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Neuroscience

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65921
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai
* These authors contributed equally

Summary

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BBB) è una componente fisiologica chiave del sistema nervoso centrale (SNC), che mantiene i nutrienti, elimina i rifiuti e protegge il cervello dagli agenti patogeni. Le proprietà di barriera intrinseche della BBB rappresentano una sfida per la somministrazione di farmaci terapeutici nel sistema nervoso centrale per il trattamento di malattie neurologiche. La compromissione della funzione della BBB è stata correlata a malattie neurologiche. L'angiopatia amiloide cerebrale (CAA), la deposizione di amiloide nella vascolarizzazione cerebrale che porta a una BBB compromessa, è una comorbilità nella maggior parte dei casi di malattia di Alzheimer (AD), suggerendo che la disfunzione o la rottura della BBB può essere coinvolta nella neurodegenerazione. A causa dell'accesso limitato al tessuto BBB umano, i meccanismi che contribuiscono alla corretta funzione e alla degenerazione della BBB rimangono sconosciuti. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una BBB derivata da cellule staminali pluripotenti umane (iBBB) incorporando cellule endoteliali, periciti e astrociti in una matrice 3D. L'iBBB si auto-assembla per ricapitolare l'anatomia e le interazioni cellulari presenti nella BBB. La semina di iBBB con amiloide cattura gli aspetti chiave della CAA. Inoltre, l'iBBB offre una piattaforma flessibile per modulare i fattori genetici e ambientali implicati nelle malattie cerebrovascolari e nella neurodegenerazione, per studiare come la genetica e lo stile di vita influenzano il rischio di malattia. Infine, l'iBBB può essere utilizzato per lo screening dei farmaci e gli studi di chimica farmaceutica per ottimizzare la somministrazione terapeutica al SNC. In questo protocollo, descriviamo la differenziazione dei tre tipi di cellule (cellule endoteliali, periciti e astrociti) derivanti da cellule staminali pluripotenti umane, come assemblare le cellule differenziate nell'iBBB e come modellare CAA in vitro utilizzando amiloide esogena. Questo modello supera la sfida di studiare il tessuto cerebrale umano vivo con un sistema che ha sia fedeltà biologica che flessibilità sperimentale, e consente di interrogare la BBB umana e il suo ruolo nella neurodegenerazione.

Introduction

La barriera emato-encefalica (BBB) è una rete microvascolare chiave che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia per mantenere un ambiente ideale per una corretta funzione neuronale. Ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell'afflusso e dell'efflusso di sostanze nel sistema nervoso centrale mantenendo l'omeostasi metabolica 1,2,3,4, eliminando i rifiuti 4,5,6 e proteggendo il cervello da agenti patogeni e tossine 7,8.

Il tipo di cellula primaria della BBB è la cellula endoteliale (EC). Le cellule endoteliali, derivate dalla linea mesodermica, formano le pareti del sistema vascolare 1,9. Le EC microvascolari formano giunzioni strette tra loro per ridurre notevolmente la permeabilità della loro membrana 10,11,12,13,14 mentre esprimono trasportatori per facilitare il movimento dei nutrienti dentro e fuori il SNC 1,4,12,14. Le EC microvascolari sono circondate da periciti (PC) - cellule murali che regolano la funzione microvascolare e l'omeostasi e sono fondamentali per regolare la permeabilità della BBB alle molecole e alle cellule immunitarie 15,16,17. L'astrocita, un importante tipo di cellula gliale, è l'ultimo tipo di cellula che comprende la BBB. Le estremità degli astrociti si avvolgono attorno ai tubi vascolari EC-PC mentre i corpi cellulari si estendono nel parenchima cerebrale, formando una connessione tra neuroni e vascolarizzazione1. Trasportatori distinti di soluti e substrati sono localizzati sulle estremità degli astrociti (ad esempio, l'acquaporina 4 [AQP-4]) che hanno un ruolo critico nella funzioneBBB 18,19,20,21.

La BBB è fondamentale per mantenere la corretta funzione della salute del cervello e la disfunzione della BBB è stata segnalata in molte malattie neurologiche, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) 22,23,24,25, la sclerosi multipla 7,26,27,28, l'epilessia 29,30 e l'ictus31,32. È sempre più riconosciuto che le anomalie cerebrovascolari svolgono un ruolo centrale nella neurodegenerazione, contribuendo ad aumentare la suscettibilità agli eventi ischemici ed emorragici. Ad esempio, oltre il 90% dei pazienti con AD ha angiopatia amiloide cerebrale (CAA), una condizione caratterizzata dalla deposizione di β amiloide (Aβ) lungo la vascolarizzazione cerebrale. La CAA aumenta la permeabilità della BBB e diminuisce la funzione della BBB, lasciando il SNC vulnerabile all'ischemia, agli eventi emorragici e al declino cognitivo accelerato33.

Recentemente abbiamo sviluppato un modello in vitro della BBB umana, derivato da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente, che incorpora EC, PC e astrociti incapsulati in una matrice 3D (Figura 1A). L'iBBB ricapitola le interazioni fisiologicamente rilevanti, tra cui la formazione del tubo vascolare e la localizzazione delle estremità degli astrociti con la vascolarizzazione24. Abbiamo applicato l'iBBB per modellare la suscettibilità alla CAA mediata da APOE4 (Figura 1B). Questo ci ha permesso di identificare i meccanismi cellulari e molecolari causali attraverso i quali APOE4 promuove la CAA e di sfruttare queste intuizioni per sviluppare strategie terapeutiche che riducano la patologia CAA e migliorino l'apprendimento e la memoria in vivo nei topi APOE424. Qui, forniamo un protocollo dettagliato e un video tutorial per ricostruire la BBB da iPSC umane e modellare CAA in vitro.

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Protocol

1. Differenziare le iPSC in cellule iBBB

NOTA: Questi protocolli di differenziazione sono stati precedentemente descritti in Mesentier-Louro et al.34.

  1. Piastre per colture cellulari di rivestimento
    1. Scongelare la matrice di membrana con fattore di crescita ridotto (GF) durante la notte a 4 °C. Diluire 500 μL di matrice di membrana basale in 49,5 mL di DMEM. Mantenere questa soluzione fredda per evitare la polimerizzazione prematura della soluzione di rivestimento.
    2. Aggiungere 1-2 mL per pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale a 6 pozzetti. Lasciare agire la soluzione di rivestimento per almeno 20 minuti a 37 °C prima di sostituirla con il terreno di coltura riscaldato appropriato.
  2. Differenziamento delle iPSC umane in cellule endoteliali inducibili da ETV2
    Durata: 8 giorni
    NOTA: Questo protocollo è adattato da Blanchard et al.24 e Qian et al.35. Utilizziamo l'espressione inducibile dalla doxiciclina del fattore di trascrizione ETV2, come descritto da Wang et al.36 per migliorare la resa. ETV2 è stato introdotto tramite il plasmide PiggyBac e le cellule sono state poi trasfettate.
    1. Coltura di iPSC su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in terreno di coltura di cellule staminali pluripotenti senza alimentatore fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del ~70%.
      NOTA: Si consiglia di mantenere le iPSC inducibili con la selezione del plasmide PiggyBac (cioè la puromicina)
    2. Giorno 0: Dissociare le cellule con una miscela di proteasi e collagenasi per 5 minuti. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi e del terreno di coltura delle cellule staminali. Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare con terreno di coltura di cellule staminali e piastrare le cellule a 20.800 cellule/cm2 su piastre rivestite a matrice di membrana basale GF ridotta in terreno di coltura di cellule staminali integrate con 10 μM Y27632.
    3. Giorno 1: Sostituire il terreno con DeSR1 [DMEM/F12 + integratore di glutammina, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Amino (MEM-NEAA), 1% penicillina-streptomicina (P/S)], integrato con 10 ng/mL di BMP4, 6 μM CHIR99021 e 5 μg/mL di doxiciclina.
    4. Giorno 3: Sostituire il terreno con DeSR2 [DMEM/F12 + integratore di glutammina, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] integrato con 5 μg/mL di doxiciclina.
    5. Giorno 5: Sostituire il terreno con hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] integrato con 50 ng/mL DI VEGF-A, 2 μM di forskolina e 5 μg/mL di doxiciclina.
    6. Giorno 7: Sostituire il terreno con hECSR integrato con 50 ng/mL DI VEGF-A, 2 μM di forskolina e 5 μg/mL di doxiciclina.
    7. Giorno 8: Dividere gli EC 1:3 con una miscela di proteasi-collagenasi e riseminare su piastre fresche rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in hECSR integrate con 50 ng/mL di VEGF-A e 5 μg/mL di doxiciclina.
      NOTA: Questo è il momento migliore per incapsulare le EC in iBBB per una formazione vascolarizzazione uniforme.
    8. Giorno 10+: Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni con hECSR integrato con 50 ng/mL di VEGF-A e 5 μg/mL di doxiciclina. Continuare a dividere le cellule 1:3 con una miscela di proteasi-collagenasi quando le piastre sono confluenti.
      NOTA: gli EC derivati da iPSC possono essere congelati in qualsiasi momento a partire dal giorno 8. Solleva le celle, come se fossero di passaggio. Risospendere il pellet in terreno di congelamento EC [60% di sostituzione del siero knockout (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ng/mL DI VEGF-A e 10 μM Y27632], dividendo le cellule 1:3, e congelare utilizzando un contenitore di congelamento a -80 °C. Scongelare su piastre rivestite a matrice di membrana basale GF ridotta in hECSR integrate con 50 ng/mL DI VEGF-A, 5 μg/mL di doxiciclina.
    9. Confermare la differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali mediante immunocitochimica utilizzando anticorpi contro CD31/PECAM1 o VE-caderina (Figura 2A).
  3. Differenziazione delle iPSC umane in periciti
    Durata: 6 giorni
    NOTA: Questo protocollo è stato adattato da Patsch et al.36.
    1. Coltura di iPSC su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in condizioni di assenza di alimentatore in terreno di coltura di cellule staminali fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del ~70%.
    2. Giorno 0: Dissociare le cellule con una miscela di proteasi e collagenasi per 5 minuti. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi e del terreno di coltura delle cellule staminali. Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare con terreno di coltura di cellule staminali e placcare le cellule a 37.000-40.000 cellule/cm2 (a seconda della linea cellulare) su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in terreno di coltura di cellule staminali integrate con 10 μM Y27632.
    3. Giorno 1: Sostituire il terreno con N2B27 [50% DMEM/F12 + integratore di glutammina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, integratore di glutammina, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S] integrato con 25 ng/mL di BMP4 e 8 uM CHIR99021.
    4. Giorni 3-4: Sostituire il terreno con N2B27 integrato con 2 ng/mL di Activina A e 10 ng/mL DI PDGF-BB e somministrare quotidianamente.
    5. Giorno 5: Dividere i PC con una miscela di proteasi-collagenasi e seminare su piastre rivestite di gelatina allo 0,1% a 35.000 cellule/cm2 in N2B27 integrate con 10 ng/mL PDGF-BB.
      NOTA: le celle divise solo una volta confluenti. Alcune linee potrebbero richiedere qualche giorno in più prima di essere pronte per essere divise; Continuare a cambiare il terreno ogni giorno fino a quando le cellule non sono confluenti.
    6. Espandere i PC in N2B27 integrato con 10 ng/mL PDGF-BB, cambiando terreno ogni 2-3 giorni. Rimuovere PDGF-BB dal terreno dopo che le cellule hanno raggiunto nuovamente la confluenza e hanno subito un secondo passaggio.
      NOTA: I periciti sono pronti per essere utilizzati negli iBBB dopo il secondo passaggio. Una volta espansi, i PC possono essere bloccati. Sollevare le cellule come se fossero di passaggio, risospendere il pellet cellulare in terreni di congelamento [90% KSR e 10% DMSO] e congelare utilizzando un contenitore di congelamento a -80 °C. Scongelare su piastre ricoperte di gelatina allo 0,1% a 35.000 cellule/cm2 in N2B27.
    7. Confermare la differenziazione dei periciti mediante immunocitochimica utilizzando anticorpi contro PDGFRB e NG2 (Figura 2B).
  4. Differenziazione delle iPSC umane in cellule progenitrici neurali (NPC) e astrociti
    Tempistiche: 45 giorni in totale (15 giorni per gli NPC seguiti da 30 giorni per gli astrociti)
    NOTA: Il protocollo di differenziazione NPC è stato adattato da Chambers et al.38 e il differenziamento degli astrociti è quello descritto in TCW et al.39.
    1. Coltura di iPSC su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in condizioni di assenza di alimentatore in terreno di coltura di cellule staminali fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del ~70%.
    2. Dissociare le cellule con una miscela di proteasi e collagenasi per 5 minuti. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi e del terreno di coltura delle cellule staminali. Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare con terreno di coltura di cellule staminali e placcare le cellule a 100.000 cellule/cm2 su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta in terreno di coltura di cellule staminali integrate con 10 μM Y27632.
    3. Sostituire il terreno di coltura con cellule staminali il giorno seguente. Continuare a nutrire le cellule a giorni alterni fino a quando non raggiungono il >95% di confluenza (3-4 giorni a seconda della linea cellulare).
    4. NPC Giorno 0: Sostituire il terreno con N2B27 [50% DMEM/F12 + integratore di glutammina, 50% Neurobasale, 1x MEM-NEAA, 0,5x, integratore di glutammina, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P/S] integrato con 10 μM SB43152 e 100 nM LDN193189.
    5. PNG giorni 1-9: Nutrire quotidianamente le cellule con N2B27 integrato con 10 μM SB43152 e 100 nM LDN193189.
    6. NPC Giorno 10: Dividere gli NPC 1:3 con la miscela proteasi-collagenasi e il seme su piastre rivestite di matrice di membrana basale GF ridotta fresca in N2B27 integrata con 20 ng/mL FGF-basico e 10 μM Y27632.
    7. Giorni 11 - 13 NPC: Nutrire quotidianamente gli NPC con N2B27 integrato con 20 ng/mL di FGF-basic.
    8. NPC Giorno 14: Dividere gli NPC 1:3 con la miscela proteasi-collagenasi e riseminare su piastre rivestite con matrice di membrana basale GF ridotta fresca in N2B27 integrata con 20 ng/mL FGF-basico e 10 μM Y27632.
    9. NPC Giorno 15/Astrocita Giorno 0: Questo è il giorno 0 della differenziazione degli astrociti. Nutrire le cellule con il mezzo astrocitario completo (AM).
      NOTA: Gli NPC possono essere mantenuti in N2B27 integrato con 20 ng/mL FGF-basico e passato quando confluente. Per congelare gli NPC, risospendere il pellet cellulare in terreni di congelamento [90% KSR e 10% DMSO], dividere le cellule 1:3 e congelare utilizzando un contenitore di congelamento a -80 °C. Scongelare su piastre rivestite a matrice di membrana basale GF ridotta in N2B27 integrate con 20 ng/mL bFGF e 10 μM Y27632.
    10. Astrociti giorni 1-30: Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni con AM. Quando le cellule sono confluenti al >90%, passaggio utilizzando la miscela proteasi-collagenasi e piastra a 15.000 cellule/cm2 su piastre rivestite a matrice di membrana basale GF ridotta fresca in AM.
      NOTA: Gli astrociti dovrebbero essere completamente differenziati in 30 giorni. Gli astrociti possono essere congelati in terreni di congelamento [90% KSR e 10% DMSO] in un contenitore di congelamento a -80 °C. Scongelare su piastre rivestite a matrice di membrana basale GF ridotta in AM a 25.000-35.000 cellule/cm2.
    11. Confermare la differenziazione delle NPC mediante immunocitochimica utilizzando anticorpi contro Nestin e SOX2. Confermare la differenziazione degli astrociti mediante immunocitochimica utilizzando anticorpi contro S100B e CD44 (Figura 2C).

2. Assemblaggio dell'iBBB

  1. Scongelare la matrice di membrana basale con fattore di crescita ridotto (GF) durante la notte a 4 °C. Non diluire questa matrice in DMEM poiché gli iBBB sono incapsulati in una matrice di membrana basale GF ridotta al 100%. Ogni iBBB richiede 50 μL della matrice.
  2. Dissociare le EC differenziate con una miscela proteasi-collagenasi a 37 °C per 5 min. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi rispetto all'hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare in hECSR.
    NOTA: Utilizzare una provetta conica, da 15 mL o 50 mL, sufficientemente grande da contenere il volume delle cellule dissociate più i terreni. Le cellule possono anche essere divise in più provette e quindi ricombinate dopo la risospensione.
  3. Dissociare i PC differenziati con la miscela proteasi-collagenasi a 37 °C per 5 min. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi a N2B27 (50% DMEM/F12 + integratore di glutammina, 50% Neurobasale, 1x MEM-NEAA, integratore di glutammina 0,5x, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicillina-streptomicina [P/S]). Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare in N2B27.
  4. Dissociare gli astrociti differenziati con la miscela proteasi-collagenasi a 37 °C per 5 min. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico con un rapporto 1:3 della miscela proteasi-collagenasi per completare il mezzo astrocitario (AM). Centrifugare le celle a 300 × g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare in AM.
  5. Usando un emocitometro, conta ogni tipo di cellula. Diluire ogni tipo di sospensione cellulare a una concentrazione finale di 1 × 106 cellule/mL nel terreno appropriato.
  6. Combina il numero calcolato di cellule per ogni tipo di cellula in una provetta conica: 50 μL di iBBB richiedono 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC e 5 × 104 astrociti. Includere il 10% in più rispetto al numero di celle calcolato per tenere conto degli errori di pipettaggio. Centrifugare la miscela cellulare a 300 × g per 3 min.
    NOTA: Si consiglia vivamente di placcare alcune cellule rimanenti di ogni tipo di cellula in monocolture 2D per fissarle e colorarle per il controllo di qualità delle cellule in ingresso. Placcare ogni tipo di cellula a 35.000 cellule/cm2 su piastre precedentemente preparate rivestite con matrice di membrana basale GF ridotta e fissare dopo 3-4 giorni. Vedere la Tabella 1 per gli anticorpi specifici per tipo di cellula.
  7. Aspirare il terreno dal pellet cellulare lasciando circa 50 μL del surnatante sopra il pellet cellulare. Utilizzando un P200, risospendere delicatamente il pellet cellulare nel terreno residuo per creare un impasto monocellulare.
  8. Miscelare il liquame cellulare in una quantità sufficiente di matrice di membrana basale GF ridotta integrata con 10 ng/mL di VEGF-A per il numero desiderato di iBBB a 50 μL di matrice di membrana basale GF ridotta per iBBB, avendo cura di mescolare le cellule in modo omogeneo senza introdurre bolle d'aria.
    NOTA: In questa fase è fondamentale mantenere le cellule e la matrice della membrana basale GF ridotta sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prematura.
  9. Pipettare 50 μL di miscela di matrice a membrana basale GF ridotta nel pozzetto di una piastra di coltura con fondo di vetro a 48 pozzetti. Distribuire uniformemente il volume sul fondo del piatto (Figura 1C).
  10. Incubare gli iBBB a 37 °C per 30-40 minuti per consentire alla matrice di membrana basale GF ridotta di polimerizzare, incapsulando le cellule nella matrice.
  11. Aggiungere 500 μL di AM integrati con 10 ng/mL DI VEGF-A, 5 μg/mL di doxiciclina e 10 μM Y27632.
  12. Cambiare il terreno il giorno seguente in AM integrato con 10 ng/mL di VEGF-A. Continuare a cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni. Dopo 2 settimane, interrompere l'integrazione con VEGF-A; Gli iBBB sono pronti per i saggi a valle dopo 2 settimane.

3. Indurre l'angiopatia amiloide cerebrale (CAA) con fibrille Aβ

  1. Preparare soluzioni madre di amiloide-β1-40 e amiloide-β1-42 a 200 μM in PBS.
  2. Aggiungere Aβ al terreno iBBB su iBBB a 2 settimane fino a una concentrazione finale di 20 nM. Incubare le cellule in un terreno integrato con Aβ per 96 ore (4 giorni).
  3. Dopo 96 ore, rimuovere il mezzo e continuare con il fissaggio (sezione 4).

4. Fissaggio e colorazione dell'iBBB

  1. Per fissare l'iBBB, rimuovere il terreno, lavare in 1 mL di PBS e incubare in 500 μL di paraformaldeide al 4% per una notte a 4 °C.
  2. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e risciacquare per 4 volte (almeno) 15 minuti in 1 mL di PBS.
  3. Permeabilizzare i campioni in PBST allo 0,3% (PBS con Triton X-100 allo 0,3%) per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.
  4. Incubare le colture in tampone bloccante (5% Siero Normale in 0,3% PBST) a temperatura ambiente per almeno 1 ora agitando delicatamente.
    NOTA: Il tipo di siero utilizzato dipende dalla specie ospite per gli anticorpi secondari utilizzati. Ad esempio, se la specie ospite per gli anticorpi secondari è la capra, utilizzare il normale siero di capra; Se la specie ospite è l'asino, usa il normale siero d'asino. Questo può essere fatto anche durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
  5. Diluire gli anticorpi primari alla concentrazione raccomandata o determinata nel tampone bloccante.
  6. Sostituire la soluzione bloccante con la diluizione dell'anticorpo primario. Assicurarsi che gli iBBB siano completamente immersi nella soluzione anticorpale per un'incubazione uniforme; 100-150 μL sono sufficienti per coprire un iBBB da 50 μL in una piastra di coltura con fondo in vetro a 48 pozzetti. Incubare per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
  7. Rimuovere l'anticorpo primario. Lavare gli iBBB per 3 x 10-20 minuti in PBS allo 0,3%.
  8. Diluire l'anticorpo secondario alla concentrazione raccomandata o determinata nel tampone bloccante. Inoltre, aggiungere un colorante nucleare, come Hoechst, alla soluzione anticorpale secondaria alla concentrazione raccomandata o determinata.
  9. Sostituire l'ultimo lavaggio PBS con la diluizione secondaria degli anticorpi. Assicurarsi che gli iBBB siano completamente immersi nella soluzione anticorpale per un'incubazione uniforme; 100-150 μL sono sufficienti per coprire un iBBB da 50 μL in una piastra di coltura con fondo in vetro a 48 pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore agitando delicatamente.
    NOTA: Questa operazione può essere eseguita anche durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
  10. Lavare gli iBBB 4-5 volte per almeno 1 ora per lavaggio in PBS. Conservare in PBS o in un supporto di montaggio anti-sbiadimento a 4 °C fino all'acquisizione dei campioni.
  11. Per ottenere un'immagine su un microscopio invertito, conservare gli iBBB in lastre o piatti con fondo di vetro. Posizionare un vetrino coprioggetti sopra il pozzetto di vetro per mantenere gli iBBB in posizione (Figura 1D).

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Representative Results

Un iBBB correttamente formato si solidifica in un singolo disco traslucido (Figura 3A). È normale che l'iBBB si stacchi dalla superficie su cui è stato pipettato per la prima volta dopo alcuni giorni. Questo non può essere evitato, ma non è una grande preoccupazione per la corretta formazione dell'iBBB se si presta attenzione quando si cambia il supporto per non aspirare accidentalmente l'iBBB. Dopo 24 ore, le singole cellule uniformemente distribuite possono essere identificate al microscopio in campo chiaro (Figura 3B). Dopo 2 settimane, possono essere visibili strutture più distinte, anche se è difficile distinguerle con la definizione (Figura 3C).

La qualità dell'iBBB dipende fortemente dalla qualità della differenziazione delle celle di input. Si consiglia vivamente di placcare alcune cellule rimanenti in monocolture 2D per fissare e colorare per marcatori specifici del tipo di cellula. Gli iBBB formati da cellule endoteliali positive per oltre il 70% per PECAM1 o VE-caderina (Figura 2A), i periciti positivi per oltre il 95% per PDGFRB (Figura 2B) e gli astrociti positivi per oltre il 95% per S100B e CD44 (Figura 2C) sono i migliori per iBBB di successo. I risultati di questo controllo di qualità sono il primo indicatore di iBBB di alta qualità.

Le strutture 3D fisiologicamente rilevanti dovrebbero formarsi dopo 2 settimane di auto-assemblaggio. Al momento del fissaggio e della colorazione, vediamo l'evidenza di strutture tubolari che si colorano positivamente per il marcatore endoteliale PECAM1, che è fondamentale per la formazione di giunzioni strette (Figura 4A). La più grande variabilità nella formazione di iBBB è l'entità della formazione di microvascolari. Nello scenario "peggiore", la rete cellulare endoteliale appare più frammentata o non si estende in tutto l'iBBB, mentre nello scenario "migliore", la vascolarizzazione è uniforme e si ramifica in tutto l'iBBB. La differenziazione delle cellule endoteliali che è superiore al 70% PECAM1-positiva forma reti più coerenti. Inoltre, l'acquaporina-4, una proteina espressa dagli astrociti che si localizza alle estremità degli astrociti, si allinea con la colorazione PECAM1, indicando che gli astrociti estendono le loro zampe terminali per entrare in contatto con le cellule endoteliali (Figura 4B). Infine, ci aspettiamo di vedere i periciti intorno al sistema vascolare (Figura 4C).

La lettura primaria per l'angiopatia amiloide cerebrale (CAA) nelle iBBB è la presenza di β amiloide (Aβ). L'Aβ può essere misurato utilizzando anticorpi mirati o seminando Aβ marcato in modo fluorescente per indurre fenotipi di CAA (Figura 5). Il trattamento delle iBBB con Aβ dovrebbe aumentare l'intensità e l'area di colorazione dell'Aβ, poiché le cellule della BBB non esprimono molta proteina Aβ endogena. In alternativa, i campioni fissi possono essere colorati con tioflavina T per rilevare l'accumulo di amiloide. I livelli di Aβ dipendono dal genotipo delle cellule staminali utilizzate per generare l'iBBB, con alcuni fattori di rischio associati al morbo di Alzheimer e alla CAA che aumentano la quantità di accumulo e colorazione di Aβ (Figura 5B, C)24.

Figure 1
Figura 1: Una barriera emato-encefalica in vitro per modellare l'angiopatia amiloide cerebrale. (A) Rappresentazione schematica dell'assemblaggio e della maturazione di iBBB. Dopo la differenziazione di cellule endoteliali, astrociti e periciti da cellule staminali pluripotenti indotte, le cellule vengono incapsulate in una matrice di gel in una sospensione a singola cellula. Nel corso di 2 settimane, le cellule si auto-assemblano in unità vascolari, simili alle strutture identificate in vivo. (B) Schema del test dell'angiopatia amiloide cerebrale. L'amiloide-β viene aggiunto agli iBBB maturi per 96 ore per indurre l'aggregazione di Aβ. (C) Diagramma che mostra la vista laterale di un iBBB dopo la semina in un pozzo con fondo di vetro. (D) Un grafico di un iBBB preparato per l'imaging su un microscopio invertito. Abbreviazioni: BBB = barriera emato-encefalica; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iBBB = un modello in vitro della BBB umana derivato da un modello di BBB derivato da iPSC del paziente, che incorpora cellule endoteliali, periciti e astrociti incapsulati in una matrice 3D; Aβ = β amiloide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Validazione di cellule iBBB derivate da iPSC. (A) Proiezione rappresentativa di massima intensità di cellule endoteliali in monocolture 2D colorate con VE-caderina (verde) e PECAM1 (rosso). (B) Immagini rappresentative di periciti in monocolture 2D colorate con PDGFRB (verde) e NG2 (rosso). (C) Immagini rappresentative di astrociti in monocolture 2D colorate con CD44 (in alto; verde) e S100B (in basso; in verde). Tutti i nuclei sono colorati con Hoechst 33342. Le immagini sono state scattate con una Nikon Eclipse Ti2-E con ingrandimento 20x (A,B) o una Leica Stellaris 8 con ingrandimento 40x (C). Tutte le barre della scala sono da 100 μm. Abbreviazioni: BBB = barriera emato-encefalica; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iBBB = un modello in vitro della BBB umana derivato da un modello di BBB derivato da iPSC del paziente, che incorpora cellule endoteliali, periciti e astrociti incapsulati in una matrice 3D; VE-caderina = caderina endoteliale vascolare; PECAM1 = molecola 1 di adesione piastrinica ed endoteliale; PDGFRB = recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine; NG2 = antigene gliale neurone 2; S100B = S100 proteina beta legante il calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Assemblaggio dell'iBBB. (A) Immagine in campo chiaro di un iBBB da 15 μL 24 ore dopo la placcatura con ingrandimento 2x. (B) Immagine in campo chiaro di un iBBB 24 ore dopo la placcatura con ingrandimento 10x. (C) Immagine in campo chiaro di un iBBB 2 settimane dopo la placcatura con un ingrandimento di 10x. Barra graduata = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Immagini scattate con una Nikon Eclipse Ts2R-FL invertita. Abbreviazioni: BBB = barriera emato-encefalica; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iBBB = un modello in vitro della BBB umana derivato da un modello di BBB derivato da iPSC del paziente, che incorpora cellule endoteliali, periciti e astrociti incapsulati in una matrice 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Interazioni cellulari nell'iBBB. Immagini rappresentative di cellule endoteliali, periciti e astrociti nell'iBBB. (A) Cellule endoteliali (PECAM1) e astrociti (S100β). (B) Co-localizzazione delle cellule endoteliali (PECAM1) e degli astrociti terminali (AQP-4). (C) cellule endoteliali (PECAM1) e periciti (NG2). Tutti i nuclei sono colorati con Hoechst 33342. Le immagini confocali Z-stack sono state scattate con una Leica Stellaris 8 con ingrandimento 20x (A, B) o con una Nikon Eclipse Ti2-E con ingrandimento 20x (C). Barre di scala = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Abbreviazioni: BBB = barriera emato-encefalica; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iBBB = un modello in vitro della BBB umana derivato da un modello di BBB derivato da iPSC del paziente, che incorpora cellule endoteliali, periciti e astrociti incapsulati in una matrice 3D; PECAM1 = molecola 1 di adesione piastrinica ed endoteliale; AQP-4 = acquaporina-4; NG2 = antigene gliale neurone 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Angiopatia amiloide cerebrale in vitro. (A) iBBB non-AD esposti a terreni condizionati da neuroni di controllo o da sovraespressione di Aβ. L'anticorpo 6e10 riconosce Aβ. (B) Immagini rappresentative di iBBB da linee cellulari isogeniche APOE3 e APOE4 trattate con 20 nM Aβ-FITC1-42 per 96 ore. (C) Quantificazione dell'amiloide in iBBB da linee cellulari isogeniche APOE3 e APOE4 trattate con 20 nM Aβ-FITC1-40 o Aβ-FITC1-42. Barre di scala = 50 μm (A), 10 μm (B). Questa cifra è stata adattata da Blanchard et al24. Abbreviazioni: BBB = barriera emato-encefalica; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iBBB = un modello in vitro della BBB umana derivato da un modello di BBB derivato da iPSC del paziente, che incorpora cellule endoteliali, periciti e astrociti incapsulati in una matrice 3D; Aβ = β amiloide. APOE = Apolipoproteina E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Marcatori Società Numero di catalogo Diluizione
Cellule endoteliali PECAM1 (CD31) Sistemi di ricerca e sviluppo AF806 1:500
VE-caderina (CD144) Sistemi di ricerca e sviluppo AF938 1:500
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 1:500
Periciti PDGFRβ Sistemi di ricerca e sviluppo AF385 1:500
NG2 cantone di Abcam AB255811 1:500
Astrociti Visualizzazione del materiale S100β Sigma-Aldrich S2532-100uL 1:500
CD44 Tecnologia di segnalazione cellulare ANNI 3570 1:400
AQP-4 Invitrogen PA5-53234 1:300
GFAP
ALDH1L1
EAAT1
EAAT2
Amiloide-β 6e10 Bioleggenda SIG-39320 1:1,000
Tioflavina T Chem Impex 22870 25 μM

Tabella 1: Marcatori cellulari consigliati per i controlli di qualità della differenziazione. Marcatori cellulari per i diversi tipi cellulari della BBB che possono essere utilizzati per verificare la qualità delle differenziazioni e per identificare le cellule nell'iBBB formata. I marcatori utilizzati in questo documento sono in grassetto.

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Discussion

La disfunzione della BBB è una comorbilità e, potenzialmente, una causa o un fattore esacerbante in numerose malattie neurologiche 7,40,41. Tuttavia, è quasi impossibile studiare la biologia molecolare e cellulare alla base della disfunzione e della degradazione della BBB negli esseri umani con malattie neurovascolari. La BBB inducibile (iBBB) presentata in questo protocollo fornisce un sistema in vitro che ricapitola importanti interazioni cellulari della BBB, tra cui la formazione del tubo vascolare e la localizzazione delle estremità degli astrociti con la vascolarizzazione. L'iBBB può essere utilizzato per studiare le vie molecolari coinvolte in qualsiasi fase della disfunzione della BBB e può modellare fenotipi di malattie neurovascolari, come l'aggregazione di amiloide-β, come si vede nell'angiopatia amiloide cerebrale.

L'assemblaggio dell'iBBB è semplice, anche se la qualità degli iBBB dipende fortemente dalla qualità delle cellule derivate da iPSC utilizzate. Mentre l'iBBB fornisce una nicchia multicellulare che può promuovere la maturazione delle cellule componenti, ogni tipo di cellula deve essere adeguatamente modellato prima di essere incapsulato. È fondamentale eseguire controlli di qualità su ciascuna differenziazione eseguendo la colorazione in immunofluorescenza per marcatori specifici per tipo di cellula sulle singole monocolture (Tabella 1). Ogni linea iPSC si comporta in modo diverso e alcune condizioni, come la densità di semina o il numero di giorni in ciascun mezzo di patterning, potrebbero dover essere determinate empiricamente e regolate per ottimizzare l'efficienza di differenziazione.

Il protocollo descritto suggerisce una dimensione di 50 μL, ma l'iBBB può essere ridotto fino a 5 μL, a seconda della disponibilità delle celle, del numero di iBBB desiderati e dell'applicazione a valle. Gli iBBB più grandi contengono più cellule, il che li rende ideali per la raccolta di proteine, lipidi o acidi nucleici. Gli iBBB più piccoli possono facilitare lo screening dei farmaci o altri test scalabili.

L'iBBB è uno strumento molto versatile per lo studio della BBB in vitro. Poiché ogni tipo di cellula è differenziato in modo indipendente, gli iBBB possono essere assemblati da diversi background genetici, permettendoci di studiare come i fattori di rischio genetici influenzano specifici tipi di cellule per contribuire alla disfunzione della BBB. Questa strategia è stata applicata per dimostrare che l'APOE4, il fattore di rischio più comune per la malattia di Alzheimer e l'angiopatia amiloide cerebrale, agisce in parte attraverso un meccanismo patogenetico specifico nei periciti24. Un ulteriore utilizzo di questo strumento ci consentirebbe di analizzare i contributi individuali di EC, PC e astrociti nel mantenere l'integrità della BBB e il modo in cui ogni tipo di cellula vacilla durante lo sviluppo della malattia.

Attualmente, il metodo più comune per modellare la BBB in vitro è l'utilizzo di un sistema transwell, seminato con EC e talvolta co-coltivato con periciti e/o astrociti, per formare un monostrato impermeabile 42,43,44. La struttura 3D dell'iBBB consente l'autoassemblaggio dell'unità vascolare e permette la formazione di strutture tubolari che assomigliano maggiormente alla vascolarizzazione fisiologica. Uno svantaggio della semina di iBBB in una piastra a pozzetti, come descritto in questo protocollo, è che non subiscono le sollecitazioni causate dalla vascolarizzazione a flusso costante in un sistema in vivo. Per ovviare a questo problema, l'iBBB può essere seminato in un chip microfluidico in grado di generare un flusso dinamico 45,46,47. Questo sistema può essere utilizzato anche per testare la permeabilità vascolare e la perfusione di piccole molecole.

In conclusione, questo metodo fornisce un modello flessibile, 3D, derivato da iPSC della BBB che può essere utilizzato come piattaforma per studiare innumerevoli aspetti della BBB a livello cellulare, inclusa la capacità di ricapitolare i fenotipi delle malattie neurovascolari e il potenziale per lo screening della permeabilità della BBB dei farmaci per un'ampia gamma di applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation e Brain Injury Association of America. C.G. è supportato da NIH F31NS130909. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500

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