Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إعادة بناء الحاجز الدموي الدماغي في المختبر لنمذجة الأمراض العصبية واستهدافها علاجيا

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

يلعب الحاجز الدموي الدماغي (BBB) دورا حاسما في الحفاظ على بيئة دماغية مستقرة وصحية. يرتبط خلل BBB بالعديد من الأمراض العصبية. لقد قمنا بتطوير نموذج 3D ، مشتق من الخلايا الجذعية من BBB للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية الدماغية ، وسلامة BBB ، وكيف يتم تغيير BBB عن طريق علم الوراثة والمرض.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو مكون فسيولوجي رئيسي للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث يحافظ على العناصر الغذائية ، ويزيل النفايات ، ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض. تشكل خصائص الحاجز المتأصل في BBB تحديا لتوصيل الأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي لعلاج الأمراض العصبية. ارتبط ضعف وظيفة BBB بالأمراض العصبية. اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، ترسب الأميلويد في الأوعية الدموية الدماغية مما يؤدي إلى BBB للخطر ، هو اعتلال مشترك في معظم حالات مرض الزهايمر (AD) ، مما يشير إلى أن خلل BBB أو الانهيار قد يكون متورطا في التنكس العصبي. نظرا لمحدودية الوصول إلى أنسجة BBB البشرية ، تظل الآليات التي تساهم في وظيفة BBB المناسبة وانحطاط BBB غير معروفة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير BBB مشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (iBBB) من خلال دمج الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية في مصفوفة 3D. يتجمع iBBB ذاتيا لتلخيص التشريح والتفاعلات الخلوية الموجودة في BBB. يلتقط بذر iBBBs باستخدام الأميلويد الجوانب الرئيسية ل CAA. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر iBBB منصة مرنة لتعديل العوامل الوراثية والبيئية المتورطة في الأمراض الدماغية الوعائية والتنكس العصبي ، للتحقيق في كيفية تأثير الوراثة ونمط الحياة على مخاطر المرض. أخيرا ، يمكن استخدام iBBB لفحص الأدوية ودراسات الكيمياء الطبية لتحسين التسليم العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي. في هذا البروتوكول ، نصف تمايز الأنواع الثلاثة من الخلايا (الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية) الناشئة عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، وكيفية تجميع الخلايا المتمايزة في iBBB ، وكيفية نمذجة CAA في المختبر باستخدام الأميلويد الخارجي. يتغلب هذا النموذج على التحدي المتمثل في دراسة أنسجة المخ البشرية الحية بنظام يتمتع بكل من الدقة البيولوجية والمرونة التجريبية ، ويتيح استجواب BBB البشري ودوره في التنكس العصبي.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرئيسية التي تفصل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط للحفاظ على بيئة مثالية للوظيفة العصبية المناسبة. له دور حاسم في تنظيم تدفق وتدفق المواد إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال الحفاظ على التوازن الأيضي1،2،3،4 ، وإزالة النفايات4،5،6 ، وحماية الدماغ من مسببات الأمراض والسموم7،8.

نوع الخلية الأولية ل BBB هو الخلية البطانية (EC). تشكل الخلايا البطانية ، المشتقة من سلالة الأديم المتوسط ، جدران الأوعية الدموية 1,9. تشكل ECs الأوعية الدموية الدقيقة تقاطعات ضيقة مع بعضها البعض لتقليل نفاذية غشائها بشكل كبير10،11،12،13،14 أثناء التعبير عن الناقلات لتسهيل حركة العناصر الغذائية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي1،4،12،14. يتم إحاطة ECs الأوعية الدموية الدقيقة بواسطة الخلايا الجدارية (PCs) التي تنظم وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة والتوازن وهي ضرورية لتنظيم نفاذية BBB للجزيئات والخلايا المناعية15،16،17. الخلية النجمية ، وهي نوع من الخلايا الدبقية الرئيسية ، هي نوع الخلية النهائي الذي يتكون من BBB. تلتف أقدام نهاية الخلايا النجمية حول الأنابيب الوعائية EC-PC بينما تمتد أجسام الخلايا إلى حمة الدماغ ، وتشكل اتصالا بين الخلايا العصبية والأوعية الدموية1. يتم تحديد ناقلات المذاب والركيزة المتميزة على أقدام نهاية الخلايا النجمية (على سبيل المثال ، aquaporin 4 [AQP-4]) التي لها دور حاسم في وظيفة BBB18،19،20،21.

يعد BBB أمرا بالغ الأهمية في الحفاظ على وظيفة صحة الدماغ المناسبة ، وقد تم الإبلاغ عن خلل وظيفي في BBB في العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) 22،23،24،25 ، والتصلب المتعدد7،26،27،28 ، والصرع29،30 ، والسكتة الدماغية31،32. من المعترف به بشكل متزايد أن التشوهات الوعائية الدماغية تلعب دورا مركزيا في التنكس العصبي ، مما يساهم في زيادة التعرض للأحداث الإقفارية والنزفية. على سبيل المثال ، يعاني أكثر من 90٪ من مرضى الزهايمر من اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، وهي حالة تتميز بترسب β الأميلويد (Aβ) على طول الأوعية الدموية الدماغية. يزيد CAA من نفاذية BBB ويقلل من وظيفة BBB ، مما يجعل الجهاز العصبي المركزي عرضة لنقص التروية والأحداث النزفية والتدهور المعرفي المتسارع33.

لقد طورنا مؤخرا نموذجا في المختبر ل BBB البشري ، مشتقا من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها المريض ، والتي تتضمن ECs وأجهزة الكمبيوتر والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D (الشكل 1A). يلخص iBBB التفاعلات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، بما في ذلك تكوين أنبوب الأوعية الدموية وتوطين أقدام نهاية الخلايا النجمية مع الأوعية الدموية24. قمنا بتطبيق iBBB لنمذجة حساسية CAA بوساطة APOE4 (الشكل 1B). وقد مكننا ذلك من تحديد الآليات الخلوية والجزيئية السببية التي يعزز بها APOE4 CAA ، والاستفادة من هذه الأفكار لتطوير استراتيجيات علاجية تقلل من أمراض CAA وتحسن التعلم والذاكرة في الجسم الحي في الفئران APOE424. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا وفيديو تعليمي لإعادة بناء BBB من iPSCs البشرية ونمذجة CAA في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التمييز بين iPSCs إلى خلايا iBBB

ملاحظة: سبق وصف بروتوكولات التمايز هذه في Mesentier-Louro et al.34.

  1. طلاء لوحات ثقافة الخلايا
    1. ذوبان الجليد خفضت مصفوفة غشاء عامل النمو (GF) بين عشية وضحاها عند 4 °C. تمييع 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 49.5 مل من DMEM. حافظ على هذا المحلول باردا لمنع البلمرة المبكرة لمحلول الطلاء.
    2. أضف 1-2 مل لكل بئر من صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 6 آبار. اترك محلول الطلاء لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل استبداله بوسط الاستزراع الدافئ المناسب.
  2. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا بطانية محفزة ل ETV2
    التوقيت: 8 أيام
    ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Blanchard et al.24 وQian et al.35. نستخدم التعبير المستحث للدوكسيسيكلين لعامل النسخ ETV2 ، كما وصفه Wang et al.36 لتحسين العائد. تم إدخال ETV2 عبر بلازميد PiggyBac ثم تم نقل الخلايا.
    1. استزراع iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط خلايا جذعية متعدد القدرات خال من وحدة التغذية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
      ملاحظة: نوصي بالحفاظ على iPSCs المستحثة مع اختيار بلازميد PiggyBac (أي بوروميسين)
    2. يوم 0: افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 20800 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مكملة ب 10 ميكرومتر Y27632.
    3. يوم 1: استبدل الوسط ب DeSR1 [DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 1x كحد أدنى من الأحماض الأمينية الأساسية المتوسطة غير الأساسية (MEM-NEAA) ، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S)] ، مكمل ب 10 نانوغرام / مل BMP4 ، 6 ميكرومتر CHIR99021 ، و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
    4. يوم 3: يستعاض عن الوسط ب DeSR2 [DMEM/F12 + مكمل غلوتامين، 1x MEM-NEAA، 1x N-2، 1x B-27، 1٪ P/S] مكملا ب 5 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين.
    5. يوم 5: يستعاض عن الوسط ب hECSR [وسط خال من المصل البطاني البشري، 1x MEM-NEAA، 1x B-27، 1٪ P/S] مكملا ب 50 نانوغرام/مل VEGF-A، 2 ميكرومتر فورسكولين، 5 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين.
    6. يوم 7: يستعاض عن الوسط ب hECSR المكمل ب 50 نانوغرام/مل من VEGF-A و2 ميكرومتر فورسكولين و5 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين.
    7. يوم 8: قم بتقسيم ECs 1: 3 بمزيج من البروتياز والكولاجيناز وأعد البذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي منخفض GF في hECSR مكملة ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
      ملاحظة: هذه هي أفضل نقطة زمنية لتغليف ECs في iBBBs لتشكيل الأوعية الدموية بشكل موحد.
    8. يوم 10+: تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع hECSR المكمل ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين. استمر في تقسيم الخلايا 1: 3 بمزيج البروتياز والكولاجيناز عندما تكون الألواح متقاربة.
      ملاحظة: يمكن تجميد ECs المشتقة من iPSC في أي وقت بدءا من اليوم 8. ارفع الخلايا ، كما لو كانت تمر. أعد تعليق الحبيبات في وسط التجميد EC [60٪ استبدال مصل الضربة القاضية (KSR) ، 30٪ hECSR ، 10٪ DMSO ، 50 نانوغرام / مل VEGF-A ، و 10 ميكرومتر Y27632] ، وتقسيم الخلايا 1: 3 ، والتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بالذوبان على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في hECSR مكملة ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A ، 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
    9. تأكيد تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد CD31 / PECAM1 أو VE-cadherin (الشكل 2A).
  3. تمايز iPSCs البشرية إلى pericytes
    التوقيت: 6 أيام
    ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من Patsch et al.36.
    1. ثقافة iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع GF مخفضة في ظروف خالية من التغذية في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
    2. يوم 0: افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 37000-40000 خلية / سم2 (اعتمادا على خط الخلية) على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مع استكمال 10 ميكرومتر Y27632.
    3. يوم 1: استبدل الوسائط ب N2B27 [50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x ، مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1x- B-27 ، 1٪ P / S] مكمل ب 25 نانوغرام / مل BMP4 و 8 ميكرومتر CHIR99021.
    4. الأيام 3-4: استبدل الوسائط ب N2B27 المكمل ب 2 نانوغرام / مل أكتيفين أ و 10 نانوغرام / مل PDGF-BB ، وقم بالتغذية يوميا.
    5. يوم 5: قم بتقسيم أجهزة الكمبيوتر بمزيج البروتياز والكولاجيناز والبذور على ألواح مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ عند 35000 خلية / سم2 في N2B27 مكملة ب 10 نانوغرام / مل PDGF-BB.
      ملاحظة: تقسيم الخلايا فقط مرة واحدة متقاربة. قد تتطلب بعض الخطوط بضعة أيام أخرى قبل أن تكون جاهزة للانقسام ؛ استمر في تغيير الوسائط يوميا حتى تتلاقى الخلايا.
    6. قم بتوسيع أجهزة الكمبيوتر في N2B27 مع استكمال 10 نانوغرام / مل PDGF-BB ، وتغيير الوسائط كل 2-3 أيام. قم بإزالة PDGF-BB من الوسائط بعد أن تصل الخلايا مرة أخرى إلى نقطة التقاء وتخضع لممر ثان.
      ملاحظة: Pericytes جاهزة للاستخدام في iBBBs بعد المقطع الثاني. بمجرد توسيعها ، يمكن تجميد أجهزة الكمبيوتر. ارفع الخلايا كما لو كانت تمر ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] وقم بالتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج على ألواح مطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ عند 35000 خلية / سم2 في N2B27.
    7. تأكيد تمايز pericyte عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد PDGFRB و NG2 (الشكل 2B).
  4. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) وخلايا نجمية
    التوقيت: إجمالي 45 يوما (15 يوما ل NPCs تليها 30 يوما للخلايا النجمية)
    ملاحظة: تم تكييف بروتوكول تمايز NPC من Chambers et al.38 ، وتمايز الخلايا النجمية كما هو موضح في TCW et al.39.
    1. ثقافة iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع GF مخفضة في ظروف خالية من التغذية في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
    2. افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 100000 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مكملة ب 10 ميكرومتر Y27632.
    3. استبدل وسط الخلايا الجذعية في اليوم التالي. استمر في تغذية الخلايا كل يوم حتى تصل إلى التقاء >95٪ (3-4 أيام حسب خط الخلية).
    4. NPC اليوم 0: استبدل الوسائط ب N2B27 [50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x ، مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1X- B-27 ، 1٪ P / S] مكمل ب 10 ميكرومتر SB43152 و 100 نانومتر LDN193189.
    5. أيام NPC 1-9: تغذية الخلايا يوميا مع N2B27 تستكمل مع 10 ميكرومتر SB43152 و 100 نانومتر LDN193189.
    6. NPC اليوم 10: قم بتقسيم NPCs 1: 3 مع خليط البروتياز والكولاجيناز والبذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF أساسي و 10 ميكرومتر Y27632.
    7. أيام NPC 11 - 13: قم بتغذية NPCs يوميا باستخدام N2B27 المكمل ب 20 نانوغرام / مل FGF-basic.
    8. اليوم 14 من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني: قم بتقسيم NPCs 1: 3 مع خليط البروتياز والكولاجيناز وإعادة البذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF أساسي و 10 ميكرومتر Y27632.
    9. NPC اليوم 15 / يوم الخلايا النجمية 0: هذا هو اليوم 0 من تمايز الخلايا النجمية. تغذية الخلايا مع وسط الخلايا النجمية الكامل (AM).
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على NPCs في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF الأساسي وتمريرها عند التقارب. لتجميد NPCs ، أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] ، وقم بتقسيم الخلايا 1: 3 ، وقم بالتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الجليد على الألواح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة في N2B27 المكملة ب 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y27632.
    10. أيام الخلايا النجمية 1-30: تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع AM. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة >90٪ ، قم بالمرور باستخدام خليط البروتياز والكولاجيناز والصفيحة عند 15000 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي منخفض GF في AM.
      ملاحظة: يجب تمييز الخلايا النجمية بشكل كامل في غضون 30 يوما. يمكن تجميد الخلايا النجمية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] في حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الجليد على الألواح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة في AM عند 25000-35000 خلية / سم2.
    11. تأكيد تمايز NPC عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد Nestin و SOX2. تأكيد تمايز الخلايا النجمية عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد S100B و CD44 (الشكل 2C).

2. تجميع iBBB

  1. ذوبان الجليد انخفاض عامل النمو (GF) مصفوفة الغشاء القاعدي بين عشية وضحاها عند 4 °C. لا تخفف هذه المصفوفة في DMEM حيث يتم تغليف iBBBs في مصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة بنسبة 100٪. يتطلب كل iBBB 50 ميكرولتر من المصفوفة.
  2. افصل ECs المتمايزة بخليط البروتياز والكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز إلى hECSR (وسط خال من مصل البطانية البشري ، 1x MEM-NEAA ، 1x B-27 ، 1٪ P / S). قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في hECSR.
    ملاحظة: استخدم أنبوبا مخروطيا ، إما 15 مل أو 50 مل ، وهو كبير بما يكفي لاستيعاب حجم الخلايا المنفصلة بالإضافة إلى الوسائط. يمكن أيضا تقسيم الخلايا بين أنابيب متعددة ثم إعادة تجميعها عند التعليق.
  3. افصل أجهزة الكمبيوتر المتمايزة بمزيج البروتياز والكولاجيناز على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز إلى N2B27 (50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1x B-27 ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين [P / S]). قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في N2B27.
  4. افصل الخلايا النجمية المتمايزة بخليط البروتياز والكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز لإكمال وسط الخلايا النجمية (AM). قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في AM.
  5. باستخدام مقياس الدم ، عد كل نوع من الخلايا. خفف كل نوع من أنواع معلقات الخلايا إلى تركيز نهائي قدره 1 × 106 خلايا / مل في الوسط المناسب.
  6. اجمع بين العدد المحسوب للخلايا لكل نوع خلية في أنبوب مخروطي: يتطلب 50 ميكرولتر من iBBB 2.5 × 105 ECs و 5 × 104 أجهزة كمبيوتر و 5 × 104 خلايا نجمية. قم بتضمين 10٪ أكثر من العدد المحسوب للخلايا لحساب أخطاء السحب. قم بتدوير خليط الخلية على حرارة 300 × جم لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: يوصى بشدة بلوحة بعض الخلايا المتبقية من كل نوع خلية في 2D monocultures لإصلاح وصمة عار لمراقبة جودة خلايا الإدخال. قم بلوحة كل نوع خلية عند 35000 خلية / سم2 على ألواح معدة مسبقا مطلية بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة وتثبيتها بعد 3-4 أيام. انظر الجدول 1 لمعرفة الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية.
  7. نضح وسط من بيليه الخلية تاركا حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية فوق حبيبات الخلية. باستخدام P200 ، أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في الوسط المتبقي لإنشاء ملاط أحادي الخلية.
  8. امزج ملاط الخلية في مصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة كافية مكملة ب 10 نانوغرام / مل VEGF-A للعدد المطلوب من iBBBs عند 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة لكل iBBB ، مع الحرص على خلط الخلايا بشكل متجانس مع عدم إدخال أي فقاعات هواء.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الحفاظ على الخلايا وتقليل مصفوفة الغشاء القاعدي GF على الجليد في هذه المرحلة لمنع البلمرة المبكرة.
  9. ماصة 50 ميكرولتر من خليط مصفوفة الغشاء القاعدي GF المختزل في بئر طبق استزراع زجاجي القاع مكون من 48 بئرا. قم بتوزيع الحجم بالتساوي في جميع أنحاء قاع الطبق (الشكل 1C).
  10. احتضان iBBBs عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي GF المختزلة بالبلمرة ، وتغليف الخلايا في المصفوفة.
  11. أضف 500 ميكرولتر من AM المكمل ب 10 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين و 10 ميكرومتر Y27632.
  12. قم بتغيير الوسط في اليوم التالي إلى AM مع استكمال 10 نانوغرام / مل VEGF-A. استمر في تغيير الوسيط كل 2-3 أيام. بعد 2 أسابيع ، توقف عن تناول مكملات VEGF-A ؛ iBBBs جاهزة لمقايسات المصب بعد 2 أسابيع.

3. إحداث اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) مع ألياف Aβ

  1. تحضير محاليل المخزون من الأميلويد β1-40 والأميلويد β1-42 عند 200 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني.
  2. أضف Aβ إلى وسيط iBBB على iBBBs لمدة أسبوعين إلى تركيز نهائي يبلغ 20 نانومتر. احتضان الخلايا في وسط مكمل ب Aβ لمدة 96 ساعة (4 أيام).
  3. بعد 96 ساعة ، قم بإزالة الوسيط واستمر في التثبيت (القسم 4).

4. إصلاح وتلطيخ iBBB

  1. لإصلاح iBBB ، قم بإزالة الوسط ، واغسله في 1 مل من PBS ، واحتضانه في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة محلول بارافورمالدهايد 4٪ ، واشطفه لمدة 4 × (على الأقل) 15 دقيقة في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. تتخلل العينات في 0.3٪ PBST (PBS مع 0.3٪ Triton X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
  4. احتضان الثقافات في منع العازلة (5٪ مصل عادي في 0.3٪ PBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل مع هز لطيف.
    ملاحظة: يعتمد نوع المصل المستخدم على الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. على سبيل المثال ، إذا كانت الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية هي الماعز ، فاستخدم مصل الماعز الطبيعي ؛ إذا كان النوع المضيف هو حمار ، فاستخدم مصل الحمير العادي. يمكن القيام بذلك أيضا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز الموصى به أو المحدد في منع العازلة.
  6. استبدل محلول الحجب بتخفيف الجسم المضاد الأساسي. تأكد من أن iBBBs مغمورة بالكامل في محلول الأجسام المضادة حتى الحضانة ؛ 100-150 ميكرولتر تكفي لتغطية 50 ميكرولتر iBBB في طبق استزراع زجاجي القاع 48 بئرا. احتضان الليلية على حرارة 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  7. إزالة الجسم المضاد الأساسي. اغسل iBBBs لمدة 3 × 10-20 دقيقة في 0.3٪ PBS.
  8. تمييع الجسم المضاد الثانوي إلى التركيز الموصى به أو المحدد في منع العازلة. بالإضافة إلى ذلك ، أضف بقعة نووية ، مثل Hoechst ، إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي بالتركيز الموصى به أو المحدد.
  9. استبدل آخر غسل PBS بتخفيف الأجسام المضادة الثانوي. تأكد من أن iBBBs مغمورة بالكامل في محلول الأجسام المضادة حتى الحضانة ؛ 100-150 ميكرولتر تكفي لتغطية 50 ميكرولتر iBBB في طبق استزراع زجاجي القاع 48 بئرا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع هز لطيف.
    ملاحظة: يمكن أيضا القيام بذلك طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
  10. اغسل iBBBs 4-5x لمدة 1 ساعة على الأقل لكل غسلة في برنامج تلفزيوني. يخزن في PBS أو وسائط تركيب مضادة للبهتان على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تصوير العينات.
  11. للتصوير على مجهر مقلوب ، احتفظ ب iBBBs في أطباق أو أطباق ذات قاع زجاجي. ضع غطاء زجاجي فوق البئر الزجاجي للحفاظ على iBBBs في مكانها (الشكل 1 د).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتجمد iBBB المشكل بشكل صحيح في قرص شفاف واحد (الشكل 3 أ). من الطبيعي أن ينفصل iBBB عن السطح الذي تم سحبه عليه لأول مرة بعد بضعة أيام. لا يمكن تجنب ذلك ، ولكنه ليس مصدر قلق كبير للتكوين الصحيح ل iBBB إذا تم توخي الحذر عند تغيير الوسائط لعدم استنشاق iBBB عن طريق الخطأ. بعد 24 ساعة ، موزعة بالتساوي ، يمكن تحديد الخلايا المفردة تحت مجهر برايت فيلد (الشكل 3 ب). بعد أسبوعين ، قد تكون الهياكل الأكثر تميزا مرئية ، على الرغم من صعوبة تحديدها بالتعريف (الشكل 3C).

تعتمد جودة iBBB بشكل كبير على جودة تمايز خلايا الإدخال. نوصي بشدة بطلاء بعض الخلايا المتبقية في الزراعة الأحادية 2D لإصلاح وتلوين علامات محددة من نوع الخلية. iBBBs المتكونة من الخلايا البطانية التي تزيد عن 70٪ إيجابية ل PECAM1 أو VE-cadherin (الشكل 2A) ، والخلايا المحيطة أكثر من 95٪ إيجابية ل PDGFRB (الشكل 2B) ، والخلايا النجمية التي تزيد عن 95٪ إيجابية ل S100B و CD44 (الشكل 2C) هي الأفضل ل iBBBs الناجحة. نتائج فحص الجودة هذا هي أول مؤشر ل iBBBs عالية الجودة.

يجب أن تتشكل هياكل 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية بعد 2 أسابيع من التجميع الذاتي. عند التثبيت والتلوين ، نرى دليلا على وجود هياكل تشبه الأنبوب تلطخ إيجابية للعلامة البطانية PECAM1 ، وهو أمر بالغ الأهمية لتشكيل الوصلة الضيقة (الشكل 4 أ). أكبر تباين في تكوين iBBB هو مدى تكوين الأوعية الدموية الدقيقة. في سيناريو "أسوأ الحالات" ، تبدو شبكة الخلايا البطانية أكثر تجزؤا أو لا تمتد في جميع أنحاء iBBB ، بينما في سيناريو "أفضل الحالات" ، تكون الأوعية الدموية موحدة وتتفرع في جميع أنحاء iBBB. يشكل تمايز الخلايا البطانية الذي يزيد عن 70٪ إيجابي PECAM1 شبكات أكثر اتساقا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن aquaporin-4 ، وهو بروتين تعبر عنه الخلايا النجمية يتمركز في نهاية الخلايا النجمية ، يتماشى مع تلطيخ PECAM1 ، مما يشير إلى أن الخلايا النجمية تمد أقدامها الطرفية للاتصال بالخلايا البطانية (الشكل 4B). وأخيرا، نتوقع أن نرى الخلايا المحيطة حول الأوعية الدموية (الشكل 4C).

القراءة الأولية لاعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) في iBBBs هي وجود β الأميلويد (Aβ). يمكن قياس Aβ باستخدام الأجسام المضادة المستهدفة أو عن طريق البذر المسمى بالفلورسنت Aβ للحث على الأنماط الظاهرية ل CAA (الشكل 5). يجب أن تزيد معالجة iBBBs ب Aβ من شدة تلطيخ Aβ ومساحته ، لأن خلايا BBB لا تعبر عن الكثير من بروتين Aβ الداخلي. بدلا من ذلك ، يمكن تلطيخ العينات الثابتة ب Thioflavin T للكشف عن تراكم الأميلويد. تعتمد مستويات Aβ على النمط الجيني للخلايا الجذعية المستخدمة لتوليد iBBB ، مع بعض عوامل الخطر المرتبطة بمرض الزهايمر و CAA التي تزيد من كمية تراكم Aβ وتلطيخه (الشكل 5B ، C) 24.

Figure 1
الشكل 1: حاجز دموي دماغي في المختبر لنموذج اعتلال الأوعية النشواني الدماغي. (أ) التمثيل التخطيطي لتجميع iBBB والنضج. بعد تمايز الخلايا البطانية والخلايا النجمية والخلايا المحيطة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، يتم تغليف الخلايا في مصفوفة هلامية في تعليق أحادي الخلية. على مدار 2 أسابيع ، تتجمع الخلايا ذاتيا في وحدات الأوعية الدموية ، على غرار الهياكل المحددة في الجسم الحي. ب: رسم تخطيطي لمقايسة اعتلال الأوعية النشواني الدماغي. يضاف الأميلويد β إلى iBBBs الناضجة لمدة 96 ساعة للحث على تجميع Aβ. (ج) شكل يوضح المنظر الجانبي ل iBBB بعد البذر في بئر ذات قاع زجاجي. د: رسم بياني ل iBBB معد للتصوير على مجهر مقلوب. الاختصارات: BBB = حاجز الدم في الدماغ. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iBBB = نموذج في المختبر من BBB البشري مشتق من نموذج BBB مشتق من iPSC للمريض ، والذي يتضمن الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D ؛ Aβ = أميلويد β. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من صحة خلايا iBBB المشتقة من iPSC. (أ) الإسقاط التمثيلي الأقصى للكثافة للخلايا البطانية في الزراعات الأحادية ثنائية الأبعاد الملطخة ب VE-cadherin (أخضر) و PECAM1 (أحمر). (B) صور تمثيلية للخلايا المحيطة في زراعات أحادية ثنائية الأبعاد ملطخة ب PDGFRB (أخضر) و NG2 (أحمر). (C) صور تمثيلية للخلايا النجمية في الزراعات الأحادية ثنائية الأبعاد الملطخة ب CD44 (أعلى ؛ أخضر) و S100B (أسفل ؛ أخضر). جميع النوى ملطخة ب Hoechst 33342. تم التقاط الصور على نيكون Eclipse Ti2-E عند تكبير 20x (A ، B) أو Leica Stellaris 8 عند تكبير 40x (C). جميع قضبان المقياس 100 ميكرومتر. الاختصارات: BBB = حاجز الدم في الدماغ. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iBBB = نموذج في المختبر من BBB البشري مشتق من نموذج BBB مشتق من iPSC للمريض ، والذي يتضمن الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D ؛ VE-cadherin = الكاديرين البطاني الوعائي ؛ PECAM1 = جزيء التصاق الصفائح الدموية والخلايا البطانية 1 ؛ PDGFRB = مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية بيتا. NG2 = مستضد الخلايا العصبية الدبقية 2 ؛ S100B = S100 بروتين بيتا ملزم للكالسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجميع iBBB. (A) صورة برايتفيلد ل 15 ميكرولتر iBBB 24 ساعة بعد الطلاء عند تكبير 2x. (B) صورة برايتفيلد ل iBBB 24 ساعة بعد الطلاء عند تكبير 10x. (C) صورة برايتفيلد ل iBBB بعد أسبوعين من الطلاء عند تكبير 10x. شريط المقياس = 1 مم (أ) ، 100 ميكرومتر (ب ، ج). الصور التي تم التقاطها على نيكون الكسوف المقلوب Ts2R-FL. الاختصارات: BBB = حاجز الدم في الدماغ. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iBBB = نموذج في المختبر من BBB البشري مشتق من نموذج BBB مشتق من iPSC للمريض ، والذي يتضمن الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التداخلات الخلوية في iBBB . صور تمثيلية للخلايا البطانية والخلايا المحيطة والخلايا النجمية في iBBB. أ: الخلايا البطانية (PECAM1) والخلايا النجمية (S100β). (ب) التوطين المشترك للخلايا البطانية (PECAM1) ونهاية الخلايا النجمية (AQP-4). ج: الخلايا البطانية (PECAM1) والخلايا المحيطة (NG2). جميع النوى ملطخة ب Hoechst 33342. تم التقاط صور Z-stack متحدة البؤر على Leica Stellaris 8 عند تكبير 20x (A ، B) أو Nikon Eclipse Ti2-E عند تكبير 20x (C). قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (أ) ، 100 ميكرومتر (ب ، ج). الاختصارات: BBB = حاجز الدم في الدماغ. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iBBB = نموذج في المختبر من BBB البشري مشتق من نموذج BBB مشتق من iPSC للمريض ، والذي يتضمن الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D ؛ PECAM1 = جزيء التصاق الصفائح الدموية والخلايا البطانية 1 ؛ AQP-4 = أكوابورين -4 ؛ NG2 = مستضد الخلايا العصبية الدبقية 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: اعتلال الأوعية النشواني الدماغي في المختبر. (أ) iBBBs غير AD المعرضة لوسائط مشروطة من الخلايا العصبية للتحكم أو الخلايا العصبية ذات التعبير المفرط Aβ. يتعرف الجسم المضاد 6e10 على Aβ. (ب) صور تمثيلية ل iBBBs من خطوط خلايا APOE3 و APOE4 متساوية المنشأ المعالجة ب 20 نانومتر Aβ-FITC1-42 لمدة 96 ساعة. (ج) القياس الكمي للأميلويد في iBBBs من خطوط خلايا APOE3 و APOE4 متساوية المنشأ المعالجة ب 20 نانومتر Aβ-FITC1-40 أو Aβ-FITC1-42. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (أ) ، 10 ميكرومتر (ب). تم اقتباس هذا الرقم من بلانشارد وآخرون24. الاختصارات: BBB = حاجز الدم في الدماغ. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iBBB = نموذج في المختبر من BBB البشري مشتق من نموذج BBB مشتق من iPSC للمريض ، والذي يتضمن الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D ؛ Aβ = أميلويد β. APOE = صميم البروتين الشحمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

علامات شركة رقم الكتالوج التخفيف
الخلايا البطانية بيكام 1 (CD31) أنظمة البحث والتطوير AF806 1:500
VE-كادهيرين (CD144) أنظمة البحث والتطوير AF938 1:500
زو-1 إنفيتروجين MA3-39100-A488 1:500
بيريسيتس PDGFRβ أنظمة البحث والتطوير AF385 1:500
إن جي 2 أبكام أب255811 1:500
الخلايا النجمية S100β سيغما ألدريتش S2532-100uL 1:500
سي دي 44 تقنية إشارات الخلية عقد 3570 1:400
القاعدة في القاعدة في العراق -4 إنفيتروجين PA5-53234 1:300
GFAP
ALDH1L1
إيات 1
إيات 2
أميلويد β 6E10 بيولوجيجند SIG-39320 1:1,000
ثيوفلافين تي كيم امبكس 22870 25 ميكرومتر

الجدول 1: علامات الخلايا الموصى بها لفحوصات جودة التمايز. علامات الخلية لأنواع الخلايا المختلفة من BBB التي يمكن استخدامها للتحقق من جودة التمايز وتحديد الخلايا في iBBB المشكلة. العلامات المستخدمة في هذه الورقة غامقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلل BBB هو مراضة مشتركة ، ويحتمل أن يكون سببا أو عاملا مفاقم في العديد من الأمراض العصبية7،40،41. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل دراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الخلل الوظيفي وانهيار BBB في البشر المصابين بأمراض الأوعية الدموية العصبية. يوفر Inducible-BBB (iBBB) المقدم في هذا البروتوكول نظاما في المختبر يلخص التفاعلات الخلوية المهمة ل BBB ، بما في ذلك تكوين أنبوب الأوعية الدموية وتوطين أقدام نهاية الخلايا النجمية مع الأوعية الدموية. يمكن استخدام iBBB لدراسة المسارات الجزيئية المشاركة في أي مرحلة من مراحل خلل BBB ويمكنه نمذجة الأنماط الظاهرية للأمراض العصبية الوعائية ، مثل تجميع الأميلويد β ، كما يظهر في اعتلال الأوعية الأميلويد الدماغي.

يعد تجميع iBBB أمرا بسيطا ، على الرغم من أن جودة iBBBs تعتمد بشكل كبير على جودة الخلايا المشتقة من iPSC المستخدمة. بينما يوفر iBBB مكانة متعددة الخلايا يمكن أن تعزز نضوج الخلايا المكونة ، يجب أن يكون كل نوع من الخلايا منقوشا بشكل صحيح قبل تغليفه. من الأهمية بمكان إجراء فحوصات الجودة على كل تمايز عن طريق إجراء تلطيخ التألق المناعي للعلامات الخاصة بنوع الخلية على الزراعات الأحادية الفردية (الجدول 1). يتصرف كل خط iPSC بشكل مختلف وقد تحتاج بعض الشروط ، مثل كثافة البذر أو عدد الأيام في كل وسط نقش ، إلى تحديدها تجريبيا وتعديلها لتحسين كفاءة التمايز.

يقترح البروتوكول الموصوف حجم 50 ميكرولتر ، ولكن يمكن تقليص iBBB إلى صغير يصل إلى 5 ميكرولتر ، اعتمادا على توفر الخلية وعدد iBBBs المطلوبة والتطبيق النهائي. تحتوي iBBBs الأكبر حجما على المزيد من الخلايا ، مما يجعلها مثالية لجمع البروتين أو الدهون أو الحمض النووي. يمكن أن تسهل iBBBs الأصغر فحوصات الأدوية أو غيرها من المقايسات القابلة للتطوير.

iBBB هي أداة متعددة الاستخدامات لدراسة BBB في المختبر. نظرا لأن كل نوع من الخلايا متمايز بشكل مستقل ، يمكن تجميع iBBBs من خلفيات وراثية مختلفة ، مما يسمح لنا بدراسة كيفية تأثير عوامل الخطر الوراثية على أنواع معينة من الخلايا للمساهمة في خلل BBB. تم تطبيق هذه الاستراتيجية لإظهار أن APOE4 ، عامل الخطر الأكثر شيوعا لمرض الزهايمر واعتلال الأوعية النشواني الدماغي ، يعمل جزئيا من خلال آلية مسببة للأمراض على وجه التحديد في pericytes24. سيسمح لنا الاستخدام الإضافي لهذه الأداة بتشريح المساهمات الفردية ل ECs وأجهزة الكمبيوتر والخلايا النجمية في الحفاظ على سلامة BBB وكيف يتعثر كل نوع من الخلايا أثناء تطور المرض.

حاليا ، الطريقة الأكثر شيوعا لنمذجة BBB في المختبر هي باستخدام نظام transwell ، المصنف مع ECs ، وأحيانا يتم استزراعه بشكل مشترك مع pericytes و / أو الخلايا النجمية ، لتشكيل طبقة أحادية غير منفذة42،43،44. هيكل 3D من iBBB تمكن من التجميع الذاتي لوحدة الأوعية الدموية ويسمح لتشكيل الهياكل أنبوبي التي تشبه أكثر الأوعية الدموية الفسيولوجية. عيب بذر iBBBs في لوحة جيدة ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، هو أنها لا تعاني من الضغوط الهائلة الناجمة عن التدفق المستمر للأوعية الدموية في نظام في الجسم الحي . للتغلب على هذا ، يمكن زرع iBBB في شريحة الموائع الدقيقة التي يمكن أن تولد تدفقا ديناميكيا45،46،47. يمكن أيضا استخدام هذا النظام لاختبار نفاذية الأوعية الدموية وتروية الجزيئات الصغيرة.

في الختام ، توفر هذه الطريقة نموذجا مرنا ، 3D ، مشتقا من iPSC من BBB يمكن استخدامه كمنصة لدراسة جوانب لا حصر لها من BBB على المستوى الخلوي ، بما في ذلك القدرة على تلخيص الأنماط الظاهرية للأمراض العصبية الوعائية وإمكانية فحص نفاذية BBB للدواء لمجموعة واسعة من التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من قبل NIH 3-UG3-NS115064-01 و R01NS14239 وصندوق علاج الزهايمر ووكالة ناسا 80ARCO22CA004 ومبادرة تشان زوكربيرج ومؤسسة MJFF / ASAP وجمعية إصابات الدماغ الأمريكية. يتم دعم CG من قبل المعاهد الوطنية للصحة F31NS130909. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

الحاجز الدموي الدماغي ، الجهاز العصبي المركزي ، الأمراض العصبية ، توصيل الأدوية العلاجية ، وظيفة BBB ، اعتلال الأوعية الدموية النشواني الدماغي ، مرض الزهايمر ، التنكس العصبي ، الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، الخلايا البطانية ، الخلايا المحيطة ، الخلايا النجمية ، مصفوفة 3D ، IBBB ، ترسب الأميلويد ، الأمراض الدماغية الوعائية ، العوامل الوراثية ، العوامل البيئية ، فحص الأدوية ، الاستهداف الطبي
إعادة بناء الحاجز الدموي الدماغي <em>في المختبر</em> لنمذجة الأمراض العصبية واستهدافها علاجيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J.… More

Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter