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Neuroscience

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Abstract

La barrera hematoencefálica (BHE) es un componente fisiológico clave del sistema nervioso central (SNC), que mantiene los nutrientes, elimina los desechos y protege el cerebro de los patógenos. Las propiedades de barrera inherentes de la barrera hematoencefálica plantean un desafío para la administración de fármacos terapéuticos en el SNC para tratar enfermedades neurológicas. El deterioro de la función de la BHE se ha relacionado con enfermedades neurológicas. La angiopatía amiloide cerebral (AAC), el depósito de amiloide en la vasculatura cerebral que conduce a una BHE comprometida, es una comorbilidad en la mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer (EA), lo que sugiere que la disfunción o descomposición de la BHE puede estar involucrada en la neurodegeneración. Debido al acceso limitado al tejido humano de la BHE, los mecanismos que contribuyen a la función adecuada de la BHE y a la degeneración de la BHE siguen siendo desconocidos. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado una BHE derivada de células madre pluripotentes humanas (iBBB) mediante la incorporación de células endoteliales, pericitos y astrocitos en una matriz 3D. El iBBB se autoensambla para recapitular la anatomía y las interacciones celulares presentes en el BBB. La siembra de iBBB con amiloide captura aspectos clave de la AAC. Además, el iBBB ofrece una plataforma flexible para modular los factores genéticos y ambientales implicados en las enfermedades cerebrovasculares y la neurodegeneración, para investigar cómo la genética y el estilo de vida afectan el riesgo de enfermedad. Por último, el iBBB se puede utilizar para el cribado de fármacos y estudios de química médica para optimizar la administración terapéutica al SNC. En este protocolo, describimos la diferenciación de los tres tipos de células (células endoteliales, pericitos y astrocitos) que surgen de células madre pluripotentes humanas, cómo ensamblar las células diferenciadas en el iBBB y cómo modelar CAA in vitro utilizando amiloide exógeno. Este modelo supera el reto de estudiar tejido cerebral humano vivo con un sistema que tiene tanto fidelidad biológica como flexibilidad experimental, y permite interrogar la BHE humana y su papel en la neurodegeneración.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BHE) es una red microvascular clave que separa el sistema nervioso central (SNC) de la periferia para mantener un entorno ideal para una función neuronal adecuada. Tiene un papel fundamental en la regulación de la entrada y salida de sustancias en el SNC mediante el mantenimiento de la homeostasis metabólica 1,2,3,4, la eliminación de desechos 4,5,6 y la protección del cerebro de patógenos y toxinas 7,8.

El tipo de célula primaria de la BHE es la célula endotelial (CE). Las células endoteliales, derivadas del linaje del mesodermo, forman las paredes de la vasculatura 1,9. Las CE microvasculares forman uniones estrechas entre sí para disminuir en gran medida la permeabilidad de su membrana 10,11,12,13,14 mientras expresan transportadores para facilitar el movimiento de nutrientes dentro y fuera del SNC 1,4,12,14 . Las CE microvasculares están rodeadas por células murales de pericitos (PC) que regulan la función microvascular y la homeostasis y son fundamentales para regular la permeabilidad de la BHE a las moléculas y células inmunitarias 15,16,17. El astrocito, un tipo de célula glial importante, es el último tipo de célula que comprende la BHE. Los pies terminales de los astrocitos se envuelven alrededor de los tubos vasculares EC-PC, mientras que los cuerpos celulares se extienden hacia el parénquima cerebral, formando una conexión entre las neuronas y lavasculatura. En los extremos de los astrocitos (p. ej., acuaporina 4 [AQP-4]) se localizan distintos transportadores de solutos y sustratos que tienen un papel crítico en la función de la BHE 18,19,20,21.

La BHE es fundamental para mantener la función adecuada de la salud cerebral, y se ha descrito una disfunción de la BHE en muchas enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer (EA)22,23,24,25, la esclerosis múltiple 7,26,27,28, la epilepsia 29,30 y el accidente cerebrovascular31,32. Cada vez se reconoce más que las anomalías cerebrovasculares desempeñan un papel central en la neurodegeneración, contribuyendo a una mayor susceptibilidad a los eventos isquémicos y hemorrágicos. Por ejemplo, más del 90% de los pacientes con EA tienen angiopatía amiloide cerebral (AAC), una afección caracterizada por el depósito de β amiloide (Aβ) a lo largo de la vasculatura cerebral. La AAC aumenta la permeabilidad a la BHE y disminuye la función de la BHE, dejando al SNC vulnerable a la isquemia, los eventos hemorrágicos y el deterioro cognitivo acelerado33.

Recientemente hemos desarrollado un modelo in vitro de la BHE humana, derivado de células madre pluripotentes inducidas por el paciente, que incorpora CEs, PCs y astrocitos encapsulados en una matriz 3D (Figura 1A). El iBBB recapitula las interacciones fisiológicamente relevantes, incluyendo la formación del tubo vascular y la localización de los extremos de los astrocitos con la vasculatura24. Se aplicó el iBBB para modelar la susceptibilidad de la AAC mediada por APOE4 (Figura 1B). Esto nos permitió identificar los mecanismos celulares y moleculares causales por los cuales APOE4 promueve la AAC, y aprovechar estos conocimientos para desarrollar estrategias terapéuticas que reduzcan la patología de la AAC y mejoren el aprendizaje y la memoria in vivo en ratones APOE424. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado y un video tutorial para reconstruir la BHE a partir de iPSC humanas y modelar CAA in vitro.

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Protocol

1. Diferenciación de las iPSC en células iBBB

NOTA: Estos protocolos de diferenciación han sido descritos previamente en Mesentier-Louro et al.34.

  1. Recubrimiento de placas de cultivo celular
    1. Descongele la matriz de membrana del factor de crecimiento reducido (GF) durante la noche a 4 °C. Diluir 500 μL de matriz de membrana basal en 49,5 mL de DMEM. Mantenga esta solución fría para evitar la polimerización prematura de la solución de recubrimiento.
    2. Agregue 1-2 ml por pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 6 pocillos. Deje actuar la solución de recubrimiento durante al menos 20 minutos a 37 °C antes de sustituirla por el medio de cultivo calentado adecuado.
  2. Diferenciación de iPSCs humanas en células endoteliales inducibles por ETV2
    Duración: 8 días
    NOTA: Este protocolo es una adaptación de Blanchard et al.24 y Qian et al.35. Utilizamos la expresión inducible por doxiciclina del factor de transcripción ETV2, descrita por Wang et al.36 para mejorar el rendimiento. ETV2 se introdujo a través del plásmido PiggyBac y las células se transfectaron.
    1. Cultive iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre pluripotentes libres de alimentador hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
      NOTA: Recomendamos que las iPSC inducibles se mantengan con selección para el plásmido PiggyBac (es decir, puromicina)
    2. Día 0: Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Girar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 20.800 células/cm2 en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementado con 10 μM Y27632.
    3. Día 1: Reemplace el medio con DeSR1 [DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 1x Aminoácidos No Esenciales Mínimos del Medio Esencial (MEM-NEAA), 1% de penicilina-estreptomicina (P/S)], suplementado con 10 ng/mL de BMP4, 6 μM de CHIR99021 y 5 μg/mL de doxiciclina.
    4. Día 3: Reemplace el medio con DeSR2 [DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] suplementado con 5 μg/mL de doxiciclina.
    5. Día 5: Reemplace el medio con hECSR [medio libre de suero endotelial humano, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] suplementado con 50 ng/ml de VEGF-A, 2 μM de forskolina y 5 μg/ml de doxiciclina.
    6. Día 7: Reemplace el medio con hECSR suplementado con 50 ng/ml de VEGF-A, 2 μM de forskolina y 5 μg/ml de doxiciclina.
    7. Día 8: Dividir las EC 1:3 con una mezcla de proteasa y colagenasa y volver a sembrar en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en hECSR suplementadas con 50 ng/mL de VEGF-A y 5 μg/mL de doxiciclina.
      NOTA: Este es el mejor momento para encapsular las CE en iBBB para la formación uniforme de vasculaturas.
    8. Día 10+: Alimente las células cada 2-3 días con hECSR suplementado con 50 ng/mL de VEGF-A y 5 μg/mL de doxiciclina. Continúe dividiendo las células 1:3 con una mezcla de proteasa y colagenasa cuando las placas sean confluentes.
      NOTA: Los AE derivados de iPSC se pueden congelar en cualquier momento a partir del día 8. Levanta las celdas, como si fuera a pasar. Vuelva a suspender el gránulo en medio de congelación EC [60 % de reemplazo de suero knockout (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml de VEGF-A y 10 μM Y27632], dividiendo las células 1:3, y congele utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongele en placas recubiertas de matriz de membrana basal reducida de GF en hECSR suplementadas con 50 ng/mL DE VEGF-A, 5 μg/mL de doxiciclina.
    9. Confirmar la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra CD31/PECAM1 o VE-cadherina (Figura 2A).
  3. Diferenciación de las iPSCs humanas en pericitos
    Duración: 6 días
    NOTA: Este protocolo fue adaptado de Patsch et al.36.
    1. Cultivo de iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en condiciones libres de alimentador en medio de células madre hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
    2. Día 0: Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 37.000-40.000 células/cm2 (dependiendo de la línea celular) en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementado con 10 μM Y27632.
    3. Día 1: Reemplace el medio con N2B27 [50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, suplemento de glutamina, 1x N-2, 1x-B-27, 1% P/S] suplementado con 25 ng/mL de BMP4 y 8 uM CHIR99021.
    4. Días 3-4: Reemplace el medio con N2B27 suplementado con 2 ng/mL de Activina A y 10 ng/mL DE PDGF-BB, y aliméntelo diariamente.
    5. Día 5: Divida los PC con una mezcla de proteasa y colagenasa y la semilla en placas recubiertas de gelatina al 0,1% a 35.000 células/cm2 en N2B27 suplementadas con 10 ng/ml de PDGF-BB.
      NOTA: Solo divida las celdas una vez que confluyan. Algunas líneas pueden requerir unos días más antes de que estén listas para dividirse; Continúe cambiando el medio diariamente hasta que las células sean confluentes.
    6. Amplíe los PC en N2B27 suplementados con 10 ng/ml de PDGF-BB, cambiando el medio cada 2-3 días. Retire el PDGF-BB del medio después de que las células vuelvan a alcanzar la confluencia y se sometan a un segundo paso.
      NOTA: Los pericitos están listos para ser utilizados en iBBB después del segundo paso. Una vez expandidos, los PC se pueden congelar. Levantar las celdas como si fueran a pasar, volver a suspender el gránulo de celda en medios de congelación [90% KSR y 10% DMSO] y congelar utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongelar en placas recubiertas de gelatina al 0,1% a 35.000 células/cm2 en N2B27.
    7. Confirmar la diferenciación pericitaria mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra PDGFRB y NG2 (Figura 2B).
  4. Diferenciación de iPSCs humanas en células progenitoras neurales (NPCs) y astrocitos
    Tiempo: 45 días en total (15 días para los NPC seguidos de 30 días para los astrocitos)
    NOTA: El protocolo de diferenciación de NPC fue adaptado de Chambers et al.38, y la diferenciación de astrocitos es la descrita en TCW et al.39.
    1. Cultivo de iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en condiciones libres de alimentador en medio de células madre hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
    2. Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 100.000 células/cm2 en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementadas con 10 μM Y27632.
    3. Reemplace el medio de células madre al día siguiente. Continúe alimentando las células cada dos días hasta que alcancen el >95% de confluencia (3-4 días dependiendo de la línea celular).
    4. Día 0 de los PNJ: Sustituya el medio por N2B27 [50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, suplemento de glutamina, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S] suplementado con 10 μM SB43152 y 100 nM LDN193189.
    5. Días 1-9 de NPC: Alimente las células diariamente con N2B27 suplementado con 10 μM SB43152 y 100 nM LDN193189.
    6. NPC Día 10: Divida las NPC 1:3 con la mezcla de proteasa-colagenasa y semillas en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en N2B27 suplementadas con 20 ng/mL de FGF-básico y 10 μM de Y27632.
    7. Días 11 - 13 de NPC: Alimenta a los NPC diariamente con N2B27 suplementado con 20 ng/mL de FGF-básico.
    8. Día 14 del PNJ: Dividir las NPC 1:3 con la mezcla de proteasa-colagenasa y resembrar en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en N2B27 suplementadas con 20 ng/mL de FGF-básico y 10 μM de Y27632.
    9. NPC Día 15/Astrocito Día 0: Este es el día 0 de la diferenciación de los astrocitos. Alimente las células con medio de astrocitos completo (AM).
      NOTA: Los NPC se pueden mantener en N2B27 complementados con 20 ng/mL de FGF-básico y pasar cuando son confluentes. Para congelar los NPC, vuelva a suspender el gránulo de la célula en un medio de congelación [90% KSR y 10% DMSO], divida las células 1:3 y congele utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongele en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en N2B27 suplementadas con 20 ng/ml de bFGF y 10 μM de Y27632.
    10. Astrocitos Días 1-30: Alimente las células cada 2-3 días con AM. Cuando las células son >90% confluentes, pase usando la mezcla de proteasa-colagenasa y placa a 15.000 células/cm2 en placas frescas reducidas de la membrana basal GF recubiertas de matriz en la AM.
      NOTA: Los astrocitos deben estar completamente diferenciados en 30 días. Los astrocitos se pueden congelar en medios de congelación [90% KSR y 10% DMSO] en un recipiente de congelación a -80 °C. Descongelar en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en AM a 25.000-35.000 células/cm2.
    11. Confirmar la diferenciación de NPC mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra Nestin y SOX2. Confirmar la diferenciación de astrocitos por inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra S100B y CD44 (Figura 2C).

2. Montaje del iBBB

  1. Descongele la matriz de la membrana basal del factor de crecimiento reducido (GF) durante la noche a 4 °C. No diluya esta matriz en DMEM, ya que los iBBB están encapsulados en una matriz de membrana basal GF reducida al 100%. Cada iBBB requiere 50 μL de la matriz.
  2. Disociar las CE diferenciadas con una mezcla de proteasa y colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa a hECSR (medio libre de suero endotelial humano, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular en hECSR.
    NOTA: Utilice un tubo cónico, ya sea de 15 ml o 50 ml, que sea lo suficientemente grande como para acomodar el volumen de células disociadas más los medios. Las células también pueden dividirse en varios tubos y luego recombinarse tras la resuspensión.
  3. Disociar los PC diferenciados con la mezcla de proteasa-colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa a N2B27 (50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x suplemento de glutamina, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicilina-estreptomicina [P/S]). Girar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular en N2B27.
  4. Disociar los astrocitos diferenciados con la mezcla proteasa-colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa para completar el medio de astrocitos (AM). Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo de celda en AM.
  5. Con un hemocitómetro, cuente cada tipo de célula. Diluir cada tipo de suspensión celular hasta una concentración final de 1 × 106 células/ml en el medio adecuado.
  6. Combine el número calculado de células para cada tipo de célula en un tubo cónico: 50 μL de iBBB requieren 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC y 5 × 104 astrocitos. Incluya un 10 % más que el número calculado de celdas para tener en cuenta los errores de pipeteo. Centrifugar la mezcla de células a 300 × g durante 3 min.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente sembrar algunas células sobrantes de cada tipo de célula en monocultivos 2D para fijarlas y teñirlas para el control de calidad de las células de entrada. Colocar cada tipo de célula a 35.000 células/cm2 en placas previamente preparadas recubiertas con matriz reducida de membrana basal GF y fijar después de 3-4 días. Consulte la Tabla 1 para ver los anticuerpos específicos del tipo celular.
  7. Aspire el medio del gránulo de la célula dejando aproximadamente 50 μL del sobrenadante por encima del gránulo de la célula. Con un P200, vuelva a suspender suavemente el gránulo de celda en medio residual para crear una suspensión de una sola celda.
  8. Mezcle la suspensión celular en una matriz de membrana basal de GF reducida suficiente suplementada con 10 ng/ml de VEGF-A para obtener el número deseado de iBBB a 50 μl de matriz de membrana basal de GF reducida por iBBB, teniendo cuidado de mezclar las células de manera homogénea sin introducir burbujas de aire.
    NOTA: Es fundamental mantener las células y la matriz de la membrana basal reducida de GF en hielo en esta etapa para evitar la polimerización prematura.
  9. Pipetear 50 μL de mezcla reducida de matriz de membrana basal GF en el pocillo de una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Distribuya el volumen uniformemente por todo el fondo del plato (Figura 1C).
  10. Incubar los iBBB a 37 °C durante 30-40 min para permitir que la matriz reducida de la membrana basal GF se polimerice, encapsulando las células en la matriz.
  11. Añadir 500 μL de AM suplementado con 10 ng/mL DE VEGF-A, 5 μg/mL de doxiciclina y 10 μM de Y27632.
  12. Cambie el medio al día siguiente a AM suplementado con 10 ng/mL de VEGF-A. Continúe cambiando el medio cada 2-3 días. Después de 2 semanas, deje de tomar suplementos de VEGF-A; Los iBBB están listos para los ensayos posteriores después de 2 semanas.

3. Inducción de angiopatía amiloide cerebral (AAC) con fibrillas Aβ

  1. Preparar soluciones madre de amiloide-β1-40 y amiloide-β1-42 a 200 μM en PBS.
  2. Añadir Aβ al medio iBBB en iBBB de 2 semanas hasta una concentración final de 20 nM. Incubar las células en medio suplementado con Aβ durante 96 h (4 días).
  3. Después de 96 h, retire el medio y continúe con la fijación (sección 4).

4. Fijación y tinción del iBBB

  1. Para fijar el iBBB, retire el medio, lave en 1 ml de PBS e incube en 500 μl de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.
  2. Retire la solución de paraformaldehído al 4% y enjuague durante 4 x (al menos) 15 minutos en 1 ml de PBS.
  3. Permeabilizar las muestras en PBST al 0,3 % (PBS con Triton X-100 al 0,3 %) durante 1 h a temperatura ambiente con una agitación suave.
  4. Incubar los cultivos en tampón de bloqueo (suero normal al 5 % en PBST al 0,3 %) a temperatura ambiente durante al menos 1 h con una agitación suave.
    NOTA: El tipo de suero utilizado depende de la especie huésped de los anticuerpos secundarios utilizados. Por ejemplo, si la especie huésped de los anticuerpos secundarios es la cabra, utilice suero de cabra normal; Si la especie huésped es un burro, use suero de burro normal. Esto también se puede hacer durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
  5. Diluir los anticuerpos primarios a la concentración recomendada o determinada en el tampón de bloqueo.
  6. Reemplace la solución de bloqueo con la dilución de anticuerpos primarios. Asegúrese de que los iBBB estén completamente sumergidos en una solución de anticuerpos para una incubación uniforme; 100-150 μL es suficiente para cubrir una iBBB de 50 μL en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Incubar durante la noche a 4 °C agitando suavemente.
  7. Extirpar el anticuerpo primario. Lave los iBBB durante 3 x 10-20 min en PBS al 0,3%.
  8. Diluir el anticuerpo secundario a la concentración recomendada o determinada en tampón de bloqueo. Además, agregue una tinción nuclear, como Hoechst, a la solución de anticuerpos secundarios a la concentración recomendada o determinada.
  9. Reemplace el último lavado de PBS con la dilución secundaria de anticuerpos. Asegúrese de que los iBBB estén completamente sumergidos en una solución de anticuerpos para una incubación uniforme; 100-150 μL es suficiente para cubrir una iBBB de 50 μL en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h agitando suavemente.
    NOTA: Esto también se puede hacer durante la noche a 4 °C agitando suavemente.
  10. Lave los iBBB 4-5 veces durante al menos 1 hora por lavado en PBS. Almacenar en PBS o en medios de montaje antidecoloración a 4 °C hasta que se obtengan imágenes de las muestras.
  11. Para obtener imágenes en un microscopio invertido, mantenga los iBBB en platos o platos con fondo de vidrio. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre el cubreobjetos de vidrio para mantener los iBBB en su lugar (Figura 1D).

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Representative Results

Un iBBB correctamente formado se solidifica en un solo disco translúcido (Figura 3A). Es normal que el iBBB se desprenda de la superficie sobre la que se pipeteó por primera vez después de unos días. Esto no se puede evitar, pero no es una preocupación importante para la formación adecuada de la iBBB si se tiene cuidado al cambiar el medio para no aspirar accidentalmente la iBBB. Después de 24 h, distribuidas uniformemente, se pueden identificar células individuales bajo un microscopio de campo claro (Figura 3B). Después de 2 semanas, pueden ser visibles estructuras más distintas, aunque es difícil distinguirlas con definición (Figura 3C).

La calidad del iBBB depende en gran medida de la calidad de la diferenciación de las celdas de entrada. Recomendamos encarecidamente sembrar algunas células sobrantes en monocultivos 2D para fijar y teñir marcadores específicos del tipo de célula. Las iBBB formadas a partir de células endoteliales que son positivas en más del 70% para PECAM1 o VE-cadherina (Figura 2A), los pericitos con más del 95% de positividad para PDGFRB (Figura 2B) y los astrocitos con más del 95% de positividad para S100B y CD44 (Figura 2C) son los mejores para las iBBB exitosas. Los resultados de este control de calidad son el primer indicador de iBBB de alta calidad.

Las estructuras 3D fisiológicamente relevantes deben formarse después de 2 semanas de autoensamblaje. Tras la fijación y la tinción, vemos evidencia de estructuras en forma de tubo que dan positivo para el marcador endotelial PECAM1, que es fundamental para la formación de uniones estrechas (Figura 4A). La mayor variabilidad en la formación de iBBB es la extensión de la formación de microvasculaturas. En el "peor de los casos", la red de células endoteliales parece más fragmentada o no se extiende por toda la iBBB, mientras que en el "mejor de los casos", la vasculatura es uniforme y se ramifica a lo largo de la iBBB. La diferenciación de las células endoteliales que es superior al 70% positiva para PECAM1 forma redes más consistentes. Además, la acuaporina-4, una proteína expresada por los astrocitos que se localiza en los extremos de los astrocitos, se alinea con la tinción de PECAM1, lo que indica que los astrocitos extienden sus extremos para contactar con las células endoteliales (Figura 4B). Por último, esperamos ver pericitos alrededor de la vasculatura (Figura 4C).

La lectura principal de la angiopatía amiloide cerebral (AAC) en las BBB es la presencia de β amiloide (Aβ). El Aβ puede medirse utilizando anticuerpos dirigidos o mediante la siembra de Aβ marcado con fluorescencia para inducir fenotipos de CAA (Figura 5). El tratamiento de las BBB con Aβ debe aumentar la intensidad y el área de tinción de Aβ, ya que las células de la BHE no expresan una gran cantidad de proteína Aβ endógena. Alternativamente, las muestras fijas se pueden teñir con tioflavina T para detectar la acumulación de amiloide. Los niveles de Aβ dependen del genotipo de las células madre utilizadas para generar la iBBB, y algunos factores de riesgo asociados a la enfermedad de Alzheimer y a la AAC aumentan la cantidad de acumulación y tinción de Aβ (Figura 5B, C)24.

Figure 1
Figura 1: Una barrera hematoencefálica in vitro para modelar la angiopatía amiloide cerebral. (A) Representación esquemática del ensamblaje y maduración de iBBB. Después de la diferenciación de las células endoteliales, astrocitos y pericitos de las células madre pluripotentes inducidas, las células se encapsulan en una matriz de gel en una suspensión unicelular. En el transcurso de 2 semanas, las células se autoensamblan en unidades vasculares, similares a las estructuras identificadas in vivo. (B) Esquema del ensayo de angiopatía amiloide cerebral. Se añade amiloide-β a las iBBB maduras durante 96 h para inducir la agregación de Aβ. (C) Diagrama que muestra la vista lateral de un iBBB después de la siembra en un pozo con fondo de vidrio. (D) Un gráfico de un iBBB preparado para la obtención de imágenes en un microscopio invertido. Abreviaturas: BHE = barrera hematoencefálica; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iBBB = un modelo in vitro de la BHE humana derivado de un modelo de BHE derivado de iPSC de paciente, que incorpora células endoteliales, pericitos y astrocitos encapsulados en una matriz 3D; Aβ = amiloide-β. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Validación de células iBBB derivadas de iPSC. (A) Proyección representativa de la intensidad máxima de las células endoteliales en monocultivos 2D teñidos con VE-cadherina (verde) y PECAM1 (rojo). (B) Imágenes representativas de pericitos en monocultivos 2D teñidos con PDGFRB (verde) y NG2 (rojo). (C) Imágenes representativas de astrocitos en monocultivos 2D teñidos con CD44 (arriba; verde) y S100B (abajo; verde). Todos los núcleos se tiñen con Hoechst 33342. Las imágenes se tomaron con una Nikon Eclipse Ti2-E con un aumento de 20x (A,B) o una Leica Stellaris 8 con un aumento de 40x (C). Todas las barras de escala son de 100 μm. Abreviaturas: BHE = barrera hematoencefálica; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iBBB = un modelo in vitro de la BHE humana derivado de un modelo de BHE derivado de iPSC de paciente, que incorpora células endoteliales, pericitos y astrocitos encapsulados en una matriz 3D; VE-cadherina = cadherina endotelial vascular; PECAM1 = molécula de adhesión plaquetaria y de células endoteliales 1; PDGFRB = receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas; NG2 = antígeno glial neuronal 2; S100B = proteína beta de unión al calcio S100. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Montaje del iBBB. (A) Imagen de campo claro de un iBBB de 15 μL 24 h después del recubrimiento con un aumento de 2x. (B) Imagen de campo claro de un iBBB 24 h después del enchapado con un aumento de 10x. (C) Imagen de campo claro de un iBBB 2 semanas después del recubrimiento con un aumento de 10x. Barra de escala = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Imágenes tomadas con una Nikon Eclipse Ts2R-FL invertida. Abreviaturas: BBB = barrera hematoencefálica; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iBBB = un modelo in vitro de la BHE humana derivado de un modelo de BHE derivado de iPSC del paciente, que incorpora células endoteliales, pericitos y astrocitos encapsulados en una matriz 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Interacciones celulares en el iBBB. Imágenes representativas de células endoteliales, pericitos y astrocitos en la iBBB. (A) Células endoteliales (PECAM1) y astrocitos (S100β). (B) Colocalización de células endoteliales (PECAM1) y terminales de astrocitos (AQP-4). (C) células endoteliales (PECAM1) y pericitos (NG2). Todos los núcleos se tiñen con Hoechst 33342. Las imágenes confocales de la pila Z se tomaron con una Leica Stellaris 8 con un aumento de 20x (A,B) o una Nikon Eclipse Ti2-E con un aumento de 20x (C). Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Abreviaturas: BHE = barrera hematoencefálica; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iBBB = un modelo in vitro de la BHE humana derivado de un modelo de BHE derivado de iPSC de paciente, que incorpora células endoteliales, pericitos y astrocitos encapsulados en una matriz 3D; PECAM1 = molécula de adhesión plaquetaria y de células endoteliales 1; AQP-4 = acuaporina-4; NG2 = antígeno glial neuronal 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Angiopatía amiloide cerebral in vitro. (A) iBBBs no AD expuestas a medios condicionados de neuronas de control o de sobreexpresión de Aβ. El anticuerpo 6e10 reconoce Aβ. (B) Imágenes representativas de iBBBs de líneas celulares isogénicas APOE3 y APOE4 tratadas con 20 nM Aβ-FITC1-42 durante 96 h. (C) Cuantificación de amiloide en iBBBs a partir de líneas celulares isogénicas APOE3 y APOE4 tratadas con 20 nM Aβ-FITC1-40 o Aβ-FITC1-42. Barras de escala = 50 μm (A), 10 μm (B). Esta figura fue adaptada de Blanchard et al24. Abreviaturas: BHE = barrera hematoencefálica; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iBBB = un modelo in vitro de la BHE humana derivado de un modelo de BHE derivado de iPSC de paciente, que incorpora células endoteliales, pericitos y astrocitos encapsulados en una matriz 3D; Aβ = amiloide-β. APOE = ApolipoproteínaE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Marcadores Compañía Número de catálogo Dilución
Células endoteliales PECAM1 (CD31) Sistemas de investigación y desarrollo AF806 1:500
VE-cadherina (CD144) Sistemas de investigación y desarrollo AF938 1:500
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Pericitos PDGFRβ Sistemas de investigación y desarrollo AF385 1:500
NG2 Abcam AB255811 1:500
Astrocitos S100β Sigma-Aldrich S2532-100uL 1:500
CD44 Tecnología de señalización celular 3570S 1:400
AQP-4 Invitrogen PA5-53234 1:300
GFAP
ALDH1L1
EAAT1
EAAT2
Amiloide-β 6e10 Bioleyenda SIG-39320 1:1,000
Tioflavina T Químico Impex 22870 25 μM

Tabla 1: Marcadores celulares recomendados para controles de calidad de diferenciación. Marcadores celulares para los diferentes tipos celulares de la BHE que se pueden utilizar para comprobar la calidad de las diferenciaciones y para identificar las células de la iBBB formada. Los marcadores utilizados en este documento están en negrita.

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Discussion

La disfunción de la BHE es una comorbilidad y, potencialmente, una causa o factor exacerbante en numerosas enfermedades neurológicas 7,40,41. Sin embargo, es casi imposible estudiar la biología molecular y celular que subyace a la disfunción y la degradación de la BHE en humanos con enfermedad neurovascular. La BHE inducible (iBBB) presentada en este protocolo proporciona un sistema in vitro que recapitula importantes interacciones celulares de la BHE, incluida la formación del tubo vascular y la localización de los astrocitos en los extremos de los pies con la vasculatura. La iBBB se puede utilizar para estudiar las vías moleculares implicadas en cualquier etapa de la disfunción de la BHE y puede modelar los fenotipos de enfermedades neurovasculares, como la agregación de β amiloide, como se observa en la angiopatía amiloide cerebral.

El montaje de las iBBB es sencillo, aunque la calidad de las iBBB depende en gran medida de la calidad de las células derivadas de iPSC que se utilizan. Si bien el iBBB proporciona un nicho multicelular que puede promover la maduración de las células componentes, cada tipo de célula debe tener un patrón adecuado antes de encapsularse. Es fundamental realizar controles de calidad en cada diferenciación mediante la realización de tinciones de inmunofluorescencia para marcadores específicos de tipo celular en los monocultivos individuales (Tabla 1). Cada línea de iPSC se comporta de manera diferente y es posible que algunas condiciones, como la densidad de siembra o el número de días en cada medio de modelado, deban determinarse empíricamente y ajustarse para optimizar la eficiencia de la diferenciación.

El protocolo descrito sugiere un tamaño de 50 μL, pero la iBBB puede reducirse a tan solo 5 μL, dependiendo de la disponibilidad de células, el número de iBBB deseados y la aplicación posterior. Las iBBB más grandes contienen más células, lo que las hace ideales para la recolección de proteínas, lípidos o ácidos nucleicos. Los iBBB más pequeños pueden facilitar la detección de drogas u otros ensayos escalables.

El iBBB es una herramienta muy versátil para el estudio de la BHE in vitro. Debido a que cada tipo de célula se diferencia de forma independiente, las iBBB se pueden ensamblar a partir de diferentes antecedentes genéticos, lo que nos permite estudiar cómo los factores de riesgo genéticos afectan a tipos celulares específicos para contribuir a la disfunción de la BBB. Esta estrategia se aplicó para demostrar que la APOE4, el factor de riesgo más común para la enfermedad de Alzheimer y la angiopatía amiloide cerebral, actúa en parte a través de un mecanismo patogénico específicamente en los pericitos24. Un uso más detallado de esta herramienta nos permitiría diseccionar las contribuciones individuales de las CE, las CP y los astrocitos en el mantenimiento de la integridad de la BHE y cómo cada tipo de célula flaquea durante el desarrollo de la enfermedad.

En la actualidad, el método más común de modelización in vitro de la BHE es mediante el uso de un sistema transwell, sembrado con CEs, y a veces co-cultivado con pericitos y/o astrocitos, para formar una monocapa impermeable 42,43,44. La estructura 3D de la iBBB permite el autoensamblaje de la unidad vascular y permite la formación de estructuras tubulares que se asemejan más a la vasculatura fisiológica. Un inconveniente de sembrar iBBB en una placa de pocillo, como se describe en este protocolo, es que no experimentan las tensiones causadas por la vasculatura de flujo constante en un sistema in vivo. Para superar esto, el iBBB se puede sembrar en un chip microfluídico que puede generar un flujo dinámico 45,46,47. Este sistema también se puede utilizar para probar la permeabilidad de la vasculatura y la perfusión de moléculas pequeñas.

En conclusión, este método proporciona un modelo flexible, 3D y derivado de iPSC de la BHE que se puede utilizar como plataforma para estudiar innumerables aspectos de la BHE a nivel celular, incluida la capacidad de recapitular los fenotipos de enfermedades neurovasculares y el potencial para detectar la permeabilidad de la BHE a los fármacos para una amplia gama de aplicaciones.

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Disclosures

Los autores no reportan conflictos de interés.

Acknowledgments

Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation y Brain Injury Association of America. C.G. cuenta con el apoyo de NIH F31NS130909. La Figura 1A se creó con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

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Barrera Hematoencefálica SNC Enfermedad Neurológica Administración Terapéutica de Fármacos Función BBB Angiopatía Amiloide Cerebral Enfermedad de Alzheimer Neurodegeneración Células Madre Pluripotentes Humanas Células Endoteliales Pericitos Astrocitos Matriz 3D IBBB Depósito de Amiloide Enfermedad Cerebrovascular Factores Genéticos Factores Ambientales Detección de Drogas Focalización Médica
Reconstrucción de la barrera hematoencefálica <em>in vitro</em> para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica
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