Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren in vitro til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

Blod-hjerne-barrieren (BBB) spiller en afgørende rolle for at opretholde et stabilt og sundt hjernemiljø. BBB dysfunktion er forbundet med mange neurologiske sygdomme. Vi har udviklet en 3D, stamcelleafledt model af BBB for at undersøge cerebrovaskulær patologi, BBB-integritet, og hvordan BBB ændres af genetik og sygdom.

Abstract

Blod-hjerne-barrieren (BBB) er en vigtig fysiologisk komponent i centralnervesystemet (CNS), opretholder næringsstoffer, rydder affald og beskytter hjernen mod patogener. BBB's iboende barriereegenskaber udgør en udfordring for terapeutisk lægemiddellevering til CNS til behandling af neurologiske sygdomme. Nedsat BBB-funktion har været relateret til neurologisk sygdom. Cerebral amyloid angiopati (CAA), aflejring af amyloid i cerebral vaskulatur, der fører til en kompromitteret BBB, er en co-morbiditet i de fleste tilfælde af Alzheimers sygdom (AD), hvilket tyder på, at BBB dysfunktion eller nedbrydning kan være involveret i neurodegeneration. På grund af begrænset adgang til humant BBB-væv forbliver de mekanismer, der bidrager til korrekt BBB-funktion og BBB-degeneration, ukendte. For at løse disse begrænsninger har vi udviklet en human pluripotent stamcelleafledt BBB (iBBB) ved at inkorporere endotelceller, pericytter og astrocytter i en 3D-matrix. iBBB samler sig selv for at rekapitulere anatomien og cellulære interaktioner, der findes i BBB. Såning af iBBB'er med amyloid fanger nøgleaspekter af CAA. Derudover tilbyder iBBB en fleksibel platform til at modulere genetiske og miljømæssige faktorer, der er involveret i cerebrovaskulær sygdom og neurodegeneration, for at undersøge, hvordan genetik og livsstil påvirker sygdomsrisikoen. Endelig kan iBBB bruges til lægemiddelscreening og medicinalkemiske undersøgelser for at optimere terapeutisk levering til CNS. I denne protokol beskriver vi differentieringen af de tre typer celler (endotelceller, pericytter og astrocytter), der stammer fra humane pluripotente stamceller, hvordan man samler de differentierede celler i iBBB, og hvordan man modellerer CAA in vitro ved hjælp af eksogent amyloid. Denne model overvinder udfordringen med at studere levende menneskeligt hjernevæv med et system, der har både biologisk troskab og eksperimentel fleksibilitet, og muliggør forhør af den menneskelige BBB og dens rolle i neurodegeneration.

Introduction

Blod-hjerne-barrieren (BBB) er et vigtigt mikrovaskulært netværk, der adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien for at opretholde et ideelt miljø for korrekt neuronal funktion. Det har en kritisk rolle i reguleringen af tilstrømning og udstrømning af stoffer til CNS ved at opretholde metabolisk homeostase 1,2,3,4, rydde affald 4,5,6 og beskytte hjernen mod patogener og toksiner 7,8.

Den primære celletype af BBB er endotelcellen (EC). Endotelceller, der stammer fra mesoderm-slægten, danner væggene i vaskulaturen 1,9. Mikrovaskulære EC'er danner tætte kryds med hinanden for i høj grad at reducere permeabiliteten af deres membran 10,11,12,13,14, mens de udtrykker transportører for at lette bevægelsen af næringsstoffer ind og ud af CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulære EC'er er omgivet af pericytter (PC'er)-vægmalerier, der regulerer mikrovaskulær funktion og homeostase og er kritiske for regulering af BBB's permeabilitet for molekyler og immunceller 15,16,17. Astrocytten, en vigtig gliacelletype, er den endelige celletype, der omfatter BBB. Astrocyte endefødder vikles rundt om EC-PC-vaskulærrørene, mens cellelegemerne strækker sig ind i hjernens parenchyma og danner en forbindelse mellem neuroner og vaskulatur1. Forskellige opløste stoffer og substrattransportører er lokaliseret på astrocytendefødder (f.eks. aquaporin 4 [AQP-4]), der har en kritisk rolle i BBB-funktion 18,19,20,21.

BBB er afgørende for at opretholde korrekt hjernesundhedsfunktion, og dysfunktion af BBB er blevet rapporteret i mange neurologiske sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD) 22,23,24,25, multipel sklerose 7,26,27,28, epilepsi 29,30 og slagtilfælde31,32. Det anerkendes i stigende grad, at cerebrovaskulære abnormiteter spiller en central rolle i neurodegeneration, hvilket bidrager til øget modtagelighed for iskæmiske og hæmoragiske hændelser. For eksempel har mere end 90% af AD-patienter cerebral amyloid angiopati (CAA), en tilstand karakteriseret ved aflejring af amyloid β (Aβ) langs cerebral vaskulatur. CAA øger BBB-permeabiliteten og nedsætter BBB-funktionen, hvilket efterlader CNS sårbar over for iskæmi, hæmoragiske hændelser og accelereret kognitiv tilbagegang33.

Vi har for nylig udviklet en in vitro-model af den humane BBB, afledt af patientinducerede pluripotente stamceller, som inkorporerer EC'er, PC'er og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix (figur 1A). iBBB rekapitulerer fysiologisk relevante interaktioner, herunder vaskulær rørdannelse og lokalisering af astrocytendefødder med vaskulatur24. Vi anvendte iBBB til at modellere følsomheden af CAA medieret af APOE4 (figur 1B). Dette gjorde det muligt for os at identificere de kausale cellulære og molekylære mekanismer, hvormed APOE4 fremmer CAA, og udnytte disse indsigter til at udvikle terapeutiske strategier, der reducerer CAA-patologi og forbedrer læring og hukommelse in vivo hos APOE4-mus24. Her giver vi en detaljeret protokol og videovejledning til rekonstruktion af BBB fra humane iPSC'er og modellering af CAA in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differentiering af iPSC'er i iBBB-celler

BEMÆRK: Disse differentieringsprotokoller er tidligere beskrevet i Mesentier-Louro et al.34.

  1. Belægning af cellekulturplader
    1. Optøning af membranmatrix med reduceret vækstfaktor (GF) natten over ved 4 °C. Fortynd 500 μL kældermembranmatrix i 49,5 ml DMEM. Hold denne opløsning kold for at forhindre for tidlig polymerisation af belægningsopløsningen.
    2. Tilsæt 1-2 ml pr. hul af en 6-brønds vævskulturbehandlet plade. Lad overfladebehandlingsopløsningen sidde i mindst 20 minutter ved 37 °C, før den udskiftes med det passende opvarmede dyrkningsmedium.
  2. Differentiering af humane iPSC'er i ETV2-inducerbare endotelceller
    Tidspunkt: 8 dage
    BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra Blanchard et al.24 og Qian et al.35. Vi bruger den doxycyclin-inducerbare ekspression af transkriptionsfaktoren ETV2, som beskrevet af Wang et al.36 for at forbedre udbyttet. ETV2 blev introduceret via PiggyBac plasmid, og cellerne blev derefter transfekteret.
    1. Kultur iPSC'er på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i føderfrit pluripotent stamcellemedium, indtil cellerne når ~ 70% sammenløb.
      BEMÆRK: Vi anbefaler, at de inducerbare iPSC'er opretholdes med selektion for PiggyBac plasmidet (dvs. puromycin)
    2. Dag 0: Dissocier cellerne med en protease-kollagenaseblanding i 5 min. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et forhold på 1: 3 mellem protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepillen med stamcellemedium og plade cellerne ved 20.800 celler/cm2 på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i stamcellemedium suppleret med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Udskift mediet med DeSR1 [DMEM/F12 + glutamintilskud, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% penicillin-streptomycin (P/S)], suppleret med 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 og 5 μg/ml doxycyclin.
    4. Dag 3: Udskift mediet med DeSR2 [DMEM/F12 + glutamintilskud, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] suppleret med 5 μg/ml doxycyclin.
    5. Dag 5: Udskift substratet med hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] suppleret med 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM forskolin og 5 μg/ml doxycyclin.
    6. Dag 7: Substratet erstattes med hECSR suppleret med 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM forskolin og 5 μg/ml doxycyclin.
    7. Dag 8: Opdel EC'er 1:3 med en protease-kollagenaseblanding og genfrø på friskreducerede GF-bundmembranmatrixbelagte plader i hECSR suppleret med 50 ng/ml VEGF-A og 5 μg/ml doxycyclin.
      BEMÆRK: Dette er det bedste tidspunkt at indkapsle EC'er i iBBB'er for ensartet vaskulaturdannelse.
    8. Dag 10+: Foder cellerne hver 2.-3. dag med hECSR suppleret med 50 ng/ml VEGF-A og 5 μg/ml doxycyclin. Fortsæt med at opdele cellerne 1: 3 med en protease-kollagenaseblanding, når pladerne er sammenflydende.
      BEMÆRK: iPSC-afledte EC'er kan fryses når som helst fra dag 8. Løft cellerne, som om at passere. Pellet resuspenderes i EF-frysemedium [60% knockout serum replacement (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ng/mL VEGF-A og 10 μM Y27632], cellerne opdeles 1:3, og fryses ved hjælp af en frysebeholder ved -80 °C. Optø på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i hECSR suppleret med 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml doxycyclin.
    9. Hjernens mikrovaskulære endotelcelledifferentiering bekræftes ved immuncytokemi ved anvendelse af antistoffer mod CD31/PECAM1 eller VE-cadherin (figur 2A).
  3. Differentiering af humane iPSC'er i pericytter
    Tidspunkt: 6 dage
    BEMÆRK: Denne protokol blev tilpasset fra Patsch et al.36.
    1. Kultur iPSC'er på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader under føderfrie forhold i stamcellemedium, indtil cellerne når ~ 70% sammenløb.
    2. Dag 0: Dissocier cellerne med en protease-kollagenaseblanding i 5 min. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et forhold på 1: 3 mellem protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepillen med stamcellemedium og plade cellerne ved 37.000-40.000 celler / cm2 (afhængigt af cellelinjen) på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i stamcellemedium suppleret med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Udskift mediet med N2B27 [50% DMEM/F12 + glutamintilskud, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutamintilskud, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S] suppleret med 25 ng/ml BMP4 og 8 uM CHIR99021.
    4. Dag 3-4: Udskift mediet med N2B27 suppleret med 2 ng/ml Activin A og 10 ng/mL PDGF-BB, og fød dagligt.
    5. Dag 5: Opdelte pc'er med en protease-kollagenaseblanding og frø på 0,1% gelatinebelagte plader ved 35.000 celler / cm2 i N2B27 suppleret med 10 ng / mL PDGF-BB.
      BEMÆRK: Opdel kun celler, når de er sammenflydende. Nogle linjer kan kræve et par dage mere, før de er klar til at splitte; Fortsæt med at skifte medie dagligt, indtil cellerne er sammenflydende.
    6. Udvid pc'er i N2B27 suppleret med 10 ng/mL PDGF-BB, skift medie hver 2.-3. dag. Fjern PDGF-BB fra medierne, når cellerne igen når sammenløbet og gennemgår en anden passage.
      BEMÆRK: Perictter er klar til brug i iBBB'er efter den anden passage. Når pc'erne er udvidet, kan de fryses. Løft cellerne som for at passere, resuspender cellepelleten i frysemedier [90% KSR og 10% DMSO] og frys ved hjælp af en frysebeholder ved -80 °C. Optø på 0,1% gelatinebelagte plader ved 35.000 celler /cm2 i N2B27.
    7. Pericytdifferentiering bekræftes ved immuncytokemi ved anvendelse af antistoffer mod PDGFRB og NG2 (figur 2B).
  4. Differentiering af humane iPSC'er i neurale stamceller (NPC'er) og astrocytter
    Timing: 45 dage i alt (15 dage for NPC'er efterfulgt af 30 dage for astrocytter)
    BEMÆRK: NPC-differentieringsprotokollen blev tilpasset fra Chambers et al.38, og astrocytdifferentieringen er som beskrevet i TCW et al.39.
    1. Kultur iPSC'er på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader under føderfrie forhold i stamcellemedium, indtil cellerne når ~ 70% sammenløb.
    2. Dissocier cellerne med en protease-kollagenaseblanding i 5 min. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et forhold på 1: 3 mellem protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepillen med stamcellemedium og plade cellerne ved 100.000 celler / cm2 på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i stamcellemedium suppleret med 10 μM Y27632.
    3. Udskift stamcellemediet den følgende dag. Fortsæt med at fodre cellerne hver anden dag, indtil de når >95% sammenløb (3-4 dage afhængigt af cellelinjen).
    4. NPC Dag 0: Udskift mediet med N2B27 [50% DMEM/F12 + glutamintilskud, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutamintilskud, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P/S] suppleret med 10 μM SB43152 og 100 nM LDN193189.
    5. NPC-dag 1-9: Foder cellerne dagligt med N2B27 suppleret med 10 μM SB43152 og 100 nM LDN193189.
    6. NPC Dag 10: Opdel NPC'er 1:3 med protease-kollagenaseblandingen og frø på friskreducerede GF-kældermembranmatrixbelagte plader i N2B27 suppleret med 20 ng/ml FGF-basisk og 10 μM Y27632.
    7. NPC Dage 11 - 13: Foder NPC'er dagligt med N2B27 suppleret med 20 ng/ml FGF-basic.
    8. NPC-dag 14: Opdel NPC'erne 1:3 med protease-kollagenaseblandingen og genfrø på friskreducerede GF-bundmembranmatrixbelagte plader i N2B27 suppleret med 20 ng/ml FGF-basisk og 10 μM Y27632.
    9. NPC dag 15/astrocyt dag 0: Dette er dag 0 i astrocytdifferentieringen. Foder cellerne med komplet astrocytmedium (AM).
      BEMÆRK: NPC'er kan opretholdes i N2B27 suppleret med 20 ng/ml FGF-basisk og passeres, når de flyder sammen. For at fryse NPC'er skal du resuspendere cellepelleten i frysemedier [90% KSR og 10% DMSO], opdele cellerne 1:3 og fryse ved hjælp af en frysebeholder ved -80 °C. Optø på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i N2B27 suppleret med 20 ng/ml bFGF og 10 μM Y27632.
    10. Astrocyte dag 1-30: Foder cellerne hver 2-3 dage med AM. Når celler er >90% sammenflydende, passage ved hjælp af protease-kollagenaseblandingen og plade ved 15.000 celler / cm2 på frisk reduceret GF kældermembranmatrixbelagte plader i AM.
      BEMÆRK: Astrocytter skal være fuldt differentieret på 30 dage. Astrocytter kan fryses i frysemedier [90% KSR og 10% DMSO] i en frysebeholder ved -80 °C. Optø på reducerede GF kældermembranmatrixbelagte plader i AM ved 25.000-35.000 celler / cm2.
    11. Bekræft NPC-differentiering ved immuncytokemi ved hjælp af antistoffer mod Nestin og SOX2. Bekræft astrocytdifferentiering ved immuncytokemi ved hjælp af antistoffer mod S100B og CD44 (figur 2C).

2. Montering af iBBB

  1. Optø reduceret vækstfaktor (GF) kældermembranmatrix natten over ved 4 °C. Fortynd ikke denne matrix i DMEM, da iBBB'erne er indkapslet i 100% reduceret GF kældermembranmatrix. Hver iBBB kræver 50 μL af matrixen.
  2. De differentierede EC'er dissocieres med en protease-kollagenaseblanding ved 37 °C i 5 minutter. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et forhold på 1: 3 mellem protease-kollagenaseblandingen og hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P / S). Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepellet i hECSR.
    BEMÆRK: Brug et konisk rør, enten 15 ml eller 50 ml, der er stort nok til at rumme volumenet af dissocierede celler plus medier. Celler kan også opdeles mellem flere rør og derefter rekombineres ved resuspension.
  3. De differentierede pc'er dissocieres med protease-kollagenaseblandingen ved 37 °C i 5 minutter. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et forhold på 1: 3 af protease-kollagenaseblandingen til N2B27 (50% DMEM / F12 + glutamintilskud, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x glutamintilskud, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicillin-streptomycin [P / S]). Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepillen i N2B27.
  4. Dissocier de differentierede astrocytter med protease-kollagenaseblandingen ved 37 °C i 5 min. Overfør de dissocierede celler til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellem protease-kollagenaseblandingen for at fuldføre astrocytmedium (AM). Spin ned celler ved 300 × g i 3 min. Resuspender cellepillen i AM.
  5. Brug et hæmocytometer til at tælle hver celletype. Hver type cellesuspension fortyndes til en slutkoncentration på 1 × 106 celler/ml i det passende medium.
  6. Kombiner det beregnede antal celler for hver celletype i et konisk rør: 50 μL iBBB kræver 2,5 × 105 EC'er, 5 × 104 pc'er og 5 × 104 astrocytter. Medtag 10 % mere end det beregnede antal celler for at tage højde for pipetteringsfejl. Drej celleblandingen ned ved 300 × g i 3 min.
    BEMÆRK: Det anbefales stærkt at plade nogle resterende celler af hver celletype i 2D-monokulturer for at fiksere og plette til kvalitetskontrol af inputcellerne. Plade hver celletype ved 35.000 celler / cm2 på tidligere forberedte plader belagt med reduceret GF kældermembranmatrix og fiks efter 3-4 dage. Se tabel 1 for celletypespecifikke antistoffer.
  7. Der suges substrat fra cellepellet, så ca. 50 μL supernatant forbliver over cellepellet. Brug en P200 til forsigtigt at resuspendere cellepelleten i restmedium for at skabe en enkeltcelleopslæmning.
  8. Bland celleopslæmningen i tilstrækkelig reduceret GF kældermembranmatrix suppleret med 10 ng / ml VEGF-A til det ønskede antal iBBB'er ved 50 μL reduceret GF kældermembranmatrix pr. iBBB, og sørg for at blande cellerne homogent, mens der ikke indføres luftbobler.
    BEMÆRK: Det er afgørende at holde cellerne og reduceret GF kældermembranmatrix på is på dette stadium for at forhindre for tidlig polymerisation.
  9. Pipette 50 μL reduceret GF kældermembranmatrixblanding i brønden i en 48-brønds glasbundet kulturskål. Fordel lydstyrken jævnt i bunden af skålen (figur 1C).
  10. Inkuber iBBB'erne ved 37 °C i 30-40 minutter for at lade den reducerede GF-kældermembranmatrix polymerisere og indkapsle cellerne i matrixen.
  11. Der tilsættes 500 μL AM suppleret med 10 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml doxycyclin og 10 μM Y27632.
  12. Mediet skiftes den følgende dag til AM suppleret med 10 ng/ml VEGF-A. Fortsæt med at ændre mediet hver 2-3 dage. Efter 2 uger skal du stoppe med at supplere med VEGF-A; iBBB'er er klar til downstream-assays efter 2 uger.

3. Inducering af cerebral amyloid angiopati (CAA) med Aβ-fibriller

  1. Der fremstilles stamopløsninger af amyloid-β1-40 og amyloid-β1-42 ved 200 μM i PBS.
  2. Tilsæt Aβ til iBBB-medium på 2-ugers iBBB'er til en endelig koncentration på 20 nM. Inkuber cellerne i Aβ-suppleret medium i 96 timer (4 dage).
  3. Efter 96 timer fjernes mediet, og fastgørelsen fortsættes (punkt 4).

4. Fastgørelse og farvning af iBBB

  1. For at fiksere iBBB fjernes mediet, vaskes i 1 ml PBS og inkuberes i 500 μL 4% paraformaldehyd natten over ved 4 °C.
  2. Fjern 4% paraformaldehydopløsningen, og skyl i 4 x (mindst) 15 minutter i 1 ml PBS.
  3. Permeabiliser prøverne i 0,3% PBST (PBS med 0,3% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
  4. Inkuber kulturerne i blokerende buffer (5% normalt serum i 0,3% PBST) ved stuetemperatur i mindst 1 time ved forsigtig omrystning.
    BEMÆRK: Den anvendte serumtype afhænger af værtsarten for de anvendte sekundære antistoffer. For eksempel, hvis værtsarten for de sekundære antistoffer er ged, skal du bruge normalt gedeskerum; Hvis værtsarten er æsel, skal du bruge normalt æselserum. Dette kan også gøres natten over ved 4 °C med forsigtig omrystning.
  5. Fortynd primære antistoffer mod den anbefalede eller bestemte koncentration i blokerende buffer.
  6. Udskift blokeringsopløsningen med den primære antistoffortynding. Sørg for, at iBBB'erne er helt nedsænket i antistofopløsning til jævn inkubation; 100-150 μL er nok til at dække en 50 μL iBBB i en 48-brønds glasbundet kulturskål. Der inkuberes natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning.
  7. Fjern det primære antistof. Vask iBBB'er i 3 x 10-20 minutter i 0,3% PBS.
  8. Det sekundære antistof fortyndes mod den anbefalede eller bestemte koncentration i blokerende buffer. Der tilsættes desuden en nuklear plet, såsom Hoechst, til den sekundære antistofopløsning ved den anbefalede eller bestemte koncentration.
  9. Udskift den sidste PBS-vask med den sekundære antistoffortynding. Sørg for, at iBBB'erne er helt nedsænket i antistofopløsning til jævn inkubation; 100-150 μL er nok til at dække en 50 μL iBBB i en 48-brønds glasbundet kulturskål. Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer med forsigtig omrystning.
    BEMÆRK: Dette kan også gøres natten over ved 4 °C med forsigtig omrystning.
  10. Vask iBBB 4-5x i mindst 1 time pr. vask i PBS. Opbevares i PBS eller antifalmende monteringsmedier ved 4 °C, indtil prøverne er afbildet.
  11. For at afbilde på et omvendt mikroskop skal du opbevare iBBB'er i glasbundsplader eller fade. Placer et glasdæksel over glasbrønden for at holde iBBB'erne på plads (figur 1D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En korrekt formet iBBB størkner til en enkelt gennemskinnelig skive (figur 3A). Det er normalt, at iBBB løsner sig fra overfladen, hvorpå den først blev pipetteret efter et par dage. Dette kan ikke undgås, men er ikke et stort problem for den korrekte dannelse af iBBB, hvis man er forsigtig, når man skifter medie for ikke ved et uheld at aspirere iBBB. Efter 24 timer, jævnt fordelt, kan enkeltceller identificeres under et brightfield-mikroskop (figur 3B). Efter 2 uger kan mere tydelige strukturer være synlige, selvom det er vanskeligt at skelne med definition (figur 3C).

Kvaliteten af iBBB er stærkt afhængig af kvaliteten af differentieringen af inputcellerne. Vi anbefaler stærkt at platte nogle resterende celler i 2D-monokulturer for at fikse og plette til celletypespecifikke markører. iBBB'er dannet af endotelceller, der er over 70% positive for PECAM1 eller VE-cadherin (figur 2A), pericytter over 95% positive for PDGFRB (figur 2B) og astrocytter over 95% positive for S100B og CD44 (figur 2C) er bedst til vellykkede iBBB'er. Resultaterne fra denne kvalitetskontrol er den tidligste indikator for iBBB'er af høj kvalitet.

Fysiologisk relevante 3D-strukturer skal dannes efter 2 ugers selvmontering. Ved fastgørelse og farvning ser vi tegn på rørlignende strukturer, der pletter positivt for endotelmarkøren PECAM1, som er kritisk for tæt forbindelsesdannelse (figur 4A). Den største variation i iBBB-dannelse er omfanget af mikrovaskulaturdannelse. I et "worst-case" scenario forekommer endotelcellenetværket mere fragmenteret eller strækker sig ikke gennem iBBB, mens vaskulaturen i "bedste tilfælde" er ensartet og forgrener sig i hele iBBB. Endotelcelledifferentiering, der er over 70% PECAM1-positiv, danner mere konsistente netværk. Derudover er aquaporin-4, et protein udtrykt af astrocytter, der lokaliserer til astrocytens endefødder, på linje med PECAM1-farvning, hvilket indikerer, at astrocytter strækker deres endefødder for at kontakte endotelcellerne (figur 4B). Endelig forventer vi at se pericytter omkring vaskulaturen (figur 4C).

Den primære aflæsning for cerebral amyloid angiopati (CAA) i iBBB'er er tilstedeværelsen af amyloid-β (Aβ). Aβ kan måles ved hjælp af målrettede antistoffer eller ved såning fluorescerende mærket Aβ for at inducere CAA-fænotyper (figur 5). Behandling af iBBB'er med Aβ bør øge Aβ-farvningsintensiteten og arealet, da cellerne i BBB ikke udtrykker meget endogent Aβ-protein. Alternativt kan faste prøver farves med thioflavin T for at detektere amyloidakkumulering. Aβ-niveauer afhænger af genotypen af de stamceller, der bruges til at generere iBBB, med nogle Alzheimers sygdom og CAA-associerede risikofaktorer, der øger mængden af Aβ-akkumulering og farvning (figur 5B, C)24.

Figure 1
Figur 1: En in vitro blod-hjerne barriere til model cerebral amyloid angiopati. (A) Skematisk gengivelse af iBBB-samling og modning. Efter differentieringen af endotelceller, astrocytter og pericytter fra inducerede pluripotente stamceller indkapsles celler i en gelmatrix i en enkeltcellesuspension. I løbet af 2 uger samles cellerne selv i vaskulære enheder, svarende til de strukturer, der er identificeret in vivo. (B) Skematisk oversigt over analysen af cerebral amyloid angiopati. Amyloid-β tilsættes til modne iBBB'er i 96 timer for at inducere Aβ-aggregering. (C) Diagram, der viser sidebilledet af en iBBB efter såning i en brønd med glasbund. (D) En grafik af en iBBB forberedt til billeddannelse på et omvendt mikroskop. Forkortelser: BBB = blod-hjerne-barriere; iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller iBBB = en in vitro-model af den humane BBB afledt af en patient-iPSC-afledt BBB-model, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix Aβ = Amyloid-β. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Validering af iPSC-afledte iBBB-celler. (A) Repræsentativ maksimal intensitetsprojektion af endotelceller i 2D-monokulturer farvet med VE-cadherin (grøn) og PECAM1 (rød). (B) Repræsentative billeder af pericytter i 2D-monokulturer farvet med PDGFRB (grøn) og NG2 (rød). (C) Repræsentative billeder af astrocytter i 2D-monokulturer farvet med CD44 (øverst; grøn) og S100B (nederst; grøn). Alle kerner er bejdset med Hoechst 33342. Billeder blev taget på en Nikon Eclipse Ti2-E ved 20x forstørrelse (A, B) eller en Leica Stellaris 8 ved 40x forstørrelse (C). Alle skalastænger er 100 μm. Forkortelser: BBB = blod-hjerne-barriere; iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller iBBB = en in vitro-model af den humane BBB afledt af en patient-iPSC-afledt BBB-model, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix VE-cadherin = vaskulær endotelcadherin; PECAM1 = trombocyt- og endotelcelleadhæsionsmolekyle 1; PDGFRB = trombocytafledt vækstfaktorreceptor beta; NG2 = neuron glia antigen 2; S100B = S100 calciumbindende protein beta. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Samling af iBBB. (A) Brightfield-billede af en 15 μL iBBB 24 timer efter plettering ved 2x forstørrelse. (B) Brightfield-billede af en iBBB 24 timer efter plettering ved 10x forstørrelse. (C) Brightfield-billede af en iBBB 2 uger efter plettering ved 10x forstørrelse. Skalabjælke = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Billeder taget på en omvendt Nikon Eclipse Ts2R-FL. Forkortelser: BBB = blod-hjerne-barriere; iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller iBBB = en in vitro-model af den humane BBB afledt af en patient iPSC-afledt BBB-model, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Celleinteraktioner i iBBB. Repræsentative billeder af endotelceller, pericytter og astrocytter i iBBB. (A) Endotelceller (PECAM1) og astrocytter (S100β). (B) Endotelceller (PECAM1) og astrocyte endefødder (AQP-4) co-lokalisering. C) endotelceller (PECAM1) og pericytter (NG2). Alle kerner er bejdset med Hoechst 33342. Konfokale Z-stack-billeder blev taget på en Leica Stellaris 8 ved 20x forstørrelse (A,B) eller en Nikon Eclipse Ti2-E ved 20x forstørrelse (C). Skalastænger = 200 μm (A), 100 μm (B, C). Forkortelser: BBB = blod-hjerne-barriere; iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller iBBB = en in vitro-model af den humane BBB afledt af en patient-iPSC-afledt BBB-model, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix PECAM1 = trombocyt- og endotelcelleadhæsionsmolekyle 1; AQP-4 = aquaporin-4; NG2 = neuron glia antigen 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Cerebral amyloid angiopati in vitro. (A) Ikke-AD iBBB'er eksponeret for konditionerede medier fra kontrol- eller Aβ-overekspressionsneuroner. 6e10 antistof genkender Aβ. (B) Repræsentative billeder af iBBB'er fra isogene APOE3- og APOE4-cellelinjer behandlet med 20 nM Aβ-FITC1-42 i 96 timer. (C) Kvantificering af amyloid i iBBB'er fra isogene APOE3- og APOE4-cellelinjer behandlet med 20 nM Aβ-FITC1-40 eller Aβ-FITC1-42. Skalastænger = 50 μm (A), 10 μm (B). Denne figur blev tilpasset fra Blanchard et al24. Forkortelser: BBB = blod-hjerne-barriere; iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller iBBB = en in vitro-model af den humane BBB afledt af en patient-iPSC-afledt BBB-model, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix Aβ = Amyloid-β. APOE = ApolipoproteinE. Klik her for at se en større version af denne figur.

Markører Firma Katalognummer Fortynding
Endotelceller PECAM1 (CD31) F&U-systemer AF806 1:500
VE-cadherin (CD144) F&U-systemer AF938 1:500
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Pericytter PDGFRβ F&U-systemer AF385 1:500
NG2 Abcam AB255811 1:500
Astrocytter S100β Sigma-Aldrich S2532-100UL 1:500
CD44 Celle signalteknologi 3570'ERNE 1:400
AQP-4 Invitrogen PA5-53234 1:300
GFAP
ALDH1L1
EAAT1
EAAT2
Amyloid-β 6E10 Biolegende SIG-39320 1:1,000
Thioflavin T Chem Impex 22870 25 μM

Tabel 1: Anbefalede cellemarkører til kvalitetskontrol af differentiering. Cellemarkører for de forskellige celletyper i BBB, der kan bruges til at kontrollere kvaliteten af differentieringerne og til at identificere cellerne i den dannede iBBB. De markører, der bruges i dette papir, er fed skrift.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BBB dysfunktion er en co-morbiditet, og potentielt en årsag eller forværrende faktor i talrige neurologiske sygdomme 7,40,41. Det er imidlertid næsten umuligt at studere molekylær- og cellebiologien, der ligger til grund for dysfunktion og nedbrydning af BBB hos mennesker med neurovaskulær sygdom. Den inducerbare-BBB (iBBB), der præsenteres i denne protokol, tilvejebringer et in vitro-system, der rekapitulerer vigtige celleinteraktioner af BBB, herunder vaskulær rørdannelse og lokalisering af astrocytendefødder med vaskulatur. iBBB kan bruges til at studere de molekylære veje, der er involveret på ethvert stadium af BBB-dysfunktion og kan modellere neurovaskulære sygdomsfænotyper, såsom amyloid-β-aggregering, som det ses i cerebral amyloid angiopati.

Samlingen af iBBB er ligetil, selvom kvaliteten af iBBB'erne er meget afhængig af kvaliteten af de iPSC-afledte celler, der anvendes. Mens iBBB giver en multicellulær niche, der kan fremme modningen af komponentcellerne, skal hver celletype være korrekt mønstret, før den indkapsles. Det er afgørende at udføre kvalitetskontrol af hver differentiering ved at udføre immunofluorescensfarvning for celletypespecifikke markører på de enkelte monokulturer (tabel 1). Hver iPSC-linje opfører sig forskelligt, og nogle betingelser, såsom såtæthed eller antallet af dage i hvert mønstermedium, skal muligvis bestemmes empirisk og justeres for at optimere differentieringseffektiviteten.

Den beskrevne protokol foreslår en størrelse på 50 μL, men iBBB kan skaleres ned til så lille som 5 μL afhængigt af celletilgængelighed, antallet af ønskede iBBB'er og downstream-applikationen. Større iBBB'er indeholder flere celler, hvilket gør dem ideelle til protein-, lipid- eller nukleinsyreopsamling. Mindre iBBB'er kan lette lægemiddelscreeninger eller andre skalerbare assays.

iBBB er et meget alsidigt værktøj til at studere BBB in vitro. Fordi hver celletype er differentieret uafhængigt, kan iBBB'er samles fra forskellige genetiske baggrunde, så vi kan studere, hvordan genetiske risikofaktorer påvirker specifikke celletyper for at bidrage til BBB-dysfunktion. Denne strategi blev anvendt til at vise, at APOE4, den mest almindelige risikofaktor for Alzheimers sygdom og cerebral amyloid angiopati, virker delvist gennem en patogen mekanisme specifikt i pericytter24. Yderligere brug af dette værktøj ville give os mulighed for at dissekere de individuelle bidrag fra EC'er, pc'er og astrocytter til opretholdelse af BBB-integritet, og hvordan hver celletype vakler under sygdomsudvikling.

I øjeblikket er den mest almindelige metode til modellering af BBB in vitro ved hjælp af et transwell-system, podet med EC'er og undertiden co-dyrket med pericytter og / eller astrocytter for at danne et uigennemtrængeligt monolag 42,43,44. 3D-strukturen af iBBB muliggør selvmontering af den vaskulære enhed og tillader dannelse af rørformede strukturer, der mere ligner fysiologisk vaskulatur. En ulempe ved såning af iBBB'er i en brøndplade, som beskrevet i denne protokol, er, at de ikke oplever de rene belastninger forårsaget af konstant strømningsvaskulatur i et in vivo-system. For at overvinde dette kan iBBB podes i en mikrofluidisk chip, der kan generere et dynamisk flow 45,46,47. Dette system kan også bruges til at teste vaskulaturpermeabilitet og perfusion af små molekyler.

Afslutningsvis giver denne metode en fleksibel, 3D, iPSC-afledt model af BBB, der kan bruges som en platform til at studere utallige aspekter af BBB på celleniveau, herunder evnen til at rekapitulere neurovaskulære sygdomsfænotyper og potentialet til at screene lægemiddel BBB-permeabilitet til en bred vifte af applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimers Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF / ASAP Foundation og Brain Injury Association of America. C.G. er støttet af NIH F31NS130909. Figur 1A blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blod-hjerne-barriere CNS Neurologisk sygdom Terapeutisk lægemiddellevering BBB-funktion Cerebral amyloid angiopati Alzheimers sygdom Neurodegeneration Humane pluripotente stamceller Endotelceller Pericytter Astrocytter 3D-matrix IBBB Amyloidaflejring Cerebrovaskulær sygdom Genetiske faktorer Miljøfaktorer Lægemiddelscreening Medicinsk målretning
Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren <em>in vitro</em> til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter