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Neuroscience

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

Abstract

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)의 핵심 생리학적 구성 요소로, 영양분을 유지하고 노폐물을 제거하며 병원균으로부터 뇌를 보호합니다. BBB의 고유한 장벽 특성은 신경 질환을 치료하기 위해 CNS로의 치료 약물 전달에 어려움을 제기합니다. BBB 기능 장애는 신경 질환과 관련이 있습니다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 대뇌 혈관에 아밀로이드가 침착되어 BBB가 손상되는 현상으로, 알츠하이머병(AD)의 대부분의 경우 동반 질환으로, BBB 기능 장애 또는 고장이 신경 퇴행에 관여할 수 있음을 시사합니다. 인간 BBB 조직에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 적절한 BBB 기능과 BBB 변성에 기여하는 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 3D 매트릭스에 통합하여 인간 만능 줄기 세포 유래 BBB(iBBB)를 개발했습니다. iBBB는 BBB에 존재하는 해부학적 구조와 세포 상호 작용을 요약하기 위해 자체 조립됩니다. iBBB에 아밀로이드를 파종하면 CAA의 주요 측면을 포착할 수 있습니다. 또한 iBBB는 뇌혈관 질환 및 신경 퇴행과 관련된 유전적 및 환경적 요인을 조절하여 유전학 및 생활 방식이 질병 위험에 미치는 영향을 조사할 수 있는 유연한 플랫폼을 제공합니다. 마지막으로, iBBB는 중추신경계에 대한 치료 전달을 최적화하기 위해 약물 스크리닝 및 의약 화학 연구에 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 인간 만능줄기세포에서 발생하는 3가지 유형의 세포(내피세포, 주위세포, 성상교세포)의 분화, 분화된 세포를 iBBB로 조립하는 방법, 외인성 아밀로이드를 이용하여 in vitro 에서 CAA를 모델링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 생물학적 충실도와 실험적 유연성을 모두 갖춘 시스템으로 살아있는 인간 뇌 조직을 연구하는 문제를 극복하고 인간 BBB와 신경 퇴행에서의 역할을 조사할 수 있습니다.

Introduction

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)를 말초에서 분리하여 적절한 신경 기능을 위한 이상적인 환경을 유지하는 핵심 미세혈관 네트워크입니다. 뇌는 대사 항상성 1,2,3,4를 유지하고, 노폐물 4,5,6을 제거하며, 병원균과 독소로부터 뇌를 보호함으로써 중추신경계로의 물질 유입과 유출을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 7,8.

BBB의 일차 세포 유형은 내피 세포(EC)입니다. 중배엽 계통에서 유래 한 내피 세포는 혈관 (vasculature) 1,9의 벽을 형성합니다. 미세혈관 EC는 서로 긴밀한 접합부를 형성하여 막의 투과성을 크게 감소시키는 동시에10,11,12,13,14 중추신경계 1,4,12,14 안팎으로 영양소의 이동을 촉진하는 수송체를 발현합니다. 미세혈관 EC는 미세혈관 기능과 항상성을 조절하는 주위 세포(PC)-벽화 세포로 둘러싸여 있으며 분자 및 면역 세포에 대한 BBB의 투과성을 조절하는 데 중요합니다 15,16,17. 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 성상교세포(astrocyte)는 BBB를 구성하는 최종 세포 유형입니다. 성상세포(astrocyte)의 말단은 EC-PC 혈관관을 감싸고 세포체는 뇌 실질(brain parenchyma)로 확장되어 뉴런과 혈관 1 사이의 연결을 형성합니다. 뚜렷한 용질 및 기질 수송체는 BBB 기능 18,19,20,21에서 중요한 역할을 하는 성상세포(astrocyte) 말단부(예를 들어, 아쿠아포린 4[AQP-4])에 국한된다.

BBB는 적절한 뇌 건강 기능을 유지하는 데 중요하며, BBB의 기능 장애는 알츠하이머병(AD)22,23,24,25, 다발성 경화증 7,26,27,28, 간질29,30 및 뇌졸중 31,32을 포함한 많은 신경 질환에서 보고되었습니다. 뇌혈관 이상이 신경 퇴행의 중심적인 역할을 하여 허혈성 및 출혈성 사건에 대한 감수성을 증가시키는 데 기여한다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병 환자의 90% 이상이 뇌혈관을 따라 아밀로이드 β(Aβ)이 침착되는 것을 특징으로 하는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 앓고 있습니다. CAA는 BBB 투과성을 증가시키고 BBB 기능을 감소시켜 중추신경계를 허혈, 출혈성 사건 및 가속화된 인지 기능 저하에 취약하게 만든다33.

우리는 최근 3D 매트릭스에 캡슐화된 EC, PC 및 성상세포를 통합하는 환자 유도 만능 줄기세포에서 파생된 인간 BBB의 시험관 내 모델을 개발했습니다(그림 1A). iBBB는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 위치 파악을 포함하여 생리학적으로 관련된 상호작용을 재현한다24. iBBB를 적용하여 APOE4에 의해 매개되는 CAA의 감수성을 모델링했습니다(그림 1B). 이를 통해 APOE4가 CAA를 촉진하는 인과적 세포 및 분자 메커니즘을 식별하고, 이러한 통찰력을 활용하여 APOE4 마우스24에서 CAA 병리를 줄이고 생체 내 학습 및 기억을 개선하는 치료 전략을 개발할 수 있었습니다. 여기에서는 인간 iPSC에서 BBB를 재구성하고 체외에서 CAA를 모델링하기 위한 자세한 프로토콜과 비디오 자습서를 제공합니다.

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Protocol

1. iPSC를 iBBB 세포로 분화

참고: 이러한 차별화 프로토콜은 이전에 Mesentier-Louro et al.34에서 설명되었습니다.

  1. 코팅 세포 배양 플레이트
    1. 감소된 성장 인자(GF) 막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. 500μL의 기저막 매트릭스를 49.5mL의 DMEM에 희석합니다. 코팅 용액의 조기 중합을 방지하기 위해 이 용액을 차갑게 유지하십시오.
    2. 6웰 조직 배양 처리 플레이트의 웰당 1-2mL를 추가합니다. 코팅 용액을 37°C에서 최소 20분 동안 그대로 두었다가 적절한 가열된 배양 배지로 교체합니다.
  2. 인간 iPSC를 ETV2 유도 내피 세포로 분화
    타이밍 : 8 일
    참고: 이 프로토콜은 Blanchard et al.24 및 Qian et al.35에서 채택되었습니다. 수율을 개선하기 위해 Wang et al.36 에 의해 설명된 전사 인자 ETV2의 독시사이클린 유도 발현을 사용합니다. ETV2는 PiggyBac 플라스미드를 통해 도입된 후 세포를 transfection했습니다.
    1. 세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 feeder-free 만능 줄기 세포 배지에서 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다.
      참고: 유도성 iPSC는 PiggyBac 플라스미드(즉, puromycin)를 선택하여 유지할 것을 권장합니다.
    2. 0일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 20,800 cells/cm2 로 세포를 도장합니다.
    3. 1일차: 배지를 DeSR1[DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 최소 필수 배지 비필수 아미노산(MEM-NEAA) 1개, 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 1%)]로 대체하고 BMP4 10ng/mL, CHIR99021 6μM 및 독시사이클린 5μg/mL를 보충합니다.
    4. 3일차: 배지를 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 DeSR2[DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S]로 대체합니다.
    5. 5일차: 배지를 50ng/mL VEGF-A, 2μM 포스콜린 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR[Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S]으로 대체합니다.
    6. 7일차: 배지를 50ng/mL VEGF-A, 2μM 포스콜린 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR로 대체합니다.
    7. 8일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 EC를 1:3으로 분할하고 50ng/mL VEGF-A 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 다시 파종합니다.
      알림: 이것은 균일한 혈관 형성을 위해 EC를 iBBB로 캡슐화하는 가장 좋은 시점입니다.
    8. 10일차+: 2-3일마다 50ng/mL VEGF-A 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR을 세포에 공급합니다. 플레이트가 합류할 때 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 1:3으로 계속 분할합니다.
      참고: iPSC에서 파생된 EC는 8일부터 언제든지 동결될 수 있습니다. 통과하듯이 세포를 들어 올립니다. 펠릿을 EC 동결 배지[60% 녹아웃 혈청 치환(KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50ng/mL VEGF-A 및 10μM Y27632]에 재현탁시키고 세포를 1:3으로 분할하고 -80°C에서 동결 용기를 사용하여 동결합니다. 50ng/mL VEGF-A, 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 해동합니다.
    9. CD31/PECAM1 또는 VE-cadherin에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학으로 뇌 미세혈관 내피 세포 분화를 확인합니다(그림 2A).
  3. 인간 iPSC를 주위세포(pericyte)로 분화
    타이밍 : 6 일
    참고: 이 프로토콜은 Patsch et al.36에서 채택되었습니다.
    1. 줄기 세포 배지의 피더가 없는 조건에서 세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다.
    2. 0일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 에서 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 37,000-40,000 cells/cm2 (세포주에 따라 다름)로 세포를 도장합니다.
    3. 1일차: 배지를 25ng/mL BMP4 및 8uM CHIR99021가 보충된 N2B27[50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, 글루타민 보충제, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S]로 교체합니다.
    4. 3-4일차: 배지를 2ng/mL Activin A 및 10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27로 교체하고 매일 급여합니다.
    5. 5일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 PC를 분할하고 10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27에서 35,000세포/cm2 의 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에 파종합니다.
      알림: 한 번만 셀을 분할합니다. 일부 줄은 분할할 준비가 되기까지 며칠이 더 걸릴 수 있습니다. 세포가 합류할 때까지 매일 배지를 계속 교체하십시오.
    6. 10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27에서 PC를 확장하고 2-3일마다 배지를 교체합니다. 세포가 다시 한 번 밀도에 도달하고 두 번째 통로를 거친 후 배지에서 PDGF-BB를 제거합니다.
      참고: pericyte는 두 번째 통과 후 iBBB에서 사용할 준비가 되었습니다. PC가 확장되면 고정될 수 있습니다. 세포를 통과하는 것처럼 들어 올리고 세포 펠릿을 동결 매체[90% KSR 및 10% DMSO]에 재현탁시키고 -80°C의 냉동 용기를 사용하여 동결합니다. N2B27에서 35,000 cells/cm2 로 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에서 해동합니다.
    7. PDGFRB 및 NG2에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학에 의한 주위 세포 분화를 확인합니다(그림 2B).
  4. 인간 iPSC를 신경 전구 세포(NPC) 및 성상세포로 분화
    타이밍 : 총 45 일 (NPC의 경우 15 일, 성상 세포의 경우 30 일)
    참고: NPC 분화 프로토콜은 Chambers et al.38에서 채택되었으며, 성상세포 분화는 TCW et al.39에 기술된 바와 같다.
    1. 줄기 세포 배지의 피더가 없는 조건에서 세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다.
    2. 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 에서 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 세포를 100,000 cells/cm2 로 도금합니다.
    3. 다음날 줄기 세포 배지를 교체하십시오. 세포가 >95% 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 세포에 계속 공급합니다(세포주에 따라 3-4일).
    4. NPC 0일차: 배지를 10μM SB43152 및 100nM LDN193189가 보충된 N2B27[50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, 글루타민 보충제, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S]로 교체합니다.
    5. NPC 1-9일차: 10μM SB43152 및 100nM LDN193189가 보충된 N2B27을 매일 세포에 공급합니다.
    6. NPC 10일차: NPC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 1:3으로 분할하고 20ng/mL FGF-basic 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 종자합니다.
    7. NPC 11일차 - 13일차: 매일 NPC에게 20ng/mL FGF-basic이 보충된 N2B27을 먹이십시오.
    8. NPC 14일차: NPC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 1:3으로 분할하고 20ng/mL FGF-basic 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 다시 파종합니다.
    9. NPC 15일차/성상세포 0일차: 이것은 성상세포 분화의 0일차입니다. 세포에 완전한 성상교세포 배지(AM)를 공급합니다.
      참고: NPC는 N2B27에서 20ng/mL FGF-염기성으로 보충되고 합류할 때 통과할 수 있습니다. NPC를 얼리려면 세포 펠릿을 냉동 배지[90% KSR 및 10% DMSO]에 재현탁시키고 세포를 1:3으로 분할한 다음 -80°C의 냉동 용기를 사용하여 냉동합니다. 20ng/mL bFGF 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 해동합니다.
    10. 성상교세포 1-30일차: 2-3일마다 세포에 AM을 공급합니다. 세포가 >90% 합류하면 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 사용하여 15,000 cells/cm2 의 플레이트를 AM의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 통과시킵니다.
      참고: 성상교세포는 30일 이내에 완전히 분화되어야 합니다. 성상교세포는 -80°C의 냉동 용기에 있는 냉동 배지[90% KSR 및 10% DMSO]에서 냉동할 수 있습니다. 25,000-35,000 cells/cm의 AM에서 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 해동합니다2.
    11. Nestin 및 SOX2에 대한 항체를 이용한 면역세포화학에 의한 NPC 분화를 확인합니다. S100B 및 CD44에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학으로 성상세포 분화를 확인합니다(그림 2C).

2. iBBB 조립

  1. 감소된 성장 인자(GF) 기저막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. iBBB는 100% 환원된 GF 기저막 매트릭스에 캡슐화되어 있으므로 DMEM에서 이 매트릭스를 희석하지 마십시오. 각 iBBB에는 50μL의 매트릭스가 필요합니다.
  2. 분화된 EC를 37°C에서 5분 동안 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 해리합니다. 해리된 세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 hECSR에 1:3 비율로 원뿔형 튜브로 옮깁니다(Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). 3분 동안 300× g 의 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 hECSR에 재현탁시킵니다.
    참고: 15mL 또는 50mL의 원뿔형 튜브를 사용하며, 이 튜브는 해리된 세포와 배지의 부피를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 세포는 또한 여러 튜브로 분할된 다음 재현탁 시 재결합될 수 있습니다.
  3. 분화된 PC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 37°C에서 5분 동안 해리합니다. N2B27(50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x 글루타민 보충제, 1x N-2, 1x B-27, 1% 페니실린-스트렙토마이신[P/S])에 대한 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 해리된 세포를 전달합니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 N2B27에 재현탁시킵니다.
  4. 분화된 성상교세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 37°C에서 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮겨 성상교세포 배지(AM)를 완성합니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 AM에 재현탁시킵니다.
  5. 혈구계를 사용하여 각 세포 유형을 계산합니다. 각 유형의 세포 현탁액을 적절한 배지에서 1 × 106 cells/mL의 최종 농도로 희석합니다.
  6. 원뿔형 튜브에서 각 세포 유형에 대해 계산된 세포 수를 결합합니다: 50μL의 iBBB에는 2.5 × 105 EC, 5 × 104 PC, 5 × 104 성상교세포가 필요합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 계산된 셀 수보다 10% 더 많은 셀 수를 포함합니다. 셀 혼합물을 300× g 에서 3분 동안 회전시킵니다.
    알림: 입력 셀의 품질 관리를 위해 고정 및 염색을 위해 2D 단일 배양에서 각 셀 유형의 일부 남은 셀을 도금하는 것이 좋습니다. 환원된 GF 기저막 매트릭스로 코팅된 이전에 준비된 플레이트에 각 세포 유형을 35,000 cells/cm2 로 도금하고 3-4일 후에 고정합니다. 세포 유형 특이적 항체에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
  7. 세포 펠릿에서 매질을 흡인하여 세포 펠릿 위에 약 50μL의 상층액을 남깁니다. P200을 사용하여 세포 펠릿을 잔류 매체에 부드럽게 재현탁하여 단일 세포 슬러리를 만듭니다.
  8. iBBB당 50μL의 환원된 GF 기저막 매트릭스에서 원하는 수의 iBBB에 대해 10ng/mL VEGF-A가 보충된 충분히 환원된 GF 기저막 매트릭스에 세포 슬러리를 혼합하고, 기포를 도입하지 않으면서 세포를 균질하게 혼합하도록 주의합니다.
    알림: 이 단계에서 세포와 환원된 GF 기저막 매트릭스를 얼음 위에 유지하여 조기 중합을 방지하는 것이 중요합니다.
  9. 50μL의 환원된 GF 기저막 매트릭스 혼합물을 48웰 유리 바닥 배양 접시의 웰에 피펫팅합니다. 접시 바닥에 부피를 고르게 분산시킵니다(그림 1C).
  10. iBBB를 37°C에서 30-40분 동안 배양하여 환원된 GF 기저막 매트릭스가 중합되도록 하여 매트릭스에 세포를 캡슐화합니다.
  11. 10ng/mL VEGF-A, 5μg/mL 독시사이클린, 10μM Y27632가 보충된 AM 500μL를 추가합니다.
  12. 다음날 배지를 10ng/mL VEGF-A가 보충된 AM으로 변경하십시오. 2-3일마다 매체를 계속 교체하십시오. 2주 후, VEGF-A 보충을 중단하십시오. iBBB는 2주 후에 다운스트림 분석을 위한 준비가 됩니다.

3. Aβ 피브릴을 이용한 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 유도

  1. PBS에서 200μM에서 아밀로이드-β1-40 및 아밀로이드-β1-42 의 원액을 준비합니다.
  2. 2주 iBBB에서 최종 농도 20nM까지 iBBB 배지에 Aβ를 첨가합니다. Aβ 보충 배지에서 96시간(4일) 동안 세포를 배양합니다.
  3. 96시간 후에 매체를 제거하고 고정을 계속합니다(섹션 4).

4. iBBB 고정 및 염색

  1. iBBB를 고정하려면 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세척한 다음 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드 500μL에서 배양합니다.
  2. 4% 파라포름알데히드 용액을 제거하고 PBS 1mL에서 4 x (최소) 15분 동안 헹굽니다.
  3. 0.3% PBST(0.3% Triton X-100이 포함된 PBS)에서 샘플을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 투과시킵니다.
  4. 차단 완충액(0.3% PBST에 5% 일반 혈청)에서 배양액을 실온에서 부드럽게 흔들면서 최소 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 사용되는 혈청의 유형은 사용된 2차 항체의 숙주 종에 따라 다릅니다. 예를 들어, 2차 항체의 숙주 종이 염소인 경우 일반 염소 혈청을 사용합니다. 숙주 종이 당나귀인 경우 일반 당나귀 혈청을 사용하십시오. 이것은 또한 4 °C에서 밤새 부드럽게 흔들어 수행할 수 있습니다.
  5. 1차 항체를 차단 완충액에서 권장 또는 결정된 농도로 희석합니다.
  6. 차단 용액을 1차 항체 희석액으로 교체합니다. 균일한 배양을 위해 iBBB가 항체 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 100-150μL는 48웰 유리 바닥 배양 접시에서 50μL iBBB를 덮기에 충분합니다. 4 °C에서 부드럽게 흔들어 하룻밤 동안 배양합니다.
  7. 1차 항체를 제거합니다. 3% PBS에서 10 x 20-0.3분 동안 iBBB를 세척합니다.
  8. 2차 항체를 차단 완충액에서 권장 또는 결정된 농도로 희석합니다. 또한 Hoechst와 같은 핵 염색을 권장 또는 결정된 농도의 2차 항체 용액에 추가합니다.
  9. 마지막 PBS 세척을 2차 항체 희석액으로 교체합니다. 균일한 배양을 위해 iBBB가 항체 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 100-150μL는 48웰 유리 바닥 배양 접시에서 50μL iBBB를 덮기에 충분합니다. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
    알림: 이것은 또한 4 °C에서 밤새 부드럽게 흔들어 수행할 수 있습니다.
  10. PBS에서 세탁당 최소 4시간 동안 iBBB를 5-1번 세탁하십시오. 샘플이 이미지화될 때까지 4°C의 PBS 또는 페이딩 방지 장착 매체에 보관합니다.
  11. 도립 현미경으로 이미지를 촬영하려면 iBBB를 유리 바닥 접시나 접시에 보관하십시오. 유리 웰 위에 유리 커버슬립을 놓아 iBBB를 제자리에 고정합니다(그림 1D).

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Representative Results

적절하게 형성된 iBBB는 하나의 반투명 디스크로 응고됩니다(그림 3A). iBBB가 며칠 후에 처음 피펫팅된 표면에서 분리되는 것은 정상입니다. 이것은 피할 수 없지만 실수로 iBBB를 흡입하지 않도록 매체를 교체할 때 주의를 기울인다면 iBBB의 적절한 형성에 큰 문제가 되지 않습니다. 24시간 후 균일하게 분포된 단일 세포를 명시야 현미경으로 식별할 수 있습니다(그림 3B). 2주 후에는 더 뚜렷한 구조를 볼 수 있지만 명확하게 식별하기는 어렵습니다(그림 3C).

iBBB의 품질은 입력 셀의 분화 품질에 크게 좌우됩니다. 세포 유형 특이적 마커를 고정하고 염색하기 위해 2D 단일 배양에서 일부 남은 세포를 도금하는 것이 좋습니다. PECAM1 또는 VE-cadherin에 대해 70% 이상 양성인 내피 세포(그림 2A), PDGFRB에 대해 95% 이상 양성인 주위 세포(그림 2B), S100B 및 CD44에 대해 95% 이상 양성인 성상세포(그림 2C)로 형성된 iBBB는 성공적인 iBBB에 가장 적합합니다. 이 품질 검사의 결과는 고품질 iBBB에 대한 가장 빠른 지표입니다.

생리학적으로 관련된 3D 구조는 2주간의 자가 조립 후에 형성되어야 합니다. 고정 및 염색 시 단단한 접합 형성에 중요한 내피 마커 PECAM1에 대해 양성으로 염색되는 튜브 모양의 구조의 증거를 볼 수 있습니다(그림 4A). iBBB 형성의 가장 큰 변동성은 미세혈관 형성의 정도입니다. "최악의 경우" 시나리오에서는 내피 세포 네트워크가 더 단편화되거나 iBBB 전체로 확장되지 않는 반면, "최상의 경우" 시나리오에서는 혈관 조직이 균일하고 iBBB 전체에 걸쳐 분기됩니다. PECAM1 양성이 70% 이상인 내피 세포 분화는 보다 일관된 네트워크를 형성합니다. 또한 성상교세포의 말단부에 국한된 성상교세포에서 발현되는 단백질인 아쿠아포린-4는 PECAM1 염색과 일치하며, 이는 성상교세포가 내피세포와 접촉하기 위해 말단을 확장한다는 것을 나타냅니다(그림 4B). 마지막으로, 혈관 조직 주위에 pericyte를 볼 수 있을 것으로 예상됩니다(그림 4C).

iBBB에서 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)의 주요 판독값은 아밀로이드 β(Aβ)의 존재입니다. Aβ는 표적 항체를 사용하거나 형광 표지된 Aβ를 파종하여 CAA 표현형을 유도하여 측정할 수 있습니다(그림 5). Aβ로 iBBB를 처리하면 BBB의 세포가 내인성 Aβ 단백질을 많이 발현하지 않기 때문에 Aβ 염색 강도와 면적이 증가해야 합니다. 또는 고정 샘플을 Thioflavin T로 염색하여 아밀로이드 축적을 검출할 수 있습니다. Aβ 수준은 iBBB를 생성하는 데 사용되는 줄기세포의 유전자형에 따라 달라지며, 일부 알츠하이머병 및 CAA 관련 위험 요인은 Aβ 축적 및 염색의 양을 증가시킵니다(그림 5B, C)24.

Figure 1
그림 1: 대뇌 아밀로이드 혈관병증을 모델링하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽. (A) iBBB 조립 및 성숙의 개략적 표현. 유도만능줄기세포로부터 내피세포, 성상교세포, 주위세포를 분화시킨 후, 세포는 단세포 현탁액의 겔 매트릭스에 캡슐화됩니다. 2주 동안 세포는 생체 내에서 확인된 구조와 유사한 혈관 단위로 자체 조립됩니다. (B) 대뇌 아밀로이드 혈관병증 분석의 개략도. 아밀로이드-β은 Aβ 응집을 유도하기 위해 96시간 동안 성숙된 iBBB에 첨가됩니다. (C) 바닥이 유리로 된 우물에 씨를 뿌린 후 iBBB의 측면도를 보여주는 다이어그램. (D) 도립 현미경에서 이미징하기 위해 준비된 iBBB의 그래픽. 약어: BBB = 혈액-뇌 장벽; iPSC = 유도만능줄기세포; iBBB = 3D 매트릭스에 캡슐화된 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 통합하는 환자 iPSC 유래 BBB 모델로부터 유래한 인간 BBB의 시험관 내 모델; Aβ = 아밀로이드-β. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: iPSC 유래 iBBB 세포의 검증. (A) VE-cadherin(녹색) 및 PECAM1(빨간색)로 염색된 2D 단일 배양에서 내피 세포의 대표적인 최대 강도 투영. (B) PDGFRB(녹색) 및 NG2(빨간색)로 염색된 2D 단일배양에서 주세포의 대표 이미지. (C) CD44(위, 녹색) 및 S100B(아래, 녹색)로 염색된 2D 단일 배양에서 성상교세포의 대표 이미지. 모든 핵은 Hoechst 33342로 염색됩니다. 이미지는 니콘 이클립스 Ti2-E를 20배 배율(A,B)로 촬영하거나 라이카 스텔라리스 8을 40배 배율(C)로 촬영했습니다. 모든 스케일 바는 100 μm입니다. 약어: BBB = 혈액-뇌 장벽; iPSC = 유도만능줄기세포; iBBB = 3D 매트릭스에 캡슐화된 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 통합하는 환자 iPSC 유래 BBB 모델로부터 유래한 인간 BBB의 시험관 내 모델; VE-cadherin = 혈관 내피 cadherin; PECAM1 = 혈소판 및 내피 세포 접착 분자 1; PDGFRB = 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타; NG2 = 뉴런 신경교 항원 2; S100B = S100 칼슘 결합 단백질 베타. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: iBBB 조립. (A) 2배 배율로 도금한 후 24시간 동안 15μL iBBB의 명시야 이미지. (B) 10배 배율로 도금한 후 24시간 동안 iBBB의 명시야 이미지. (C) 10배 배율로 도금한 후 2주 후에 iBBB의 명시야 이미지. 눈금 막대 = 1mm(A), 100μm(B,C). 거꾸로 된 Nikon Eclipse Ts2R-FL에서 촬영한 이미지. 약어: BBB = 혈액-뇌 장벽; iPSC = 유도만능줄기세포; iBBB = 3D 매트릭스에 캡슐화된 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 통합하는 환자 iPSC 유래 BBB 모델에서 파생된 인간 BBB의 시험관 내 모델입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: iBBB의 세포 상호 작용. iBBB의 내피 세포, 주위 세포 및 성상 세포의 대표 이미지. (A) 내피세포(PECAM1) 및 성상세포(S100β). (B) 내피 세포(PECAM1)와 성상세포 말단부(AQP-4) 공동 국소화. (C) 내피 세포(PECAM1) 및 주위 세포(NG2). 모든 핵은 Hoechst 33342로 염색됩니다. 컨포칼 Z 스택 이미지는 라이카 스텔라리스 8(Leica Stellaris 8)에서 20배 배율(A,B) 또는 니콘 이클립스 Ti2-E(C)로 촬영했습니다. 스케일 바 = 200 μm(A), 100 μm(B,C). 약어: BBB = 혈액-뇌 장벽; iPSC = 유도만능줄기세포; iBBB = 3D 매트릭스에 캡슐화된 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 통합하는 환자 iPSC 유래 BBB 모델로부터 유래한 인간 BBB의 시험관 내 모델; PECAM1 = 혈소판 및 내피 세포 접착 분자 1; AQP-4 = 아쿠아포린-4; NG2 = 뉴런 신경교 항원 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 체외 대뇌 아밀로이드 혈관병증. (A) 대조군 또는 Aβ-과발현 뉴런의 조건화된 배지에 노출된 비 AD iBBB. 6e10 항체는 Aβ를 인식합니다. (B) 96시간 동안 20nM Aβ-FITC1-42 로 처리한 동원성 APOE3 및 APOE4 세포주에서 추출한 iBBB의 대표 이미지. (C) 20nM Aβ-FITC1-40 또는 Aβ-FITC1-42로 처리한 동원성 APOE3 및 APOE4 세포주에서 추출한 iBBB의 아밀로이드 정량화. 스케일 바 = 50 μm(A), 10 μm(B). 이 그림은 Blanchard et al24에서 발췌한 것입니다. 약어: BBB = 혈액-뇌 장벽; iPSC = 유도만능줄기세포; iBBB = 3D 매트릭스에 캡슐화된 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 통합하는 환자 iPSC 유래 BBB 모델로부터 유래한 인간 BBB의 시험관 내 모델; Aβ = 아밀로이드-β. APOE = 아포지단백E. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마커 회사 카탈로그 번호 희석
내피 세포 PECAM1 (CD31) R&D 시스템 AF806 시리즈 1:500
VE-카데린(CD144) R&D 시스템 AF938 시리즈 1:500
ZO-1 (조-1) 인체배출 MA3-39100-A488 1:500
주위 세포(Pericyte) PDGFRβ R&D 시스템 AF385 시리즈 1:500
NG2 (영문) 앱캠 ab255811 1:500
성상교세포(Astrocyte) S100β 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) S2532-100u엘 1:500
CD44 시리즈 세포 신호 전달 기술 3570년대 1:400
AQP-4 시리즈 인체배출 PA5-53234 시리즈 1:300
증권 시세 표시기
ALDH1L1
EAAT1 (이아트1)
EAAT2 (이아트2)
아밀로이드 β 6e10 바이오레전드 SIG-39320 시리즈 1:1,000
티오플라빈 T 화학 임펙스 22870 25 마이크로미터

표 1: 분화 품질 검사를 위한 권장 세포 마커. 분화 품질을 확인하고 형성된 iBBB에서 세포를 식별하는 데 사용할 수 있는 BBB의 다양한 세포 유형에 대한 세포 마커. 이 문서에 사용된 마커는 굵게 표시되어 있습니다.

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Discussion

BBB 기능 장애는 동반 질환이며, 잠재적으로 수많은 신경 질환의 원인 또는 악화 요인이 될 수 있다 7,40,41. 그러나 신경 혈관 질환이 있는 인간에서 BBB의 기능 장애 및 고장의 기저에 있는 분자 및 세포 생물학을 연구하는 것은 거의 불가능합니다. 이 프로토콜에 제시된 유도 BBB(iBBB)는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 국소화를 포함하여 BBB의 중요한 세포 상호 작용을 요약하는 시험관 내 시스템을 제공합니다. iBBB는 BBB 기능 장애의 모든 단계와 관련된 분자 경로를 연구하는 데 사용할 수 있으며 뇌 아밀로이드 혈관병증에서 볼 수 있듯이 아밀로이드 β 응집과 같은 신경 혈관 질환 표현형을 모델링할 수 있습니다.

iBBB의 조립은 간단하지만, iBBB의 품질은 사용되는 iPSC 유래 셀의 품질에 크게 좌우됩니다. iBBB는 구성 세포의 성숙을 촉진할 수 있는 다세포 틈새를 제공하지만, 캡슐화하기 전에 각 세포 유형을 적절하게 패터닝해야 합니다. 개별 단일 배양에서 세포 유형 특이적 마커에 대한 면역형광 염색을 수행하여 각 분화에 대한 품질 검사를 수행하는 것이 중요합니다(표 1). 모든 iPSC 라인은 다르게 동작하며, 분화 효율을 최적화하기 위해 파종 밀도 또는 각 패터닝 배지의 일수와 같은 일부 조건을 경험적으로 결정하고 조정해야 할 수 있습니다.

설명된 프로토콜은 50μL 크기를 제안하지만 iBBB는 셀 가용성, 원하는 iBBB 수 및 다운스트림 응용 분야에 따라 5μL까지 축소할 수 있습니다. 더 큰 iBBB는 더 많은 세포를 포함하므로 단백질, 지질 또는 핵산 수집에 이상적입니다. 더 작은 iBBB는 약물 스크리닝 또는 기타 확장 가능한 분석을 용이하게 할 수 있습니다.

iBBB는 체외에서 BBB를 연구하기 위한 매우 다재다능한 도구입니다. 각 세포 유형은 독립적으로 분화되기 때문에 iBBB는 서로 다른 유전적 배경에서 조립될 수 있으므로 유전적 위험 요인이 특정 세포 유형에 어떻게 영향을 미쳐 BBB 기능 장애에 기여하는지 연구할 수 있습니다. 이 전략은 알츠하이머병과 뇌 아밀로이드 혈관병증의 가장 흔한 위험 인자인 APOE4가 부분적으로 세포주위(pericyte)의 병원성 기전을 통해 작용한다는 것을 보여주기 위해 적용되었다24. 이 도구를 추가로 사용하면 BBB 무결성을 유지하는 데 있어 EC, PC 및 성상교세포의 개별 기여와 질병 발생 중에 각 세포 유형이 어떻게 흔들리는지 분석할 수 있습니다.

현재, 시험관내에서 BBB를 모델링하는 가장 일반적인 방법은 EC로 파종되고 때로는 주위 세포 및/또는 성상교세포와 공동 배양된 트랜스웰 시스템을 사용하여 불투과성 단층 42,43,44를 형성하는 것입니다. iBBB의 3D 구조는 혈관 단위의 자가 조립을 가능하게 하고 생리적 혈관 구조와 더 유사한 관 구조를 형성할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 웰 플레이트에 iBBB를 파종할 때의 단점은 생체 내 시스템에서 일정한 흐름 혈관 구조로 인한 순전한 응력을 경험하지 않는다는 것입니다. 이를 극복하기 위해, iBBB는 동적 흐름(45,46,47)을 생성할 수 있는 미세유체 칩에 시드될 수 있다. 이 시스템은 또한 혈관 투과성 및 소분자의 관류를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

결론적으로, 이 방법은 신경 혈관 질환 표현형을 재현할 수 있는 능력과 광범위한 응용 분야에서 약물 BBB 투과성을 스크리닝할 수 있는 가능성을 포함하여 세포 수준에서 BBB의 수많은 측면을 연구하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있는 BBB의 유연한 3D iPSC 파생 모델을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

Acknowledgments

이 연구는 NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation 및 Brain Injury Association of America의 지원을 받습니다. C.G.는 NIH F31NS130909의 지원을 받습니다. 그림 1A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

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혈액뇌장벽 중추신경계 신경질환 치료약물전달 BBB기능 뇌아밀로이드혈관병증 알츠하이머병 신경변성 인체만능줄기세포 내피세포 주위세포 성상교세포 3차원매트릭스 IBBB 아밀로이드침착 뇌혈관질환 유전요인 환경요인 약물스크리닝 약제표적화
신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 <em>체외</em> 혈액-뇌 장벽 재건
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Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

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