आत्मीयता है लेकिन CRBN के लिए केवल एक माइक्रोमोलर आत्मीयता है। इस मामले में, सीआरबीएन के लिए प्रोटैक अणु का बंधन संतृप्त नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर मनाया जाने वाला "हुक प्रभाव" होता है। हुक प्रभाव तीन शरीर प्रणालियों की एक संपत्ति है जिसमें दो प्रजातियां हैं जो एक हेटेरोट्रिमेरिक कॉम्प्लेक्स बना सकती हैं जब दोनों एक ब्रिजिंग अणु (चित्रा 1)17से बंधे होते हैं। हुक प्रभाव तब देखा जाता है जब ब्रिजिंग प्रजाति दो अन्य प्रजातियों के सापेक्ष अधिक एकाग्रता में होती है। परिणामी अवस्था वह है जिसमें बाइनरी इंटरैक्शन टर्नरी इंटरैक्शन को पछाड़ते हैं। जिन प्रणालियों में हुक प्रभाव देखा जाता है, उन्हें इस रिपोर्ट में चर्चा किए गए विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन विचारों की आवश्यकता होती है। PROTAC- प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन के मूल्यांकन के लिए बायोफिजिकल assays के उपयोग के मूल्यांकन के लिए सामान्य अवधारणाएं और अभिकर्मक आवश्यकताएं प्रदान की जाती हैं।

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Protocol

सभी प्रोटीन अच्छी उपज और शुद्धता (>80%) साहित्य प्रोटोकॉल18 निम्नलिखित के साथ ई कोलाई में overexpressed थे. बायोटिनाइलेशन एक बीरा-उत्प्रेरित प्रतिक्रिया18 का उपयोग करके किया गया था। सभी छोटे अणुओं को 100% डीएमएसओ में 1 एमएम स्टॉक समाधान पर तैयार किया गया था। यहां वर्णित प्रक्रियाओं के लिए विशेष प्रयोगशाला सुरक्षा उपकरण या सावधानियों की आवश्यकता नहीं है। मानक प्रयोगशाला व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग किया जाना चाहिए (यानी, लैब कोट, सुरक्षा चश्मे और दस्ताने)।

इस अध्ययन में लागू प्रोटीन नीचे सूचीबद्ध हैं:
वीएचएल: बायोटिनिलेटेड वीएचएल (53-213)/एलोंगिनबी (1-104)/एलोंगिनसी (17-112) कॉम्प्लेक्स एलोगिनबी के सी-टर्मिनस पर एवी-टैग के साथ।
Brd4BD2: गैर-टैग किए गए Brd4BD2(333-460)
सीआरबीएन: बायोटिनिलेटेड सीआरबीएन (319-442) एन टर्मिनस पर एवी-टैग के साथ
PPM1D: N टर्मिनस पर गैर-टैग या डबल His8-टैग PPM1D(1-420)

इस अध्ययन में लागू छोटे अणु नीचे सूचीबद्ध हैं:
MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC जो VHL और Brd4BD2 से बांधता है
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN KD ~ 3 μM, PPM1D से बाइंड नहीं होता है
बीआरडी-5110 (मेगावाट = 872.0 डीए): सीआरबीएन के डी ~ 3 माइक्रोन, पीपीएम 1 डी केडी = 1-2 एनएम
BRD-4761 (MW = 476.6 Da): CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM से बाइंड नहीं होता है

1. विधि 1: आईटीसी (इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री)

नोट: अनुमापन ऑटो इंजेक्शन के साथ एक माइक्रो कैलोरीमीटर का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. बफर तैयारी: 20 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम टीसीईपी, पीएच 7.5 युक्त बफर के 3 एल तैयार करें।
  2. डायलिसिस: चरण 1.1 में तैयार बफर के 1 एल के खिलाफ वीएचएल और बीआरडी 4बीडी 2 (~ 500 माइक्रोन प्रत्येक 500 माइक्रोन) को डायलाइज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 बार, क्रमशः 4 एच, 2 एच और लगभग 16 घंटे के लिए। बाद के चरणों में उपयोग के लिए अंतिम डायलिसिस के बाद बफर सहेजें।
  3. एक प्लास्टिक कवर के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली पर नमूने तैयार करें.
    1. प्रत्येक अनुमापन के लिए, सेल के लिए समाधान के 400 माइक्रोन, सिरिंज के लिए 125 माइक्रोन, और सफाई के लिए बफर के 400 माइक्रोन तैयार करें। प्लेट पर लगातार तीन कुओं में नमूने जोड़ें। चूंकि यौगिक स्टॉक 100% डीएमएसओ में 1 एमएम पर तैयार किया जाता है, इसलिए सेल और सिरिंज में मिलान बफर सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन समाधान में डीएमएसओ का समान प्रतिशत जोड़ें। अंतिम समाधान में 2% डीएमएसओ जोड़ें।
      1. MZ1 में VHL के अनुमापन के लिए नमूना: बफर के 392 μL, MZ1 के 4 μL को 1 mM (10 μM अंतिम एकाग्रता), और 100% DMSO के 4 μL युक्त सेल समाधान तैयार करें। 85.7 माइक्रोन, 100% डीएमएसओ (84 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के 2.5 माइक्रोन पर वीएचएल के 122.5 माइक्रोन युक्त एक सिरिंज समाधान तैयार करें।
      2. बफर में वीएचएल के अनुमापन के लिए नमूने (नमूना 1.3.1.1 से उत्पन्न डेटा की पृष्ठभूमि घटाव के लिए डेटा का उपयोग किया जाएगा): 392 माइक्रोन बफर, 8 माइक्रोन 100% डीएमएसओ युक्त सेल समाधान तैयार करें। 85.7 माइक्रोन, (84 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) पर वीएचएल के 122.5 माइक्रोन युक्त एक सिरिंज समाधान तैयार करें और 100% डीएमएसओ के 2.5 माइक्रोन जोड़ें।
      3. MZ1 और Brd4 BD2 में VHL के अनुमापन के लिए नमूने: सेल समाधान तैयार करें जिसमें 17.1 माइक्रोन Brd4BD2 (16.8 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के392 माइक्रोन, 1 मिमी (8.4 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) पर MZ1 के 3.36 माइक्रोन युक्त सेल समाधान तैयार करें, और 100% डीएमएसओ का 4.64 माइक्रोन। 85.7 माइक्रोन (84 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) और 100% डीएमएसओ के 2.5 माइक्रोन पर वीएचएल के 122.5 माइक्रोन युक्त एक सिरिंज समाधान तैयार करें।
      4. Brd4BD2 (1.3.1.3 की पृष्ठभूमि) में VHL के अनुमापन के लिए नमूने: सेल समाधान तैयार करें जिसमें 17.1 माइक्रोन Brd4BD2 (16.8 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के 392 माइक्रोन और 100% डीएमएसओ के 8 माइक्रोन शामिल हैं। 85.7 माइक्रोन (84 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) और 100% डीएमएसओ के 2.5 माइक्रोन पर वीएचएल के 122.5 माइक्रोन युक्त एक सिरिंज समाधान तैयार करें।
  4. माइक्रो-कैलोरीमीटर पर सभी चार अनुमापन चलाएं। प्रत्येक में 120 एस समय अंतराल पर 2 माइक्रोन / एस की दर से 2 माइक्रोन सिरिंज समाधान के 19 इंजेक्शन होते हैं। प्रोटीन (0.4 μL) का प्रारंभिक इंजेक्शन बनाएं और डेटा विश्लेषण के दौरान इसे त्याग दें। 25 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्रयोगों प्रदर्शन, जबकि 600 आरपीएम पर सरगर्मी.
  5. डेटा विश्लेषण: निर्माता (चित्रा 2) द्वारा प्रदान किए गए विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्टोइकोमेट्री (एन), पृथक्करण स्थिरांक (केडी), और बाध्यकारी (ΔH) की थैलेपी प्राप्त करने के लिए डेटा को एकल-बाध्यकारी-साइट मॉडल में फिट करें।

2. विधि 2: BLI (बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री)

  1. 5 हर्ट्ज की अधिग्रहण दर के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) लेपित सेंसर का उपयोग करके बीएलआई प्रयोग करें। स्वचालित बीएलआई प्रयोग के दौरान, सुनिश्चित करें कि सेंसर एक कॉलम के भीतर स्थिर हैं और 392 माइक्रोन की अधिकतम अच्छी मात्रा के साथ 96-अच्छी तरह से, फ्लैट तल, काली प्लेट के विभिन्न स्तंभों के बीच चलते हैं। समाधान के 200 माइक्रोन के साथ प्रयोग में इस्तेमाल किया थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
    नोट: बीएलआई केवल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (यानी, टर्नरी जटिल गठन) का पता लगाने के लिए उपयोगी है। यह प्रोटीन और छोटे अणुओं के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है।
    1. बफर तैयारी: 20 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम टीसीईपी, 0.05% पी20, पीएच 7.5 युक्त बफर के 100 एमएल तैयार करें।
    2. स्थिरीकरण चरण के लिए अनुकूलन: निर्माता द्वारा अनुशंसित परीक्षण सेंसर को 1-3 एनएम पर लोड करें। ~ 1.0 एनएम की एक लोड हो रहा है यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है. इसे प्राप्त करने के लिए, सेंसर को 80 एस के लिए 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल पर वीएचएल युक्त समाधान में डुबोएं।
    3. निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग करके सात एसए सेंसर लागू करके बीएलआई काइनेटिक माप करें:
      1. पहले आधारभूत चरण के लिए, 60 एस के लिए बफर में डुबकी।
      2. स्थिरीकरण चरण के लिए, 80 एस के लिए 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल पर वीएचएल के समाधान में डुबकी।
      3. दूसरे आधारभूत चरण के लिए, 60 एस के लिए बफर में डुबकी।
      4. एसोसिएशन चरण के लिए, 2 माइक्रोन पर Brd4BD2 की एक निश्चित सांद्रता के समाधान में डुबकी, 2% पर DMSO की निश्चित एकाग्रता, और 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.3 nM, 3.1 nM, और 0 nM (संदर्भ सेंसर) पर MZ300 की अलग-अलग सांद्रता।
      5. पृथक्करण चरण के लिए, 600 एस के लिए बफर में डुबकी।
    4. निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें। k on, koff, र KD डाटा फिटिंग (चित्रा 3) को लागि सूचित गरिन्छ।

3. विधि 3: एसपीआर (सतह प्लास्मोन अनुनाद)

नोट: सभी एसपीआर प्रयोगों आरटी पर streptavidin (एसए) लेपित सेंसर चिप्स का उपयोग कर किया जाता है. यद्यपि एनटीए चिप का उपयोग प्रोटीन और छोटे अणुओं के बीच पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन इसका उपयोग टर्नरी कॉम्प्लेक्स पर लागू होने पर सावधानी के साथ किया जाना चाहिए, क्योंकि एसए चिप की तुलना में बहुत अधिक पृष्ठभूमि देखी जाती है, संभवतः विश्लेषण में चार्ज चिप सतह और प्रोटीन के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के कारण।

  1. VHL-MZ1 इंटरैक्शन के लिए SPR
    1. बफर तैयारी।
      1. 20 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम टीसीईपी, 0.005% पी20, पीएच7.5 युक्त 1 एल बफर तैयार करें, और इसे 0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट से गुजरें।
      2. भविष्य में उपयोग (डीएमएसओ-मुक्त बफर) के लिए 20 एमएल बफर निकालें और डीएमएसओ के 20 एमएल (अंतिम चल रहे बफर में 2% डीएमएसओ) के साथ फिर से भरें। नीचे वर्णित सभी नमूनों में डीएमएसओ को 2% पर रखें (चरण 3.1 और 3.2)
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एसए चिप को सक्रिय करें और वीएचएल को ~ 2000 आरयू (5 माइक्रोन/एमएल के प्रोटीन समाधान को 5 माइक्रोन/मिनट पर इंजेक्ट करें) को स्थिर करें।
    3. 130 माइक्रोन की अधिकतम मात्रा के साथ 384-अच्छी तरह से, शंक्वाकार तल, पारभासी, पॉलीप्रोपाइलीन प्लेट पर 10 माइक्रोन पर शीर्ष एकाग्रता के साथ 3-गुना, 8-बिंदु धारावाहिक कमजोर पड़ने में MZ1 तैयार करें। पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोप्लेट्स के साथ संगत स्वयं चिपकने वाला, पारदर्शी प्लास्टिक फोइल के साथ प्लेट को कवर करें।
      1. अंतिम एकाग्रता पर 2% डीएमएसओ सुनिश्चित करने के लिए डीएमएसओ मुक्त बफर के साथ शीर्ष एकाग्रता तैयार करें। डीएमएसओ मुक्त बफर के 147 माइक्रोन के लिए, 1 एमएम पर एमजेड 1 स्टॉक के 1.5 माइक्रोन और 100% डीएमएसओ के 1.5 माइक्रोन जोड़ें।
      2. 2% DMSO युक्त चल रहे बफर के साथ 3 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें. चल रहे बफर के 100 माइक्रोन तक, चरण 3.1.3.1 में तैयार शीर्ष एकाग्रता पर समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें, और 2एन डी उच्चतम एकाग्रता तैयार करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं।
      3. फिर चरण 3.1.3.2 में तैयार समाधान के 50 माइक्रोन को बफर चलाने के अगले 100 माइक्रोन में स्थानांतरित करें, 3वें उच्चतम एकाग्रता तैयार करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं, और इसी तरह।
    4. बहु-चक्र सेटअप का उपयोग करके SPR चलाएँ: मोड: उच्च-प्रदर्शन; संपर्क समय: 120 एस; पृथक्करण समय: 300 एस; प्रवाह दर: 50 μL/मिनट।
    5. उपकरण निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें। स्थिर-अवस्था विश्लेषण ने संकेत दिया किकेडी = 26 (± 3) एनएम और ~ 91% (± 5%) बाध्यकारी हासिल करने के आरमैक्स (चित्रा 4ए)
  2. वीएचएल के लिए एसपीआर: MZ1: Brd4BD2 टर्नरी कॉम्प्लेक्स
    1. चरण 3.1.1 में वर्णित के रूप में बफर तैयार करें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एसए चिप को सक्रिय करें और वीएचएल को ~ 100 आरयू में स्थिर करें। 5 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल वीएचएल का प्रोटीन समाधान इंजेक्ट करें और ~ 100 आरयू की सतह घनत्व तक पहुंचने तक 1-5 मिनट के बीच संपर्क समय करें।
    3. 323 माइक्रोन की अधिकतम मात्रा के साथ 96-अच्छी तरह से, स्पष्ट, पॉलीस्टाइनिन, गोल नीचे प्लेट में दो 5-गुना, 5-बिंदु एकल-चक्र इंजेक्शन के लिए नमूने तैयार करें और इसे स्वयं चिपकने वाला, पारदर्शी, प्लास्टिक फोइल के साथ कवर करें जो पॉलीस्टायर्न माइक्रोप्लेट्स के साथ संगत हैं जैसा कि चरणों में वर्णित है 3.2.3.1-3.2.3.2।
      1. नकारात्मक नियंत्रण: विश्लेषण में केवल Brd4BD2 होता है।
        1. 200 माइक्रोन (#A5) की मात्रा के साथ चलने वाले बफर में 25 माइक्रोन पर शीर्ष एकाग्रता तैयार करें
        2. बाईं ओर अगले 4 कुओं (#A1-A4) में चल रहे बफर में 2 माइक्रोन पर Brd4BD2 के प्रत्येक 160 माइक्रोन जोड़ें
        3. A5 के 40 माइक्रोन को A4 में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह मिलाएं।
        4. A4 के 40 माइक्रोन को A3 में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह मिलाएं। A1 तक ऐसा करते रहें।
      2. टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन: एनालाइट में MZ1 और Brd4BD2 शामिल हैं।
        1. डीएमएसओ-मुक्त बफर (#B5) में 25.5 माइक्रोन बीआरडी 4बीडी 2 युक्त 100% -डीएमएसओ समाधान में 20 माइक्रोन पर एमजेड 1 के 4 माइक्रोन जोड़कर शीर्ष एकाग्रता तैयार करें। अंतिम सांद्रता 25 माइक्रोन बीआरडी 4 बीडी 2, 100 एनएम एमजेड 1, और2% डीएमएसओ हैं।
        2. बाईं ओर अगले 4 कुओं (#B1-B4) के लिए चल रहे बफर में 2 माइक्रोन पर Brd4BD2 के प्रत्येक 160 माइक्रोन जोड़ें
        3. B5 के 40 माइक्रोन को B4 में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह मिलाएं।
        4. बी 4 के 40 माइक्रोन को बी 3 में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह मिलाएं। B1 तक ऐसा करते रहें।
    4. एकल-चक्र सेटअप का उपयोग करके एसपीआर चलाएं: संपर्क समय: 100 एस; पृथक्करण समय: 720 एस; प्रवाह दर: 50 μL/मिनट। एक स्थिर पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नमूने से पहले बफर के तीन इंजेक्शन लागू करें।
    5. डेटा विश्लेषण: घटाव के लिए पृष्ठभूमि के रूप में बफर के तीसरे इंजेक्शन लागू करें. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, जब MZ1 मौजूद नहीं होता है, तो VHL और Brd4BD2 के बीच SPR प्रतिक्रिया नगण्य होती है। जब MZ1 मौजूद होता है, तो काइनेटिक फिटिंग VHL और MZ1-Brd4BD2 कॉम्प्लेक्स के बीच की बातचीत को इंगित करती है k on = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1, और KD = 1 nM। (चित्र 4B)
  3. सीआरबीएन और छोटे अणु इंटरैक्शन के लिए एसपीआर
    1. बफर तैयारी।
      1. 50 एमएम ट्रिस, 100 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल 2, 0.5 एमएम टीसीईपी, 0.005% पी20, पीएच 7.5 युक्त 1 एल बफर तैयार करें, और इसे0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट से गुजरें।
      2. बफर के 20 एमएल निकालें और 100% डीएमएसओ (अंतिम चलने वाले बफर में 2% डीएमएसओ) के 20 एमएल को फिर से भरें। नीचे वर्णित सभी नमूनों में डीएमएसओ को 2% पर रखना महत्वपूर्ण है (चरण 3.3, 3.4 और 3.5)।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए SA चिप को सक्रिय करें और CRBN को ~800 RU तक स्थिर करें।
    3. 3.1.3 में वर्णित के रूप में 30 माइक्रोन की एक शीर्ष एकाग्रता के साथ एक 384 अच्छी तरह से थाली पर 3 गुना, 6 पीटी धारावाहिक कमजोर पड़ने में यौगिकों तैयार करें.
    4. बहु-चक्र सेटअप का उपयोग करके एसपीआर चलाएं: मोड: उच्च प्रदर्शन, संपर्क समय: 60 एस, पृथक्करण समय: 90 एस; प्रवाह दर: 50 μL/मिनट। इस प्रणाली के लिए, तीन बफर इंजेक्शन एक स्थिर पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं। अन्य परख प्रणालियों के लिए, अतिरिक्त बफर इंजेक्शन करना आवश्यक हो सकता है।
    5. निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें।
      नोट: स्थिर-राज्य विश्लेषण इंगित करता है कि बीआरडी -2512 और बीआरडी -5110 केकेडी दोनों 3 माइक्रोन के आसपास हैं। हालांकि, बाध्यकारी केवल शीर्ष एकाग्रता पर ~ 70% आरअधिकतम बाध्यकारी तक पहुंच गया। कमजोर आत्मीयता और सेंसरग्राम के आकार दोनों से संकेत मिलता है कि उच्च सांद्रता पर यौगिक अघुलनशीलता होने की संभावना है। इस प्रकार, वास्तविक KD 3 माइक्रोन से अधिक हो सकता है। BRD-4761, जो CRBN से बंधता नहीं है, को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था।
  4. PPM1D और छोटे अणु इंटरैक्शन के लिए SPR
    1. चरण 3.3.1 में वर्णित के रूप में बफर तैयार करें। नाइट्रिलोएसेटिक एसिड (एनटीए) सेंसर चिप का इस्तेमाल करें।
    2. एकल-चक्र लागू करें क्योंकि PPM1D वारहेड में धीमी kचालू और kबंद है। निर्माता के डिफ़ॉल्ट सेटअप का उपयोग करके एनटीए चिप को पुन: उत्पन्न करें और प्रत्येक यौगिक इंजेक्शन के बाद पीपीएम 1 डी को ~ 1000 आरयू में स्थिर करें (5 माइक्रोन / मिनट पर 5 माइक्रोग्राम / एमएल के प्रोटीन समाधान इंजेक्ट करें)।
    3. 3.1.3 में वर्णित के रूप में 400 एनएम पर शीर्ष एकाग्रता के साथ 3 गुना, 5 बिंदु धारावाहिक कमजोर पड़ने में यौगिकों तैयार करें.
    4. एकल-चक्र सेटअप का उपयोग करके एसपीआर चलाएं: मोड: उच्च प्रदर्शन; संपर्क समय: 90 एस; पृथक्करण समय: 600 एस; प्रवाह दर: 50 μL/मिनट। एक स्थिर पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक यौगिक से पहले बफर के तीन इंजेक्शन लागू करें।
    5. डेटा विश्लेषण। घटाव के लिए पृष्ठभूमि के रूप में बफर के तीसरे इंजेक्शन लागू करें. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, BRD-2512 PPM1D के लिए बाध्यकारी नहीं दिखाता है। BRD-4761 और BRD-5110 के लिए, काइनेटिक फिटिंग ने दोनों के लिए KD को 1-2 nM होने का संकेत दिया।
  5. CRBN के लिए SPR:PROTAC: PPM1D टर्नरी कॉम्प्लेक्स
    1. चरण 3.3.1 में वर्णित के रूप में बफर तैयार करें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एसए चिप को सक्रिय करें और सीआरबीएन को ~ 35 आरयू में स्थिर करें (5 माइक्रोन / मिनट पर 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल का प्रोटीन समाधान इंजेक्ट करें)।
    3. चरण 3.2.3 में वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, रिक्त स्थान सहित सभी नमूनों में 1 माइक्रोन पर [पीपीएम 1 डी] रखते हुए 30 माइक्रोन की शीर्ष एकाग्रता के साथ 3 गुना, 6-बिंदु धारावाहिक कमजोर पड़ने में तीन यौगिकों को तैयार करें।
    4. बहु-चक्र सेटअप का उपयोग करके SPR चलाएँ: मोड: उच्च-प्रदर्शन; संपर्क समय: 60 एस; पृथक्करण समय: 90 एस; प्रवाह दर: 50 μL/मिनट।
    5. निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें।
      नोट: जबकि बीआरडी-2512 और बीआरडी-4761 नहीं/नगण्य प्रतिक्रिया दिखाते हैं, बीआरडी-5110 स्पष्ट रूप से तेजी से चालू/बंद कैनेटीक्स(चित्रा 5ए-सी)के साथ स्थिर अवस्था में "हुक प्रभाव" दिखाता है। बीआरडी-5110(चित्रा 5सी)से प्रयोगात्मक बाध्यकारी प्रतिक्रिया सिमुलेशन से अनुमानित प्रतिक्रिया के बीच में है जब केडी (सीआरबीएन, सीपीडी) 3 या 10 माइक्रोन(चित्रा 5ई)है, यह सुझाव देते हुए कि टर्नरी केडी और बाइनरीकेडी बहुत समान हैं। पीपीएम 1 डी की कोई स्पष्ट सहयोग नहीं है: बीआरडी -5110: सीआरबीएन जटिल गठन।

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Representative Results

वीएचएल की विशेषता: एमजेड 1 बाइनरी कॉम्प्लेक्स और वीएचएल: एमजेड 1: बीआरडी 4 बीडी 2 टर्नरी कॉम्प्लेक्स चित्रा2 (आईटीसी), चित्रा 3 (बीएलआई), और चित्रा 4 (एसपीआर) में एक बहुत ही समान बफर का उपयोग करके पाया जा सकता है। ऑर्थोगोनल परख से निकाले गएकेडी सुसंगत हैं। सहकारिता की गणना K D (बाइनरी)/KD (टर्नरी) द्वारा की जा सकती है, जो अत्यधिक सकारात्मक है (ITC से 15 या SPR से 26)।

सीआरबीएन की विशेषता: प्रोटैक: पीपीएम 1 डी प्रणाली एसपीआर (चित्रा 5 ए-डी) द्वारा की गई थी। सीआरबीएन को ~ 35 आरयू में स्थिर किया गया था ताकि टर्नरी जटिल गठन के अवलोकन की सुविधा मिल सके। अकेले PROTAC के बंधन के परिणामस्वरूप <2 आरयू का संकेत मिला जो शोर से नीचे है। विश्लेषण में PPM1D एसए चिप सतह पर एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत देता है, और लागू किया जा सकता है कि उच्चतम एकाग्रता 1 माइक्रोन के आसपास है. यह मान सीआरबीएन और उसके वारहेड ≥3 माइक्रोन) के बीच केडी से कम है, इस प्रकार "हुक प्रभाव" की उम्मीद है। एसपीआर इसका पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है, जिसका सिमुलेशन (चित्रा 5ई) के साथ अच्छा समझौता है। सिमुलेशन साहित्य19 में गैर-सहकारी संतुलन का उपयोग करके किया गया था जो क्लासिक एसपीआर गणना [प्रतिक्रिया अधिकतम = (प्रतिक्रियालिगैंड × मासस्थिरीकरण)/मासलिगैंड के साथ संयुक्त था। चूंकि सीआरबीएन और यौगिक के बीच केडी उच्च एकाग्रता पर यौगिक की अघुलनशीलता के कारण सटीक रूप से निर्धारित नहीं है, इसलिए सिमुलेशन चार अनुमानित केडी का उपयोग करके किया गया था: 1 माइक्रोन, 3 माइक्रोन, 10 माइक्रोन, या 30 माइक्रोन। प्रयोगात्मक परिणाम नकली 3 माइक्रोन और 10 माइक्रोन घटता के बीच में गिर गए, जो बाइनरी सिस्टम मेंकेडी के लगभग समान है, यह सुझाव देता है कि कोई सहकारिता नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: तीन बाध्यकारी परिदृश्यों का चित्रण और विभिन्न केडी की परिभाषा । (ए) क्लासिक दो-घटक सिस्टम। (बी) तीन-घटक प्रणाली जिसमें प्रोटैक के एक छोर को संतृप्त किया जा सकता है, इस प्रकार, इसका मूल्यांकन दो-घटक प्रणाली के रूप में किया जा सकता है। (सी) तीन-घटक प्रणाली जिसमें "हुक प्रभाव" मनाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आईटीसी परिणाम। VHL को MZ1 (बाएं) या MZ1:Brd4BD2 कॉम्प्लेक्स (दाएं) में अनुमापन करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बीएलआई परिणाम। MZ1 VHL के गठन की मध्यस्थता करता है: MZ1: Brd4BD2 टर्नरी कॉम्प्लेक्स। (ए) कच्चे डेटा। (बी) पृष्ठभूमि संकेतों का घटाव जहां [MZ1] = 0। (सी) कश्मीर पर, कश्मीरबंद, और के डी निकालने के लिए बी की काइनेटिक फिटिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसपीआर परिणाम । (ए) एमजेड 1 वीएचएल के लिए बाध्यकारी। (बी) MZ1: Brd4BD2 बाइनरी कॉम्प्लेक्स VHL के लिए बाध्यकारी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एसपीआर परिणाम एक प्रतिनिधि पीपीएम 1 डी-प्रोटैक के "हुक प्रभाव" दिखा रहा है। सीआरबीएन को एसए चिप सतह पर स्थिर किया गया था, जबकि [पीपीएम 1 डी] सभी मामलों के लिए विश्लेषण में 1 माइक्रोन पर रखा गया था। (ए) बीआरडी -2512, एक यौगिक जो केवल सीआरबीएन को बांधता है, लगभग कोई प्रतिक्रिया नहीं देता है। (बी) बीआरडी -4761, एक यौगिक जो केवल पीपीएम 1 डी से बांधता है, वह भी कोई प्रतिक्रिया नहीं देता है। (सी, डी) BRD-5110, BRD-5110 में CRBN के वारहेड के साथ एक PROTAC और BRD-1 में PPM4761D के वारहेड ने टर्नरी कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रेरित किया। (ई) सीआरबीएन और यौगिक के बीच केडी मानते हुए एसपीआर परिणामों का अनुकरण 1 माइक्रोन (काला), 3 माइक्रोन (नीला), 10 माइक्रोन (लाल), या 30 माइक्रोन (हरा) है। BRD-2512 वक्र 3 माइक्रोन और 10 माइक्रोन के बीच है, जो मापा बाइनरी KD के बहुत करीब है, जो कोई सहकारिता (सहकारिता = 1) का सुझाव नहीं देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

PROTAC अणुओं और उनके प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों के बीच बाइनरी और टर्नरी इंटरैक्शन का बायोफिजिकल लक्षण वर्णन व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सेलुलर सिस्टम के सापेक्ष अद्वितीय और पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। PROTAC अणु के प्रत्येक वारहेड और उसके प्रोटीन बाइंडिंग भागीदारों के बीच आत्मीयता को समझना उन इंटरैक्शन के अनुकूलन की दिशा में औषधीय रसायन विज्ञान के प्रयासों को निर्देशित करने में मदद कर सकता है। टर्नरी PROTAC परिसरों के पहले प्रकाशित क्रिस्टल संरचनाओं लिंकर क्षेत्र में परमाणुओं प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों16,20 के एक या दोनों के साथ बातचीत फार्म कर सकते हैं कि पता चला है. प्रयोगात्मक रूप से टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन की सहकारिता का निर्धारण लिंकर अनुकूलन का समर्थन कर सकता है।

इस रिपोर्ट में वर्णित तीन अलग-अलग बायोफिजिकल तकनीकों का उपयोग है जो PROTAC अणुओं और उनके प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों के बीच बाध्यकारी समानता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। विधि 1 PROTAC अणु, MZ1, VHL E3 ligase कॉम्प्लेक्स और Brd4BD2 ब्रोमोडोमेन के लिए इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (ITC) प्रयोगात्मक सेट-अप का विवरण देती है। आईटीसी के परिणामों ने एमजेड 1 और वीएचएल के बीच बाइनरी इंटरैक्शन के लिए 59 एनएम और वीएचएल और पूर्व-मिश्रित एमजेड 1 और बीआरडी 4बीडी 2 के बीच टर्नरी इंटरैक्शन के लिए 4 एनएम केकेडी को दिखाया। समानताएं एसपीआर में देखी गई लोगों के अनुरूप थीं (एमजेड 1 के डी = 26 एनएम के लिए स्थिर वीएचएल बाध्यकारी, पूर्व-मिश्रित एमजेड 1 और बीआरडी 4 बीडी 2 के डी = 1 एनएम के लिए स्थिर वीएचएल बाइंडिंग) और बीएलआई (केडी =2.8 एनएम)। जबकि MZ1 के लिए VHL बाइंडिंग के लिए ITC KD परिणाम रिपोर्ट किए गए मानों16 के अनुरूप हैं, प्राप्त स्टोइकोमेट्री अलग है। इस परिणाम के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यहां वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल HEPES आधारित बफर में MZ1 के गरीब घुलनशीलता है, जबकि साहित्य से परिणाम एक बिस tris आधारित बफर का उपयोग कर उत्पन्न किए गए थे. लेखकों ने एसपीआर, आईटीसी और बीएलआई में समान बफर घटकों का उपयोग करना पसंद किया।

विधि 2 स्थिर वीएचएल की बातचीत के बीएलआई विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन करता है, बीआरडी 4बीडी 2 की एक निश्चित एकाग्रता, और एमजेड 1 की अलग-अलग सांद्रता। तकनीक की संवेदनशीलता सीमाओं के कारण, टर्नरी जटिल गठन के लिए KD, kon, और kऑफ मान उत्पन्न किए जा सकते हैं, लेकिन MZ1 और प्रोटीन के बीच द्विआधारी बातचीत के लिए नहीं।

विधि 3 एकाधिक SPR assays का वर्णन करता है। एसपीआर बीएलआई की तुलना में अधिक संवेदनशील है और इसे प्रोटीन-छोटे अणु (बाइनरी) और प्रोटीन-प्रोटीन (टर्नरी) इंटरैक्शन दोनों का निरीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मामले में, पृष्ठभूमि संकेतों को सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए क्योंकि विश्लेषण में प्रोटीन उच्च और अस्थिर संकेत दे सकता है। एसपीआर डीएमएसओ, ग्लिसरॉल और डिटर्जेंट सहित उच्च अपवर्तक सूचकांक वाले अभिकर्मकों के प्रति बहुत संवेदनशील है। यदि प्रोटीन ग्लिसरॉल या डिटर्जेंट युक्त बफर में संग्रहीत किया जाता है, तो चल रहे बफर में उन घटकों की मिलान सांद्रता होनी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी लागू करने से किसी भी एसपीआर प्रयोग से पहले उन्हें पूरी तरह से हटा दिया जाता है। बफर और विश्लेषण नमूनों के बीच डीएमएसओ सांद्रता से निकटता से मेल खाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। DMSO विलायक सुधार निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है।

चरण 3.1 में विधि बाइनरी VHL-MZ1 इंटरैक्शन के लिए SPR परख का वर्णन करती है। विधि 3.2 वीएचएल के लिए एसपीआर परख का वर्णन करती है: एमजेड 1: बीआरडी 4 बीडी 2 टर्नरी कॉम्प्लेक्स जहां वीएचएल स्थिर है, और विश्लेषण या तो बीआरडी 4 बीडी 2 अकेले या एमजेड 1: बीआरडी 4 बीडी 2 कॉम्प्लेक्स है। इस प्रणाली में, Brd4BD2 और VHL के बीच बातचीत नगण्य है। टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन अत्यधिक सहकारी है (ɑ = 26)। टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन के लिए ऑफ-रेट 0.014 s-1 है, जिसके लिए सिंगल-साइकिल कैनेटीक्स के उपयोग की आवश्यकता होती है। आईटीसी के परिणाम एक अत्यधिक सहकारी टर्नरी कॉम्प्लेक्स गठन (ɑ = 15) भी दिखाते हैं। चरण 3.3, 3.4, और 3.5 में एसपीआर विधियां सीआरबीएन और पीपीएम 1 डी के बीच एक प्रोटैक अणु, बीआरडी-5110 की उपस्थिति से प्रेरित एक जटिल के गठन के मूल्यांकन के लिए परख का वर्णन करती हैं। PROTAC अणु में CRBN (K D ~ 3 μM) के लिए एक कमजोर संबंध और PPM1D (KD = 1-2 nM) के लिए एक मजबूत संबंध है। नतीजतन, सीआरबीएन के लिए कमजोर बंधन संतृप्त नहीं होता है और इसके परिणामस्वरूप "हुक-प्रभाव" मनाया जाता है। हालांकि प्रयोग में उपयोग की जाने वाली डीएमएसओ एकाग्रता को बढ़ाकर लिगैंड घुलनशीलता को बढ़ाना संभव है, लेकिन उन उदाहरणों में प्रोटीन स्थिरता की सावधानीपूर्वक निगरानी करना महत्वपूर्ण है जो डीएमएसओ की उच्च सांद्रता से नकारात्मक रूप से प्रभावित हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, डीएमएसओ में विघटन की उच्च गर्मी होती है जो प्रोटीन के लिए लिगेंड के बंधन की गर्मी को अस्पष्ट कर सकती है। देखभाल सिरिंज में समाधान के DMSO सांद्रता और सेल में समाधान मैच के लिए लिया जाना चाहिए. लेखक एक ही बफर तैयारी के खिलाफ दो समाधानों के डायलिसिस की सलाह देते हैं।

सामान्य सिफारिशें और दिशानिर्देश यहां किए गए और रिपोर्ट किए गए प्रयोगों के आधार पर प्रदान किए जाते हैं। जब PROTAC अणुओं और उनके प्रोटीन बाइंडिंग पार्टनर्स के बीच बाइनरी इंटरैक्शन की समानताएं मजबूत होती हैं (KD <1 μM), SPR टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन की सहकारिता पर बहुमूल्य जानकारी के साथ-साथ विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संबंध प्रदान करता है। जब प्रोटीन बाइंडिंग पार्टनर्स और PROTAC अणु में से एक के बीच बाइनरी इंटरैक्शन की समानताएं कमजोर होती हैं (KD >1 μM), परख सेटअप को संशोधित करने की आवश्यकता होगी। उन उदाहरणों में, आणविक सिमुलेशन का उपयोग जहां बाध्यकारी स्थिरांक तय किए जाते हैं, और लिगैंड और विश्लेषण की सांद्रता विविध होती है, परख डिजाइन का मार्गदर्शन करने और प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने में मूल्यवान हो सकती है। आईटीसी परख बाध्यकारी के स्टोइकोमेट्री पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन एसपीआर और बीएलआई के सापेक्ष काफी अधिक प्रोटीन और यौगिक अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, PROTAC अणु की घुलनशीलता ITC प्रयोगों के लिए सीमित हो सकती है। बीएलआई में आईटीसी की तुलना में अधिक थ्रूपुट होता है और इसके लिए कम प्रोटीन और यौगिक अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, संवेदनशीलता सीमाओं के कारण, बीएलआई का उपयोग केवल टर्नरी जटिल गठन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है न कि प्रोटैक अणुओं और उनके प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों के बीच द्विआधारी बातचीत। यह अनुशंसा की जाती है कि एसपीआर का उपयोग बाइनरी और टर्नरी प्रोटैक बाइंडिंग परख और बीएलआई और आईटीसी परख दोनों के नियमित परीक्षण के लिए किया जाए, जो एसपीआर से परिणामों के ऑर्थोगोनल सत्यापन के लिए उपयोग किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या अन्य हितों का टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम एमआईटी और हार्वर्ड के ब्रॉड इंस्टीट्यूट में चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए केंद्र से एक नवाचार और प्रौद्योगिकी विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया. लेखक इस काम के समर्थन के लिए वरिष्ठ नेतृत्व टीम और समीक्षा समिति के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

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References

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चिमेरस (PROTACS) को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस द्वारा प्रेरित टर्नरी कॉम्प्लेक्स फॉर्मेशन के मूल्यांकन के लिए बायोफिजिकल परख का विकास और अनुप्रयोग
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Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

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