Summary
血脑屏障（BBB）在维持稳定和健康的大脑环境方面起着至关重要的作用。血脑屏障功能障碍与许多神经系统疾病有关。我们开发了一种 3D 干细胞衍生的 BBB 模型，用于研究脑血管病理学、BBB 完整性以及 BBB 如何被遗传和疾病改变。
Abstract
血脑屏障 （BBB） 是中枢神经系统 （CNS） 的关键生理组成部分，可维持营养、清除废物并保护大脑免受病原体的侵害。血脑屏障固有的屏障特性对治疗药物递送至中枢神经系统以治疗神经系统疾病提出了挑战。血脑屏障功能受损与神经系统疾病有关。脑淀粉样血管病 （CAA） 是淀粉样蛋白在脑血管系统中的沉积导致 BBB 受损，是大多数阿尔茨海默病 （AD） 病例的合并症，表明 BBB 功能障碍或分解可能与神经退行性变有关。由于对人体血脑屏障组织的访问有限，导致正常血脑屏障功能和血脑屏障变性的机制仍然未知。为了解决这些局限性，我们通过将内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞掺入 3D 基质中，开发了一种人类多能干细胞衍生的 BBB （iBBB）。iBBB 自组装以概括 BBB 中存在的解剖结构和细胞相互作用。用淀粉样蛋白接种 iBBB 可捕获 CAA 的关键方面。此外，iBBB提供了一个灵活的平台来调节与脑血管疾病和神经退行性变有关的遗传和环境因素，以研究遗传和生活方式如何影响疾病风险。最后，iBBB可用于药物筛选和药物化学研究，以优化向中枢神经系统的治疗输送。在该方案中，我们描述了由人类多能干细胞产生的三种细胞（内皮细胞，周细胞和星形胶质细胞）的分化，如何将分化的细胞组装到iBBB中，以及如何使用外源性淀粉样蛋白 在体外 模拟CAA。该模型克服了使用具有生物学保真度和实验灵活性的系统研究活体人脑组织的挑战，并能够研究人类血脑屏障及其在神经退行性变中的作用。
Introduction
血脑屏障 （BBB） 是将中枢神经系统 （CNS） 与外周分开的关键微血管网络，以维持正常神经元功能的理想环境。它通过维持代谢稳态 1,2,3,4、清除废物 4,5,6 以及保护大脑免受病原体和毒素的侵害，在调节物质流入和流入中枢神经系统方面起着关键作用 7,8。
血脑屏障的主要细胞类型是内皮细胞（EC）。源自中胚层谱系的内皮细胞形成脉管系统的壁 1,9。微血管 EC 彼此形成紧密连接，大大降低其膜的通透性10、11、12、13、14，同时表达转运蛋白以促进营养物质进出中枢神经系统1、4、12、14.微血管 EC 被周细胞 （PC） 壁细胞包围，这些细胞调节微血管功能和稳态，对于调节 BBB 对分子和免疫细胞的通透性至关重要 15,16,17。星形胶质细胞是一种主要的神经胶质细胞类型，是构成血脑屏障的最终细胞类型。星形胶质细胞端脚缠绕在 EC-PC 血管管周围，而细胞体延伸到脑实质，在神经元和脉管系统之间形成连接1。不同的溶质和底物转运蛋白位于星形胶质细胞端脚（例如水通道蛋白 4 [AQP-4]）上，这些转运蛋白在 BBB 功能中起关键作用18、19、20、21。
血脑屏障对于维持正常的大脑健康功能至关重要，许多神经系统疾病都报告了血脑屏障的功能障碍，包括阿尔茨海默病 （AD）22、23、24、25、多发性硬化症7、26、27、28、癫痫29、30 和中风31,32.人们越来越认识到，脑血管异常在神经退行性变中起着核心作用，导致对缺血和出血事件的易感性增加。例如，超过 90% 的 AD 患者患有脑淀粉样血管病 （CAA），其特征是淀粉样蛋白 β （Aβ） 沿脑血管系统沉积。CAA 增加 BBB 通透性并降低 BBB 功能，使中枢神经系统容易出现缺血、出血事件和加速认知能力下降33。
我们最近开发了一种人类血脑屏障的 体外 模型，该模型源自患者诱导的多能干细胞，其中包含封装在 3D 基质中的 EC、PC 和星形胶质细胞（图 1A）。iBBB 概括了生理相关的相互作用，包括血管管的形成和星形胶质细胞端足与脉管系统的定位 24。我们应用 iBBB 来模拟 APOE4 介导的 CAA 的易感性（图 1B）。这使我们能够确定 APOE4 促进 CAA 的因果细胞和分子机制，并利用这些见解开发治疗策略，以减少 CAA 病理学并改善 APOE4 小鼠 体内 的学习和记忆24。在这里，我们提供了一个详细的实验方案和视频教程，用于从人iPSCs重建BBB并在 体外对CAA进行建模。
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Protocol
1. 将 iPSC 分化为 iBBB 细胞
注：这些分化方案先前已在Mesentier-Louro等人34中描述过。
- 包被细胞培养板
- 在4°C下解冻还原生长因子（GF）膜基质过夜。 在 49.5 mL DMEM 中稀释 500 μL 基底膜基质。保持该溶液低温，以防止涂层溶液过早聚合。
- 每孔加入 1-2 mL 的 6 孔组织培养处理板。在用适当的加热培养基替换之前，将包衣溶液在37°C下保持至少20分钟。
- 人 iPSC 分化为 ETV2 诱导的内皮细胞
时间：8天
注意：该协议改编自Blanchard等人24 和Qian等人35。我们使用转录因子 ETV2 的多西环素诱导表达，如 Wang 等人 36 所述来提高产量。通过 PiggyBac 质粒引入 ETV2，然后转染细胞。- 在无饲养层的多能干细胞培养基中，在还原的GF基底膜基质包被板上培养iPSC，直到细胞达到~70%的汇合度。
注意：我们建议通过选择PiggyBac质粒（即嘌呤霉素）来维持诱导型iPSC - 第0天： 用蛋白酶 - 胶原酶混合物解离细胞5分钟。将解离的细胞转移到锥形管中，蛋白酶 - 胶原酶混合物与干细胞培养基的比例为1：3。在300× g 下旋转细胞3分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以 20,800 个细胞/cm2 的平板铺在补充有 10 μM Y27632 的干细胞培养基中的还原 GF 基底膜包被板上。
- 第一天： 用 DeSR1 [DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂、1x 最低必需培养基非必需氨基酸 （MEM-NEAA）、1% 青霉素-链霉素 （P/S）] 替换培养基，补充有 10 ng/mL BMP4、6 μM CHIR99021 和 5 μg/mL 多西环素。
- 第三天： 用补充有 5 μg/mL 多西环素的 DeSR2 [DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂、1x MEM-NEAA、1x N-2、1x B-27、1% P/S] 替换培养基。
- 第五天： 用补充有 50 ng/mL VEGF-A、2 μM 毛喉素和 5 μg/mL 多西环素的 hECSR [人内皮无血清培养基、1x MEM-NEAA、1x B-27、1% P/S] 替换培养基。
- 第七天： 用补充有 50 ng/mL VEGF-A、2 μM 毛喉素和 5 μg/mL 多西环素的 hECSR 替换培养基。
- 第8天： 用蛋白酶-胶原酶混合物将 ECs 1：3 分开，并在补充有 50 ng/mL VEGF-A 和 5 μg/mL 多西环素的 hECSR 中重新接种到新鲜还原的 GF 基底膜基质包被板上。
注意：这是将 EC 封装到 iBBB 中以形成均匀脉管系统的最佳时间点。 - 第10+天： 每 2-3 天用补充有 50 ng/mL VEGF-A 和 5 μg/mL 多西环素的 hECSR 喂养细胞。当平板汇合时，继续用蛋白酶 - 胶原酶混合物以1：3的比例分裂细胞。
注意：从第 8 天开始，iPSC 衍生的 EC 可以在任何时候冷冻。抬起细胞，仿佛要通过。将沉淀重悬于EC冷冻培养基[60%敲除血清替代物（KSR），30%hECSR，10%DMSO，50ng / mL VEGF-A和10μM Y27632]中，将细胞按1：3分开，并使用-80°C的冷冻容器冷冻。 在补充有 50 ng/mL VEGF-A、5 μg/mL 多西环素的 hECSR 中解冻到还原的 GF 基底膜基质包被板上。 - 使用针对CD31 / PECAM1或VE-钙粘蛋白的抗体通过免疫细胞化学确认脑微血管内皮细胞分化（图2A）。
- 在无饲养层的多能干细胞培养基中，在还原的GF基底膜基质包被板上培养iPSC，直到细胞达到~70%的汇合度。
- 人iPSC分化为周细胞
定时：6天
注意：该协议改编自Patsch等人36。- 在干细胞培养基中，在无饲养层条件下在还原的GF基底膜基质包被板上培养iPSC，直到细胞达到~70%的汇合度。
- 第0天： 用蛋白酶 - 胶原酶混合物解离细胞5分钟。将解离的细胞转移到锥形管中，蛋白酶 - 胶原酶混合物与干细胞培养基的比例为1：3。将细胞以300× g 旋转3分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以 37,000-40,000 个细胞/cm2 （取决于细胞系）铺板在补充有 10 μM Y27632 的干细胞培养基中的还原 GF 基底膜基质包被板上。
- 第一天： 用补充有 25 ng/mL BMP4 和 8 uM CHIR99021的 N2B27 [50% DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂、50% Neurobasal、1x MEM-NEAA、0.5x、谷氨酰胺补充剂、1x N-2、1x-B-27、1% P/S] 替换培养基。
- 第3-4天： 用补充有 2 ng/mL Activin A 和 10 ng/mL PDGF-BB 的 N2B27 替换培养基，并每天喂食。
- 第五天： 用蛋白酶 - 胶原酶混合物将PC分割，并接种到补充有10ng / mL PDGF-BB的N2B27中以35,000个细胞/cm 2 的0.1%明胶包被板上。
注意：只有汇合一次才能拆分单元格。有些线路可能需要几天时间才能准备好拆分;继续每天更换培养基，直到细胞汇合。 - 在补充有 10 ng/mL PDGF-BB 的 N2B27 中扩增 PC，每 2-3 天更换一次培养基。在细胞再次汇合并进行第二次传代后，从培养基中除去PDGF-BB。
注意：周细胞在第二次传代后即可用于 iBBB。扩展后，PC 可以被冻结。将细胞抬起，仿佛传代，将细胞沉淀重悬于冷冻培养基[90%KSR和10%DMSO]中，并使用-80°C的冷冻容器冷冻。 在 N2B27 中以 35,000 个细胞/cm2 解冻到 0.1% 明胶包被的板上。 - 使用抗PDGFRB和NG2的抗体通过免疫细胞化学确认周细胞分化（图2B）。
- 人类 iPSC 分化为神经祖细胞 （NPC） 和星形胶质细胞
时间：总共 45 天（NPC 为 15 天，星形胶质细胞为 30 天）
注：鼻咽癌分化方案改编自Chambers等人38，星形胶质细胞分化如TCW等人39所述。- 在干细胞培养基中，在无饲养层条件下在还原的GF基底膜基质包被板上培养iPSC，直到细胞达到~70%的汇合度。
- 用蛋白酶 - 胶原酶混合物解离细胞5分钟。将解离的细胞转移到锥形管中，蛋白酶 - 胶原酶混合物与干细胞培养基的比例为1：3。将细胞以300× g 旋转3分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以 100,000 个细胞/cm2 的浓度铺板放在补充有 10 μM Y27632 的干细胞培养基中的还原 GF 基底膜包被板上。
- 第二天更换干细胞培养基。每隔一天继续喂养细胞，直到它们达到 >95% 的汇合度（3-4 天，具体取决于细胞系）。
- NPC 第 0 天： 用补充有 10 μM SB43152 和 100 nM LDN193189的 N2B27 [50% DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂、50% Neurobasal、1x MEM-NEAA、0.5x、谷氨酰胺补充剂、1x N-2、1X-B-27、1% P/S] 替换培养基。
- NPC 第 1-9 天： 每天用补充有 10 μM SB43152 和 100 nM LDN193189的 N2B27 喂养细胞。
- NPC第10天： 将NPC与蛋白酶-胶原酶混合物1：3分开，并接种到补充有20ng / mL碱性FGF和10μM Y27632的N2B27中新鲜还原的GF基底膜基质包被板上。
- NPC 第 11 - 13 天： 每天用补充有 20 ng/mL 碱性 FGF 的 N2B27 喂养 NPC。
- NPC第14天： 将NPC与蛋白酶-胶原酶混合物1：3分开，并重新接种到补充有20ng / mL碱性FGF和10μM Y27632的N2B27中新鲜还原的GF基底膜基质包被板上。
- 鼻咽癌第 15 天/星形胶质细胞第 0 天： 这是星形胶质细胞分化的第 0 天。用完整的星形胶质细胞培养基（AM）喂养细胞。
注意：NPC 可以维持在补充有 20 ng/mL 碱性 FGF 的 N2B27 中，并在汇合时传代。为了冷冻NPC，将细胞沉淀重悬于冷冻培养基[90%KSR和10%DMSO]中，将细胞按1：3分开，并使用-80°C的冷冻容器冷冻。 解冻到补充有 20 ng/mL bFGF 和 10 μM Y27632 的 N2B27 中的还原 GF 基底膜基质包被板上。 - 星形胶质细胞第 1-30 天： 每 2-3 天用 AM 喂养细胞。当细胞>90%汇合时，使用蛋白酶-胶原酶混合物和板在AM中以15,000个细胞/cm 2 在新鲜还原的GF基底膜基质包被板上传代。
注意：星形胶质细胞应在 30 天内完全分化。星形胶质细胞可以在-80°C的冷冻容器中的冷冻培养基[90%KSR和10%DMSO]中冷冻。 在AM中以25,000-35,000个细胞/cm 2解冻到还原的GF基底膜基质包被板上。 - 使用针对 Nestin 和 SOX2 的抗体通过免疫细胞化学确认 NPC 分化。使用针对S100B和CD44的抗体通过免疫细胞化学确认星形胶质细胞分化（图2C）。
2. 组装 iBBB
- 在4°C下解冻还原生长因子（GF）基底膜基质过夜。 不要在DMEM中稀释该基质，因为iBBB封装在100%还原的GF基底膜基质中。每个 iBBB 需要 50 μL 的基质。
- 在37°C下用蛋白酶 - 胶原酶混合物解离分化的ECs5分钟。将解离的细胞转移到锥形管中，蛋白酶 - 胶原酶混合物与hECSR（人内皮无血清培养基，1x MEM-NEAA，1x B-27,1% P / S）的比例为1：3。将细胞以300× g 旋转3分钟。将细胞沉淀重悬于hECSR中。
注意：使用锥形管，15 mL 或 50 mL，其大小足以容纳解离细胞和培养基的体积。细胞也可以在多个试管中分裂，然后在重悬时重新组合。 - 将分化的PC与蛋白酶 - 胶原酶混合物在37°C下解离5分钟。将解离的细胞转移到锥形管中，蛋白酶 - 胶原酶混合物与N 2B27（50%DMEM / F12 +谷氨酰胺补充剂，50%神经基底，1x MEM-NEAA，0.5x谷氨酰胺补充剂，1x N-2,1x B-27,1%青霉素 - 链霉素[P / S]）。在300× g 下旋转细胞3分钟。将细胞沉淀重悬于N 2 B 27中。
- 在37°C下用蛋白酶 - 胶原酶混合物解离分化的星形胶质细胞5分钟。将解离的细胞转移到具有1：3比例的蛋白酶 - 胶原酶混合物的锥形管中，以完成星形胶质细胞培养基（AM）。以 300 × g 旋转细胞 3 分钟。将细胞沉淀重悬于AM中。
- 使用血细胞计数器，计数每种细胞类型。在适当的培养基中将每种类型的细胞悬液稀释至终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
- 将计算出的细胞数组合在锥形管中：50μL iBBB 需要 2.5 × 105 个 EC、5 × 10个 4 个 PC 和 5 个 × 104 个星形胶质细胞。比计算出的细胞数多 10%，以解决移液错误。将细胞混合物以300× g 旋转3分钟。
注意：强烈建议在2D单一培养物中对每种细胞类型的一些剩余细胞进行铺板，以固定和染色，以便对输入细胞进行质量控制。将每种细胞类型以 35,000 个细胞/cm2 的比例铺在先前制备的涂有还原 GF 基底膜基质的平板上，并在 3-4 天后固定。细胞类型特异性抗体见 表1 。 - 从细胞沉淀中抽出培养基，在细胞沉淀上方留下约 50 μL 的上清液。使用P200，轻轻地将细胞沉淀重悬于残留培养基中，以形成单细胞浆液。
- 将细胞浆液混合在补充有 10 ng/mL VEGF-A 的足够还原的 GF 基底膜基质中，以获得所需数量的 iBBB，每 iBBB 含有 50 μL 还原的 GF 基底膜基质，注意均匀混合细胞，同时不引入任何气泡。
注意：在此阶段将细胞和还原的GF基底膜基质保持在冰上以防止过早聚合至关重要。 - 将 50 μL 还原的 GF 基底膜基质混合物移液到 48 孔玻璃底培养皿的孔中。将体积均匀分布在整个培养皿底部（图1C）。
- 将iBBBs在37°C下孵育30-40分钟，以使还原的GF基底膜基质聚合，将细胞封装在基质中。
- 加入补充有 10 ng/mL VEGF-A、5 μg/mL 多西环素和 10 μM Y27632 的 500 μL AM。
- 第二天将培养基更换为补充有 10 ng/mL VEGF-A 的 AM。继续每 2-3 天更换一次培养基。2周后，停止补充VEGF-A;iBBB 可在 2 周后进行下游检测。
3. 用 Aβ 原纤维诱导脑淀粉样血管病 （CAA）
- 在PBS中以200μM制备淀粉样蛋白-β-40 和淀粉样蛋白-β 1-42 的储备溶液。
- 在 2 周的 iBBB 上将 Aβ 加入 iBBB 培养基中，终浓度为 20 nM。将细胞在补充Aβ的培养基中孵育96小时（4天）。
- 96小时后，取出培养基并继续固定（第4节）。
4. 固定和染色 iBBB
- 要固定iBBB，请除去培养基，在1mL PBS中洗涤，并在500μL 4%多聚甲醛中在4°C下孵育过夜。
- 除去 4% 多聚甲醛溶液，并在 1 mL PBS 中冲洗 4 x（至少）15 分钟。
- 在室温下轻轻摇动，将样品在0.3%PBST（含0.3%Triton X-100的PBS）中透化1小时。
- 将培养物在室温下在封闭缓冲液（0.3%PBST中的5%正常血清）中孵育至少1小时，轻轻摇动。
注意：使用的血清类型取决于所用二抗的宿主物种。例如，如果二抗的宿主物种是山羊，则使用正常的山羊血清;如果宿主物种是驴，则使用普通驴血清。这也可以在4°C下轻轻摇晃过夜。 - 在封闭缓冲液中将一抗稀释至推荐浓度或确定浓度。
- 用一抗稀释液代替封闭溶液。确保将 iBBB 完全浸没在抗体溶液中以均匀孵育;100-150 μL 足以在 48 孔玻璃底培养皿中覆盖 50 μL iBBB。在4°C下轻轻摇动孵育过夜。
- 取出一抗。在0.3%PBS中洗涤iBBB3×10-20分钟。
- 在封闭缓冲液中将二抗稀释至推荐浓度或确定浓度。此外，在二抗溶液中加入推荐或确定浓度的核染色剂（如赫斯特）。
- 用二抗稀释液替换最后一次 PBS 洗涤液。确保将 iBBB 完全浸没在抗体溶液中以均匀孵育;100-150 μL 足以在 48 孔玻璃底培养皿中覆盖 50 μL iBBB。在室温下孵育2小时，轻轻摇动。
注意：这也可以在4°C下轻轻摇晃过夜。 - 在 PBS 中洗涤 iBBB 4-5 次至少 1 小时。储存在4°C的PBS或防褪色封固剂中，直到样品成像。
- 要在倒置显微镜上成像，请将 iBBB 保存在玻璃底板或培养皿中。将玻璃盖玻片放在玻璃孔上以将 iBBB 固定到位（图 1D）。
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Representative Results
正确形成的iBBB凝固成单个半透明圆盘（图3A）。几天后，iBBB从首次移液的表面脱落是正常的。这是无法避免的，但如果在更换介质时小心不要意外吸出 iBBB，则这不是 iBBB 正确形成的主要问题。24小时后，均匀分布的单个细胞可以在明场显微镜下鉴定（图3B）。2周后，可以看到更明显的结构，尽管很难用定义来辨认（图3C）。
iBBB的质量很大程度上取决于输入细胞分化的质量。我们强烈建议将一些剩余的细胞接种在 2D 单一培养物中，以固定和染色细胞类型特异性标记物。由PECAM1或VE-cadherin阳性超过70%的内皮细胞形成的iBBB（图2A），PDGFRB阳性超过95%的周细胞（图2B），以及S100B和CD44阳性超过95%的星形胶质细胞（图2C）最适合成功的iBBB。这种质量检查的结果是高质量 iBBB 的最早指标。
生理相关的 3D 结构应在自组装 2 周后形成。在固定和染色后，我们看到了管状结构的证据，这些结构对内皮标志物PECAM1染色呈阳性，这对于紧密连接的形成至关重要（图4A）。iBBB形成的最大变异性是微血管系统形成的程度。在“最坏情况”情况下，内皮细胞网络看起来更加支离破碎或不延伸到整个 iBBB，而在“最佳情况”情况下，脉管系统是均匀的，并且在整个 iBBB 中分支。PECAM1阳性率超过70%的内皮细胞分化形成更一致的网络。此外，水通道蛋白-4是一种由星形胶质细胞表达的蛋白质，定位于星形胶质细胞端足，与PECAM1染色一致，表明星形胶质细胞延伸其端足以接触内皮细胞（图4B）。最后，我们期望在脉管系统周围看到周细胞（图4C）。
iBBB 中脑淀粉样血管病 （CAA） 的主要读数是淀粉样蛋白β （Aβ） 的存在。可以使用靶向抗体或通过接种荧光标记的 Aβ 来诱导 CAA 表型来测量 Aβ（图 5）。用 Aβ 处理 iBBB 应增加 Aβ 染色强度和面积，因为 BBB 的细胞不表达大量内源性 Aβ 蛋白。或者，可以用硫黄素T染色固定样品以检测淀粉样蛋白积累。Aβ水平取决于用于产生iBBB的干细胞的基因型，一些阿尔茨海默病和CAA相关的危险因素会增加Aβ积累和染色的量（图5B，C）24。
图 1：模拟脑淀粉样血管病的 体外 血脑屏障。 （A） iBBB组装和成熟的示意图。内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞从诱导多能干细胞分化后，细胞以单细胞悬浮液封装在凝胶基质中。在 2 周的过程中，细胞自组装成血管单元，类似于 体内鉴定的结构。（B）脑淀粉样血管病测定示意图。将淀粉样蛋白-β加入成熟的iBBB中96小时以诱导Aβ聚集。（C） 显示 iBBB 在玻璃底井中播种后的侧视图图。（D） 准备在倒置显微镜上成像的 iBBB 图形。缩写：BBB = 血脑屏障;iPSCs = 诱导多能干细胞;iBBB = 源自患者 iPSC 衍生的 BBB 模型的人 BBB 的 体外 模型，该模型包含封装在 3D 基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞;Aβ = 淀粉样蛋白-β。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：iPSC 来源的 iBBB 细胞的验证。 （A） 用 VE-钙粘蛋白（绿色）和 PECAM1（红色）染色的 2D 单培养物中内皮细胞的代表性最大强度投影。（B） 用 PDGFRB（绿色）和 NG2（红色）染色的 2D 单培养物中周细胞的代表性图像。（C） 用 CD44（上图;绿色）和 S100B（下图;图：图）染色的 2D 单培养物中星形胶质细胞的代表性图像。所有细胞核均用 Hoechst 33342 染色。图像是在尼康Eclipse Ti2-E上以20倍放大倍率（A，B）或徕卡Stellaris 8以40倍放大倍率（C）拍摄的。所有比例尺均为 100 μm。缩写：BBB = 血脑屏障;iPSCs = 诱导多能干细胞;iBBB = 源自患者 iPSC 衍生的 BBB 模型的人 BBB 的 体外 模型，该模型包含封装在 3D 基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞;VE-钙粘蛋白=血管内皮钙粘蛋白;PECAM1 = 血小板和内皮细胞粘附分子 1;PDGFRB = 血小板衍生生长因子受体β;NG2 = 神经元神经胶质抗原 2;S100B = S100 钙结合蛋白 β。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：iBBB 的组装。 （A） 15 μL iBBB 在 2 倍放大倍率下镀层 24 小时后的明场图像。（B） iBBB 在 10 倍放大倍率下镀层后 24 小时的明场图像。（C） 10 倍放大倍率下电镀 2 周后 iBBB 的明场图像。比例尺 = 1 mm （A），100 μm （B，C）。在倒置的尼康Eclipse Ts2R-FL上拍摄的图像。 缩写：BBB = 血脑屏障;iPSCs = 诱导多能干细胞;iBBB = 源自患者 iPSC 衍生的 BBB 模型的人 BBB 的 体外 模型，该模型包含封装在 3D 基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：iBBB 中的细胞相互作用。 iBBB 中内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的代表性图像。（A） 内皮细胞 （PECAM1） 和星形胶质细胞 （S100β）。（B） 内皮细胞 （PECAM1） 和星形胶质细胞端足 （AQP-4） 共定位。（C）内皮细胞（PECAM1）和周细胞（NG2）。所有细胞核均用 Hoechst 33342 染色。在徕卡 Stellaris 8 上以 20 倍放大倍率 （A，B） 或尼康 Eclipse Ti2-E 以 20 倍放大倍率 （C） 拍摄共聚焦 Z 堆栈图像。比例尺 = 200 μm （A），100 μm （B，C）。缩写：BBB = 血脑屏障;iPSCs = 诱导多能干细胞;iBBB = 源自患者 iPSC 衍生的 BBB 模型的人 BBB 的 体外 模型，该模型包含封装在 3D 基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞;PECAM1 = 血小板和内皮细胞粘附分子 1;AQP-4 = 水通道蛋白-4;NG2 = 神经元神经胶质抗原 2。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5： 体外脑淀粉样血管病。 （A） 暴露于来自对照或 Aβ 过表达神经元的条件培养基的非 AD iBBB。6e10 抗体可识别 Aβ。（B） 用 20 nM Aβ-FITC1-42 处理 96 小时的等基因 APOE3 和 APOE4 细胞系的 iBBB 的代表性图像。 （C） 用 20 nM Aβ-FITC1-40 或 Aβ-FITC1-42 处理的等基因 APOE3 和 APOE4 细胞系中 iBBB 中的淀粉样蛋白的定量。比例尺 = 50 μm （A），10 μm （B）。这个数字改编自 Blanchard 等人24。缩写：BBB = 血脑屏障;iPSCs = 诱导多能干细胞;iBBB = 源自患者 iPSC 衍生的 BBB 模型的人 BBB 的 体外 模型，该模型包含封装在 3D 基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞;Aβ = 淀粉样蛋白-β。APOE = 载脂蛋白 E。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 标记 | 公司 | 货号 | 稀释 | |
| 内皮细胞 | PECAM1 （CD31） | 安迪生物R&D | AF806型 | 1:500 |
| VE-钙粘蛋白 （CD144） | 研发系统 | AF938型 | 1:500 | |
| ZO-1型 | Invitrogen（英维特罗原） | 编号：MA3-39100-A488 | 1:500 | |
| 周细胞 | PDGFRβ型 | 安迪生物R&D | AF385型 | 1:500 |
| NG2型 | Abcam中文官网 | ab255811 | 1:500 | |
| 星形胶质细胞 | S100β型 | 西格玛-奥尔德里奇 | S2532-100毫升 | 1:500 |
| CD44型 | 细胞信号转导技术 | 3570年代 | 1:400 | |
| AQP-4型 | Invitrogen（英维特罗原） | PA5-53234型 | 1:300 | |
| GFAP的 | ||||
| ALDH1L1 | ||||
| EAAT1型 | ||||
| EAAT2型 | ||||
| 淀粉样蛋白-β | 6E10系列 | 生物传奇 | SIG-39320系列 | 1:1,000 |
| 硫黄素 T | 化学 Impex | 22870 | 25微米 |
表1：用于分化质量检查的推荐细胞标记物。 不同细胞类型的血脑屏障的细胞标记物，可用于检查分化质量并识别形成的 iBBB 中的细胞。本文中使用的标记以粗体显示。
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Discussion
血脑屏障功能障碍是许多神经系统疾病的合并症，并且可能是原因或加重因素7,40,41。然而，几乎不可能研究人类神经血管疾病患者血脑屏障功能障碍和分解的分子和细胞生物学。本方案中介绍的诱导型BBB（iBBB）提供了一个体外系统，该系统概括了BBB的重要细胞相互作用，包括血管管的形成和星形胶质细胞端足与脉管系统的定位。iBBB 可用于研究 BBB 功能障碍任何阶段涉及的分子通路，并且可以模拟神经血管疾病表型，例如淀粉样蛋白β聚集，如脑淀粉样血管病所示。
iBBB的组装很简单，尽管iBBB的质量高度依赖于所使用的iPSC衍生细胞的质量。虽然 iBBB 提供了一个可以促进组成细胞成熟的多细胞生态位，但每种细胞类型在封装之前都需要正确模式化。通过对单个单一培养物的细胞类型特异性标记物进行免疫荧光染色，对每个分化进行质量检查至关重要（表1）。每个 iPSC 系的行为都不同，可能需要根据经验确定某些条件，例如接种密度或每种图案培养基中的天数，以优化分化效率。
所述方案建议 50 μL 大小，但 iBBB 可以缩小到小至 5 μL，具体取决于细胞可用性、所需 iBBB 的数量和下游应用。较大的 iBBB 含有更多细胞，使其成为蛋白质、脂质或核酸采集的理想选择。较小的 iBBB 可以促进药物筛选或其他可扩展的检测。
iBBB是一种非常通用的工具，用于 在体外研究BBB。由于每种细胞类型都是独立分化的，因此 iBBB 可以从不同的遗传背景中组装而成，这使我们能够研究遗传风险因素如何影响特定细胞类型以导致 BBB 功能障碍。该策略用于表明 APOE4 是阿尔茨海默病和脑淀粉样血管病最常见的危险因素，部分通过周细胞特异性致病机制起作用24。进一步使用该工具将使我们能够剖析 EC、PC 和星形胶质细胞在维持 BBB 完整性方面的个体贡献，以及每种细胞类型在疾病发展过程中如何动摇。
目前，体外对 BBB 进行建模的最常见方法是使用 transwell 系统，接种 EC，有时与周细胞和/或星形胶质细胞共培养，以形成不透水的单层 42,43,44。iBBB 的 3D 结构使血管单元能够自组装，并允许形成更类似于生理性脉管系统的管状结构。如本方案所述，在孔板中接种iBBBs的一个缺点是，它们不会经历体内系统中恒流脉管系统引起的纯粹应力。为了克服这个问题，可以将iBBB接种到微流控芯片中，该芯片可以产生动态流45,46,47。该系统还可用于测试脉管系统通透性和小分子灌注。
总之，该方法提供了一个灵活的、3D的、iPSC衍生的血脑屏障模型，可以作为一个平台，在细胞水平上研究血脑屏障的无数方面，包括概括神经血管疾病表型的能力和筛选药物血脑屏障通透性的潜力，以实现广泛的应用。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH 3-UG3-NS115064-01、R01NS14239、治愈阿尔茨海默氏症基金会、NASA 80ARCO22CA004、Chan-Zuckerberg Initiative、MJFF/ASAP 基金会和美国脑损伤协会的支持。CG由NIH F31NS130909支持。 图 1A 是用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Activin A | Peprotech | 20-14E | |
| Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
| Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
| Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
| Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
| Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
| B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
| BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
| CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
| Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
| Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
| GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
| Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
| LDN193189 | Tocris | 6053 | |
| Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
| Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
| PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
| Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
| S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
| SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
| Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
| VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
| ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
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