Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Abstract

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine wichtige physiologische Komponente des zentralen Nervensystems (ZNS), die Nährstoffe aufrechterhält, Abfallstoffe beseitigt und das Gehirn vor Krankheitserregern schützt. Die inhärenten Barriereeigenschaften der BHS stellen eine Herausforderung für die therapeutische Wirkstoffabgabe in das ZNS zur Behandlung neurologischer Erkrankungen dar. Eine beeinträchtigte BHS-Funktion wurde mit neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA), die Ablagerung von Amyloid im zerebralen Gefäßsystem, die zu einer beeinträchtigten BHS führt, ist in den meisten Fällen der Alzheimer-Krankheit (AD) eine Komorbidität, was darauf hindeutet, dass eine BHS-Dysfunktion oder ein BHS-Abbau an der Neurodegeneration beteiligt sein kann. Aufgrund des begrenzten Zugangs zu menschlichem BHS-Gewebe sind die Mechanismen, die zur ordnungsgemäßen Funktion der BHS und zur Degeneration der BHS beitragen, noch unbekannt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine humane pluripotente Stammzell-abgeleitete BHS (iBBB) entwickelt, indem wir Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten in eine 3D-Matrix integrieren. Die iBBB baut sich selbst zusammen, um die Anatomie und die zellulären Interaktionen in der BHS zu rekapitulieren. Die Aussaat von iBBBs mit Amyloid erfasst wichtige Aspekte von CAA. Darüber hinaus bietet das iBBB eine flexible Plattform zur Modulation genetischer und umweltbedingter Faktoren, die an zerebrovaskulären Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sind, um zu untersuchen, wie Genetik und Lebensstil das Krankheitsrisiko beeinflussen. Schließlich kann der iBBB für Arzneimittel-Screenings und medizinisch-chemische Studien verwendet werden, um die therapeutische Abgabe an das ZNS zu optimieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Differenzierung der drei Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten), die aus humanen pluripotenten Stammzellen entstehen, wie die differenzierten Zellen in die iBBB eingebaut werden und wie CAA in vitro mit exogenem Amyloid modelliert werden kann. Dieses Modell überwindet die Herausforderung, lebendes menschliches Hirngewebe mit einem System zu untersuchen, das sowohl biologische Genauigkeit als auch experimentelle Flexibilität aufweist und die Untersuchung der menschlichen BHS und ihrer Rolle bei der Neurodegeneration ermöglicht.

Introduction

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein wichtiges mikrovaskuläres Netzwerk, das das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Peripherie trennt, um eine ideale Umgebung für die ordnungsgemäße neuronale Funktion aufrechtzuerhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Ein- und Ausflusses von Substanzen in das ZNS, indem es die metabolische Homöostase aufrechterhält 1,2,3,4, Abfallstoffe beseitigt 4,5,6 und das Gehirn vor Krankheitserregern und Toxinen schützt 7,8.

Der primäre Zelltyp der BHS ist die Endothelzelle (EC). Endothelzellen, die aus der Mesodermlinie stammen, bilden die Wände des Gefäßsystems 1,9. Mikrovaskuläre ECs bilden Tight Junctions miteinander, um die Permeabilität ihrer Membran stark zu verringern 10,11,12,13,14 während sie Transporter exprimieren, um den Transport von Nährstoffen in und aus dem ZNS zu erleichtern 1,4,12,14 . Mikrovaskuläre ECs sind von Perizyten (PCs) umgeben, die die mikrovaskuläre Funktion und Homöostase regulieren und für die Regulierung der Permeabilität der BHS für Moleküle und Immunzellen entscheidend sind 15,16,17. Der Astrozyt, ein wichtiger Gliazelltyp, ist der letzte Zelltyp, aus dem die BHS besteht. Die Endfüße der Astrozyten wickeln sich um die EC-PC-Gefäßröhren, während sich die Zellkörper in das Hirnparenchym erstrecken und eine Verbindung zwischen Neuronen und Gefäßen bilden1. Unterschiedliche Stoff- und Substrattransporter sind auf den Endfüßen der Astrozyten lokalisiert (z. B. Aquaporin 4 [AQP-4]), die eine entscheidende Rolle bei der BHS-Funktion spielen 18,19,20,21.

Die BHS ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Gehirngesundheit, und Funktionsstörungen der BHS wurden bei vielen neurologischen Erkrankungen berichtet, darunter Alzheimer-Krankheit (AD)22,23,24,25, Multiple Sklerose 7,26,27,28, Epilepsie29,30 und Schlaganfall31,32. Es wird zunehmend anerkannt, dass zerebrovaskuläre Anomalien eine zentrale Rolle bei der Neurodegeneration spielen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für ischämische und hämorrhagische Ereignisse beitragen. Zum Beispiel leiden mehr als 90 % der Alzheimer-Patienten an zerebraler Amyloid-Angiopathie (CAA), einer Erkrankung, die durch die Ablagerung von Amyloid-β (Aβ) entlang des zerebralen Gefäßsystems gekennzeichnet ist. CAA erhöht die BHS-Permeabilität und verringert die BHS-Funktion, wodurch das ZNS anfällig für Ischämie, hämorrhagische Ereignisse und beschleunigten kognitiven Verfall wird33.

Wir haben kürzlich ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS entwickelt, das aus patienteninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wird und ECs, PCs und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind (Abbildung 1A). Die iBBB rekapituliert physiologisch relevante Interaktionen, einschließlich der Gefäßtubenbildung und der Lokalisation von Astrozyten-Endfüßen mit dem Gefäßsystem24. Wir haben die iBBB angewendet, um die Suszeptibilität von CAA zu modellieren, die durch APOE4 vermittelt wird (Abbildung 1B). Dies ermöglichte es uns, die kausalen zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, durch die APOE4 CAA fördert, und diese Erkenntnisse zu nutzen, um therapeutische Strategien zu entwickeln, die die CAA-Pathologie reduzieren und das Lernen und Gedächtnis in vivo in APOE4-Mäusen verbessern24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll und ein Video-Tutorial zur Verfügung, um die BHS aus humanen iPS-Zellen zu rekonstruieren und CAA in vitro zu modellieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differenzierung von iPS-Zellen zu iBBB-Zellen

ANMERKUNG: Diese Differenzierungsprotokolle wurden bereits in Mesentier-Louro et al.34 beschrieben.

  1. Beschichtung von Zellkulturplatten
    1. Membranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor (GF) über Nacht bei 4 °C auftauen. Verdünnen Sie 500 μl Basalmembranmatrix in 49,5 ml DMEM. Halten Sie diese Lösung kalt, um eine vorzeitige Polymerisation der Beschichtungslösung zu verhindern.
    2. Fügen Sie 1-2 ml pro Well einer mit Gewebekulturen behandelten 6-Well-Platte hinzu. Lassen Sie die Beschichtungslösung mindestens 20 Minuten bei 37 °C einwirken, bevor Sie sie durch das geeignete erwärmte Nährmedium ersetzen.
  2. Differenzierung humaner iPS-Zellen in ETV2-induzierbare Endothelzellen
    Dauer: 8 Tage
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Blanchard et al.24 und Qian et al.35 übernommen. Wir verwenden die Doxycyclin-induzierbare Expression des Transkriptionsfaktors ETV2, wie sie von Wang et al.36 beschrieben wurde, um die Ausbeute zu verbessern. ETV2 wurde über das PiggyBac-Plasmid eingeführt und die Zellen wurden anschließend transfiziert.
    1. Kultivierung von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in feederfreiem pluripotentem Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die induzierbaren iPS-Zellen mit Selektion für das PiggyBac-Plasmid (d. h. Puromycin) beizubehalten
    2. Tag 0: Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 20.800 Zellen/cm2 auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tag 1: Ersetzen Sie das Medium durch DeSR1 [DMEM/F12 + Glutaminpräparat, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% Penicillin-Streptomycin (P/S)], ergänzt mit 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 und 5 μg/ml Doxycyclin.
    4. Tag 3: Ersetzen Sie das Medium durch DeSR2 [DMEM/F12 + Glutaminpräparat, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] ergänzt mit 5 μg/ml Doxycyclin.
    5. Tag 5: Ersetzen Sie das Medium durch hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S], ergänzt mit 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM Forskolin und 5 μg/ml Doxycyclin.
    6. Tag 7: Ersetzen Sie das Medium durch hECSR, das mit 50 ng/ml VEGF-A, 2 μM Forskolin und 5 μg/ml Doxycyclin ergänzt wird.
    7. Tag 8: ECs 1:3 mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und in hECSR, ergänzt mit 50 ng/ml VEGF-A und 5 μg/ml Doxycyclin auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten erneut aussäen.
      HINWEIS: Dies ist der beste Zeitpunkt, um ECs in iBBBs zu kapseln, um eine gleichmäßige Gefäßbildung zu gewährleisten.
    8. Tag 10+: Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit hECSR, ergänzt mit 50 ng/ml VEGF-A und 5 μg/ml Doxycyclin. Fahren Sie fort, die Zellen 1:3 mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch zu teilen, wenn die Platten zusammenfließen.
      HINWEIS: iPSC-abgeleitete ECs können ab Tag 8 jederzeit eingefroren werden. Heben Sie die Zellen an, als ob sie passieren würden. Resuspendieren Sie das Pellet in EC-Gefriermedium [60 % Knockout-Serumersatz (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml VEGF-A und 10 μM Y27632], teilen Sie die Zellen 1:3 und frieren Sie es in einem Gefrierbehälter bei -80 °C ein. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in hECSR, ergänzt mit 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml Doxycyclin.
    9. Bestätigung der mikrovaskulären Endothelzelldifferenzierung des Gehirns durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen CD31/PECAM1 oder VE-Cadherin (Abbildung 2A).
  3. Differenzierung humaner iPS-Zellen in Perizyten
    Dauer: 6 Tage
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Patsch et al.36 übernommen.
    1. Kultur von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten unter feederfreien Bedingungen in Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
    2. Tag 0: Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 37.000-40.000 Zellen/cm2 (je nach Zelllinie) auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tag 1: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27 [50% DMEM/F12 + Glutamin-Ergänzung, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, Glutamin-Ergänzung, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S], ergänzt mit 25 ng/ml BMP4 und 8 μM CHIR99021.
    4. Tag 3-4: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27, ergänzt mit 2 ng/ml Activin A und 10 ng/ml PDGF-BB, und füttern Sie es täglich.
    5. Tag 5: PCs mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf 0,1 % gelatinebeschichtete Platten bei 35.000 Zellen/cm2 in N2B27 auftragen, ergänzt mit 10 ng/ml PDGF-BB.
      HINWEIS: Teilen Sie Zellen nur, wenn sie zusammenfließen. Einige Linien benötigen möglicherweise noch ein paar Tage, bevor sie bereit sind, sich zu teilen. Wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen zusammenfließen.
    6. Erweitern Sie PCs in N2B27, ergänzt mit 10 ng/mL PDGF-BB, und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Entfernen Sie PDGF-BB aus dem Medium, nachdem die Zellen wieder Konfluenz erreicht haben und eine zweite Passage durchlaufen haben.
      HINWEIS: Perizyten sind nach der zweiten Passage bereit für die Verwendung in iBBBs. Einmal ausgeklappt, können PCs eingefroren werden. Heben Sie die Zellen wie zum Durchgang an, resuspendieren Sie das Zellpellet in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] und frieren Sie es in einem Gefrierbehälter bei -80 °C ein. Auftauen auf 0,1 % gelatinebeschichteten Platten bei 35.000 Zellen/cm2 in N2B27.
    7. Bestätigung der Perizytendifferenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen PDGFRB und NG2 (Abbildung 2B).
  4. Differenzierung humaner iPS-Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs) und Astrozyten
    Zeitplan: 45 Tage insgesamt (15 Tage für NPCs, gefolgt von 30 Tagen für Astrozyten)
    ANMERKUNG: Das NPC-Differenzierungsprotokoll wurde von Chambers et al.38 übernommen, und die Astrozytendifferenzierung ist wie in TCW et al.39 beschrieben.
    1. Kultur von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten unter feederfreien Bedingungen in Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
    2. Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 100.000 Zellen/cm2 auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tauschen Sie das Stammzellmedium am nächsten Tag aus. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag, bis sie eine Konfluenz von >95 % erreichen (3-4 Tage, je nach Zelllinie).
    4. NPC Tag 0: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27 [50% DMEM/F12 + Glutamin-Ergänzung, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, Glutamin-Ergänzung, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S], ergänzt mit 10 μM SB43152 und 100 nM LDN193189.
    5. NPC-Tage 1-9: Füttern Sie die Zellen täglich mit N2B27, ergänzt mit 10 μM SB43152 und 100 nM LDN193189.
    6. NPC Tag 10: NPCs 1:3 mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten in N2B27 aussäen, ergänzt mit 20 ng/ml FGF-basisch und 10 μM Y27632.
    7. NPC-Tage 11 - 13: Füttern Sie NPCs täglich mit N2B27, ergänzt mit 20 ng/ml FGF-basisch.
    8. NPC Tag 14: NPCs 1:3 mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten in N2B27 ergänzen, ergänzt mit 20 ng/mL FGF-basic und 10 μM Y27632.
    9. NPC Tag 15/Astrozyten Tag 0: Dies ist Tag 0 der Astrozytendifferenzierung. Füttern Sie die Zellen mit vollständigem Astrozytenmedium (AM).
      HINWEIS: NPCs können in N2B27 gehalten werden, ergänzt mit 20 ng/mL FGF-basisch und bei Konfluation durchgelassen werden. Um NPCs einzufrieren, wird das Zellpellet in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] resuspendiert, die Zellen 1:3 geteilt und in einem Gefrierbehälter bei -80 °C eingefroren. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in N2B27, ergänzt mit 20 ng/ml bFGF und 10 μM Y27632.
    10. Astrozyten Tage 1-30: Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit AM. Wenn die Zellen zu >90 % konfluent sind, erfolgt die Passage mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch und der Platte bei 15.000 Zellen/cm2 auf frischen, reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in AM.
      HINWEIS: Astrozyten sollten innerhalb von 30 Tagen vollständig differenziert sein. Astrozyten können in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] in einem Gefrierbehälter bei -80 °C eingefroren werden. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in AM bei 25.000-35.000 Zellen/cm2.
    11. Bestätigung der NPC-Differenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen Nestin und SOX2. Bestätigung der Astrozytendifferenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen S100B und CD44 (Abbildung 2C).

2. Zusammenbau der iBBB

  1. Tauen Sie die Basalmembranmatrix des reduzierten Wachstumsfaktors (GF) über Nacht bei 4 °C auf. Verdünnen Sie diese Matrix nicht in DMEM, da die iBBBs in 100% reduzierter GF-Basalmembranmatrix eingekapselt sind. Jede iBBB benötigt 50 μl der Matrix.
  2. Dissoziation der differenzierten ECs mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zu hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S) überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in hECSR.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein konisches Röhrchen, entweder 15 ml oder 50 ml, das groß genug ist, um das Volumen der dissoziierten Zellen und Medien aufzunehmen. Zellen können auch auf mehrere Röhrchen aufgeteilt und dann bei Resuspension rekombiniert werden.
  3. Dissoziation der differenzierten PCs mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zu N2B27 überführt (50% DMEM/F12 + Glutamin-Supplement, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x Glutamin-Supplement, 1x N-2, 1x B-27, 1% Penicillin-Streptomycin [P/S]). Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in N2B27.
  4. Dissoziation der differenzierten Astrozyten mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum vollständigen Astrozytenmedium (AM). Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in AM.
  5. Zählen Sie mit einem Hämozytometer jeden Zelltyp. Jede Art von Zellsuspension wird im geeigneten Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 106 Zellen/ml verdünnt.
  6. Kombinieren Sie die berechnete Anzahl von Zellen für jeden Zelltyp in einem konischen Röhrchen: 50 μl iBBB erfordern 2,5 × 105 ECs, 5 × 104 PCs und 5 × 104 Astrozyten. Fügen Sie 10 % mehr als die berechnete Anzahl von Zellen hinzu, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Schleudern Sie die Zellmischung bei 300 × g für 3 Minuten herunter.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einige übrig gebliebene Zellen jedes Zelltyps in 2D-Monokulturen zu beschichten, um sie für die Qualitätskontrolle der Eingangszellen zu fixieren und zu färben. Platten Sie jeden Zelltyp mit 35.000 Zellen/cm2 auf zuvor vorbereiteten Platten, die mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtet sind, und fixieren Sie sie nach 3-4 Tagen. Siehe Tabelle 1 für zelltypspezifische Antikörper.
  7. Saugen Sie das Medium aus dem Zellpellet ab, wobei ca. 50 μl des Überstandes über dem Zellpellet verbleiben. Mit einem P200 wird das Zellpellet vorsichtig in Restmedium resuspendiert, um eine einzellige Aufschlämmung zu erzeugen.
  8. Mischen Sie die Zellaufschlämmung in einer ausreichenden reduzierten GF-Basalmembranmatrix, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A für die gewünschte Anzahl von iBBBs bei 50 μl reduzierter GF-Basalmembranmatrix pro iBBB, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen homogen gemischt werden, ohne dass Luftblasen entstehen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen und die reduzierte GF-Basalmembranmatrix in diesem Stadium auf Eis zu lassen, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
  9. Pipettieren Sie 50 μl der reduzierten GF-Basalmembranmatrixmischung in die Vertiefung einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden. Verteilen Sie das Volumen gleichmäßig auf dem Boden der Schale (Abbildung 1C).
  10. Inkubieren Sie die iBBBs bei 37 °C für 30-40 Minuten, damit die reduzierte GF-Basalmembranmatrix polymerisieren und die Zellen in der Matrix einkapseln kann.
  11. Fügen Sie 500 μl AM hinzu, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A, 5 μg/ml Doxycyclin und 10 μM Y27632.
  12. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag auf AM, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A. Wechseln Sie das Medium weiterhin alle 2-3 Tage. Beenden Sie nach 2 Wochen die Supplementierung mit VEGF-A; iBBBs sind nach 2 Wochen bereit für Downstream-Assays.

3. Induktion einer zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA) mit Aβ-Fibrillen

  1. Stammlösungen von Amyloid-β1-40 und Amyloid-β1-42 bei 200 μM in PBS herstellen.
  2. Aβ zu iBBB-Medium auf 2-wöchigen iBBBs bis zu einer Endkonzentration von 20 nM zugeben. Die Zellen werden 96 h (4 Tage) in Aβ-supplementiertem Medium inkubiert.
  3. Entfernen Sie nach 96 Stunden das Medium und fahren Sie mit der Fixierung fort (Abschnitt 4).

4. Fixieren und Färben der iBBB

  1. Um die iBBB zu fixieren, entfernen Sie das Medium, waschen Sie 1 ml PBS ein und inkubieren Sie es in 500 μl 4%igem Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C.
  2. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung und spülen Sie sie 4 x (mindestens) 15 Minuten lang in 1 ml PBS.
  3. Permeabilisieren Sie die Proben in 0,3 % PBST (PBS mit 0,3 % Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  4. Inkubieren Sie die Kulturen in Blocking-Puffer (5 % normales Serum in 0,3 % PBST) bei Raumtemperatur für mindestens 1 h unter leichtem Schütteln.
    HINWEIS: Die Art des verwendeten Serums hängt von der Wirtsspezies für die verwendeten Sekundärantikörper ab. Wenn die Wirtsspezies für die sekundären Antikörper z. B. Ziege ist, verwenden Sie normales Ziegenserum; Wenn es sich bei der Wirtsart um einen Esel handelt, verwenden Sie normales Eselsserum. Dies kann auch über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln erfolgen.
  5. Verdünnen Sie die Primärantikörper auf die empfohlene oder festgelegte Konzentration im Blockierungspuffer.
  6. Ersetzen Sie die blockierende Lösung durch die Verdünnung des primären Antikörpers. Stellen Sie sicher, dass die iBBBs vollständig in Antikörperlösung eingetaucht sind, um eine gleichmäßige Inkubation zu gewährleisten. 100-150 μl reichen aus, um eine 50 μl iBBB in einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden zu bedecken. Über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
  7. Entfernen Sie den primären Antikörper. Waschen Sie iBBBs 3 x 10-20 Minuten lang in 0,3 % PBS.
  8. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper auf die empfohlene oder festgelegte Konzentration im Blockierungspuffer. Zusätzlich wird der sekundären Antikörperlösung eine Kernfärbung, z. B. Hoechst, in der empfohlenen oder bestimmten Konzentration hinzugefügt.
  9. Ersetzen Sie die letzte PBS-Wäsche durch die sekundäre Antikörperverdünnung. Stellen Sie sicher, dass die iBBBs vollständig in Antikörperlösung eingetaucht sind, um eine gleichmäßige Inkubation zu gewährleisten. 100-150 μl reichen aus, um eine 50 μl iBBB in einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden zu bedecken. 2 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
    HINWEIS: Dies kann auch über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln erfolgen.
  10. Waschen Sie iBBBs 4-5x für mindestens 1 h pro Waschgang in PBS. In PBS oder lichtbeständigen Eindeckmedien bei 4 °C lagern, bis die Proben abgebildet sind.
  11. Für die Aufnahme auf einem inversen Mikroskop bewahren Sie iBBBs in Glasbodenplatten oder -schalen auf. Legen Sie ein Deckglas über die Glasmulde, um die iBBBs an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 1D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eine richtig geformte iBBB erstarrt zu einer einzigen durchscheinenden Scheibe (Abbildung 3A). Es ist normal, dass sich die iBBB nach einigen Tagen von der Oberfläche löst, auf die sie zuerst pipettiert wurde. Dies lässt sich nicht vermeiden, ist aber kein großes Problem für die ordnungsgemäße Bildung der iBBB, wenn beim Medienwechsel darauf geachtet wird, dass die iBBB nicht versehentlich abgesaugt wird. Nach 24 h können gleichmäßig verteilte, einzelne Zellen unter dem Hellfeldmikroskop identifiziert werden (Abbildung 3B). Nach 2 Wochen können deutlichere Strukturen sichtbar sein, die jedoch nur schwer zu erkennen sind (Abbildung 3C).

Die Qualität der iBBB hängt stark von der Qualität der Differenzierung der Eingangszellen ab. Wir empfehlen dringend, einige übrig gebliebene Zellen in 2D-Monokulturen zu plattieren, um zelltypspezifische Marker zu fixieren und zu färben. iBBBs, die aus Endothelzellen gebildet werden, die zu über 70 % positiv für PECAM1 oder VE-Cadherin sind (Abbildung 2A), Perizyten, die zu über 95 % positiv für PDGFRB sind (Abbildung 2B), und Astrozyten, die zu über 95 % positiv für S100B und CD44 sind (Abbildung 2C), eignen sich am besten für erfolgreiche iBBBs. Die Ergebnisse dieser Qualitätsprüfung sind der früheste Indikator für qualitativ hochwertige iBBBs.

Physiologisch relevante 3D-Strukturen sollten sich nach 2 Wochen Selbstorganisation bilden. Bei der Fixierung und Färbung sehen wir Hinweise auf röhrenartige Strukturen, die sich positiv für den Endothelmarker PECAM1 färben, der für die Bildung von Tight Junctions entscheidend ist (Abbildung 4A). Die größte Variabilität in der iBBB-Bildung ist das Ausmaß der Mikrogefäßbildung. In einem "Worst-Case"-Szenario erscheint das Endothelzellnetzwerk stärker fragmentiert oder erstreckt sich nicht über die gesamte iBBB, während im "Best-Case"-Szenario das Gefäßsystem gleichmäßig ist und sich durch die gesamte iBBB verzweigt. Eine Differenzierung von Endothelzellen, die zu über 70 % PECAM1-positiv ist, bildet konsistentere Netzwerke. Darüber hinaus stimmt Aquaporin-4, ein Protein, das von Astrozyten exprimiert wird und an den Endfüßen der Astrozyten lokalisiert ist, mit der PECAM1-Färbung überein, was darauf hindeutet, dass Astrozyten ihre Endfüße ausstrecken, um mit den Endothelzellen in Kontakt zu kommen (Abbildung 4B). Schließlich erwarten wir, Perizyten um das Gefäßsystem herum zu sehen (Abbildung 4C).

Der primäre Messwert für die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA) in iBBBs ist das Vorhandensein von Amyloid-β (Aβ). Aβ kann mit gezielten Antikörpern oder durch Aussaat von fluoreszenzmarkiertem Aβ gemessen werden, um CAA-Phänotypen zu induzieren (Abbildung 5). Die Behandlung von iBBBs mit Aβ sollte die Intensität und Fläche der Aβ-Färbung erhöhen, da die Zellen der BHS nicht viel endogenes Aβ-Protein exprimieren. Alternativ können fixierte Proben mit Thioflavin T gefärbt werden, um eine Amyloid-Akkumulation nachzuweisen. Der Aβ-Spiegel hängt vom Genotyp der Stammzellen ab, die zur Erzeugung der iBBB verwendet werden, wobei einige Alzheimer- und CAA-assoziierte Risikofaktoren die Menge der Aβ-Akkumulation und -Färbung erhöhen (Abbildung 5B, C)24.

Figure 1
Abbildung 1: Eine in vitro Blut-Hirn-Schranke zur Modellierung der zerebralen Amyloid-Angiopathie. (A) Schematische Darstellung der iBBB-Assemblierung und -Reifung. Nach der Differenzierung von Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen werden die Zellen in einer Gelmatrix in einer Einzelzellsuspension eingekapselt. Im Laufe von 2 Wochen bauen sich die Zellen selbst zu vaskulären Einheiten zusammen, ähnlich den in vivo identifizierten Strukturen. (B) Schematische Darstellung des zerebralen Amyloid-Angiopathie-Assays. Amyloid-β wird für 96 h zu gereiften iBBBs gegeben, um die Aβ-Aggregation zu induzieren. (C) Diagramm mit der Seitenansicht einer iBBB nach der Aussaat in einer Vertiefung mit Glasboden. (D) Grafik einer iBBB, die für die Bildgebung auf einem inversen Mikroskop vorbereitet wurde. Abkürzungen: BHS = Blut-Hirn-Schranke; iPS-Zellen = induzierte pluripotente Stammzellen; iBBB = ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS, abgeleitet von einem iPSC-abgeleiteten BHS-Modell für Patienten, das Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind; Aβ = Amyloid-β. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Validierung von iPSC-abgeleiteten iBBB-Zellen. (A) Repräsentative Maximalintensitätsprojektion von Endothelzellen in 2D-Monokulturen, die mit VE-Cadherin (grün) und PECAM1 (rot) gefärbt wurden. (B) Repräsentative Bilder von Perizyten in 2D-Monokulturen, die mit PDGFRB (grün) und NG2 (rot) gefärbt wurden. (C) Repräsentative Bilder von Astrozyten in 2D-Monokulturen, gefärbt mit CD44 (oben; grün) und S100B (unten; grün). Alle Zellkerne sind mit Hoechst 33342 gefärbt. Die Bilder wurden mit einer Nikon Eclipse Ti2-E bei 20-facher Vergrößerung (A,B) oder einer Leica Stellaris 8 bei 40-facher Vergrößerung (C) aufgenommen. Alle Maßstäbe sind 100 μm. Abkürzungen: BHS = Blut-Hirn-Schranke; iPS-Zellen = induzierte pluripotente Stammzellen; iBBB = ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS, abgeleitet von einem iPSC-abgeleiteten BHS-Modell für Patienten, das Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind; VE-Cadherin = vaskuläres endotheliales Cadherin; PECAM1 = Blutplättchen- und Endothelzelladhäsionsmolekül 1; PDGFRB = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor Beta; NG2 = Neuronen-Glia-Antigen 2; S100B = S100 Kalzium-bindendes Protein beta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Montage der iBBB. (A) Hellfeldbild einer 15 μL iBBB 24 h nach der Beschichtung bei 2-facher Vergrößerung. (B) Hellfeldbild einer iBBB 24 h nach dem Galvanisieren bei 10-facher Vergrößerung. (C) Hellfeldbild einer iBBB 2 Wochen nach der Beschichtung bei 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Die Bilder wurden mit einer invertierten Nikon Eclipse Ts2R-FL aufgenommen. Abkürzungen: BHS = Blut-Hirn-Schranke; iPS-Zellen = induzierte pluripotente Stammzellen; iBBB = ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS, abgeleitet von einem Patienten-iPSC-abgeleiteten BHS-Modell, das Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Zellinteraktionen in der iBBB. Repräsentative Bilder von Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten in der iBBB. (A) Endothelzellen (PECAM1) und Astrozyten (S100β). (B) Kolokalisation von Endothelzellen (PECAM1) und Astrozyten-Endfüßen (AQP-4). (C) Endothelzellen (PECAM1) und Perizyten (NG2). Alle Zellkerne sind mit Hoechst 33342 gefärbt. Konfokale Z-Stack-Bilder wurden mit einer Leica Stellaris 8 bei 20-facher Vergrößerung (A,B) oder einer Nikon Eclipse Ti2-E bei 20-facher Vergrößerung (C) aufgenommen. Maßstabsbalken = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Abkürzungen: BHS = Blut-Hirn-Schranke; iPS-Zellen = induzierte pluripotente Stammzellen; iBBB = ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS, abgeleitet von einem iPSC-abgeleiteten BHS-Modell für Patienten, das Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind; PECAM1 = Blutplättchen- und Endothelzelladhäsionsmolekül 1; AQP-4 = Aquaporin-4; NG2 = Neuronen-Glia-Antigen 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Zerebrale Amyloid-Angiopathie in vitro. (A) Nicht-AD-iBBBs, die bei konditionierten Medien von Kontroll- oder Aβ-Überexpressionsneuronen exponiert wurden. 6e10 Antikörper erkennt Aβ. (B) Repräsentative Bilder von iBBBs aus isogenen APOE3- und APOE4-Zelllinien, die mit 20 nM Aβ-FITC1-42 für 96 Stunden behandelt wurden. (C) Quantifizierung von Amyloid in iBBBs aus isogenen APOE3- und APOE4-Zelllinien, die mit 20 nM Aβ-FITC1-40 oder Aβ-FITC1-42 behandelt wurden. Maßstabsbalken = 50 μm (A), 10 μm (B). Diese Zahl wurde von Blanchard et al.24 übernommen. Abkürzungen: BHS = Blut-Hirn-Schranke; iPS-Zellen = induzierte pluripotente Stammzellen; iBBB = ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS, abgeleitet von einem iPSC-abgeleiteten BHS-Modell für Patienten, das Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind; Aβ = Amyloid-β. APOE = ApolipoproteinE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Markierungen Firma Katalognummer Verdünnung
Endothelzellen PECAM1 (CD31) F&E-Systeme AF806-KARTON 1:500
VE-Cadherin (CD144) F&E-Systeme AF938-KARTON 1:500
ZO-1-KARTON Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Perizyten PDGFRβ F&E-Systeme AF385-KARTON 1:500
NG2-KARTON Abcam AB255811 1:500
Astrozyten S100β Sigma-Aldrich S2532-100uL 1:500
CD44-KARTON Zell-Signal-Technologie 3570S 1:400
AQP-4-KARTON Invitrogen PA5-53234-KARTON 1:300
GFAP
ALDH1L1
EAAT1-KARTON
EAAT2-KARTON
Amyloid-β 6e10 Biolegende SIG-39320-KARTON 1:1,000
Thioflavin T Chem Impex 22870 25 μM

Tabelle 1: Empfohlene Zellmarker für Differenzierungsqualitätsprüfungen. Zellmarker für die verschiedenen Zelltypen der BHS, mit denen die Qualität der Differenzierungen überprüft und die Zellen in der gebildeten iBBB identifiziert werden können. Die in diesem Artikel verwendeten Markierungen sind fett gedruckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die BHS-Dysfunktion ist eine Komorbidität und möglicherweise eine Ursache oder ein verschlimmernder Faktor bei zahlreichen neurologischen Erkrankungen 7,40,41. Es ist jedoch nahezu unmöglich, die Molekular- und Zellbiologie zu untersuchen, die der Dysfunktion und dem Zusammenbruch der BHS bei Menschen mit neurovaskulären Erkrankungen zugrunde liegt. Die in diesem Protokoll vorgestellte induzierbare BHS (iBBB) bietet ein In-vitro-System, das wichtige Zellinteraktionen der BHS rekapituliert, einschließlich der Bildung von Gefäßtuben und der Lokalisierung von Astrozyten-Endfüßen mit Gefäßen. Das iBBB kann verwendet werden, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die in jedem Stadium der BHS-Dysfunktion beteiligt sind, und kann Phänotypen neurovaskulärer Erkrankungen modellieren, wie z. B. die Amyloid-β-Aggregation, wie sie bei der zerebralen Amyloid-Angiopathie beobachtet wird.

Der Aufbau der iBBB ist einfach, obwohl die Qualität der iBBBs stark von der Qualität der verwendeten iPSC-Zellen abhängt. Während die iBBB eine multizelluläre Nische bietet, die die Reifung der Teilzellen fördern kann, muss jeder Zelltyp vor der Verkapselung richtig strukturiert werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, jede Differenzierung durch Immunfluoreszenzfärbung auf zelltypspezifische Marker in den einzelnen Monokulturen zu überprüfen (Tabelle 1). Jede iPSC-Linie verhält sich anders, und einige Bedingungen, wie z. B. die Aussaatdichte oder die Anzahl der Tage in jedem Strukturierungsmedium, müssen möglicherweise empirisch bestimmt und angepasst werden, um die Differenzierungseffizienz zu optimieren.

Das beschriebene Protokoll schlägt eine Größe von 50 μl vor, aber die iBBB kann auf bis zu 5 μl herunterskaliert werden, abhängig von der Zellverfügbarkeit, der Anzahl der gewünschten iBBBs und der nachgeschalteten Anwendung. Größere iBBBs enthalten mehr Zellen, was sie ideal für die Sammlung von Proteinen, Lipiden oder Nukleinsäuren macht. Kleinere iBBBs können Arzneimittel-Screenings oder andere skalierbare Assays erleichtern.

Die iBBB ist ein sehr vielseitiges Werkzeug, um die BHS in vitro zu untersuchen. Da jeder Zelltyp unabhängig differenziert ist, können iBBBs aus verschiedenen genetischen Hintergründen zusammengesetzt werden, was es uns ermöglicht, zu untersuchen, wie genetische Risikofaktoren bestimmte Zelltypen beeinflussen, um zur BHS-Dysfunktion beizutragen. Diese Strategie wurde angewendet, um zu zeigen, dass APOE4, der häufigste Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit und die zerebrale Amyloid-Angiopathie, zum Teil über einen pathogenen Mechanismus spezifisch in Perizyten wirkt24. Die weitere Verwendung dieses Werkzeugs würde es uns ermöglichen, die individuellen Beiträge von ECs, PCs und Astrozyten zur Aufrechterhaltung der BHS-Integrität zu analysieren und zu untersuchen, wie jeder Zelltyp während der Krankheitsentwicklung ins Wanken gerät.

Derzeit ist die gebräuchlichste Methode zur Modellierung der BHS in vitro die Verwendung eines Transwell-Systems, das mit ECs ausgesät und manchmal mit Perizyten und/oder Astrozyten kokultiviert wird, um eine undurchlässige Monoschicht 42,43,44 zu bilden. Die 3D-Struktur der iBBB ermöglicht die Selbstorganisation der Gefäßeinheit und ermöglicht die Bildung von tubulären Strukturen, die eher physiologischen Gefäßen ähneln. Ein Nachteil der Aussaat von iBBBs in einer Well-Platte, wie in diesem Protokoll beschrieben, besteht darin, dass sie nicht den schieren Belastungen ausgesetzt sind, die durch ein Gefäßsystem mit konstantem Durchfluss in einem In-vivo-System verursacht werden. Um dies zu überwinden, kann die iBBB in einen mikrofluidischen Chip eingeschleust werden, der eine dynamische Strömung 45,46,47 erzeugen kann. Mit diesem System kann auch die Durchlässigkeit der Gefäße und die Perfusion kleiner Moleküle getestet werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode ein flexibles, iPSC-abgeleitetes 3D-Modell der BHS bietet, das als Plattform für die Untersuchung unzähliger Aspekte der BHS auf zellulärer Ebene verwendet werden kann, einschließlich der Fähigkeit, die Phänotypen neurovaskulärer Erkrankungen zu rekapitulieren, und des Potenzials, die BHS-Permeabilität von Medikamenten für eine Vielzahl von Anwendungen zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird unterstützt von NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation und Brain Injury Association of America. C.G. wird von NIH F31NS130909 unterstützt. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blut-Hirn-Schranke ZNS neurologische Erkrankungen therapeutische Medikamentenverabreichung BHS-Funktion zerebrale Amyloid-Angiopathie Alzheimer-Krankheit Neurodegeneration menschliche pluripotente Stammzellen Endothelzellen Perizyten Astrozyten 3D-Matrix IBBB Amyloid-Ablagerung zerebrovaskuläre Erkrankung genetische Faktoren Umweltfaktoren Arzneimittelscreening medizinisches Targeting
Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke <em>in vitro</em> zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter