Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekonstruksjon av blod-hjernebarrieren in vitro for å modellere og terapeutisk målrette nevrologisk sykdom

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

Blod-hjernebarrieren (BBB) har en avgjørende rolle i å opprettholde et stabilt og sunt hjernemiljø. BBB dysfunksjon er forbundet med mange nevrologiske sykdommer. Vi har utviklet en 3D, stamcelleavledet modell av BBB for å undersøke cerebrovaskulær patologi, BBB-integritet og hvordan BBB endres av genetikk og sykdom.

Abstract

Blod-hjernebarrieren (BBB) er en viktig fysiologisk komponent i sentralnervesystemet (CNS), opprettholder næringsstoffer, rydder avfall og beskytter hjernen mot patogener. De iboende barriereegenskapene til BBB utgjør en utfordring for terapeutisk legemiddellevering i CNS for å behandle nevrologiske sykdommer. Nedsatt BBB-funksjon har vært relatert til nevrologisk sykdom. Cerebral amyloid angiopati (CAA), avsetning av amyloid i hjernevaskulaturen som fører til en kompromittert BBB, er en komorbiditet i de fleste tilfeller av Alzheimers sykdom (AD), noe som tyder på at BBB-dysfunksjon eller sammenbrudd kan være involvert i nevrodegenerasjon. På grunn av begrenset tilgang til humant BBB-vev, forblir mekanismene som bidrar til riktig BBB-funksjon og BBB-degenerasjon ukjente. For å løse disse begrensningene har vi utviklet en human pluripotent stamcelleavledet BBB (iBBB) ved å inkorporere endotelceller, pericytter og astrocytter i en 3D-matrise. iBBB monterer seg selv for å rekapitulere anatomien og cellulære interaksjoner som er tilstede i BBB. Seeding iBBBs med amyloid fanger viktige aspekter av CAA. I tillegg tilbyr iBBB en fleksibel plattform for å modulere genetiske og miljømessige faktorer involvert i cerebrovaskulær sykdom og nevrodegenerasjon, for å undersøke hvordan genetikk og livsstil påvirker sykdomsrisiko. Endelig kan iBBB brukes til narkotika screening og medisinsk kjemi studier for å optimalisere terapeutisk levering til CNS. I denne protokollen beskriver vi differensieringen av de tre celletypene (endotelceller, pericytter og astrocytter) som oppstår fra humane pluripotente stamceller, hvordan man monterer de differensierte cellene i iBBB, og hvordan man modellerer CAA in vitro ved bruk av eksogent amyloid. Denne modellen overvinner utfordringen med å studere levende menneskelig hjernevev med et system som har både biologisk troskap og eksperimentell fleksibilitet, og muliggjør forhør av den menneskelige BBB og dens rolle i nevrodegenerasjon.

Introduction

Blod-hjernebarrieren (BBB) er et viktig mikrovaskulært nettverk som skiller sentralnervesystemet (CNS) fra periferien for å opprettholde et ideelt miljø for riktig nevronfunksjon. Det har en kritisk rolle i å regulere tilstrømning og utstrømning av stoffer i CNS ved å opprettholde metabolsk homeostase 1,2,3,4, rydde avfall 4,5,6 og beskytte hjernen mot patogener og toksiner 7,8.

Den primære celletypen til BBB er endotelcellen (EC). Endotelceller, avledet fra mesodermlinjen, danner veggene i vaskulaturen 1,9. Mikrovaskulære EC danner tette kryss med hverandre for å redusere permeabiliteten til membranenderes 10,11,12,13,14 mens de uttrykker transportører for å lette bevegelsen av næringsstoffer inn i og ut av CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulære EC er omkranset av pericytter (PCer) -veggmalericeller som regulerer mikrovaskulær funksjon og homeostase og er kritiske for å regulere permeabiliteten til BBB til molekyler og immunceller 15,16,17. Astrocytten, en stor gliacelletype, er den siste celletypen som omfatter BBB. Astrocyttens endeføtter vikler seg rundt EC-PC-karrørene mens cellelegemene strekker seg inn i hjerneparenkymet, og danner en forbindelse mellom nevroner og vaskulatur1. Distinkte løsemiddel- og substrattransportører er lokalisert på astrocyttens endeføtter (f.eks. akvaporin 4 [AQP-4]) som har en kritisk rolle i BBB-funksjon 18,19,20,21.

BBB er kritisk for å opprettholde riktig hjernehelsefunksjon, og dysfunksjon av BBB har blitt rapportert i mange nevrologiske sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD) 22,23,24,25, multippel sklerose 7,26,27,28, epilepsi29,30 og hjerneslag 31,32. Det blir stadig mer anerkjent at cerebrovaskulære abnormiteter spiller en sentral rolle i nevrodegenerasjon, noe som bidrar til økt følsomhet for iskemiske og hemorragiske hendelser. For eksempel har mer enn 90% av AD-pasientene cerebral amyloid angiopati (CAA), en tilstand preget av avsetning av amyloid β (Aβ) langs hjernevaskulaturen. CAA øker BBB-permeabiliteten og reduserer BBB-funksjonen, slik at CNS er sårbar for iskemi, hemorragiske hendelser og akselerert kognitiv tilbakegang33.

Vi har nylig utviklet en in vitro-modell av den humane BBB, avledet fra pasientinduserte pluripotente stamceller, som inkorporerer EC, PCer og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise (figur 1A). iBBB rekapitulerer fysiologisk relevante interaksjoner, inkludert dannelse av karrør og lokalisering av astrocyttens endeføtter med vaskulatur24. Vi brukte iBBB for å modellere følsomheten til CAA mediert av APOE4 (figur 1B). Dette gjorde det mulig for oss å identifisere de kausale cellulære og molekylære mekanismene som APOE4 fremmer CAA, og utnytte denne innsikten til å utvikle terapeutiske strategier som reduserer CAA-patologi og forbedrer læring og minne in vivo i APOE4-mus24. Her gir vi en detaljert protokoll og videoopplæring for å rekonstruere BBB fra menneskelige iPSCs og modellere CAA in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differensiere iPSCs til iBBB-celler

MERK: Disse differensieringsprotokollene er tidligere beskrevet i Mesentier-Louro et al.34.

  1. Belegg cellekulturplater
    1. Tine membranmatrisen med redusert vekstfaktor (GF) over natten ved 4 °C. Fortynn 500 μL kjellermembranmatrise i 49,5 ml DMEM. Hold denne løsningen kald for å forhindre for tidlig polymerisering av beleggløsningen.
    2. Tilsett 1-2 ml per brønn av en 6-brønns vevskulturbehandlet plate. La beleggoppløsningen være på i minst 20 minutter ved 37 °C før den erstattes med egnet medium for oppvarmet dyrking.
  2. Differensiering av humane iPSCs til ETV2-induserbare endotelceller
    Tidspunkt: 8 dager
    MERK: Denne protokollen er tilpasset fra Blanchard et al.24 og Qian et al.35. Vi bruker det doksysyklininduserbare uttrykket av transkripsjonsfaktoren ETV2, som beskrevet av Wang et al.36 for å forbedre utbyttet. ETV2 ble introdusert via PiggyBac-plasmid og cellene ble deretter transfektert.
    1. Kultur iPSCs på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i materfri pluripotent stamcellemedium til cellene når ~ 70% konfluens.
      MERK: Vi anbefaler at induserbare iPSCer opprettholdes ved seleksjon for PiggyBac-plasmidet (dvs. puromycin)
    2. Dag 0: Dissociere cellene med en protease-kollagenaseblanding i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten med stamcellemedium og plate cellene ved 20 800 celler / cm2 på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i stamcellemedium supplert med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Erstatt mediet med DeSR1 [DMEM / F12 + glutamintilskudd, 1x minimum essensielle medium ikke-essensielle aminosyrer (MEM-NEAA), 1% penicillin-streptomycin (P / S)], supplert med 10 ng / ml BMP4, 6 μM CHIR99021 og 5 μg / ml doksycyklin.
    4. Dag 3: Erstatt mediet med DeSR2 [DMEM / F12 + glutamintilskudd, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P / S] supplert med 5 μg / ml doksycyklin.
    5. Dag 5: Erstatt medium med hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] supplert med 50 ng/ml vegf-a, 2 μM forskolin og 5 μg/ml doksysyklin.
    6. Dag 7: Erstatt medium med hECSR supplert med 50 ng / ml vegf-a, 2 μM forskolin og 5 μg / ml doksycyklin.
    7. Dag 8: Del ECs 1: 3 med en protease-kollagenaseblanding og frø på ferske reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i hECSR supplert med 50 ng / ml VEGF-A og 5 μg / ml doksycyklin.
      MERK: Dette er det beste tidspunktet for å kapsle inn EC-er i iBBB-er for ensartet vaskulaturdannelse.
    8. Dag 10+: Fôr cellene hver 2-3 dag med hECSR supplert med 50 ng / ml VEGF-A og 5 μg / ml doksycyklin. Fortsett å dele cellene 1: 3 med en protease-kollagenaseblanding når platene er sammenflytende.
      MERK: iPSC-avledede EC-er kan fryses når som helst fra dag 8. Løft cellene, som om de skal passere. Resuspender pelleten i EC-frysemedium [60 % knockout serumerstatning (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml VEGF-A og 10 μM Y27632], splitt cellene 1:3 og frys ved hjelp av en frysebeholder ved -80 °C. Tine på reduserte GF kjellermembranmatriksbelagte plater i hECSR supplert med 50 ng/ml vegf-a, 5 μg/ml doksysyklin.
    9. Bekrefte hjernens mikrovaskulære endotelcelledifferensiering ved immuncytokjemi ved bruk av antistoffer mot CD31/PECAM1 eller VE-cadherin (figur 2A).
  3. Differensiering av humane iPSCer i pericytter
    Tidspunkt: 6 dager
    MERK: Denne protokollen ble tilpasset fra Patsch et al.36.
    1. Kultur iPSCs på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i materfrie forhold i stamcellemedium til cellene når ~ 70% konfluens.
    2. Dag 0: Dissociere cellene med en protease-kollagenaseblanding i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten med stamcellemedium og plate cellene ved 37.000-40.000 celler / cm2 (avhengig av cellelinjen) på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i stamcellemedium supplert med 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Erstatt mediet med N2B27 [50% DMEM / F12 + glutamintilskudd, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutamintilskudd, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P / S] supplert med 25 ng / ml BMP4 og 8 uM CHIR99021.
    4. Dag 3-4: Bytt ut mediet med N2B27 supplert med 2 ng/ml Activin A og 10 ng/ml pdgf-bb, og mat daglig.
    5. Dag 5: Del PCer med en protease-kollagenaseblanding og frø på 0,1% gelatinbelagte plater ved 35 000 celler / cm2 i N2B27 supplert med 10 ng / ml PDGF-BB.
      MERK: Del bare celler én gang sammenflytende. Noen linjer kan kreve noen dager til før de er klare til å deles. Fortsett å endre mediet daglig til cellene er sammenflytende.
    6. Utvid PCer i N2B27 supplert med 10 ng / ml PDGF-BB, bytte media hver 2-3 dager. Fjern PDGF-BB fra mediet etter at cellene igjen når sammenløp og gjennomgår en ny passasje.
      MERK: Pericytter er klare til bruk i iBBB-er etter den andre passasjen. Når PC-er er utvidet, kan de fryses. Løft cellene som om de skal passere, resuspender cellepelleten i frysemedier [90% KSR og 10% DMSO] og frys ved hjelp av en frysebeholder ved -80 °C. Tine på 0,1 % gelatinbelagte plater ved 35 000 celler/cm2 i N2B27.
    7. Bekreft pericyttdifferensiering ved immuncytokjemi med antistoffer mot PDGFRB og NG2 (figur 2B).
  4. Differensiering av humane iPSCer til nevrale stamceller (NPC) og astrocytter
    Timing: 45 dager totalt (15 dager for NPCs etterfulgt av 30 dager for astrocytter)
    MERK: NPC-differensieringsprotokollen ble tilpasset fra Chambers et al.38, og astrocytdifferensieringen er som beskrevet i TCW et al.39.
    1. Kultur iPSCs på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i materfrie forhold i stamcellemedium til cellene når ~ 70% konfluens.
    2. Dissociere cellene med en protease-kollagenaseblanding i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen og stamcellemediet. Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten med stamcellemedium og plate cellene ved 100 000 celler/cm2 på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i stamcellemedium supplert med 10 μM Y27632.
    3. Bytt ut stamcellemediet neste dag. Fortsett å mate cellene annenhver dag til de når >95% sammenløp (3-4 dager avhengig av cellelinjen).
    4. NPC Dag 0: Bytt ut mediet med N2B27 [50% DMEM / F12 + glutamintilskudd, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutamintilskudd, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P / S] supplert med 10 μM SB43152 og 100 nM LDN193189.
    5. NPC dager 1-9: Fôr cellene daglig med N2B27 supplert med 10 μM SB43152 og 100 nM LDN193189.
    6. NPC Dag 10: Del NPCer 1: 3 med protease-kollagenaseblandingen og frø på ferske reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i N2B27 supplert med 20 ng / ml FGF-basisk og 10 μM Y27632.
    7. NPC Dager 11 - 13: Fôr NPCer daglig med N2B27 supplert med 20 ng / ml FGF-basisk.
    8. NPC Dag 14: Del NPC 1: 3 med protease-kollagenaseblandingen og frø på ferske reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i N2B27 supplert med 20 ng / ml FGF-basisk og 10 μM Y27632.
    9. NPC Dag 15 / Astrocyte Dag 0: Dette er dag 0 av astrocyttdifferensieringen. Fôr cellene med komplett astrocyttmedium (AM).
      MERK: NPC-er kan opprettholdes i N2B27 supplert med 20 ng / ml FGF-basisk og passeres når de er sammenflytende. For å fryse NPC-er, resuspender cellepelleten i frysemedier [90 % KSR og 10 % DMSO], del cellene 1:3 og frys ned ved hjelp av en frysebeholder ved -80 °C. Tine på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i N2B27 supplert med 20 ng / ml bFGF og 10 μM Y27632.
    10. Astrocyttdagene 1-30: Fôr cellene hver 2-3 dag med AM. Når cellene er >90% konfluerende, passerer ved hjelp av protease-kollagenaseblandingen og platen ved 15.000 celler / cm2 på friske reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i AM.
      MERK: Astrocytter skal være fullstendig differensiert i løpet av 30 dager. Astrocytter kan fryses i frysemedier [90 % KSR og 10 % DMSO] i en frysebeholder ved -80 °C. Tine på reduserte GF kjellermembranmatrisebelagte plater i AM ved 25.000-35.000 celler / cm2.
    11. Bekreft NPC-differensiering ved immuncytokjemi ved bruk av antistoffer mot Nestin og SOX2. Bekreft astrocyttdifferensiering ved immuncytokjemi med antistoffer mot S100B og CD44 (figur 2C).

2. Montering av iBBB

  1. Tine redusert vekstfaktor (GF) membranmatrise over natten ved 4 °C. Ikke fortynn denne matrisen i DMEM, da iBBB-ene er innkapslet i 100% redusert GF kjellermembranmatrise. Hver iBBB krever 50 μL av matrisen.
  2. Dissosiere de differensierte ECene med en protease-kollagenaseblanding ved 37 °C i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen og hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P / S). Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten i hECSR.
    MERK: Bruk et konisk rør, enten 15 ml eller 50 ml, som er stort nok til å imøtekomme volumet av dissosierte celler pluss media. Cellene kan også deles mellom flere rør og deretter rekombineres ved resuspensjon.
  3. Dissosiere de differensierte PC-ene med protease-kollagenaseblandingen ved 37 °C i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen og N2B27 (50% DMEM / F12 + glutamintilskudd, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x glutamintilskudd, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicillin-streptomycin [P / S]). Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten i N2B27.
  4. Dissosiere de differensierte astrocyttene med protease-kollagenaseblandingen ved 37 °C i 5 minutter. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør med et 1: 3-forhold mellom protease-kollagenaseblandingen for å fullføre astrocyttmedium (AM). Spinn ned celler ved 300 × g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten i AM.
  5. Bruk et hemocytometer til å telle hver celletype. Fortynn hver type cellesuspensjon til en endelig konsentrasjon på 1 × 106 celler/ml i egnet medium.
  6. Kombiner det beregnede antall celler for hver celletype i et konisk rør: 50 μL iBBB krever 2,5 × 105 EC, 5 × 104 stk og 5 × 104 astrocytter. Ta med 10 % mer enn det beregnede antallet celler for å ta høyde for pipetteringsfeil. Spinn ned celleblandingen ved 300 × g i 3 minutter.
    MERK: Det anbefales sterkt å plate noen gjenværende celler av hver celletype i 2D monokulturer for å fikse og flekke for kvalitetskontroll av inngangscellene. Plate hver celletype ved 35.000 celler / cm2 på tidligere tilberedte plater belagt med redusert GF kjellermembranmatrise og fiks etter 3-4 dager. Se tabell 1 for celletypespesifikke antistoffer.
  7. Aspiratmedium fra cellepelleten som etterlater ca. 50 μl av supernatanten over cellepelleten. Bruk en P200, resuspender cellepelleten forsiktig i gjenværende medium for å lage en encelleoppslemming.
  8. Bland celleoppslemmingen i nok redusert GF kjellermembranmatrise supplert med 10 ng / ml VEGF-A for ønsket antall iBBB ved 50 μL redusert GF kjellermembranmatrise per iBBB, pass på å blande cellene homogent mens du ikke introduserer luftbobler.
    MERK: Det er viktig å holde cellene og redusert GF kjellermembranmatrise på is på dette stadiet for å forhindre for tidlig polymerisering.
  9. Pipette 50 μL redusert GF kjellermembranmatriksblanding i brønnen til en 48-brønns glassbunnkulturskål. Fordel volumet jevnt utover bunnen av fatet (figur 1C).
  10. Inkuber iBBB-ene ved 37 °C i 30-40 minutter for å la den reduserte GF-kjellermembranmatrisen polymerisere, og innkapsle cellene i matrisen.
  11. Tilsett 500 μL AM supplert med 10 ng / ml vegf-a, 5 μg / ml doksycyklin og 10 μM Y27632.
  12. Endre mediet neste dag til AM supplert med 10 ng / ml VEGF-A. Fortsett å bytte medium hver 2-3 dag. Etter 2 uker, slutte å supplere med VEGF-A; iBBB-er er klare for nedstrømsanalyser etter 2 uker.

3. Indusere cerebral amyloid angiopati (CAA) med Aβ fibriller

  1. Forbered stamløsninger av amyloid-β1-40 og amyloid-β1-42 ved 200 μM i PBS.
  2. Legg Aβ til iBBB-medium på 2-ukers iBBB-er til en endelig konsentrasjon på 20 nM. Inkuber cellene i Aβ-supplert medium i 96 timer (4 dager).
  3. Etter 96 timer, fjern mediet og fortsett med festingen (avsnitt 4).

4. Feste og farge iBBB

  1. For å fikse iBBB, fjern mediet, vask i 1 ml PBS og inkuber i 500 μL 4% paraformaldehyd over natten ved 4 °C.
  2. Fjern 4% paraformaldehydoppløsningen, og skyll i 4 x (minst) 15 minutter i 1 ml PBS.
  3. Permeabiliser prøvene i 0,3% PBST (PBS med 0,3% Triton X-100) i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting.
  4. Inkuber kulturen i blokkerende buffer (5 % normalt serum i 0,3 % PBST) ved romtemperatur i minst 1 time med forsiktig risting.
    MERK: Den type serum som brukes er avhengig av vertsarten for de sekundære antistoffene som brukes. For eksempel, hvis vertsarten for de sekundære antistoffene er geit, bruk normalt geitserum; Hvis vertsarten er esel, bruk vanlig eselserum. Dette kan også gjøres over natten ved 4 °C ved forsiktig risting.
  5. Fortynn primære antistoffer mot anbefalt eller bestemt konsentrasjon i blokkerende buffer.
  6. Erstatt blokkeringsoppløsningen med primær antistofffortynning. Forsikre deg om at iBBB-ene er helt nedsenket i antistoffløsning for jevn inkubasjon; 100-150 μL er nok til å dekke en 50 μL iBBB i en 48-brønns glassbunnskulturskål. Inkuber over natten ved 4 °C med lett risting.
  7. Fjern det primære antistoffet. Vask iBBB i 3 x 10-20 min i 0,3% PBS.
  8. Fortynn det sekundære antistoffet til anbefalt eller bestemt konsentrasjon i blokkeringsbuffer. I tillegg tilsettes en kjernefysisk flekk, som Hoechst, til den sekundære antistoffløsningen ved anbefalt eller bestemt konsentrasjon.
  9. Erstatt den siste PBS-vasken med sekundær antistofffortynning. Forsikre deg om at iBBB-ene er helt nedsenket i antistoffløsning for jevn inkubasjon; 100-150 μL er nok til å dekke en 50 μL iBBB i en 48-brønns glassbunnskulturskål. Inkuber ved romtemperatur i 2 timer med forsiktig risting.
    MERK: Dette kan også gjøres over natten ved 4 °C ved forsiktig risting.
  10. Vask iBBB 4-5x i minst 1 time per vask i PBS. Oppbevares i PBS eller antifalmende monteringsmedier ved 4 °C til prøvene er avbildet.
  11. For å avbilde på et omvendt mikroskop, oppbevar iBBB-er i glassbunnplater eller tallerkener. Legg et glassdeksel over glassbrønnen for å holde iBBB-ene på plass (figur 1D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En riktig utformet iBBB størkner til en enkelt gjennomsiktig plate (figur 3A). Det er normalt at iBBB løsner fra overflaten som den først ble pipettert på etter noen dager. Dette kan ikke unngås, men er ikke en stor bekymring for riktig dannelse av iBBB hvis det tas forsiktighet når du bytter media for ikke å aspirere iBBB ved et uhell. Etter 24 timer, jevnt fordelt, kan enkeltceller identifiseres under et lysfeltmikroskop (figur 3B). Etter 2 uker kan mer distinkte strukturer være synlige, selv om det er vanskelig å skimte definisjonen (figur 3C).

Kvaliteten på iBBB er svært avhengig av kvaliteten på differensieringen av inngangscellene. Vi anbefaler på det sterkeste plating av noen gjenværende celler i 2D monokulturer for å fikse og beise for celletypespesifikke markører. iBBB dannet fra endotelceller som er over 70 % positive for PECAM1 eller VE-cadherin (figur 2A), pericytter over 95 % positive for PDGFRB (figur 2B) og astrocytter over 95 % positive for S100B og CD44 (figur 2C) er best for vellykkede iBBB-er. Resultatene fra denne kvalitetskontrollen er den tidligste indikatoren for iBBB-er av høy kvalitet.

Fysiologisk relevante 3D-strukturer skal dannes etter 2 ukers selvmontering. Ved festing og farging ser vi tegn på rørlignende strukturer som flekker positivt for endotelmarkøren PECAM1, noe som er kritisk for tett kryssdannelse (figur 4A). Den største variasjonen i iBBB-dannelse er omfanget av dannelse av mikrovaskulatur. I et "worst case" -scenario virker endotelcellenettverket mer fragmentert eller strekker seg ikke gjennom iBBB, mens i "best case" -scenariet er vaskulaturen jevn og grener gjennom iBBB. Endotelcelledifferensiering som er over 70% PECAM1-positiv danner mer konsistente nettverk. I tillegg er akvaporin-4, et protein uttrykt av astrocytter som lokaliseres til astrocyttens endeføtter, på linje med PECAM1-farging, noe som indikerer at astrocytter strekker ut endeføttene for å kontakte endotelcellene (figur 4B). Til slutt forventer vi å se pericytter rundt vaskulaturen (figur 4C).

Den primære avlesningen for cerebral amyloid angiopati (CAA) i iBBB er tilstedeværelsen av amyloid-β (Aβ). Aβ kan måles ved hjelp av målrettede antistoffer eller ved å så fluorescerende merket Aβ for å indusere CAA-fenotyper (figur 5). Behandling av iBBB med Aβ bør øke Aβ-fargeintensitet og areal, da cellene i BBB ikke uttrykker mye endogent Aβ-protein. Alternativt kan faste prøver farges med tioflavin T for å oppdage amyloidakkumulering. Aβ-nivåer er avhengig av genotypen til stamcellene som brukes til å generere iBBB, med noen Alzheimers sykdom og CAA-assosierte risikofaktorer som øker mengden Aβ-akkumulering og farging (figur 5B, C) 24.

Figure 1
Figur 1 En in vitro blod-hjernebarriere for modell av cerebral amyloid angiopati. (A) Skjematisk fremstilling av iBBB-montering og modning. Etter differensiering av endotelceller, astrocytter og pericytter fra induserte pluripotente stamceller, innkapsles celler i en gelmatrise i en enkeltcellesuspensjon. I løpet av 2 uker samles cellene selv i vaskulære enheter, som ligner strukturer identifisert in vivo. (B) Skjematisk fremstilling av analysen av cerebral amyloid angiopati. Amyloid-β tilsettes modne iBBB-er i 96 timer for å indusere Aβ-aggregering. (C) Diagram som viser sidevisningen av en iBBB etter såing i en brønn med glassbunn. (D) En grafikk av en iBBB forberedt for avbildning på et omvendt mikroskop. Forkortelser: BBB = blod-hjernebarriere; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iBBB = en in vitro-modell av den menneskelige BBB avledet fra en pasient iPSC-avledet BBB-modell, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise; Aβ = Amyloid-β. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Validering av iPSC-avledede iBBB-celler. (A) Representativ maksimal intensitetsprojeksjon av endotelceller i 2D monokulturer farget med VE-cadherin (grønn) og PECAM1 (rød). (B) Representative bilder av pericytter i 2D monokulturer farget med PDGFRB (grønn) og NG2 (rød). (C) Representative bilder av astrocytter i 2D monokulturer farget med CD44 (øverst; grønn) og S100B (nederst; grønn). Alle kjerner er farget med Hoechst 33342. Bildene ble tatt på en Nikon Eclipse Ti2-E med 20x forstørrelse (A,B) eller en Leica Stellaris 8 ved 40x forstørrelse (C). Alle skalastenger er 100 μm. Forkortelser: BBB = blod-hjernebarriere; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iBBB = en in vitro-modell av den menneskelige BBB avledet fra en pasient iPSC-avledet BBB-modell, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise; VE-cadherin = vaskulær endotelial cadherin; PECAM1 = blodplate- og endotelcelleadhesjonsmolekyl 1; PDGFRB = blodplateavledet vekstfaktorreseptor beta; NG2 = neuron glial antigen 2; S100B = S100 kalsiumbindende protein beta. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Montering av iBBB. (A) Brightfield-bilde av en 15 μL iBBB 24 timer etter plating ved 2x forstørrelse. (B) Brightfield-bilde av en iBBB 24 timer etter plating ved 10x forstørrelse. (C) Brightfield-bilde av en iBBB 2 uker etter plating ved 10x forstørrelse. Skalastang = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Bilder tatt på en omvendt Nikon Eclipse Ts2R-FL. Forkortelser: BBB = blod-hjernebarriere; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iBBB = en in vitro-modell av den menneskelige BBB avledet fra en pasient iPSC-avledet BBB-modell, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Celleinteraksjoner i iBBB. Representative bilder av endotelceller, pericytter og astrocytter i iBBB. (A) Endotelceller (PECAM1) og astrocytter (S100β). (B) Endotelceller (PECAM1) og astrocytt endeføtter (AQP-4) samlokalisering. (C) endotelceller (PECAM1) og pericytter (NG2). Alle kjerner er farget med Hoechst 33342. Konfokale Z-stack-bilder ble tatt på en Leica Stellaris 8 med 20x forstørrelse (A,B) eller en Nikon Eclipse Ti2-E ved 20x forstørrelse (C). Skalastenger = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Forkortelser: BBB = blod-hjernebarriere; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iBBB = en in vitro-modell av den menneskelige BBB avledet fra en pasient iPSC-avledet BBB-modell, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise; PECAM1 = blodplate- og endotelcelleadhesjonsmolekyl 1; AQP-4 = akvaporin-4; NG2 = nevron gliaantigen 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5 Cerebral amyloid angiopati in vitro. (A) Ikke-AD iBBB eksponert for betingede medier fra kontroll eller Aβ-overekspresjonsnevroner. 6e10 antistoff gjenkjenner Aβ. (B) Representative bilder av iBBB fra isogene APOE3- og APOE4-cellelinjer behandlet med 20 nM Aβ-FITC1-42 i 96 timer. (C) Kvantifisering av amyloid i iBBB fra isogene APOE3- og APOE4-cellelinjer behandlet med 20 nM, Aβ-FITC1-40 eller Aβ-FITC1-42. Skalastenger = 50 μm (A), 10 μm (B). Denne figuren ble tilpasset fra Blanchard et al24. Forkortelser: BBB = blod-hjernebarriere; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iBBB = en in vitro-modell av den menneskelige BBB avledet fra en pasient iPSC-avledet BBB-modell, som inkorporerer endotelceller, pericytter og astrocytter innkapslet i en 3D-matrise; Aβ = Amyloid-β. APOE = ApolipoproteinE. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Markører Firma Katalognummer Fortynning
Endotelceller PECAM1 (CD31) FoU-systemer AF806 1:500
VE-cadherin (CD144) FoU-systemer AF938 1:500
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Pericytter PDGFRβ FoU-systemer AF385 1:500
NG2 Abcam AB255811 1:500
Astrocytter S100β Sigma-Aldrich S2532-100uL 1:500
CD44 Teknologi for cellesignalering 3570-ÅRENE 1:400
AQP-4 Invitrogen PA5-53234 1:300
GFAP
ALDH1L1
EAAT1
EAAT2
Amyloid-β 6e10 Biolegende SIG-39320 1:1,000
Tioflavin T Chem Impex 22870 25 μM

Tabell 1: Anbefalte cellemarkører for kvalitetskontroll av differensiering. Cellemarkører for de forskjellige celletypene av BBB som kan brukes til å kontrollere kvaliteten på differensieringene og for å identifisere cellene i den dannede iBBB. Markørene som brukes i denne artikkelen er uthevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BBB dysfunksjon er en komorbiditet, og potensielt en årsak eller forverrende faktor i mange nevrologiske sykdommer 7,40,41. Imidlertid er det nesten umulig å studere molekylær- og cellebiologien som ligger til grunn for dysfunksjonen og nedbrytningen av BBB hos mennesker med nevrovaskulær sykdom. Inducible-BBB (iBBB) presentert i denne protokollen gir et in vitro-system som rekapitulerer viktige celleinteraksjoner av BBB, inkludert dannelse av vaskulær rør og lokalisering av astrocyttens endeføtter med vaskulatur. iBBB kan brukes til å studere de molekylære veiene som er involvert i ethvert stadium av BBB-dysfunksjon og kan modellere fenotyper av nevrovaskulær sykdom, for eksempel amyloid-β-aggregering, som sett i cerebral amyloid angiopati.

Monteringen av iBBB er grei, selv om kvaliteten på iBBB-ene er svært avhengig av kvaliteten på iPSC-avledede celler som brukes. Mens iBBB gir en flercellet nisje som kan fremme modningen av komponentcellene, må hver celletype være riktig mønstret før de blir innkapslet. Det er viktig å kvalitetskontrollere hver differensiering ved å utføre immunfluorescensfarging for celletypespesifikke markører på de enkelte monokulturene (tab 1). Hver iPSC-linje oppfører seg annerledes, og noen forhold, for eksempel såtetthet eller antall dager i hvert mønstermedium, må kanskje bestemmes empirisk og justeres for å optimalisere differensieringseffektiviteten.

Den beskrevne protokollen antyder en størrelse på 50 μL, men iBBB kan skaleres ned til så lite som 5 μL, avhengig av celletilgjengelighet, antall ønskede iBBB-er og nedstrømsapplikasjonen. Større iBBB inneholder flere celler, noe som gjør dem ideelle for protein-, lipid- eller nukleinsyresamling. Mindre iBBB-er kan legge til rette for narkotikaundersøkelser eller andre skalerbare analyser.

iBBB er et svært allsidig verktøy for å studere BBB in vitro. Fordi hver celletype er differensiert uavhengig, kan iBBB settes sammen fra forskjellige genetiske bakgrunner, slik at vi kan studere hvordan genetiske risikofaktorer påvirker spesifikke celletyper for å bidra til BBB-dysfunksjon. Denne strategien ble brukt for å vise at APOE4, den vanligste risikofaktoren for Alzheimers sykdom og cerebral amyloid angiopati, virker delvis gjennom en patogen mekanisme spesifikt i pericytter24. Videre bruk av dette verktøyet vil tillate oss å dissekere de individuelle bidragene fra EC, PCer og astrocytter for å opprettholde BBB-integritet og hvordan hver celletype svikter under sykdomsutvikling.

For tiden er den vanligste metoden for modellering av BBB in vitro ved å bruke et transbrønnsystem, sådd med EC, og noen ganger dyrket sammen med pericytter og / eller astrocytter, for å danne et ugjennomtrengelig monolag 42,43,44. 3D-strukturen til iBBB muliggjør selvmontering av den vaskulære enheten og tillater dannelse av rørformede strukturer som mer ligner fysiologisk vaskulatur. En ulempe med å så iBBB i en brønnplate, som beskrevet i denne protokollen, er at de ikke opplever de rene påkjenningene forårsaket av konstant strømningsvaskulatur i et in vivo-system. For å overvinne dette kan iBBB sås til en mikrofluidisk brikke som kan generere en dynamisk flyt 45,46,47. Dette systemet kan også brukes til å teste vaskulaturpermeabilitet og perfusjon av små molekyler.

Avslutningsvis gir denne metoden en fleksibel, 3D, iPSC-avledet modell av BBB som kan brukes som en plattform for å studere utallige aspekter av BBB på mobilnivå, inkludert evnen til å rekapitulere fenotyper av nevrovaskulær sykdom og potensialet til å skjerme BBB-permeabilitet for et bredt spekter av applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF / ASAP Foundation og Brain Injury Association of America. C.G. er støttet av NIH F31NS130909. Figur 1A ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

blod-hjernebarriere CNS nevrologisk sykdom terapeutisk legemiddellevering BBB-funksjon cerebral amyloid angiopati Alzheimers sykdom nevrodegenerasjon humane pluripotente stamceller endotelceller pericytter astrocytter 3D-matrise IBBB amyloidavsetning cerebrovaskulær sykdom genetiske faktorer miljøfaktorer legemiddelscreening medisinsk målretting
Rekonstruksjon av blod-hjernebarrieren <em>in vitro</em> for å modellere og terapeutisk målrette nevrologisk sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter