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Neuroscience

मॉडल और चिकित्सीय रूप से न्यूरोलॉजिकल रोग को लक्षित करने के लिए इन विट्रो में रक्त-मस्तिष्क बाधा का पुनर्निर्माण

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की एक स्थिर और स्वस्थ मस्तिष्क वातावरण को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका है। बीबीबी डिसफंक्शन कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों से जुड़ा हुआ है। हमने सेरेब्रोवास्कुलर पैथोलॉजी, बीबीबी अखंडता की जांच करने के लिए बीबीबी का एक 3 डी, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न मॉडल विकसित किया है, और बीबीबी को आनुवंशिकी और बीमारी से कैसे बदल दिया जाता है।

Abstract

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक प्रमुख शारीरिक घटक है, पोषक तत्वों को बनाए रखता है, अपशिष्ट को साफ करता है, और मस्तिष्क को रोगजनकों से बचाता है। बीबीबी के अंतर्निहित बाधा गुण न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए सीएनएस में चिकित्सीय दवा वितरण के लिए एक चुनौती पैदा करते हैं। बिगड़ा हुआ बीबीबी फ़ंक्शन न्यूरोलॉजिकल बीमारी से संबंधित है। सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए), सेरेब्रल वास्कुलचर में अमाइलॉइड का जमाव एक समझौता बीबीबी की ओर जाता है, अल्जाइमर रोग (एडी) के अधिकांश मामलों में एक सह-रुग्णता है, यह सुझाव देता है कि बीबीबी की शिथिलता या टूटना न्यूरोडीजेनेरेशन में शामिल हो सकता है। मानव बीबीबी ऊतक तक सीमित पहुंच के कारण, उचित बीबीबी फ़ंक्शन और बीबीबी अध: पतन में योगदान देने वाले तंत्र अज्ञात रहते हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने 3 डी मैट्रिक्स में एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को शामिल करके एक मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीबीबी (आईबीबीबी) विकसित किया है। आईबीबीबीबी बीबीबी में मौजूद शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर इंटरैक्शन को पुन: व्यवस्थित करने के लिए स्वयं को इकट्ठा करता है। अमाइलॉइड के साथ iBBBs सीडिंग CAA के प्रमुख पहलुओं को पकड़ती है। इसके अतिरिक्त, iBBB सेरेब्रोवास्कुलर रोग और न्यूरोडीजेनेरेशन में फंसे आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों को संशोधित करने के लिए एक लचीला मंच प्रदान करता है, यह जांचने के लिए कि आनुवंशिकी और जीवन शैली रोग जोखिम को कैसे प्रभावित करती है। अंत में, iBBB दवा स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सीएनएस के लिए चिकित्सीय वितरण का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली तीन प्रकार की कोशिकाओं (एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स) के भेदभाव का वर्णन करते हैं, आईबीबीबीबी में विभेदित कोशिकाओं को कैसे इकट्ठा किया जाए, और बहिर्जात एमिलॉयड का उपयोग करके इन विट्रो में सीएए को कैसे मॉडल किया जाए। यह मॉडल एक ऐसी प्रणाली के साथ जीवित मानव मस्तिष्क के ऊतकों का अध्ययन करने की चुनौती पर काबू पाता है जिसमें जैविक निष्ठा और प्रयोगात्मक लचीलापन दोनों होते हैं, और मानव बीबीबी की पूछताछ और न्यूरोडीजेनेरेशन में इसकी भूमिका को सक्षम बनाता है।

Introduction

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक प्रमुख माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क है जो उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए एक आदर्श वातावरण बनाए रखने के लिए परिधि से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को अलग करता है। चयापचय होमियोस्टेसिस 1,2,3,4 को बनाए रखने, अपशिष्ट 4,5,6 को साफ करने और रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों 7,8 से मस्तिष्क की रक्षा करके सीएनएस में पदार्थों की आमद और प्रवाह को विनियमित करने में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका है।

बीबीबी का प्राथमिक सेल प्रकार एंडोथेलियल सेल (ईसी) है। एंडोथेलियल कोशिकाएं, मेसोडर्म वंश से व्युत्पन्न, वास्कुलचर 1,9 की दीवारों का निर्माण करती हैं। माइक्रोवैस्कुलर ईसी एक दूसरे के साथ तंग जंक्शन बनाते हैं ताकि उनकी झिल्ली 10,11,12,13,14 की पारगम्यता को कम किया जा सके, जबकि ट्रांसपोर्टरों को सीएनएस 1,4,12,14 में पोषक तत्वों की आवाजाही को सुविधाजनक बनाने के लिए व्यक्त किया जा सके . माइक्रोवैस्कुलर ईसी पेरिसाइट्स (पीसी) -भित्ति कोशिकाओं से घिरे होते हैं जो माइक्रोवैस्कुलर फ़ंक्शन और होमियोस्टेसिस को विनियमित करते हैं और अणुओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं 15,16,17के लिए बीबीबी की पारगम्यता को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एस्ट्रोसाइट, एक प्रमुख ग्लियल सेल प्रकार, बीबीबी में शामिल अंतिम सेल प्रकार है। एस्ट्रोसाइट अंत-पैर ईसी-पीसी संवहनी ट्यूबों के चारों ओर लपेटते हैं जबकि कोशिका शरीर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में विस्तारित होते हैं, जिससे न्यूरॉन्स और वास्कुलचर1 के बीच संबंध बनता है। विशिष्ट विलेय और सब्सट्रेट ट्रांसपोर्टर एस्ट्रोसाइट एंड-फीट (जैसे, एक्वापोरिन 4 [एक्यूपी -4]) पर स्थानीयकृत होते हैं जिनकी बीबीबी फ़ंक्शन 18,19,20,21में महत्वपूर्ण भूमिका होती है।

बीबीबी उचित मस्तिष्क स्वास्थ्य समारोह को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है, और बीबीबी की शिथिलता अल्जाइमर रोग (एडी) 22,23,24,25, मल्टीपल स्केलेरोसिस 7,26,27,28, मिर्गी 29,30 और स्ट्रोक31,32 सहित कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में बताई गई है. यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि सेरेब्रोवास्कुलर असामान्यताएं न्यूरोडीजेनेरेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं, इस्केमिक और रक्तस्रावी घटनाओं के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि में योगदान करती हैं। उदाहरण के लिए, 90% से अधिक एडी रोगियों में सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए) होती है, जो मस्तिष्क वाहिका के साथ अमाइलॉइड β (एβ) के जमाव की विशेषता वाली स्थिति है। सीएए बीबीबी पारगम्यता बढ़ जाती है और बीबीबी समारोह कम हो जाती है, सीएनएस इस्किमिया, रक्तस्रावी घटनाओं के लिए कमजोर छोड़ने, और त्वरित संज्ञानात्मक गिरावट33.

हमने हाल ही में मानव बीबीबी के इन विट्रो मॉडल में विकसित किया है, जो रोगी-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होता है, जिसमें ईसी, पीसी, और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं जो 3 डी मैट्रिक्स(चित्रा 1ए)में समाहित हैं। आईबीबीबीबी शारीरिक रूप से प्रासंगिक इंटरैक्शन को पुन: प्रस्तुत करता है, जिसमें संवहनी ट्यूब गठन और वास्कुलचर24 के साथ एस्ट्रोसाइट एंड-फीट का स्थानीयकरण शामिल है। हमने एपीओई 4 (चित्रा 1 बी) द्वारा मध्यस्थता सीएए की संवेदनशीलता को मॉडल करने के लिए आईबीबीबीबी लागू किया। इसने हमें कारण सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने में सक्षम बनाया जिसके द्वारा APOE4 CAA को बढ़ावा देता है, और चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए इन अंतर्दृष्टि का लाभ उठाता है जो CAA पैथोलॉजी को कम करता है और APOE4 चूहों24 में विवो में सीखने और स्मृति में सुधार करता है। यहां, हम मानव आईपीएससी से बीबीबी के पुनर्निर्माण और इन विट्रो में सीएए मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और वीडियो ट्यूटोरियल प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. iBBB कोशिकाओं में IPSC विभेदन

नोट: इन भेदभाव प्रोटोकॉल पहले Mesentier-Louro एट अल.34 में वर्णित किया गया है.

  1. कोटिंग सेल संस्कृति प्लेटें
    1. पिघलना 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकास कारक (GF) झिल्ली मैट्रिक्स कम. डीएमईएम के 49.5 एमएल में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 500 माइक्रोन को पतला करें। कोटिंग समाधान के समय से पहले पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए इस समाधान को ठंडा रखें।
    2. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति का इलाज किया थाली के अच्छी तरह से प्रति 1-2 एमएल जोड़ें. उचित गर्म संस्कृति माध्यम के साथ बदलने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए कोटिंग समाधान छोड़ दें।
  2. ETV2-inducible endothelial कोशिकाओं में मानव IPSC के भेदभाव
    समय: 8 दिन
    नोट: यह प्रोटोकॉल ब्लैंचर्ड एट अल.24 और कियान एट अल.35 से अनुकूलित है। हम प्रतिलेखन कारक ETV2 की डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसिबल अभिव्यक्ति का उपयोग करते हैं, जैसा कि वांग एट अल.36 द्वारा उपज में सुधार के लिए वर्णित है। ETV2 PiggyBac प्लास्मिड के माध्यम से पेश किया गया था और कोशिकाओं को तब ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था।
    1. फीडर-फ्री प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल माध्यम में कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर संस्कृति आईपीएससी जब तक कोशिकाएं ~ 70% संगम तक नहीं पहुंच जातीं।
      नोट: हम अनुशंसा करते हैं कि इंड्यूसिबल आईपीएससी को पिग्गीबैक प्लाज्मिड (यानी, प्यूरोमाइसिन) के लिए चयन के साथ बनाए रखा जाए
    2. दिन 0: 5 मिनट के लिए एक प्रोटीज कोलेजन मिश्रण के साथ कोशिकाओं को अलग करना। स्टेम सेल माध्यम के लिए प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. स्टेम सेल माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 10 माइक्रोन Y27632 के साथ पूरक स्टेम सेल माध्यम में कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर 20,800 कोशिकाओं/सेमी2 पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    3. पहला दिन: माध्यम को DeSR1 [DMEM/F12 + ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x मिनिमम एसेंशियल मीडियम नॉन-एसेंशियल एमिनो एसिड (MEM-NEAA), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (P/S)] से बदलें, 10 ng/mL BMP4, 6 μM CHIR99021, और 5 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक।
    4. तीसरा दिन: माध्यम को DeSR2 [DMEM/F12 + ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] से बदलें जो 5 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक है।
    5. दिन 5: माध्यम को hECSR [ह्यूमन एंडोथेलियल सीरम-फ्री मीडियम, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] से बदलें जो 50 ng/mL vegf-a, 2 μM forskolin, और 5 μg/mL doxycycline के साथ पूरक है।
    6. दिन 7: 50 एनजी/एमएल वीईजीएफ-ए, 2 माइक्रोन फोर्स्कोलिन, और 5 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक एचईसीएसआर के साथ मध्यम बदलें।
    7. दिन 8: प्रोटीज़-कोलेजनेज मिश्रण के साथ ईसी 1: 3 को विभाजित करें और 50 एनजी / एमएल वीईजीएफ-ए और 5 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक एचसीएसआर में ताजा कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर फिर से बीज।
      नोट: यह एक समान वाहिका गठन के लिए iBBBs में ईसी encapsulate करने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु है.
    8. दिन 10+: कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में 50 एनजी/एमएल वीईजीएफ-ए और 5 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक एचसीएसआर के साथ खिलाएं। प्लेटें संगम होने पर कोशिकाओं को 1:3 प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के साथ विभाजित करना जारी रखें।
      नोट: आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसी को दिन 8 से शुरू होने वाले किसी भी बिंदु पर जमे हुए किया जा सकता है। कोशिकाओं को उठाएं, जैसे कि पारित होने के लिए। ईसी फ्रीजिंग मीडियम [60% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ng/mL VEGF-A, और 10 μM Y27632] में गोली को फिर से निलंबित करें, कोशिकाओं को 1:3 विभाजित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजिंग कंटेनर का उपयोग करके फ्रीज करें। 50 एनजी/एमएल वीईजीएफ-ए, 5 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक एचईसीएसआर में कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर पिघलना।
    9. सीडी31/पीईसीएएम1 या वीई-कैडरिन(चित्रा 2ए)के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल भेदभाव की पुष्टि करें।
  3. पेरिसाइट्स में मानव IPSC के भेदभाव
    समय: 6 दिन
    नोट: इस प्रोटोकॉल Patsch एट अल 36 से अनुकूलित किया गया था.
    1. स्टेम सेल माध्यम में फीडर-मुक्त स्थितियों में कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर संस्कृति आईपीएससी जब तक कोशिकाओं तक पहुंच ~ 70% संगम तक.
    2. दिन 0: 5 मिनट के लिए एक प्रोटीज कोलेजन मिश्रण के साथ कोशिकाओं को अलग करना। स्टेम सेल माध्यम के लिए प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. स्टेम सेल माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 10 माइक्रोन Y27632 के साथ पूरक स्टेम सेल माध्यम में कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर 37,000-40,000 कोशिकाओं/सेमी2 (सेल लाइन के आधार पर) पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    3. पहला दिन: मीडिया को N2B27 [50% DMEM/F12 + ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 50% न्यूरोबेसल, 1x MEM-NEAA, 0.5x, ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S] के साथ बदलें 25 ng/mL BMP4 और 8 uM CHIR99021 के साथ पूरक।
    4. दिन 3-4: मीडिया को N2B27 से बदलें जो 2 ng/mL एक्टिविन A और 10 ng/mL pdgf-BB के साथ पूरक है, और प्रतिदिन फ़ीड करें।
    5. दिन 5: प्रोटीज़-कोलेजनेज मिश्रण के साथ पीसी को विभाजित करें और N2B27 में 35,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर 0.1% जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर बीज 10 ng/mL PDGF-BB के साथ पूरक हों।
      नोट: केवल एक बार संगम कोशिकाओं को विभाजित करें। कुछ लाइनों को विभाजित करने के लिए तैयार होने से पहले कुछ और दिनों की आवश्यकता हो सकती है; कोशिकाओं के संगम होने तक दैनिक मीडिया को बदलना जारी रखें।
    6. N2B27 में पीसी का विस्तार करें 10 ng/mL PDGF-BB के साथ पूरक, हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलना। कोशिकाओं को एक बार फिर संगम तक पहुंचने और दूसरे मार्ग से गुजरने के बाद मीडिया से पीडीजीएफ-बीबी निकालें।
      नोट: पेरिसाइट्स दूसरे मार्ग के बाद iBBBs में उपयोग करने के लिए तैयार हैं। एक बार विस्तारित होने के बाद, पीसी को जमे हुए किया जा सकता है। कोशिकाओं लिफ्ट के रूप में अगर पारित करने के लिए, ठंड मीडिया [90% केएसआर और 10% डीएमएसओ] में सेल गोली resuspended और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंड कंटेनर का उपयोग कर फ्रीज. N2B27 में 35,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर 0.1% जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर पिघलना।
    7. पीडीजीएफआरबी और एनजी2(चित्रा 2बी)के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा पेरिसाइट भेदभाव की पुष्टि करें।
  4. तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में मानव IPSC के भेदभाव (एनपीसी) और astrocytes
    समय: कुल 45 दिन (एनपीसी के लिए 15 दिन और एस्ट्रोसाइट्स के लिए 30 दिन)
    नोट: एनपीसी भेदभाव प्रोटोकॉल चेम्बर्स एट अल.38 से अनुकूलित किया गया था, और एस्ट्रोसाइट भेदभाव टीसीडब्ल्यू एट अल.39 में वर्णित है।
    1. स्टेम सेल माध्यम में फीडर-मुक्त स्थितियों में कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर संस्कृति आईपीएससी जब तक कोशिकाओं तक पहुंच ~ 70% संगम तक.
    2. 5 मिनट के लिए एक प्रोटीज कोलेजन मिश्रण के साथ कोशिकाओं को अलग करना। स्टेम सेल माध्यम के लिए प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. स्टेम सेल माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 100,000 माइक्रोन Y27632 के साथ पूरक स्टेम सेल माध्यम में कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटोंपर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    3. अगले दिन स्टेम सेल माध्यम बदलें। कोशिकाओं को हर दूसरे दिन खिलाना जारी रखें जब तक कि वे >95% संगम (सेल लाइन के आधार पर 3-4 दिन) तक न पहुंच जाएं।
    4. एनपीसी दिवस 0: मीडिया को N2B27 [50% DMEM/F12 + ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 50% न्यूरोबेसल, 1x MEM-NEAA, 0.5x, ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P/S] से बदलें जो 10 माइक्रोन SB43152 और 100 एनएम LDN193189 के साथ पूरक है।
    5. एनपीसी दिन 1-9: N2B27 के साथ दैनिक कोशिकाओं फ़ीड 10 माइक्रोन SB43152 और 100 एनएम LDN193189 के साथ पूरक.
    6. एनपीसी दिवस 10: एनपीसी 1:3 को प्रोटीज़-कोलेजनेज मिश्रण के साथ विभाजित करें और N2B27 में ताजा कम GF बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर बीज 20 ng/mL FGF-बेसिक और 10 माइक्रोन Y27632 के साथ पूरक हो।
    7. एनपीसी दिन 11 - 13: एनपीसी को प्रतिदिन N2B27 के साथ 20 ng/mL FGF-basic के साथ पूरक करें।
    8. एनपीसी दिवस 14: प्रोटीज़-कोलेजनेज मिश्रण के साथ एनपीसी 1: 3 को विभाजित करें और एन 2 बी 27 में ताजा कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर 20 एनजी / एमएल एफजीएफ-बेसिक और 10 माइक्रोन वाई 27632 के साथ पूरक हैं।
    9. एनपीसी दिवस 15/एस्ट्रोसाइट दिवस 0: यह एस्ट्रोसाइट भेदभाव का दिन 0 है। पूर्ण एस्ट्रोसाइट माध्यम (एएम) के साथ कोशिकाओं को खिलाएं।
      नोट: एनपीसी को N2B27 में 20 ng/mL FGF-बेसिक के साथ पूरक रखा जा सकता है और संगम होने पर पारित किया जा सकता है। एनपीसी फ्रीज करने के लिए, ठंड मीडिया [90% केएसआर और 10% डीएमएसओ] में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, कोशिकाओं को 1: 3 विभाजित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंड कंटेनर का उपयोग करके फ्रीज करें। N2B27 में कम GF बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर पिघलना 20 ng/mL bFGF और 10 μM Y27632 के साथ पूरक।
    10. एस्ट्रोसाइट दिन 1-30: कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में एएम के साथ खिलाएं। जब कोशिकाओं >90% संगम कर रहे हैं, प्रोटीज-collagenase मिश्रण और 15,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर प्लेट का उपयोग कर ताजा कम GF तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों में AM.
      नोट: एस्ट्रोसाइट्स को 30 दिनों में पूरी तरह से विभेदित किया जाना चाहिए। एस्ट्रोसाइट्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजिंग कंटेनर में फ्रीजिंग मीडिया [90% केएसआर और 10% डीएमएसओ] में फ्रीज किया जा सकता है। एएम में कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर 25,000-35,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर पिघलना।
    11. नेस्टिन और एसओएक्स 2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा एनपीसी भेदभाव की पुष्टि करें। S100B और CD44(चित्रा 2C)के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा एस्ट्रोसाइट भेदभाव की पुष्टि करें।

2. iBBB को असेंबल करना

  1. पिघलना 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकास कारक (जीएफ) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को कम कर दिया। डीएमईएम में इस मैट्रिक्स को पतला न करें क्योंकि आईबीबीबीबी 100% कम जीएफ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में समझाया गया है। प्रत्येक iBBB मैट्रिक्स के 50 माइक्रोन की आवश्यकता है.
  2. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रोटीज कोलेजनेज मिश्रण के साथ विभेदित ईसी पृथक्करण. प्रोटीज़-कोलेजनेज़ मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में विघटित कोशिकाओं को एचईसीएसआर (मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त माध्यम, 1x एमईएम-एनईएए, 1x बी-27, 1% पी/एस) में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. एचसीएसआर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: एक शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें, या तो 15 एमएल या 50 एमएल, जो कि अलग कोशिकाओं और मीडिया की मात्रा को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ा है। कोशिकाओं को कई ट्यूबों में भी विभाजित किया जा सकता है और फिर निलंबन पर पुन: संयोजित किया जा सकता है।
  3. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के साथ विभेदित पीसी को अलग करें। प्रोटीज़-कोलेजनेज मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में विघटित कोशिकाओं को N2B27 (50% DMEM/F12 + ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 50% न्यूरोबेसल, 1x MEM-NEAA, 0.5x ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x N-2, 1x B-27, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [P/S]) में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. N2B27 में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीज-कोलेजन मिश्रण के साथ विभेदित एस्ट्रोसाइट्स को अलग करें। एस्ट्रोसाइट मीडियम (एएम) को पूरा करने के लिए प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण के 1:3 अनुपात के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में विघटित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन. एएम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, प्रत्येक सेल प्रकार की गणना करें। प्रत्येक प्रकार के सेल निलंबन को उपयुक्त माध्यम में 1 × 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
  6. एक शंक्वाकार ट्यूब में प्रत्येक सेल प्रकार के लिए कोशिकाओं की गणना की संख्या को मिलाएं: आईबीबीबीबी के 50 माइक्रोन के लिए 2.5 × 105 ईसी, 5 × 104 पीसी और 5 × 104 एस्ट्रोसाइट्स की आवश्यकता होती है। पाइपिंग त्रुटियों के लिए खाते में कोशिकाओं की गणना की गई संख्या से 10% अधिक शामिल करें। 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेल मिश्रण नीचे स्पिन.
    नोट: इनपुट कोशिकाओं के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए ठीक करने और दाग करने के लिए 2 डी मोनोकल्चर में प्रत्येक सेल प्रकार की कुछ बची हुई कोशिकाओं को प्लेट करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित पहले से तैयार प्लेटों पर 35,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर प्रत्येक सेल प्रकार प्लेट और 3-4 दिनों के बाद फिक्स. सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए तालिका 1 देखें.
  7. सेल गोली से एस्पिरेट माध्यम सेल गोली के ऊपर सतह पर तैरनेवाला के लगभग 50 माइक्रोन छोड़ देता है। एक P200 का प्रयोग, धीरे एक एकल सेल घोल बनाने के लिए अवशिष्ट माध्यम में सेल गोली resuspension.
  8. पर्याप्त कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सेल घोल मिश्रण 10 एनजी / एमएल VEGF-A के साथ पूरक iBBB प्रति कम GF तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 50 μL पर iBBBs की वांछित संख्या के लिए, किसी भी हवा बुलबुले शुरू नहीं करते हुए सजातीय रूप से कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए ख्याल रखना.
    नोट: समय से पहले पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए इस स्तर पर बर्फ पर कोशिकाओं और कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को रखना महत्वपूर्ण है।
  9. पिपेट 50 माइक्रोन कम जीएफ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के एक 48 अच्छी तरह से कांच नीचे संस्कृति पकवान के कुएं में. डिश के नीचे समान रूप से मात्रा वितरित करें (चित्रा 1 सी)।
  10. iBBBs को 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि कम GF बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को पोलीमराइज़ करने की अनुमति मिल सके, मैट्रिक्स में कोशिकाओं को encapsulating किया जा सके।
  11. 10 एनजी/एमएल वीईजीएफ-ए, 5 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन और 10 माइक्रोन वाई27632 के साथ पूरक एएम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  12. अगले दिन माध्यम को 10 एनजी/एमएल वीईजीएफ-ए के साथ पूरक एएम में बदलें। हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलना जारी रखें। 2 सप्ताह के बाद, वीईजीएफ-ए के साथ पूरक करना बंद कर दें; iBBBs 2 सप्ताह के बाद डाउनस्ट्रीम परख के लिए तैयार हैं।

3. Aβ तंतुओं के साथ मस्तिष्क अमाइलॉइड एंजियोपैथी (CAA) को प्रेरित करना

  1. पीबीएस में 200 माइक्रोन पर अमाइलॉइड-β1-40 और अमाइलॉइड-β1-42 के स्टॉक समाधान तैयार करें।
  2. 20 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 2 सप्ताह iBBB पर iBBB माध्यम में Aβ जोड़ें. 96 घंटे (4 दिन) के लिए Aβ पूरक माध्यम में कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. 96 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दें और फिक्सिंग (धारा 4) के साथ जारी रखें।

4. iBBB को ठीक करना और धुंधला करना

  1. आईबीबीबीबी को ठीक करने के लिए, माध्यम को हटा दें, पीबीएस के 1 एमएल में धो लें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोन में इनक्यूबेट करें।
  2. 4% पैराफॉर्मलाडेहाइड समाधान निकालें, और पीबीएस के 1 एमएल में 4 एक्स (कम से कम) 15 मिनट के लिए कुल्ला।
  3. कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.3% पीबीएसटी (0.3% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पीबीएस) में नमूनों को पारगम्य करें।
  4. कोमल मिलाते हुए के साथ कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बफर (0.3% पीबीएसटी में 5% सामान्य सीरम) अवरुद्ध करने में संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले सीरम का प्रकार उपयोग किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए मेजबान प्रजातियों पर निर्भर है। उदाहरण के लिए, यदि द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए मेजबान प्रजाति बकरी है, तो सामान्य बकरी सीरम का उपयोग करें; यदि मेजबान प्रजाति गधा है, तो सामान्य गधा सीरम का उपयोग करें। यह भी कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है.
  5. बफर को अवरुद्ध करने में अनुशंसित या निर्धारित एकाग्रता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें। सुनिश्चित करें कि iBBBs पूरी तरह से इनक्यूबेशन के लिए एंटीबॉडी समाधान में डूबे हुए हैं; 100-150 माइक्रोन एक 48 अच्छी तरह से कांच नीचे संस्कृति पकवान में एक 50 μL iBBB को कवर करने के लिए पर्याप्त है. कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें। 0.3% पीबीएस में 3 x 10-20 मिनट के लिए iBBBs धोएं।
  8. बफर को अवरुद्ध करने में अनुशंसित या निर्धारित एकाग्रता के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें। इसके अतिरिक्त, अनुशंसित या निर्धारित एकाग्रता पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में एक परमाणु दाग, जैसे होचस्ट जोड़ें।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ पिछले पीबीएस धोने बदलें. सुनिश्चित करें कि iBBBs पूरी तरह से इनक्यूबेशन के लिए एंटीबॉडी समाधान में डूबे हुए हैं; 100-150 माइक्रोन एक 48 अच्छी तरह से कांच नीचे संस्कृति पकवान में एक 50 μL iBBB को कवर करने के लिए पर्याप्त है. कोमल झटकों के साथ 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    नोट: यह भी कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है.
  10. पीबीएस में धोने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए iBBBs 4-5x धोएं। पीबीएस या विरोधी लुप्त होती बढ़ते मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि नमूने छवि न हों।
  11. एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर छवि करने के लिए, कांच के नीचे प्लेटों या व्यंजनों में iBBBs रखें. iBBBs को जगह में रखने के लिए कांच के ऊपर एक ग्लास कवरस्लिप रखें (चित्र 1D)।

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Representative Results

एक ठीक से गठित iBBB एक एकल पारभासी डिस्क(चित्रा 3A)में जम जाता है। iBBB के लिए उस सतह से अलग होना सामान्य है जिस पर इसे कुछ दिनों के बाद पहली बार पाइप किया गया था। इससे बचा नहीं जा सकता है, लेकिन iBBB के उचित गठन के लिए एक बड़ी चिंता का विषय नहीं है यदि मीडिया को बदलते समय गलती से iBBB को महाप्राण नहीं करने का ध्यान रखा जाता है। 24 घंटे के बाद, समान रूप से वितरित, एकल कोशिकाओं को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप(चित्रा 3बी)के तहत पहचाना जा सकता है। 2 सप्ताह के बाद, अधिक विशिष्ट संरचनाएं दिखाई दे सकती हैं, हालांकि परिभाषा (चित्रा 3सी)के साथ बाहर निकलना मुश्किल है।

आईबीबीबीबी की गुणवत्ता इनपुट कोशिकाओं के भेदभाव की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर है। हम अत्यधिक सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों के लिए ठीक करने और दाग करने के लिए 2 डी monocultures में कुछ छोड़ दिया से अधिक कोशिकाओं चढ़ाना की सिफारिश. एंडोथेलियल कोशिकाओं से बने आईबीबीबीबी जो पीईसीएएम1 या वीई-कैडरिन (चित्रा 2ए)के लिए 70% से अधिक सकारात्मक हैं, पीडीजीएफआरबी (चित्रा 2बी)के लिए 95% से अधिक सकारात्मक पेरिसाइट्स, और एस100बी और सीडी44(चित्रा 2सी)के लिए 95% से अधिक सकारात्मक एस्ट्रोसाइट्स सफल आईबीबी के लिए सर्वोत्तम हैं। इस गुणवत्ता जांच के परिणाम उच्च गुणवत्ता वाले iBBBs के लिए सबसे शुरुआती संकेतक हैं।

शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी संरचनाएं स्व-विधानसभा के 2 सप्ताह के बाद बननी चाहिए। फिक्सिंग और धुंधला होने पर, हम ट्यूब जैसी संरचनाओं के सबूत देखते हैं जो एंडोथेलियल मार्कर PECAM1 के लिए सकारात्मक दाग देते हैं, जो तंग जंक्शन गठन(चित्रा 4ए)के लिए महत्वपूर्ण है। आईबीबीबीबी गठन में सबसे बड़ी परिवर्तनशीलता माइक्रोवैस्कुलचर गठन की सीमा है। "सबसे खराब स्थिति" परिदृश्य में, एंडोथेलियल सेल नेटवर्क अधिक खंडित दिखाई देता है या पूरे iBBB में विस्तारित नहीं होता है, जबकि "सर्वश्रेष्ठ-मामला" परिदृश्य में, वास्कुलचर एक समान होता है और पूरे iBBB में शाखाएं होती हैं। एंडोथेलियल सेल भेदभाव जो 70% से अधिक है PECAM1-सकारात्मक अधिक सुसंगत नेटवर्क बनाता है। इसके अतिरिक्त, एक्वापोरिन -4, एस्ट्रोसाइट्स द्वारा व्यक्त एक प्रोटीन जो एस्ट्रोसाइट एंडफीट को स्थानीयकृत करता है, पीईसीएएम 1 धुंधला के साथ संरेखित होता है, यह दर्शाता है कि एस्ट्रोसाइट्स एंडोथेलियल कोशिकाओं (चित्रा 4बी) से संपर्क करने के लिए अपने एंडफुट का विस्तार करते हैं। अंत में, हम vasculature (चित्रा 4C) के आसपास pericytes देखने की उम्मीद.

iBBBs में सेरेब्रल अमाइलॉइड एंजियोपैथी (CAA) के लिए प्राथमिक रीडआउट अमाइलॉइड-β (Aβ) की उपस्थिति है। Aβ को लक्षित एंटीबॉडी का उपयोग करके या CAA फेनोटाइप(चित्रा 5)को प्रेरित करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल Aβ को सीडिंग करके मापा जा सकता है। Aβ के साथ iBBBs के उपचार से Aβ धुंधला तीव्रता और क्षेत्र में वृद्धि होनी चाहिए, क्योंकि BBB की कोशिकाएं बहुत अधिक अंतर्जात Aβ प्रोटीन व्यक्त नहीं करती हैं। वैकल्पिक रूप से, निश्चित नमूनों को अमाइलॉइड संचय का पता लगाने के लिए थियोफ्लेविन टी के साथ दाग दिया जा सकता है। Aβ स्तर iBBB उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्टेम कोशिकाओं के जीनोटाइप पर निर्भर हैं, कुछ अल्जाइमर रोग और CAA से जुड़े जोखिम कारकों के साथ Aβ संचय और धुंधला हो जाना (चित्रा 5B, C)24की मात्रा में वृद्धि होती है।

Figure 1
चित्रा 1: मॉडल सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी के लिए इन विट्रो रक्त-मस्तिष्क बाधा में। (ए) iBBB विधानसभा और परिपक्वता का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से एंडोथेलियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट्स के भेदभाव के बाद, कोशिकाओं को एकल-कोशिका निलंबन में जेल मैट्रिक्स में समझाया जाता है। 2 सप्ताह के दौरान, कोशिकाएं विवो में पहचानी गई संरचनाओं के समान, संवहनी इकाइयों में स्वयं को इकट्ठा करती हैं। (बी) सेरेब्रल अमाइलॉइड एंजियोपैथी परख का योजनाबद्ध। Aβ एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए 96 घंटे के लिए परिपक्व iBBBs में अमाइलॉइड-β जोड़ा जाता है। (सी) आरेख एक गिलास तल कुएं में बोने के बाद एक iBBB के पक्ष दृश्य दिखा रहा है. (डी) एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए तैयार एक iBBB का एक ग्राफिक. संक्षिप्ताक्षर: बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; iBBB = एक रोगी IPSC-व्युत्पन्न BBB मॉडल से प्राप्त मानव BBB का एक इन विट्रो मॉडल, जिसमें 3D मैट्रिक्स में समाहित एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं; Aβ = अमाइलॉइड-β। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आईपीएससी-व्युत्पन्न आईबीबीबीबी कोशिकाओं का सत्यापन। (ए) वीई-कैडरिन (हरा) और पीईसीएएम 1 (लाल) के साथ दाग वाले 2 डी मोनोकल्चर में एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। (बी) पीडीजीएफआरबी (हरा) और एनजी 2 (लाल) के साथ दाग वाले 2 डी मोनोकल्चर में पेरिसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां। (सी) सीडी 44 (शीर्ष; हरा) और एस 100 बी (नीचे; हरा) के साथ दाग वाले 2 डी मोनोकल्चर में एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां। सभी नाभिक होचस्ट 33342 के साथ दाग रहे हैं। छवियाँ 2x आवर्धन (ए, बी) पर एक Nikon ग्रहण Ti2-E या 8x बढ़ाई (सी) पर एक Leica Stellaris 40 पर लिया गया. सभी पैमाने सलाखों 100 माइक्रोन हैं. संक्षिप्ताक्षर: बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; iBBB = एक रोगी IPSC-व्युत्पन्न BBB मॉडल से प्राप्त मानव BBB का एक इन विट्रो मॉडल, जिसमें 3D मैट्रिक्स में समाहित एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं; वीई-कैडरिन = संवहनी एंडोथेलियल कैडरिन; PECAM1 = प्लेटलेट और एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु 1; PDGFRB = प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर बीटा; एनजी 2 = न्यूरॉन ग्लियाल एंटीजन 2; S100B = S100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन बीटा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आईबीबीबीबी की विधानसभा। (ए) 2x आवर्धन पर चढ़ाना के बाद 15 माइक्रोन आईबीबीबीबी 24 घंटे की ब्राइटफील्ड छवि। (बी)10x आवर्धन पर चढ़ाना के बाद एक iBBB 24 घंटे की ब्राइटफील्ड छवि। (सी)10x आवर्धन पर चढ़ाना के 2 सप्ताह बाद एक iBBB की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार = 1 मिमी (ए), 100 माइक्रोन (बी, सी)। एक उल्टे Nikon ग्रहण Ts2R-FL पर ली गई छवियां। संक्षिप्ताक्षर: बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; iBBB = एक रोगी IPSC व्युत्पन्न BBB मॉडल से व्युत्पन्न मानव BBB के इन विट्रो मॉडल, जो endothelial कोशिकाओं को शामिल शामिल है, पेरिसाइट्स, और एक 3 डी मैट्रिक्स में समझाया astrocytes. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आईबीबीबी में सेल इंटरैक्शन। "आईबीबीबीबी में एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां"। (ए) एंडोथेलियल कोशिकाएं (PECAM1) और एस्ट्रोसाइट्स (S100β)। (बी) एंडोथेलियल सेल (PECAM1) और एस्ट्रोसाइट एंडफीट (AQP-4) सह-स्थानीयकरण। (सी) एंडोथेलियल कोशिकाएं (PECAM1) और पेरिसाइट्स (NG2)। सभी नाभिक होचस्ट 33342 के साथ दाग रहे हैं। Confocal Z-स्टैक छवियों को Leica Stellaris 8 पर 20x आवर्धन (A, B) या Nikon Eclipse Ti2-E पर 20x आवर्धन (C) पर लिया गया था। स्केल बार = 200 माइक्रोन (ए), 100 माइक्रोन (बी, सी)। संक्षिप्ताक्षर: बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; iBBB = एक रोगी IPSC-व्युत्पन्न BBB मॉडल से प्राप्त मानव BBB का एक इन विट्रो मॉडल, जिसमें 3D मैट्रिक्स में समाहित एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं; PECAM1 = प्लेटलेट और एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु 1; AQP-4 = एक्वापोरिन -4; NG2 = न्यूरॉन ग्लियाल प्रतिजन 2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इन विट्रो में सेरेब्रल एमिलॉयड एंजियोपैथी। (ए) गैर-एडी iBBBs नियंत्रण या Aβ-overexpression न्यूरॉन्स से वातानुकूलित मीडिया के संपर्क में हैं। 6e10 एंटीबॉडी Aβ को पहचानता है। (बी)96 घंटे के लिए 20 एनएम Aβ-FITC1-42 के साथ इलाज की गई आइसोजेनिक APOE3 और APOE4 सेल लाइनों से iBBBs की प्रतिनिधि छवियां। (सी) 20 एनएम Aβ-FITC1-40 या Aβ-FITC1-42 के साथ इलाज की गई आइसोजेनिक APOE3 और APOE4 सेल लाइनों से iBBBs में अमाइलॉइड की मात्रा का ठहराव। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए), 10 माइक्रोन (बी)। यह आंकड़ा ब्लैंचर्ड एट अल24 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; iBBB = एक रोगी IPSC-व्युत्पन्न BBB मॉडल से प्राप्त मानव BBB का एक इन विट्रो मॉडल, जिसमें 3D मैट्रिक्स में समाहित एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं; Aβ = अमाइलॉइड-β। APOE = एपोलिपोप्रोटीन E। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मार्करों अतिथि कॅटलॉग क्रमांक तनूकरण
एंडोथेलियल कोशिकाएं पेकैम1 (सीडी31) आर एंड डी सिस्टम एएफ806 1:500
वीई-कैडरिन (सीडी 144) आर एंड डी सिस्टम एएफ938 1:500
जेडओ-1 इनविट्रोजेन एमए 3-39100-ए 488 1:500
पेरिसाइट्स पीडीजीएफआरβ आर एंड डी सिस्टम एएफ385 1:500
एनजी2 एबकैम एबी255811 1:500
एस्ट्रोसाइट्स एस100β सिग्मा-एल्ड्रिच एस 2532-100 यूएल 1:500
सीडी44 सेल सिग्नलिंग तकनीक 3570 एस 1:400
एक्यूपी-4 इनविट्रोजेन पीए5-53234 1:300
जीएफएपी
ALDH1L1
ईएएटी1
ईएएटी2
अमाइलॉइड-β 6ई10 बायोलेजेंड एसआईजी-39320 1:1,000
थियोफ्लेविन टी केम इम्पेक्स 22870 25 माइक्रोन

तालिका 1: भेदभाव गुणवत्ता जांच के लिए अनुशंसित सेल मार्कर। बीबीबी के विभिन्न सेल प्रकारों के लिए सेल मार्कर जिनका उपयोग विभेदों की गुणवत्ता की जांच करने और गठित आईबीबीबीबी में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस पेपर में उपयोग किए गए मार्कर बोल्ड हैं।

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Discussion

बीबीबी डिसफंक्शन एक सह-रुग्णता है, और संभावित रूप से, कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में एक कारण या उत्तेजक कारक 7,40,41. हालांकि, न्यूरोवास्कुलर रोग वाले मनुष्यों में बीबीबी की शिथिलता और टूटने के अंतर्निहित आणविक और कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करना लगभग असंभव है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत इंड्यूसिबल-बीबीबी (आईबीबीबी) इन विट्रो सिस्टम प्रदान करता है जो बीबीबी के महत्वपूर्ण सेल इंटरैक्शन को पुन: व्यवस्थित करता है, जिसमें संवहनी ट्यूब गठन और संवहनी के साथ एस्ट्रोसाइट एंड-फीट का स्थानीयकरण शामिल है। आईबीबीबी का उपयोग बीबीबी डिसफंक्शन के किसी भी चरण में शामिल आणविक मार्गों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और न्यूरोवास्कुलर रोग फेनोटाइप्स को मॉडल कर सकता है, जैसे कि एमिलॉयड-β एकत्रीकरण, जैसा कि सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी में देखा गया है।

iBBB की विधानसभा सीधी है, हालांकि iBBBs की गुणवत्ता iPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं है कि उपयोग कर रहे हैं की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर है. जबकि iBBB एक बहुकोशिकीय आला प्रदान करता है जो घटक कोशिकाओं की परिपक्वता को बढ़ावा दे सकता है, प्रत्येक सेल प्रकार को समझाया जाने से पहले ठीक से पैटर्न करने की आवश्यकता होती है। व्यक्तिगत मोनोकल्चर (तालिका 1) पर सेल-प्रकार विशिष्ट मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करके प्रत्येक भेदभाव पर गुणवत्ता जांच करना महत्वपूर्ण है। हर IPSC लाइन अलग तरह से व्यवहार करता है और कुछ शर्तों, इस तरह के सीडिंग घनत्व या प्रत्येक patterning माध्यम में दिनों की संख्या के रूप में, अनुभवजन्य निर्धारित किया जा करने के लिए और भेदभाव दक्षता का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.

वर्णित प्रोटोकॉल 50 माइक्रोन आकार का सुझाव देता है, लेकिन आईबीबीबीबी को सेल उपलब्धता, वांछित आईबीबीबी की संख्या और डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर 5 माइक्रोन जितना छोटा किया जा सकता है। बड़े आईबीबी में अधिक कोशिकाएं होती हैं, जो उन्हें प्रोटीन, लिपिड या न्यूक्लिक एसिड संग्रह के लिए आदर्श बनाती हैं। छोटे iBBBs ड्रग स्क्रीनिंग या अन्य स्केलेबल assays की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।

इन विट्रो में बीबीबी का अध्ययन करने के लिए आईबीबीबी एक बहुत ही बहुमुखी उपकरण है। क्योंकि प्रत्येक सेल प्रकार को स्वतंत्र रूप से विभेदित किया जाता है, आईबीबीबी को विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से इकट्ठा किया जा सकता है, जिससे हमें यह अध्ययन करने की अनुमति मिलती है कि आनुवंशिक जोखिम कारक बीबीबी शिथिलता में योगदान करने के लिए विशिष्ट सेल प्रकारों को कैसे प्रभावित करते हैं। यह रणनीति यह दिखाने के लिए लागू की गई थी कि APOE4, अल्जाइमर रोग और सेरेब्रल अमाइलॉइड एंजियोपैथी के लिए सबसे आम जोखिम कारक, विशेष रूप से पेरिसाइट्स24 में एक रोगजनक तंत्र के माध्यम से कार्य करता है। इस उपकरण का आगे उपयोग हमें बीबीबी अखंडता को बनाए रखने में ईसी, पीसी और एस्ट्रोसाइट्स के व्यक्तिगत योगदान को विच्छेदन करने की अनुमति देगा और रोग के विकास के दौरान प्रत्येक कोशिका प्रकार कैसे लड़खड़ाता है।

वर्तमान में, इन विट्रो में बीबीबी मॉडलिंग का सबसे आम तरीका एक ट्रांसवेल सिस्टम का उपयोग करके है, जो ईसी के साथ वरीयता प्राप्त है, और कभी-कभी पेरिसाइट्स और/या एस्ट्रोसाइट्स के साथ सह-सुसंस्कृत होता है, एक अभेद्य मोनोलेयर 42,43,44 बनाने के लिए। आईबीबीबीबी की 3 डी संरचना संवहनी इकाई की स्व-असेंबली को सक्षम बनाती है और ट्यूबलर संरचनाओं के गठन की अनुमति देती है जो शारीरिक वाहिका से अधिक मिलती-जुलती हैं। एक अच्छी तरह से थाली में iBBBs बोने का एक खामी, के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, वे एक में vivo प्रणाली में निरंतर प्रवाह vasculature की वजह से सरासर तनाव का अनुभव नहीं है. इसे दूर करने के लिए, iBBB को एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप में वरीयता दी जा सकती है जो एक गतिशील प्रवाह 45,46,47 उत्पन्न कर सकती है। इस प्रणाली का उपयोग वास्कुलचर पारगम्यता और छोटे अणुओं के छिड़काव का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है।

अंत में, यह विधि बीबीबी का एक लचीला, 3 डी, आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल प्रदान करती है जिसका उपयोग सेलुलर स्तर पर बीबीबी के अनगिनत पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है, जिसमें न्यूरोवास्कुलर रोग फेनोटाइप को पुन: प्राप्त करने की क्षमता और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए दवा बीबीबी पारगम्यता को स्क्रीन करने की क्षमता शामिल है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच 3-यूजी 3-NS115064-01, R01NS14239, क्योर अल्जाइमर फंड, नासा 80ARCO22CA004, चान-जुकरबर्ग इनिशिएटिव, एमजेएफएफ / एएसएपी फाउंडेशन और ब्रेन इंजरी एसोसिएशन ऑफ अमेरिका द्वारा समर्थित है। सीजी एनआईएच F31NS130909 द्वारा समर्थित है। चित्रा 1 ए BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

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References

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Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).

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