Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären in vitro för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

Blod-hjärnbarriären (BBB) har en avgörande roll för att upprätthålla en stabil och hälsosam hjärnmiljö. BBB-dysfunktion är förknippad med många neurologiska sjukdomar. Vi har utvecklat en 3D, stamcellsbaserad modell av BBB för att undersöka cerebrovaskulär patologi, BBB-integritet och hur BBB förändras av genetik och sjukdom.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) är en viktig fysiologisk komponent i det centrala nervsystemet (CNS), som upprätthåller näringsämnen, rensar avfall och skyddar hjärnan från patogener. De inneboende barriäregenskaperna hos BBB utgör en utmaning för terapeutisk läkemedelsleverans till CNS för att behandla neurologiska sjukdomar. Nedsatt BBB-funktion har kopplats till neurologisk sjukdom. Cerebral amyloidangiopati (CAA), avsättning av amyloid i hjärnans kärl som leder till en komprometterad BBB, är en komorbiditet i de flesta fall av Alzheimers sjukdom (AD), vilket tyder på att BBB-dysfunktion eller nedbrytning kan vara involverad i neurodegeneration. På grund av begränsad tillgång till mänsklig BBB-vävnad är mekanismerna som bidrar till korrekt BBB-funktion och BBB-degeneration fortfarande okända. För att ta itu med dessa begränsningar har vi utvecklat en human pluripotent stamcellshärledd BBB (iBBB) genom att införliva endotelceller, pericyter och astrocyter i en 3D-matris. iBBB monterar sig själv för att rekapitulera anatomin och cellulära interaktioner som finns i BBB. Sådd av iBBB med amyloid fångar viktiga aspekter av CAA. Dessutom erbjuder iBBB en flexibel plattform för att modulera genetiska och miljömässiga faktorer som är inblandade i cerebrovaskulär sjukdom och neurodegeneration, för att undersöka hur genetik och livsstil påverkar sjukdomsrisken. Slutligen kan iBBB användas för läkemedelsscreening och läkemedelskemiska studier för att optimera terapeutisk leverans till CNS. I detta protokoll beskriver vi differentieringen av de tre typerna av celler (endotelceller, pericyter och astrocyter) som härrör från humana pluripotenta stamceller, hur man sätter ihop de differentierade cellerna till iBBB och hur man modellerar CAA in vitro med hjälp av exogent amyloid. Denna modell övervinner utmaningen att studera levande mänsklig hjärnvävnad med ett system som har både biologisk trohet och experimentell flexibilitet, och möjliggör förhör av den mänskliga BBB och dess roll i neurodegeneration.

Introduction

Blod-hjärnbarriären (BBB) är ett viktigt mikrovaskulärt nätverk som separerar det centrala nervsystemet (CNS) från periferin för att upprätthålla en idealisk miljö för korrekt neuronal funktion. Det har en avgörande roll för att reglera inflödet och utflödet av ämnen till CNS genom att upprätthålla metabolisk homeostas 1,2,3,4, rensa avfall 4,5,6 och skydda hjärnan från patogener och toxiner 7,8.

Den primära celltypen av BBB är endotelcellen (EC). Endotelceller, härstammande från mesodermlinjen, bildar kärlväggarna 1,9. Mikrovaskulära EC:er bildar täta korsningar med varandra för att kraftigt minska permeabiliteten hos deras membran 10,11,12,13,14 samtidigt som transportörer uttrycks för att underlätta förflyttningen av näringsämnen in i och ut ur CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulära ECs är omgivna av pericyter (PCs)-muralceller som reglerar mikrovaskulär funktion och homeostas och är avgörande för att reglera permeabiliteten hos BBB för molekyler och immunceller 15,16,17. Astrocyten, en viktig gliacellstyp, är den slutliga celltypen som består av BBB. Astrocyternas ändfötter lindas runt EC-PC-kärlrören medan cellkropparna sträcker sig in i hjärnans parenkym och bildar en förbindelse mellan nervceller och kärl1. Distinkta lösta ämnen och substrattransportörer är lokaliserade på astrocyternas ändfötter (t.ex. aquaporin 4 [AQP-4]) som har en kritisk roll i BBB-funktion 18,19,20,21.

BBB är avgörande för att upprätthålla korrekt hjärnhälsofunktion, och dysfunktion av BBB har rapporterats vid många neurologiska sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD) 22,23,24,25, multipel skleros 7,26,27,28, epilepsi 29,30 och stroke31,32. Det är alltmer erkänt att cerebrovaskulära abnormiteter spelar en central roll i neurodegeneration, vilket bidrar till ökad känslighet för ischemiska och hemorragiska händelser. Till exempel har mer än 90 % av AD-patienterna cerebral amyloid angiopati (CAA), ett tillstånd som kännetecknas av avsättning av amyloid β (Aβ) längs hjärnans kärl. CAA ökar BBB-permeabiliteten och minskar BBB-funktionen, vilket gör CNS sårbart för ischemi, hemorragiska händelser och accelererad kognitiv försämring33.

Vi har nyligen utvecklat en in vitro-modell av humant BBB, härledd från patientinducerade pluripotenta stamceller, som innehåller EC, PC och astrocyter inkapslade i en 3D-matris (Figur 1A). iBBB rekapitulerar fysiologiskt relevanta interaktioner, inklusive kärlrörsbildning och lokalisering av astrocytändfötter med vaskulatur24. Vi använde iBBB för att modellera känsligheten hos CAA medierad av APOE4 (figur 1B). Detta gjorde det möjligt för oss att identifiera de kausala cellulära och molekylära mekanismerna genom vilka APOE4 främjar CAA, och utnyttja dessa insikter för att utveckla terapeutiska strategier som minskar CAA-patologi och förbättrar inlärning och minne in vivo i APOE4-möss24. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll och videohandledning för att rekonstruera BBB från humana iPSC:er och modellera CAA in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differentiera iPSCs till iBBB-celler

OBS: Dessa differentieringsprotokoll har tidigare beskrivits i Mesentier-Louro et al.34.

  1. Beläggning av cellodlingsplattor
    1. Upptining reducerade membranmatrisen med tillväxtfaktor (GF) över natten vid 4 °C. Späd 500 μl basalmembranmatris i 49,5 ml DMEM. Förvara denna lösning kall för att förhindra för tidig polymerisation av beläggningslösningen.
    2. Tillsätt 1-2 ml per brunn av en 6-brunns vävnadskulturbehandlad platta. Låt beläggningslösningen verka i minst 20 minuter vid 37 °C innan du ersätter den med lämpligt uppvärmt odlingsmedium.
  2. Differentiering av humana iPSCs till ETV2-inducerbara endotelceller
    Tidpunkt: 8 dagar
    OBS: Detta protokoll är anpassat från Blanchard et al.24 och Qian et al.35. Vi använder det doxycyklininducerbara uttrycket av transkriptionsfaktorn ETV2, som beskrivs av Wang et al.36 för att förbättra utbytet. ETV2 introducerades via PiggyBac-plasmiden och cellerna transfekterades sedan.
    1. Odla iPSCs på reducerade GF basalmembranmatrisbelagda plattor i matarfritt pluripotent stamcellsmedium tills cellerna når ~70 % sammanflöde.
      OBS: Vi rekommenderar att de inducerbara iPSC:erna bibehålls med val för PiggyBac-plasmiden (dvs. puromycin)
    2. Dag 0: Separera cellerna med en proteas-kollagenasblandning i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 mellan proteas-kollagenasblandningen och stamcellsmediet. Snurra ner cellerna med 300 × g i 3 min. Återsuspendera cellpelleten med stamcellsmedium och plätera cellerna vid 20 800 celler/cm2 på reducerade GF basalmembranmatrisbelagda plattor i stamcellsmedium kompletterat med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Ersätt mediet med DeSR1 [DMEM/F12 + glutamintillskott, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% penicillin-streptomycin (P/S)], kompletterat med 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 och 5 μg/ml doxycyklin.
    4. Dag 3: Ersätt mediet med DeSR2 [DMEM/F12 + glutamintillskott, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] kompletterat med 5 μg/ml doxycyklin.
    5. Dag 5: Ersätt medium med hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] kompletterat med 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM forskolin och 5 μg/ml doxycyklin.
    6. Dag 7: Ersätt medium med hECSR kompletterat med 50 ng/ml vegf-a, 2 μM forskolin och 5 μg/ml doxycyklin.
    7. Dag 8: Dela ECs 1:3 med en proteas-kollagenasblandning och återfrö på färska reducerade GF basalmembranmatrisbelagda plattor i hECSR kompletterat med 50 ng/ml VEGF-A och 5 μg/ml doxycyklin.
      OBS: Detta är den bästa tidpunkten för att kapsla in EC i iBBB för enhetlig vaskulaturbildning.
    8. Dag 10+: Mata cellerna var 2-3:e dag med hECSR kompletterat med 50 ng/ml VEGF-A och 5 μg/ml doxycyklin. Fortsätt att dela cellerna 1:3 med en proteas-kollagenasblandning när plattorna är sammanflytande.
      OBS: iPSC-härledda EC kan frysas när som helst från och med dag 8. Lyft cellerna, som för att passera. Återsuspendera pelleten i EC frysmedium [60 % knockoutserumersättning (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml vegf-a och 10 μM Y27632], dela cellerna 1:3 och frys in med en frysbehållare vid -80 °C. Tina på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i hECSR kompletterat med 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml doxycyklin.
    9. Bekräfta differentiering av mikrovaskulära endotelceller i hjärnan genom immuncytokemi med antikroppar mot CD31/PECAM1 eller VE-cadherin (figur 2A).
  3. Differentiering av humana iPSCs till pericyter
    Tidpunkt: 6 dagar
    OBS: Detta protokoll har anpassats från Patsch et al.36.
    1. Odla iPSCs på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor under matarfria förhållanden i stamcellsmedium tills cellerna når ~70 % sammanflöde.
    2. Dag 0: Separera cellerna med en proteas-kollagenasblandning i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 mellan proteas-kollagenasblandningen och stamcellsmediet. Snurra ner cellerna med 300 × g i 3 min. Återsuspendera cellpelleten med stamcellsmedium och plätera cellerna vid 37 000-40 000 celler/cm2 (beroende på cellinje) på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i stamcellsmedium kompletterat med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Byt ut mediet mot N2B27 [50 % DMEM/F12 + glutamintillskott, 50 % neurobasal, 1 x MEM-NEAA, 0,5 gånger, glutamintillskott, 1 x N-2, 1 x B-27, 1 % P/S] kompletterat med 25 ng/ml BMP4 och 8 μM CHIR99021.
    4. Dag 3-4: Byt ut mediet mot N2B27 kompletterat med 2 ng/ml Activin A och 10 ng/ml pdgf-bb och mata dagligen.
    5. Dag 5: Dela PC:er med en proteas-kollagenasblandning och frö på 0,1 % gelatinbelagda plattor vid 35 000 celler/cm2 i N2B27 kompletterat med 10 ng/ml pdgf-bb.
      OBS: Dela bara celler en gång konfluent. Vissa rader kan kräva ytterligare några dagar innan de är redo att delas. Fortsätt att byta media dagligen tills cellerna flyter samman.
    6. Expandera datorer i N2B27 kompletterat med 10 ng/ml pdgf-bb, byte av media var 2-3:e dag. Ta bort PDGF-BB från mediet efter att cellerna återigen når sammanflöde och genomgår en andra passage.
      OBS: Pericyter är redo att användas i iBBB efter den andra passagen. När de väl har expanderat kan datorer frysas. Lyft cellerna som om de skulle passera, återsuspendera cellpelleten i frysmedium [90 % KSR och 10 % DMSO] och frys in med en frysbehållare vid -80 °C. Tina på 0,1 % gelatinbelagda plattor vid 35 000 celler/cm2 i N2B27.
    7. Bekräfta pericytdifferentiering genom immuncytokemi med hjälp av antikroppar mot PDGFRB och NG2 (figur 2B).
  4. Differentiering av humana iPSCs till neurala stamceller (NPC) och astrocyter
    Tidpunkt: 45 dagar totalt (15 dagar för NPC:er följt av 30 dagar för astrocyter)
    OBS: NPC-differentieringsprotokollet anpassades från Chambers et al.38, och astrocytdifferentieringen är som beskrivs i TCW et al.39.
    1. Odla iPSCs på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor under matarfria förhållanden i stamcellsmedium tills cellerna når ~70 % sammanflöde.
    2. Separera cellerna med en proteas-kollagenasblandning i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 mellan proteas-kollagenasblandningen och stamcellsmediet. Snurra ner cellerna med 300 × g i 3 min. Återsuspendera cellpelleten med stamcellsmedium och plätera cellerna vid 100 000 celler/cm2 på reducerade GF basalmembranmatrisbelagda plattor i stamcellsmedium kompletterat med 10 μM Y27632.
    3. Byt ut stamcellsmediet följande dag. Fortsätt att mata cellerna varannan dag tills de når >95% sammanflöde (3-4 dagar beroende på cellinje).
    4. NPC Dag 0: Byt ut mediet mot N2B27 [50 % DMEM/F12 + glutamintillskott, 50 % neurobasal, 1 x MEM-NEAA, 0,5 gånger, glutamintillskott, 1 x N-2, 1X-B-27, 1 % P/S] kompletterat med 10 μM SB43152 och 100 nM LDN193189.
    5. NPC dag 1-9: Mata cellerna dagligen med N2B27 kompletterat med 10 μM SB43152 och 100 nM LDN193189.
    6. NPC Dag 10: Dela NPC:er 1:3 med proteas-kollagenasblandningen och frö på färska reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i N2B27 kompletterat med 20 ng/ml FGF-basisk och 10 μM Y27632.
    7. NPC dag 11 - 13: Mata NPC:er dagligen med N2B27 kompletterat med 20 ng/ml FGF-basisk.
    8. NPC Dag 14: Dela NPC:er 1:3 med proteas-kollagenasblandningen och återplantera på färska reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i N2B27 kompletterat med 20 ng/ml FGF-basisk och 10 μM Y27632.
    9. NPC Dag 15/Astrocyt Dag 0: Detta är dag 0 av astrocytdifferentieringen. Mata cellerna med komplett astrocytmedium (AM).
      OBS: NPC:er kan bibehållas i N2B27 kompletterat med 20 ng/ml FGF-basic och passera när de är sammanflytande. För att frysa NPC:er, återsuspendera cellpelleten i frysmedium [90 % KSR och 10 % DMSO], dela cellerna 1:3 och frys med en frysbehållare vid -80 °C. Tina på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i N2B27 kompletterat med 20 ng/ml bFGF och 10 μM Y27632.
    10. Astrocyt dag 1-30: Mata cellerna var 2-3:e dag med AM. När cellerna är >90 % sammanflytande, passage med hjälp av proteas-kollagenasblandningen och plattan vid 15 000 celler/cm2 på färska reducerade GF basalmembranmatrisbelagda plattor i AM.
      OBS: Astrocyter bör vara helt differentierade inom 30 dagar. Astrocyter kan frysas i frysmedel [90 % KSR och 10 % DMSO] i en frysbehållare vid -80 °C. Tina på reducerade GF-basalmembranmatrisbelagda plattor i AM vid 25 000-35 000 celler/cm2.
    11. Bekräfta NPC-differentiering genom immunocytokemi med hjälp av antikroppar mot Nestin och SOX2. Bekräfta astrocytdifferentiering genom immuncytokemi med antikroppar mot S100B och CD44 (figur 2C).

2. Montering av iBBB

  1. Upptining reducerade tillväxtfaktorn (GF) basalmembranmatrisen över natten vid 4 °C. Späd inte ut denna matris i DMEM eftersom iBBB:erna är inkapslade i 100 % reducerad GF-basalmembranmatris. Varje iBBB kräver 50 μL av matrisen.
  2. Skilj de differentierade EC med en proteas-kollagenasblandning vid 37 °C i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 mellan proteas-kollagenasblandningen och hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Snurra cellerna i 300 × g i 3 minuter. Återsuspendera cellpelleten i hECSR.
    OBS: Använd ett koniskt rör, antingen 15 ml eller 50 ml, som är tillräckligt stort för att rymma volymen av dissocierade celler plus media. Cellerna kan också delas upp på flera rör och sedan rekombineras vid omblandning.
  3. Skilj de differentierade PC-skivorna mot proteas-kollagenasblandningen vid 37 °C i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 mellan proteas-kollagenasblandningen och N2B27 (50 % DMEM/F12 + glutamintillskott, 50 % neurobasal, 1 x MEM-NEAA, 0,5 x glutamintillskott, 1 x N-2, 1 x B-27, 1 % penicillin-streptomycin [P/S]). Snurra ner cellerna med 300 × g i 3 min. Återsuspendera cellpelleten i N2B27.
  4. Separera de differentierade astrocyterna med proteas-kollagenasblandningen vid 37 °C i 5 minuter. Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör med förhållandet 1:3 av proteas-kollagenasblandningen till komplett astrocytmedium (AM). Snurra ner cellerna med 300 × g i 3 min. Återsuspendera cellpelleten på förmiddag.
  5. Använd en hemocytometer för att räkna varje celltyp. Späd varje typ av cellsuspension till en slutlig koncentration av 1 × 106 celler/ml i lämpligt medium.
  6. Kombinera det beräknade antalet celler för varje celltyp i ett koniskt rör: 50 μL iBBB kräver 2,5 × 105 ECs, 5 × 104 PCs och 5 × 104 astrocyter. Inkludera 10 % mer än det beräknade antalet celler för att ta hänsyn till pipetteringsfel. Snurra ner cellblandningen med 300 × g i 3 min.
    OBS: Det rekommenderas starkt att plätera några överblivna celler av varje celltyp i 2D-monokulturer för att fixera och färga för kvalitetskontroll av ingångscellerna. Platta varje celltyp med 35 000 celler/cm2 på tidigare förberedda plattor belagda med reducerad GF-basalmembranmatris och fixera efter 3-4 dagar. Se tabell 1 för celltypsspecifika antikroppar.
  7. Aspirera mediet från cellpelleten och lämna cirka 50 μL av supernatanten ovanför cellpelleten. Använd en P200 och återsuspendera försiktigt cellpelleten i restmedium för att skapa en encellsuppslamning.
  8. Blanda celluppslamningen i tillräckligt reducerad GF-basalmembranmatris kompletterad med 10 ng/ml VEGF-A för önskat antal iBBB vid 50 μL reducerad GF-basalmembranmatris per iBBB, var noga med att blanda cellerna homogent utan att införa några luftbubblor.
    OBS: Det är viktigt att hålla cellerna och reducerad GF-basalmembranmatris på is i detta skede för att förhindra för tidig polymerisation.
  9. Pipettera 50 μL reducerad GF basalmembranmatrisblandning i brunnen på en 48-håls odlingsskål med glasbotten. Fördela volymen jämnt över botten av skålen (Figur 1C).
  10. Inkubera iBBB:erna vid 37 °C i 30-40 minuter för att tillåta den reducerade GF-basalmembranmatrisen att polymeriseras och kapsla in cellerna i matrisen.
  11. Tillsätt 500 μl AM kompletterat med 10 ng/ml vegf-a, 5 μg/ml doxycyklin och 10 μM Y27632.
  12. Byt medium följande dag till AM kompletterat med 10 ng/ml VEGF-A. Fortsätt att byta medium var 2-3:e dag. Efter 2 veckor, sluta komplettera med VEGF-A; iBBB är redo för nedströmsanalyser efter 2 veckor.

3. Inducering av cerebral amyloidangiopati (CAA) med Aβ-fibriller

  1. Bered stamlösningar av amyloid-β1-40 och amyloid-β1-42 vid 200 μM i PBS.
  2. Tillsätt Aβ till iBBB-medium på 2-veckors iBBB till en slutlig koncentration på 20 nM. Inkubera cellerna i Aβ-kompletterat medium i 96 timmar (4 dagar).
  3. Efter 96 timmar, ta bort mediet och fortsätt med fixeringen (avsnitt 4).

4. Fixering och färgning av iBBB

  1. För att fixera iBBB, ta bort mediet, tvätta i 1 ml PBS och inkubera i 500 μl 4 % paraformaldehyd över natten vid 4 °C.
  2. Ta bort 4% paraformaldehydlösning och skölj i 4 x (minst) 15 minuter i 1 ml PBS.
  3. Permeabilisera proverna i 0.3 % PBST (PBS med 0.3 % Triton X-100) i 1 timme vid rumstemperatur med försiktig skakning.
  4. Inkubera kulturerna i blockerande buffert (5 % Normal Serum i 0,3 % PBST) vid rumstemperatur i minst 1 timme genom att skaka dem försiktigt.
    OBS: Vilken typ av serum som används beror på värdarten för de sekundära antikroppar som används. Till exempel, om värdarten för de sekundära antikropparna är get, använd normalt getserum; Om värdarten är åsna, använd vanligt åsneserum. Detta kan också göras över natten vid 4 °C med lätt skakning.
  5. Späd de primära antikropparna till den rekommenderade eller fastställda koncentrationen i blockerande buffert.
  6. Ersätt den blockerande lösningen med den primära antikroppsutspädningen. Se till att iBBB:erna är helt nedsänkta i antikroppslösning för jämn inkubation; 100-150 μL är tillräckligt för att täcka en 50 μL iBBB i en 48-håls odlingsskål med glasbotten. Inkubera över natten vid 4 °C med lätt skakning.
  7. Ta bort den primära antikroppen. Tvätta iBBBs i 3 x 10-20 min i 0.3% PBS.
  8. Späd den sekundära antikroppen till den rekommenderade eller fastställda koncentrationen i blockerande buffert. Tillsätt dessutom en kärnfärg, t.ex. Hoechst, till den sekundära antikroppslösningen vid den rekommenderade eller bestämda koncentrationen.
  9. Ersätt den sista PBS-tvätten med den sekundära antikroppsutspädningen. Se till att iBBB:erna är helt nedsänkta i antikroppslösning för jämn inkubation; 100-150 μL är tillräckligt för att täcka en 50 μL iBBB i en 48-håls odlingsskål med glasbotten. Inkubera i rumstemperatur i 2 timmar med lätt skakning.
    OBS: Detta kan också göras över natten vid 4 °C med lätt skakning.
  10. Tvätta iBBBs 4-5x i minst 1 h per tvätt i PBS. Förvaras i PBS eller anti-bleknings monteringsmedia vid 4 °C tills proverna är avbildade.
  11. För att avbilda på ett inverterat mikroskop, förvara iBBB:er i glasbottenplattor eller fat. Placera ett täckglas över glasbrunnen för att hålla iBBB:erna på plats (Figur 1D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En korrekt formad iBBB stelnar till en enda genomskinlig skiva (figur 3A). Det är normalt att iBBB lossnar från ytan där den först pipetterades efter några dagar. Detta kan inte undvikas, men är inte ett stort problem för den korrekta bildningen av iBBB om försiktighet iakttas vid byte av media för att inte oavsiktligt aspirera iBBB. Efter 24 timmar, jämnt fördelade, kan enskilda celler identifieras under ett ljusfältsmikroskop (figur 3B). Efter 2 veckor kan mer distinkta strukturer vara synliga, även om det är svårt att urskilja med definition (Figur 3C).

Kvaliteten på iBBB är i hög grad beroende av kvaliteten på differentieringen av ingångscellerna. Vi rekommenderar starkt att du pläterar några överblivna celler i 2D-monokulturer för att fixera och färga för celltypsspecifika markörer. iBBB bildade av endotelceller som är över 70 % positiva för PECAM1 eller VE-cadherin (Figur 2A), pericyter över 95 % positiva för PDGFRB (Figur 2B) och astrocyter över 95 % positiva för S100B och CD44 (Figur 2C) är bäst för framgångsrika iBBB. Resultaten från denna kvalitetskontroll är den tidigaste indikatorn för högkvalitativa iBBB:er.

Fysiologiskt relevanta 3D-strukturer bör bildas efter 2 veckors självorganisering. Vid fixering och färgning ser vi tecken på rörliknande strukturer som färgar positivt för endotelmarkören PECAM1, vilket är avgörande för bildandet av täta korsningar (Figur 4A). Den största variationen i iBBB-bildning är omfattningen av mikrovaskulaturbildningen. I ett "värsta fall" verkar endotelcellnätverket mer fragmenterat eller sträcker sig inte över hela iBBB, medan i "bästa fall" är kärlen likformiga och förgrenar sig genom hela iBBB. Endotelcellsdifferentiering som är över 70 % PECAM1-positiv bildar mer konsistenta nätverk. Dessutom är aquaporin-4, ett protein som uttrycks av astrocyter och som lokaliseras till astrocyternas ändfötter, i linje med PECAM1-färgning, vilket indikerar att astrocyter sträcker ut sina ändfötter för att komma i kontakt med endotelcellerna (Figur 4B). Slutligen förväntar vi oss att se pericyter runt kärlen (Figur 4C).

Den primära avläsningen för cerebral amyloidangiopati (CAA) i iBBB är förekomst av amyloid-β (Aβ). Aβ kan mätas med hjälp av riktade antikroppar eller genom att sådd fluorescerande märkt Aβ för att inducera CAA-fenotyper (figur 5). Behandling av iBBB med Aβ bör öka intensiteten och arean av Aβ-färgningen, eftersom cellerna i BBB inte uttrycker mycket endogent Aβ-protein. Alternativt kan fasta prover färgas med tioflavin T för att detektera amyloidansamling. Aβ-nivåerna är beroende av genotypen hos de stamceller som används för att generera iBBB, med vissa riskfaktorer för Alzheimers sjukdom och CAA-associerade faktorer som ökar mängden Aβ-ackumulering och färgning (figur 5B, C)24.

Figure 1
Figur 1: En blod-hjärnbarriär in vitro för att modellera cerebral amyloidangiopati. (A) Schematisk representation av iBBB-sammansättning och mognad. Efter differentiering av endotelceller, astrocyter och pericyter från inducerade pluripotenta stamceller, kapslas cellerna in i en gelmatris i en encellssuspension. Under loppet av 2 veckor självorganiserar sig cellerna till vaskulära enheter, liknande de strukturer som identifierats in vivo. (B) Schematisk analys av cerebral amyloidangiopati. Amyloid-β tillsätts till mogna iBBB i 96 timmar för att inducera Aβ-aggregering. (C) Diagram som visar sidovyn av en iBBB efter sådd i en brunn med glasbotten. (D) En bild av en iBBB förberedd för avbildning i ett inverterat mikroskop. Förkortningar: BBB = blod-hjärnbarriären; iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iBBB = en in vitro-modell av humant BBB som härrör från en patient-iPSC-härledd BBB-modell, som innehåller endotelceller, pericyter och astrocyter inkapslade i en 3D-matris, Aβ = Amyloid-β. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Validering av iPSC-härledda iBBB-celler. A) Representativ projektion av endotelceller med maximal intensitet i 2D-monokulturer färgade med VE-cadherin (grön) och PECAM1 (röd). (B) Representativa bilder av pericyter i 2D-monokulturer färgade med PDGFRB (grönt) och NG2 (rött). (C) Representativa bilder av astrocyter i 2D-monokulturer färgade med CD44 (överst; grönt) och S100B (nederst; grönt). Alla kärnor är färgade med Hoechst 33342. Bilderna togs med en Nikon Eclipse Ti2-E med 20x förstoring (A,B) eller en Leica Stellaris 8 med 40x förstoring (C). Alla skalstaplar är 100 μm. Förkortningar: BBB = blod-hjärnbarriären; iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iBBB = en in vitro-modell av humant BBB som härrör från en patient-iPSC-härledd BBB-modell, som innehåller endotelceller, pericyter och astrocyter inkapslade i en 3D-matris, VE-cadherin = vaskulär endotelial cadherin; PECAM1 = trombocyt- och endotelcellsadhesionsmolekyl 1, PDGFRB = trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor beta; NG2 = gliaantigen 2 i nervcellen, S100B = S100 kalciumbindande protein beta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Montering av iBBB. (A) Ljusfältsbild av en 15 μL iBBB 24 timmar efter plätering vid 2x förstoring. (B) Ljusfältsbild av en iBBB 24 timmar efter plätering vid 10x förstoring. (C) Ljusfältsbild av en iBBB 2 veckor efter plätering vid 10x förstoring. Skalstreck = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Bilderna är tagna med en inverterad Nikon Eclipse Ts2R-FL. Förkortningar: BBB = blod-hjärnbarriären; iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iBBB = en in vitro-modell av humant BBB som härrör från en patient-iPSC-härledd BBB-modell, som innehåller endotelceller, pericyter och astrocyter inkapslade i en 3D-matris. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Cellinteraktioner i iBBB. Representativa bilder av endotelceller, pericyter och astrocyter i iBBB. A) Endotelceller (PECAM1) och astrocyter (S100β). (B) Samlokalisering av endotelceller (PECAM1) och astrocytändfötter (AQP-4). C) Endotelceller (PECAM1) och pericyter (NG2). Alla kärnor är färgade med Hoechst 33342. Konfokala Z-stackbilder togs med en Leica Stellaris 8 med 20x förstoring (A,B) eller en Nikon Eclipse Ti2-E med 20x förstoring (C). Skalstreck = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Förkortningar: BBB = blod-hjärnbarriären; iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iBBB = en in vitro-modell av humant BBB som härrör från en patient-iPSC-härledd BBB-modell, som innehåller endotelceller, pericyter och astrocyter inkapslade i en 3D-matris, PECAM1 = trombocyt- och endotelcellsadhesionsmolekyl 1, AQP-4 = aquaporin-4; NG2 = gliaantigen 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Cerebral amyloidangiopati in vitro. (A) Icke-AD iBBB exponerade för betingade medier från kontroll- eller Aβ-överuttrycksneuroner. 6e10-antikropp känner igen Aβ. (B) Representativa bilder av iBBBs från isogena APOE3- och APOE4-cellinjer behandlade med 20 nM Aβ-FITC1-42 i 96 timmar. (C) Kvantifiering av amyloid i iBBBs från isogena APOE3- och APOE4-cellinjer behandlade med 20 nM Aβ-FITC1-40 eller Aβ-FITC1-42. Skalstreck = 50 μm (A), 10 μm (B). Denna figur är hämtad från Blanchard et al24. Förkortningar: BBB = blod-hjärnbarriären; iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iBBB = en in vitro-modell av humant BBB som härrör från en patient-iPSC-härledd BBB-modell, som innehåller endotelceller, pericyter och astrocyter inkapslade i en 3D-matris, Aβ = Amyloid-β. APOE = ApolipoproteinE. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Markörer Företag Katalognummer Utspädning
Endotelceller PECAM1 (CD31) R&D-system AF806 1:500
VE-cadherin (CD144) FoU-system AF938 1:500
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Pericyter PDGFRβ R&D-system AF385 1:500
NG2 Abcam Abcam AB255811 1:500
Astrocyter S100β Sigma-Aldrich S2532-100UL 1:500
CD44 Teknik för cellsignalering 3570-TALET 1:400
AQP-4 Invitrogen PA5-53234 1:300
GFAP (på engelska)
ALDH1L1
EAAT1
EAAT2
Amyloid-β 6e10 Biolegend SIG-39320 1:1,000
Thioflavin T Chem Impex 22870 25 μM

Tabell 1: Rekommenderade cellmarkörer för kvalitetskontroller av differentiering. Cellmarkörer för de olika celltyperna i BBB som kan användas för att kontrollera kvaliteten på differentieringarna och för att identifiera cellerna i den bildade iBBB. Markörerna som används i detta papper är fetstilta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BBB-dysfunktion är en komorbiditet och potentiellt en orsak eller förvärrande faktor i många neurologiska sjukdomar 7,40,41. Det är dock nästan omöjligt att studera den molekylär- och cellbiologi som ligger till grund för dysfunktion och nedbrytning av BBB hos människor med neurovaskulär sjukdom. Den inducerbara BBB (iBBB) som presenteras i detta protokoll ger ett in vitro-system som rekapitulerar viktiga cellinteraktioner i BBB, inklusive vaskulär rörbildning och lokalisering av astrocytändfötter med vaskulatur. iBBB kan användas för att studera de molekylära vägar som är involverade i alla stadier av BBB-dysfunktion och kan modellera fenotyper av neurovaskulära sjukdomar, såsom amyloid-β-aggregering, som ses vid cerebral amyloidangiopati.

Monteringen av iBBB är enkel, även om kvaliteten på iBBB:erna är starkt beroende av kvaliteten på de iPSC-härledda cellerna som används. Medan iBBB tillhandahåller en flercellig nisch som kan främja mognaden av komponentcellerna, måste varje celltyp mönstras ordentligt innan den kapslas in. Det är viktigt att utföra kvalitetskontroller av varje differentiering genom att utföra immunofluorescensfärgning för celltypsspecifika markörer på de enskilda monokulturerna (tabell 1). Varje iPSC-linje beter sig annorlunda och vissa förhållanden, såsom såddtäthet eller antalet dagar i varje mönstringsmedium, kan behöva bestämmas empiriskt och justeras för att optimera differentieringseffektiviteten.

Det beskrivna protokollet föreslår en storlek på 50 μL, men iBBB kan skalas ner till så litet som 5 μL, beroende på celltillgänglighet, antalet önskade iBBB:er och nedströmsapplikationen. Större iBBB:er innehåller fler celler, vilket gör dem idealiska för insamling av protein, lipider eller nukleinsyra. Mindre iBBB:er kan underlätta läkemedelsscreening eller andra skalbara analyser.

iBBB är ett mycket mångsidigt verktyg för att studera BBB in vitro. Eftersom varje celltyp är differentierad oberoende av varandra kan iBBB sättas samman från olika genetiska bakgrunder, vilket gör det möjligt för oss att studera hur genetiska riskfaktorer påverkar specifika celltyper för att bidra till BBB-dysfunktion. Denna strategi tillämpades för att visa att APOE4, den vanligaste riskfaktorn för Alzheimers sjukdom och cerebral amyloidangiopati, verkar delvis genom en patogen mekanism specifikt i pericyter24. Ytterligare användning av detta verktyg skulle göra det möjligt för oss att dissekera de individuella bidragen från ECs, PC och astrocyter för att upprätthålla BBB-integritet och hur varje celltyp vacklar under sjukdomsutvecklingen.

För närvarande är den vanligaste metoden för att modellera BBB in vitro genom att använda ett transwell-system, sådd med ECs, och ibland samodlad med pericyter och/eller astrocyter, för att bilda ett ogenomträngligt monolager 42,43,44. 3D-strukturen hos iBBB möjliggör självmontering av kärlenheten och möjliggör bildandet av rörformiga strukturer som mer liknar fysiologiska kärl. En nackdel med att plantera iBBB i en brunnsplatta, som beskrivs i detta protokoll, är att de inte upplever de stora påfrestningar som orsakas av vaskulatur med konstant flöde i ett in vivo-system. För att övervinna detta kan iBBB sås in i ett mikrofluidiskt chip som kan generera ett dynamiskt flöde 45,46,47. Detta system kan också användas för att testa vaskulaturpermeabilitet och perfusion av små molekyler.

Sammanfattningsvis ger denna metod en flexibel, 3D, iPSC-härledd modell av BBB som kan användas som en plattform för att studera otaliga aspekter av BBB på cellulär nivå, inklusive förmågan att rekapitulera fenotyper av neurovaskulära sjukdomar och potentialen att screena läkemedels BBB-permeabilitet för ett brett spektrum av applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation och Brain Injury Association of America. C.G. stöds av NIH F31NS130909. Figur 1A skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blod-hjärnbarriär CNS Neurologisk sjukdom Terapeutisk läkemedelstillförsel BBB-funktion Cerebral amyloidangiopati Alzheimers sjukdom Neurodegeneration Humana pluripotenta stamceller Endotelceller pericyter astrocyter 3D-matris IBBB Amyloidavlagring Cerebrovaskulär sjukdom Genetiska faktorer Miljöfaktorer Läkemedelsscreening Medicinsk inriktning
Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären <em>in vitro</em> för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter