Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utveckling och tillämpning av biofysikaliska analyser för att utvärdera ternära komplex inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS)

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65718
Automatic Translation
1, 1
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Summary

Här beskriver vi protokoll för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS) som involverar ubiquitinligaserna Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) och Cereblon (CRBN). Biofysikaliska metoder som illustreras här inkluderar ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning kan induceras att bilda komplex av heterobifunktionella molekyler i en flerstegsprocess. Kinetiken och termodynamiken i de inblandade interaktionerna bidrar till effektiviteten av ubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet. Biofysikaliska tekniker som ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) ger värdefull information som kan användas för att optimera dessa interaktioner. Med hjälp av två modellsystem etablerades en biofysikalisk analysverktygslåda för att förstå kooperativiteten hos ternära komplex och effekten av "krokeffekten" på bindningskinetiken. I ett fall utvärderades en proteolysriktad chimärmolekyl (PROTAC) som inducerade ternära komplexbildning mellan Brd4BD2 och VHL. Den heterobifunktionella molekylen, MZ1, har nM-affiniteter för både Brd4BD2-proteinet (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) och VHL-komplexet (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). För detta system utvecklades robusta SPR-, BLI- och ITC-analyser som reproducerade publicerade resultat som visade kooperativiteten hos ternära komplexbildning. I det andra fallet studerades en molekyl som inducerade ternära komplex mellan ett 46,0 kDa-protein, PPM1D, och cereblon [CRBN (319-442)]. Den heterobifunktionella molekylen, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM för PPM1D men mycket svagare bindning mot det trunkerade CRBN-komplexet (319-442) (SPR KD= ~ 3 μM). I det fallet var bindningen för CRBN i SPR inte mättnadsbar, vilket resulterade i en "hook-effekt". Genomströmnings- och reagenskrav för SPR, BLI och ITC utvärderades, och allmänna rekommendationer för deras tillämpning på PROTAC-projekt tillhandahölls.

Introduction

Polyubiquitinering av proteiner i cellen är en hårt reglerad process som involverar enzymer i Ubiquitin-ligasfamiljen 1,2. De terminala enzymerna i vägen är E3 ubiquitin-ligaser som kovalent binder ubiquitinmolekyler till sina proteinbindande partners3. Polyubiquitineringen av dessa proteinbindande partners riktar sig mot dem för proteolytisk nedbrytning av proteasom4. Detta system är en del av proteinhomeostasprocessen som har utnyttjats terapeutiskt för att inducera nedbrytningen av proteiner som är involverade i sjukdom5. Små molekyler som inducerar interaktionen mellan E3 ubiquitin-ligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) eller cereblon (CRBN), består vanligtvis av en E3-ligasbindande stridsspets ansluten med en flexibel länkare till en stridsspets som binder till proteinet som är föremål för nedbrytning. Dessa heterobifunktionella molekyler kallas vanligen proteolysriktade chimärer eller PROTACS6.

Utvecklingen av PROTACS innebär att man utvärderar molekylers förmåga att inducera nedbrytning av proteiner i celler. Många cellulära analyssystem har utvecklats som övervakar den inducerade interaktionen mellan målproteinet och E3-ligaskomponenter, såsom VHL eller CRBN, vid behandling av cellerna med en PROTAC-molekyl. En sådan cellulär analys, nanoluc-Halotag-system7, involverar ett E3-ligas som smälts samman med Halotag-acceptorn och ett målprotein som är märkt med en nanoluc-donator. Ternära komplexbildning för nanolucdonatorn och Halotag-acceptorn i närheten, vilket möjliggör överföring av energi från givaren till acceptorn, vilket resulterar i utsläpp av ljus. Variationer av detta system kan användas för att bedöma den cellulära permeabiliteten hos PROTACS-molekyler8 eller förändringar i den relativa nivån av målproteinubiquitinering9. Även om dessa cellulära system är viktiga för att driva optimeringen av PROTACS, är bildandet av komplex mellan E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning en flerstegsprocess10,11. Kinetiken och termodynamiken för de binära och ternära interaktioner som är involverade bidrar till effektivitetubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet12,13,14.

Här beskrivs protokoll som kan anpassas för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av PROTACS med hjälp av ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isoterm titreringskalorimetri (ITC). SPR- och ITC-protokoll för MZ1 PROTAC-molekylen som inducerar ternära komplexbildning mellan Brd4BD2 och VHL härledda från litteraturrapporter13,15 och som beskrivs här kunde rekapitulera de rapporterade resultaten med viss modifiering av de rapporterade procedurerna, vilket kommer att diskuteras. En beskrivning av en BLI-analys som används för att utvärdera ternära komplex bildning mellan MZI, Brd4BD2 och VHL ingår i denna rapport. Affinitetsmätningar från BLI överensstämde med de som observerades i SPR och ITC. Ett tidigare publicerat protokoll där en SPR-analys utvecklades för att bedöma den PROTAC-inducerade ternära komplexbildningen mellan PPM1D, ett Ser/Thr-proteinfosfatas vars uttryck induceras på ett p53-beroende sätt16, och CRBN beskrivs också. I detta fall har PROTAC-molekylen en nanomolär affinitet för PPM1D men endast en mikromolär affinitet för CRBN. I detta fall är bindningen av PROTAC-molekylen till CRBN inte mättnadsbar, vilket resulterar i den allmänt observerade "krokeffekten". Krokeffekten är en egenskap hos tre kroppssystem där det finns två arter som kan bilda ett heterotrimert komplex när båda är bundna till en överbryggande molekyl (Figur 1)17. Krokeffekten observeras när den överbryggande arten är i överkoncentration i förhållande till de två andra arterna. Det resulterande tillståndet är ett tillstånd där de binära interaktionerna konkurrerar ut de ternära interaktionerna. De system där krokeffekten observeras kräver specifika experimentella designöverväganden som diskuteras i denna rapport. Allmänna begrepp och reagenskrav för utvärdering av användningen av biofysikaliska analyser för utvärdering av PROTAC-inducerad ternära komplexbildning tillhandahålls.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla proteiner överuttrycktes i E.coli med god avkastning och renhet (>80%) enligt litteraturprotokollen18. Biotinylering utfördes med hjälp av en BirA-katalyserad reaktion18. Alla små molekyler framställdes vid 1 mM stamlösningar i 100% DMSO. De procedurer som beskrivs här kräver inte specialiserad laboratoriesäkerhetsutrustning eller försiktighetsåtgärder. Standardutrustning för laboratoriets personliga skyddsutrustning (PPE) bör användas (dvs. labbrock, skyddsglasögon och handskar).

Proteiner som används i denna studie listas nedan:
VHL: biotinylerat VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112)-komplex med Avi-tagg vid C-terminalen av ElonginB.
Brd4BD2: Ej taggad Brd4BD2(333-460)
CRBN: biotinylerat CRBN(319-442) med Avi-tagg vid N-ändan
PPM1D: otaggad eller dubbel His8-taggad PPM1D(1-420) vid N-ändstationen

Små molekyler som används i denna studie listas nedan:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC som binder till VHL och Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~3 μM, binder inte tillPPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): binder inte till CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM

1. Metod 1: ITC (isotermisk titreringskalorimetri)

OBS: Titreringar utförs med hjälp av en mikrokalorimeter med automatisk injektion.

  1. Buffertberedning: Förbered 3 l buffert innehållande 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Dialys: Dialysera VHL och Brd4BD2 (~ 500 μL vid 150 μM vardera) mot 1 L av bufferten som beretts i steg 1.1, 3 gånger vid 4 °C, i 4 timmar, 2 timmar respektive cirka 16 timmar. Spara bufferten efter den sista dialysen för användning i efterföljande steg.
  3. Förbered proverna på en platta med 96 brunnar och plastlock.
    1. För varje titrering bereds 400 μl lösning för cellen, 125 μL för sprutan och 400 μL buffert för rengöring. Tillsätt proverna till tre på varandra följande brunnar på plattan. Eftersom sammansatt stam bereds vid 1 mM i 100 % DMSO, tillsätt samma procentandel DMSO till proteinlösningarna för att säkerställa den matchande bufferten i cellen och sprutan. Tillsätt 2 % DMSO till de slutliga lösningarna.
      1. Prov för titrering av VHL till MZ1: Bered celllösning innehållande 392 μl buffert, 4 μl MZ1 vid 1 mM (10 μM slutlig koncentration) och 4 μL 100 % DMSO. Bered en sprutlösning som innehåller 122,5 μl VHL vid 85,7 μM, 2,5 μL 100 % DMSO (84 μM slutlig koncentration).
      2. Prover för titrering av VHL i bufferten (data kommer att användas för bakgrundssubtraktion av data som genereras från prov 1.3.1.1): Bered celllösning innehållande 392 μL buffert, 8 μL 100% DMSO. Bered en sprutlösning som innehåller 122,5 μl VHL vid 85,7 μM (84 μM slutlig koncentration) och tillsätt 2,5 μL 100 % DMSO.
      3. Prover för titrering av VHL till MZ1 och Brd4 BD2: Bered celllösning innehållande 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM slutlig koncentration), 3,36 μL MZ1 vid 1 mM (8,4 μM slutlig koncentration) och 4,64 μL 100 % DMSO. Bered en sprutlösning som innehåller 122,5 μl VHL vid 85,7 μM (84 μM slutlig koncentration) och 2,5 μL 100 % DMSO.
      4. Prover för titrering av VHL till Brd4 BD2 (bakgrund till 1.3.1.3): Bered celllösning innehållande 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM slutlig koncentration) och 8 μl 100 % DMSO. Bered en sprutlösning som innehåller 122,5 μl VHL vid 85,7 μM (84 μM slutlig koncentration) och 2,5 μL 100 % DMSO.
  4. Kör alla fyra titreringarna på mikrokalorimetern. Var och en består av 19 injektioner av 2 μL sprutlösning med en hastighet av 2 μL/s med 120 s tidsintervall. Gör en första injektion av protein (0,4 μL) och kassera det under dataanalysen. Utför alla experiment vid 25 °C under omrörning med 600 varv per minut.
  5. Dataanalys: Anpassa data till en modell med en enda bindningsplats för att erhålla stökiometri (n), dissociationskonstanten (KD) och bindningsentalpi (ΔH) med hjälp av analysprogramvaran som tillhandahålls av tillverkaren (figur 2).

2. Metod 2: BLI (bioskiktsinterferometri)

  1. Utföra BLI-experiment med streptavidin (SA) belagda sensorer vid rumstemperatur (RT) med en förvärvshastighet på 5 Hz. Under det automatiserade BLI-experimentet, se till att sensorerna är stationära i en enda kolonn och rör sig mellan olika kolonner i en 96-brunnars svart platta med platt botten och en maximal brunnsvolym på 392 μL. Fyll varje brunn på plattan som används i experimentet med 200 μL lösning.
    BLI är endast användbart för att detektera protein-proteininteraktioner (dvs. ternära komplexbildning). Den är inte tillräckligt känslig för att upptäcka interaktioner mellan proteiner och små molekyler.
    1. Buffertberedning: Förbered 100 ml buffert innehållande 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05 % P20, pH 7,5.
    2. Optimering för immobiliseringssteget: Ladda testsensorn till 1-3 nm, enligt tillverkarens rekommendationer. En belastning på ~1,0 nm används för de procedurer som beskrivs här. För att uppnå detta, doppa sensorn i en lösning som innehåller VHL vid 1.5 μg/ml i 80 s.
    3. Utför BLI-kinetiska mätningar genom att applicera sju SA-sensorer med följande sekvens:
      1. För den första baslinjefasen, doppa i bufferten i 60 s.
      2. För immobiliseringsfasen, doppa i en lösning av VHL vid 1,5 μg/ml i 80 s.
      3. För den andra baslinjefasen, doppa i bufferten i 60 s.
      4. För associationsfasen, doppa i lösning av en fast koncentration av Brd4BD2 vid 2 μM, fast koncentration av DMSO vid 2 % och varierande koncentrationer av MZ1 vid 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM och 0 nM (referenssensor) i 300 s.
      5. För dissociationsfasen, doppa i bufferten i 600 s.
    4. Utför dataanalys med hjälp av tillverkarens programvara. k on, koff och KD rapporteras för dataanpassning (figur 3).

3. Metod 3: SPR (ytplasmonresonans)

OBS: Alla SPR-experiment utförs med streptavidin (SA) belagda sensorchips vid RT. Även om NTA-chipet används för detektion mellan protein och små molekyler, ska det användas med försiktighet när det appliceras på det ternära komplexet, eftersom en mycket högre bakgrund än SA-chipet observeras, möjligen på grund av elektrostatiska interaktioner mellan den laddade chipytan och proteinet i analyten.

  1. SPR för VHL-MZ1-interaktion
    1. Förberedelse av buffert.
      1. Bered en 1 L buffert innehållande 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5, och passera den genom en 0.2 μm filterenhet.
      2. Ta bort 20 ml buffert för framtida användning (DMSO-fri buffert) och fyll på med 20 ml DMSO (2 % DMSO i den slutliga löpande bufferten). Håll DMSO på 2 % i alla samples som beskrivs nedan (steg 3.1 och 3.2)
    2. Aktivera SA-chipet enligt tillverkarens protokoll och immobilisera VHL till ~2000 RU (injicera proteinlösning på 5 μg/ml vid 5 μL/min).
    3. Bered MZ1 i en 3-faldig, 8-punkts seriespädning med en högsta koncentration på 10 μM på en konisk bottenplatta av polypropen med 384 brunnar och en maximal volym på 130 μL. Täck plattan med självhäftande, genomskinliga plastfolier som är kompatibla med mikroplattor av polypropen.
      1. Bered den högsta koncentrationen med den DMSO-fria bufferten för att säkerställa 2 % DMSO vid den slutliga koncentrationen. Tillsätt 1,5 μl MZ1-stam vid 1 mM och 1,5 μl 100 % DMSO till 147 μL DMSO-fri buffert.
      2. Bered den 3-faldiga seriespädningen med den löpande bufferten som innehåller 2 % DMSO. Tillsätt 50 μl lösning till 100 μl av den löpande bufferten vid den högsta koncentration som beretts i steg 3.1.3.1 och blanda väl för att bereda dennäst högsta koncentrationen.
      3. Överför sedan 50 μl av den lösning som beretts i steg 3.1.3.2 till nästa 100 μl löpande buffert, blanda väl för att bereda den 3:e högsta koncentrationen, och så vidare.
    4. Kör SPR med hjälp av flercykelinställningen: Läge: Högpresterande; kontakttid: 120 s; dissociationstid: 300 s; flödeshastighet: 50 μL/min.
    5. Utför dataanalys med hjälp av utvärderingsprogramvaran som tillhandahålls av instrumenttillverkaren. Steady-state-analys indikerade att KD = 26 (± 3) nM och Rmax på ~91 % (± 5 %) bindning uppnåddes (figur 4A)
  2. SPR för VHL: MZ1: Brd4BD2 ternära komplex
    1. Förbered bufferten enligt beskrivningen i steg 3.1.1.
    2. Aktivera SA-kretsen enligt tillverkarens protokoll och immobilisera VHL till ~100 RU. Injicera en proteinlösning på 0,5 μg/ml VHL med en flödeshastighet på 5 μL/min och kontakttid mellan 1-5 min tills en ytdensitet på ~100 RU uppnås.
    3. Bered prover för två 5-faldiga, 5-punkts entaktsinjektioner i en 96-håls, klar, polystyren, rund bottenplatta med en maximal volym på 323 μL och täck den med självhäftande, genomskinliga plastfolier som är kompatibla med polystyrenmikroplattor enligt beskrivningen i punkterna 3.2.3.1–3.2.3.2.
      1. Negativ kontroll: analyt innehåller endast Brd4BD2 .
        1. Bered toppkoncentrationen vid 25 μM i löpande buffert med en volym på 200 μL (#A5)
        2. Tillsätt 160 μl vardera av Brd4BD2 vid 2 μM i den löpande bufferten till de följande 4 brunnarna till vänster (#A1-A4)
        3. Överför 40 μl A5 till A4. Blanda väl.
        4. Överför 40 μL A4 till A3. Blanda väl. Fortsätt att göra det fram till A1.
      2. Ternära komplexbildning: analyten innehåller MZ1 och Brd4BD2.
        1. Bered den högsta koncentrationen genom att tillsätta 4 μl MZ1 vid 20 μM i 100 %-DMSO-lösning till 196 μL innehållande 25,5 μM Brd4BD2 i DMSO-fri buffert (#B5). De slutliga koncentrationerna är 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 och 2 % DMSO.
        2. Tillsätt 160 μl vardera av Brd4BD2 vid 2 μM i den löpande bufferten till de följande 4 brunnarna till vänster (#B1-B4)
        3. Överför 40 μl B5 till B4. Blanda väl.
        4. Överför 40 μl B4 till B3. Blanda väl. Fortsätt att göra det fram till B1.
    4. Kör SPR med hjälp av encykelinställningen: Kontakttid: 100 s; dissociationstid: 720 s; flödeshastighet: 50 μL/min. Applicera tre injektioner av buffert före varje sample för att säkerställa en stabil bakgrund.
    5. Dataanalys: Använd den tredje injektionen av bufferten som bakgrund för subtraktion. Som den negativa kontrollen, när MZ1 inte är närvarande, är SPR-svaret mellan VHL och Brd4BD2 försumbart. När MZ1 är närvarande indikerar kinetisk anpassning interaktionen mellan VHL och MZ1-Brd4BD2-komplexet har k på = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, kav = 0.014 s-1 och KD = 1 nM. (Figur 4B)
  3. SPR för CRBN och småmolekylära interaktioner
    1. Förberedelse av buffert.
      1. Bered en 1 L buffert innehållande 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5, och passera den genom en0.2 μm filterenhet.
      2. Ta bort 20 ml buffert och fyll på 20 ml 100 % DMSO (2 % DMSO i den slutliga löpande bufferten). Det är viktigt att hålla DMSO på 2 % i alla samples som beskrivs nedan (steg 3.3, 3.4 och 3.5).
    2. Aktivera SA-kretsen enligt tillverkarens protokoll och immobilisera CRBN till ~800 RU.
    3. Bered föreningarna i 3-faldig, 6-punkters seriespädning på en 384-hålsplatta med en toppkoncentration på 30 μM enligt beskrivningen i 3.1.3.
    4. Kör SPR med flercykelinställningen: Läge: Högpresterande, kontakttid: 60 s, dissociationstid: 90 s; flödeshastighet: 50 μL/min. För detta system räcker det med tre buffertinjektioner för att få en stabil bakgrund. För andra analyssystem kan det vara nödvändigt att utföra ytterligare buffertinjektioner.
    5. Utför dataanalys med hjälp av tillverkarens programvara.
      OBS: Steady-state-analys indikerar att KD för BRD-2512 och BRD-5110 båda är runt 3 μM. Bindningen nådde dock endast ~ 70 % Rmaxbindning vid toppkoncentrationen. Både svag affinitet och formen på sensorgrammet indikerar att föreningsolöslighet vid höga koncentrationer sannolikt kommer att inträffa. Således kan den faktiska KD vara högre än 3 μM. BRD-4761, som inte binder till CRBN, inkluderades som en negativ kontroll.
  4. SPR för PPM1D och småmolekylära interaktioner
    1. Förbered bufferten enligt beskrivningen i steg 3.3.1. Använd ett nitriloättiksyra (NTA) sensorchip.
    2. Tillämpa en enda cykel eftersom PPM1D-stridsspetsen har ett långsamt k på ochk av. Regenerera NTA-chipet med tillverkarens standardinställning och immobilisera PPM1D till ~ 1000 RU efter varje sammansatt injektion (injicera proteinlösning på 5 μg/ml vid 5 μL/min).
    3. Bered föreningarna i 3-faldig, 5-punkts seriespädning med den högsta koncentrationen vid 400 nM enligt beskrivningen i 3.1.3.
    4. Kör SPR med hjälp av encykelinställningen: Läge: högpresterande; Kontakttid: 90 s; dissociationstid: 600 s; flödeshastighet: 50 μL/min. Applicera tre injektioner av buffert före varje förening för att säkerställa en stabil bakgrund.
    5. Analys av data. Använd den tredje injektionen av bufferten som bakgrund för subtraktion. Som negativ kontroll visar BRD-2512 inte bindning till PPM1D. För BRD-4761 och BRD-5110 indikerade kinetisk anpassning att KD för båda var 1-2 nM.
  5. SPR för CRBN:PROTAC: PPM1D ternära komplex
    1. Förbered bufferten enligt beskrivningen i steg 3.3.1.
    2. Aktivera SA-chipet enligt tillverkarens protokoll och immobilisera CRBN till ~35 RU (injicera en proteinlösning på 0,5 μg/ml vid 5 μL/min).
    3. Bered tre föreningar i 3-faldig, 6-punkts seriespädning med en toppkoncentration på 30 μM samtidigt som [PPM1D] hålls vid 1 μM i alla prover, inklusive blankprov, med hjälp av den metod som beskrivs i steg 3.2.3.
    4. Kör SPR med hjälp av flercykelinställningen: Läge: Högpresterande; kontakttid: 60 s; dissociationstid: 90 s; flödeshastighet: 50 μL/min.
    5. Utför dataanalys med hjälp av tillverkarens programvara.
      OBS: Medan BRD-2512 och BRD-4761 visar ingen/försumbar respons, visar BRD-5110 tydligt "krokeffekten" vid steady state med snabb på/av-kinetik (Figur 5A-C). Den experimentella bindningsresponsen från BRD-5110 (figur 5C) ligger mellan den förutsagda responsen från simuleringen när man antar att K D (CRBN, cpd) är 3 eller 10 μM (figur 5E), vilket tyder på att den ternära K D och binära KD är mycket lika. Det finns ingen uppenbar samarbetsförmåga för PPM1D: BRD-5110: CRBN-komplexbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering av VHL: MZ1 binärt komplex och VHL: MZ1: Brd4BD2 ternära komplex finns i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) och figur 4 (SPR) med en mycket liknande buffert. KD extraherad från ortogonala analyser är konsekvent. Kooperativiteten kan beräknas med K D (binär) / KD (ternär), som är mycket positiv (15 från ITC eller 26 från SPR).

Karakterisering av CRBN:PROTAC: PPM1D-systemet utfördes av SPR (figur 5A-D). CRBN immobiliserades till ~35 RU för att underlätta observationen av ternära komplexbildning. Bindningen av enbart PROTAC resulterade i en signal på <2 RU, vilket är lägre än bruset. PPM1D i analyten ger en hög bakgrundssignal på SA-chipets yta, och den högsta koncentrationen som kan appliceras är runt 1 μM. Detta värde är lägre än KD mellan CRBN och dess stridsspets ≥3 μM), vilket innebär att "krokeffekten" förväntas. SPR är tillräckligt känsligt för att detektera det, vilket stämmer väl överens med simuleringen (figur 5E). Simuleringen gjordes med hjälp av de icke-kooperativa jämvikterna i litteratur19 i kombination med den klassiska SPR-beräkningen [Responsemax = (Response Ligand × MassImmobilization)/MassLigand]. Eftersom KD mellan CRBN och förening inte bestäms exakt på grund av föreningens olöslighet vid hög koncentration, gjordes simuleringen med fyra antagna KD: 1 μM, 3 μM, 10 μM eller 30 μM. De experimentella resultaten hamnade mellan de simulerade 3 μM- och 10 μM-kurvorna, vilket är nästan identiskt med KD i det binära systemet, vilket tyder på att det inte finns någon kooperativitet.

Figure 1
Figur 1: Illustration av tre bindningsscenarier och definition av olika KD. (A) Klassiska tvåkomponentsystem. (B) Trekomponentsystem där ena änden av PROTAC kan mättas, så att det kan utvärderas som ett tvåkomponentsystem. C) Trekomponentsystem där "krokeffekten" observeras. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: ITC-resultat. Titrera VHL till MZ1 (vänster) eller MZ1:Brd4BD2-komplex (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: BLI-resultat. MZ1 förmedlar bildandet av VHL: MZ1: Brd4BD2 ternära komplex. (A) Rådata. (B) Subtraktion av bakgrundssignaler där [MZ1] = 0. (C) Kinetisk anpassning av B för att extrahera k på, kav och KD. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: SPR-resultat . (A) MZ1-bindning till VHL. (B) MZ1:Brd4BD2 binärt komplex bindning till VHL. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: SPR-resultat som visar "krokeffekten" av en representativ PPM1D-PROTAC. CRBN immobiliserades på SA-chipets yta medan [PPM1D] hölls vid 1 μM i analyten i alla fall. (A) BRD-2512, en förening som endast binder till CRBN, ger nästan inget svar. (B) BRD-4761, en förening som endast binder till PPM1D, ger inte heller något svar. (C,D) BRD-5110, en PROTAC med stridsspetsen av CRBN i BRD-2512 och stridsspetsen av PPM1D i BRD-4761, inducerade bildandet av det ternära komplexet. (E) En simulering av SPR-resultat som antar att KD mellan CRBN och föreningen är 1 μM (svart), 3 μM (blå), 10 μM (röd) eller 30 μM (grön). BRD-2512-kurvan ligger mellan 3 μM och 10 μM, vilket är mycket nära den uppmätta binära KD, vilket tyder på att det inte finns någon kooperativitet (kooperativitet = 1). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofysikalisk karakterisering av de binära och ternära interaktionerna mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners kan ge unika och kompletterande insikter i förhållande till allmänt använda cellulära system. Att förstå affiniteten mellan varje stridsspets i en PROTAC-molekyl och dess proteinbindande partners kan hjälpa till att vägleda läkemedelskemiska ansträngningar mot optimering av dessa interaktioner. Tidigare publicerade kristallstrukturer av ternära PROTAC-komplex har avslöjat att atomer i länkregionen kan bilda interaktioner med en eller båda av proteinbindningspartnerna16,20. Experimentell bestämning av kooperativiteten hos ternära komplexbildning kan stödja länkoptimering.

I denna rapport beskrivs användningen av tre olika biofysikaliska tekniker som kan ge information om bindningsaffiniteterna mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners. Metod 1 beskriver den experimentella uppställningen för isotermisk titreringskalorimetri (ITC) för PROTAC-molekylen, MZ1, VHL E3-ligaskomplexet och Brd4BD2-bromodomänen. ITC-resultaten visade KD-värden på 59 nM för den binära växelverkan mellan MZ1 och VHL och 4 nM för den ternära växelverkan mellan VHL och förblandade MZ1 och Brd4BD2. Affiniteterna överensstämde med de som observerades i SPR (immobiliserad VHL-bindning till MZ1, K, D = 26 nM, immobiliserad VHL-bindning till förblandad MZ1 och Brd4,BD2, K, D=1 nM) och BLI (K,D=2,8 nM). Medan ITC KD-resultaten för VHL-bindning till MZ1 överensstämmer med rapporterade värden16, är den erhållna stökiometrin annorlunda. En möjlig förklaring till detta resultat är den dåliga lösligheten av MZ1 i den HEPES-baserade buffert som används i det protokoll som beskrivs här, medan resultaten från litteraturen genererades med hjälp av en Bis-tris-baserad buffert. Författarna föredrog att använda samma buffertkomponenter i SPR, ITC och BLI.

Metod 2 beskriver den experimentella uppställningen för BLI-analysen av interaktionen mellan immobiliserad VHL, en fast koncentration av Brd4BD2 och varierande koncentrationer av MZ1. På grund av teknikens känslighetsbegränsningar kunde KD-, K ON- och koff-värden för ternära komplexbildning genereras, men inte för den binära interaktionen mellan MZ1 och proteinerna.

Metod 3 beskriver flera SPR-analyser. SPR är känsligare än BLI och kan användas för att observera både protein-småmolekyl (binär) och protein-protein (ternär) interaktioner. I det senare fallet bör bakgrundssignalerna övervakas noggrant eftersom proteinet i analyten kan ge höga och instabila signaler. SPR är mycket känsligt för reagenser med högt brytningsindex, inklusive DMSO, glycerol och rengöringsmedel. Om proteinet lagras i en buffert som innehåller glycerol eller rengöringsmedel måste den löpande bufferten innehålla motsvarande koncentrationer av dessa komponenter. Alternativt kan du använda storleksuteslutningskromatografi för att helt ta bort dem före något SPR-experiment. Försiktighet bör iakttas för att nära matcha DMSO-koncentrationerna mellan buffert- och analytprover. DMSO-lösningsmedelskorrigeringarna utförs enligt tillverkarens instruktioner.

Metoden i steg 3.1 beskriver SPR-analysen för den binära VHL-MZ1-interaktionen. Metod 3.2 beskriver SPR-analysen för VHL: MZ1: Brd4 BD2 ternära komplex där VHL är immobiliserad och analyten är antingen Brd4 BD2 ensam eller MZ1:Brd4BD2-komplexet. I detta system är interaktionen mellan Brd4BD2 och VHL försumbar. Den ternära komplexbildningen är mycket samverkande (ɑ = 26). Off-rate för ternära komplexbildning är 0,014 s-1, vilket kräver användning av encykelkinetik. Resultat från ITC visar också en mycket samverkande ternära komplex (ɑ=15). SPR-metoderna i steg 3.3, 3.4 och 3.5 beskriver metoder för att utvärdera bildandet av ett komplex mellan CRBN och PPM1D inducerat av närvaron av en PROTAC-molekyl, BRD-5110. PROTAC-molekylen har en svag affinitet för CRBN (K D ~3 μM) och en stark affinitet för PPM1D (KD = 1-2 nM). Som ett resultat är den svaga bindningen till CRBN inte mättad och resulterar i en observerad "krok-effekt". Även om det är möjligt att öka ligandlösligheten genom att öka DMSO-koncentrationen som används i experimentet, är det i dessa fall viktigt att noggrant övervaka proteinstabiliteten som kan påverkas negativt av höga koncentrationer av DMSO. Dessutom har DMSO en hög upplösningsvärme som kan dölja värmen för bindning av ligander till protein. Försiktighet bör iakttas så att DMSO-koncentrationerna i lösningen i sprutan och lösningen i cellen överensstämmer. Författarna rekommenderar dialys av de två lösningarna mot samma buffertpreparat.

Allmänna rekommendationer och riktlinjer ges baserat på de experiment som utförts och rapporterats här. När affiniteterna för binära interaktioner mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners är starka (KD <1 μM), ger SPR tillförlitliga och reproducerbara affiniteter tillsammans med värdefull information om kooperativiteten för ternära komplexbildning. När affiniteterna för den binära interaktionen mellan en av proteinbindningspartnerna och PROTAC-molekylen är svaga (KD >1 μM), måste analysinställningen modifieras. I dessa fall kan användningen av molekylära simuleringar där bindningskonstanterna är fasta och koncentrationerna av ligand och analyt varieras vara värdefulla för att vägleda analysdesign och tolka experimentella resultat. ITC-analyser ger viktig information om stökiometrin för bindning men kräver betydligt mer protein och sammansatta reagenser i förhållande till SPR och BLI. Dessutom kan lösligheten av PROTAC-molekylen vara begränsande för ITC-experiment. BLI har högre genomströmning än ITC och kräver mindre protein och sammansatta reagenser. På grund av känslighetsbegränsningar kan dock BLI endast användas för att bedöma den ternära komplexbildningen och inte binära interaktioner mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners. Det rekommenderas att SPR används för rutintestning av både binära och ternära PROTAC-bindningsanalyser och BLI- och ITC-analyser som används för ortogonal validering av resultat från SPR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett innovations- och teknikutvecklingspris från Center for the Development of Therapeutics vid Broad Institute of MIT och Harvard. Författarna vill tacka medlemmarna i ledningsgruppen och granskningskommittén för deras stöd i detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-plate Greiner 655076 flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate Nunc 73520-120 Plate use for ITC sample preparation
96-well plate Greiner 650101 Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter Malvern Panalytical Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200 Cytiva 29136649 Instrument used to perform SPR experiments
MZ1 ProbeChem PC-60099 PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip Cytiva BR100532 SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384 Sartorius Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover Malvern PQA0001 Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover Cytiva 28975816 Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip Cytiva BR100531 SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors Sartorius 18-509 Coated sensors used in BLI experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 203
Utveckling och tillämpning av biofysikaliska analyser för att utvärdera ternära komplex inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, W., Soutter, H. The… More

Jiang, W., Soutter, H. The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS). J. Vis. Exp. (203), e65718, doi:10.3791/65718 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter