Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية عن طريق الإفراط في التعبير عن التصلب المشترك والتوتر أحادي المحور 2D

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

توضح هذه المقالة إجراء لإنتاج iTenocytes عن طريق توليد خلايا انسجة اللحمة المتوسطة المشتقة من iPSC مع الإفراط في التعبير المشترك عن Scleraxis باستخدام ناقل عدسي فيروسي وتمدد أحادي المحور عبر مفاعل حيوي 2D.

Abstract

تتطلب تحديات اليوم في إصلاح الأوتار والأربطة تحديد مرشح مناسب وفعال للعلاج القائم على الخلايا لتعزيز تجديد الأوتار. تم استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة (MSCs) كاستراتيجية محتملة لهندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار. في حين أنها متعددة القدرات ولديها إمكانات التجدد في الجسم الحي ، إلا أنها محدودة في قدرتها على التجديد الذاتي وتظهر عدم تجانس النمط الظاهري. يمكن للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التحايل على هذه القيود بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي واللدونة التنموية التي لا مثيل لها. في تطور tenocyte ، Scleraxis (Scx) هو منظم جزيئي مباشر حاسم لتمايز الأوتار. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التنظيم الميكانيكي عنصر مركزي يوجه تطور الأوتار الجنينية والشفاء. على هذا النحو ، قمنا بتطوير بروتوكول لتغليف التأثير التآزري للتحفيز البيولوجي والميكانيكي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. تم حث iPSCs لتصبح خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (iMSCs) وتم تمييزها بعلامات الخلايا اللحمية المتوسطة الكلاسيكية عبر قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، تم تحويل iMSCs إلى SCX بشكل ثابت (iMSCSCX +). يمكن أن تنضج خلاياiMSC SCX + هذه إلى خلايا iTenocytes عبر تحميل الشد أحادي المحور باستخدام مفاعل حيوي 2D. تميزت الخلايا الناتجة بمراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الخلايا iTenocytes لمساعدة الباحثين في تطوير مصدر غير محدود للخلايا الخيفية الجاهزة لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.

Introduction

لمعالجة المشكلات المعاصرة في إصلاح الأوتار والأربطة ، هناك حاجة إلى مرشح خلية ذي صلة مناسب للعلاجات القائمة على الخلايا. تتضمن إحدى طرق التحقيق في هندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs) والخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) كاستراتيجيات محتملة. تتمتع هذه الخلايا بقدرة متعددة القدرات ووفرة كبيرة وإمكانات متجددة في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فقد أظهروا قدرة شفاء محسنة ونتائج وظيفية محسنة في النماذج الحيوانية1. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا تظهر قدرات محدودة على التجديد الذاتي ، وتنوع النمط الظاهري ، وعلى وجه الخصوص ، قدرة محدودة على تكوين الأوتار. توفر تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) حلا لهذه القيود نظرا لقدرتها الرائعة على التجديد الذاتي وقدرتها على التكيف التنموي التي لا مثيل لها. حقق فريق البحث لدينا وآخرون تمايزا ناجحا ل iPSCs إلى كيانات تشبه الخلايا اللحمية المتوسطة (iMSCs) 2,3. على هذا النحو ، فإن iMSCs لديها القدرة على أن تكون مصدرا خيفيا لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.

التصلب (SCX) هو عامل نسخ ضروري لتطور الأوتار ويعتبر أقدم علامة يمكن اكتشافها للخلايا الوترية المتمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، ينشط SCX علامات تمايز الأوتار النهائية ، بما في ذلك الكولاجين من النوع 1a1 (COL1a1) والموهوك (MKX) والتينومودولين (TNMD) ، من بين أمور أخرى4،5،6. تشمل الجينات الأخرى التي يتم التعبير عنها أثناء نضوج الأوتار عضو عائلة البروتين المعزز لبلمرة التوبولين 3 (TPPP3) ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRa)7. في حين أن هذه الجينات ضرورية لتطور الأوتار ونضجها ، إلا أنها للأسف ليست فريدة من نوعها لأنسجة الأوتار ويتم التعبير عنها في الأنسجة العضلية الهيكلية الأخرى مثل العظام أو الغضاريف 5,7.

بالإضافة إلى التعبير عن العلامات أثناء نمو الأوتار ، يعد التحفيز الميكانيكي عنصرا أساسيا لتطور الأوتار الجنينية والشفاء4،5،6. الأوتار مستجيبة ميكانيكيا ، وتتغير أنماط نموها استجابة لبيئتها. على المستوى الجزيئي ، تؤثر الإشارات الميكانيكية الحيوية على التطور والنضج والصيانة واستجابات الشفاء للخلاياالوترية 8. تم استخدام أنظمة مفاعلات حيوية مختلفة لنمذجة الأحمال الفسيولوجية والإشارات الميكانيكية الحيوية. تتضمن بعض هذه الأنظمة النموذجية تحميل الأنسجة خارج الجسم الحي ، وأنظمة تحميل الخلايا 2D التي تطبق التوتر ثنائي المحور أو أحادي المحور ، وأنظمة 3D باستخدام السقالات والهلاميات المائية 9,10. تعد أنظمة 2D مفيدة عند دراسة تأثيرات التحفيز الميكانيكي على الجينات الخاصة بالوتر أو مورفولوجيا الخلايا في سياق مصير الخلية ، بينما يمكن لأنظمة 3D تكرار تفاعلات الخلية و ECM بدقةأكبر 9,10.

في أنظمة التحميل 2D ، يكون الضغط بين الخلايا وركيزة الثقافة متجانسا ، مما يعني أنه يمكن التحكم بشكل كامل في الحمل المطبق على الهيكل الخلوي للخلايا. بالمقارنة مع التحميل ثنائي المحور ، فإن التحميل أحادي المحور أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ، حيث تتعرض الخلايا الوترية في الغالب للتحميل أحادي المحور من حزم الكولاجين في الجسم الحي9. وجد أنه خلال الأنشطة اليومية ، تتعرض الأوتار لتحميل شد أحادي المحور يصل إلى 6٪ إجهاد11. على وجه التحديد ، وجدت الدراسات السابقة أن التحميل ضمن النطاقات الفسيولوجية من 4٪ -5٪ قد ثبت أنه يعزز تمايز الوتر من خلال الحفاظ على تعبير العلامات المرتبط بالوتر مثل SCX و TNMD ، بالإضافة إلى زيادة إنتاج الكولاجين 9,10. قد تكون السلالات التي تزيد عن 10٪ ذات صلة بالصدمة ولكنها ليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية 12,13.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول يأخذ في الاعتبار التأثير التآزري للتحفيز الميكانيكي والبيولوجي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. نصف أولا طريقة قابلة للتكرار لحث iPSCs في iMSCs عن طريق التعرض قصير المدى للأجسام الجنينية لعوامل النمو ، والتي تؤكدها علامات سطح MSC باستخدام قياس التدفق الخلوي. ثم نقوم بتفصيل طريقة نقل الفيروسات العدسية لهندسة iMSCs للحصول على تعبير مفرط مستقر عن SCX (iMSCSCX +). لمزيد من نضوج الخلايا ، يتم زرع iMSCSCX + في ألواح سيليكون مغلفة بالفبرونيكتين وتخضع لبروتوكول توتر أحادي المحور محسن باستخدام مفاعل حيوي CellScale MCFX. تم تأكيد إمكانات الوتر من خلال مراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين14. هذه الطريقة لتوليد iTenocytes هي إثبات للمفهوم قد يوفر مصدرا خيفيا غير محدود لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يمكن إجراء هذا البروتوكول لإنتاج iTenocytes في ثلاث خطوات رئيسية: iPSCs إلى iMSCs (10 أيام) ، iMSC إلى iMSCSCX + (2 أسابيع) ، iMSCSCX + إلى iTenocytes (4 أيام على الأقل). يمكن إيقاف كل خطوة رئيسية في البروتوكول مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا ، اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي. بالنسبة للطرق التي تنطوي على زراعة الخلايا ، يجب استخدام تقنيات معقمة. يجب أن تنمو جميع الخلايا في هذا البروتوكول عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 و 95٪ رطوبة.

1. تحريض iPSC البشري في الخلايا اللحمية المتوسطة المستحثة (iMSCs)

  1. إعداد التجربة
    1. قم بإعداد وسائط الأجسام المتوسطة - الجنينية المعدلة من Iscove (IMDM-EB).
      1. تكملة 50 مل من الوسائط القاعدية IMDM مع 8.5 مل من استبدال المصل بالضربة القاضية ، و 500 ميكرولتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية الدنيا (MEM) ، و 0.385 ميكرولتر (مخزون 110 مللي مول) بيتا ميركابتوإيثانول ، و 500 ميكرولتر من محلول مضاد حيوي مضاد حيوي (AAS) (التركيزات النهائية: 17٪ ، 1٪ ، 110 ميكرومتر ، 1٪ ، على التوالي) (انظر جدول المواد).
    2. تحضير وسائط الخلايا اللحمية المتوسطة (MSC).
      1. مكمل 440 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) منخفض الجلوكوز من Dulbecco مع 50 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، و 5 مل من محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (AAS) ، و 5 مل من L-glutamine (التركيزات النهائية: 10٪ ، 1٪ ، 2 mM ، على التوالي).
    3. تحضير ألواح مطلية بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات) (بولي هيما).
      1. أضف 10 جم من بولي هيما (انظر جدول المواد) إلى زجاجة معقمة.
      2. أضف محرك مغناطيسي إلى الزجاجة ، وأثناء التقليب ، أضف ببطء 500 مل 95٪ EtOH.
      3. بمجرد إضافة EtOH بالكامل ، قم بتشغيل وضع التحريك عند 1200 دورة في الدقيقة مع حرارة منخفضة إضافية لمدة 6 ساعات على الأقل. يمكن تخزين محلول poly-HEMA في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عام.
      4. في ظل ظروف معقمة ، أضف 2.5 ميكروغرام / سم2 في 9 مل إلى دورق T75. اضبط مستوى الصوت وفقا لحجم وعاء الاستزراع.
      5. الحفاظ على العقم ، اترك الأوعية تجف في الهواء حتى يتبخر EtOH تماما قبل الاستخدام. هذا عادة ما يستغرق 24-72 ساعة.
    4. تحضير قوارير مغلفة بالجيلاتين.
      1. اغسل زجاجة زجاجية مع هيدروكسيد الصوديوم وخصصها لإعداد الجيلاتين. لا تستخدم المنظفات.
      2. تحضير محلول الجيلاتين 1 ٪ (5 غرام الجيلاتين و 500 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية). الأوتوكلاف زجاجة مع محلول الجيلاتين لمدة 30 دقيقة.
      3. اترك محلول الجيلاتين يبرد ، ويمكن تخزينه في درجة حرارة الغرفة.
      4. قم بتغطية قارورة T75 واحدة ب 5 مل من محلول الجيلاتين لكل قارورة واحتضانها لمدة 1 ساعة على الأقل قبل خلايا البذر. يمكن تحضير قوارير مغلفة بالجيلاتين قبل 1 يوم.
    5. إعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS).
      1. امزج برنامج تلفزيوني مع 2٪ من ألبومين مصل الأبقار و 0.1٪ أزيد الصوديوم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. توليد الأجسام الجنينية (EBs)
    ملاحظة: يجب استزراع iPSCs في لوحة ذات 6 آبار ويجب أن تصل إلى التقاء 70٪ -80٪ قبل الاستخدام.
    1. في اليوم 0 ، أحضر لوحة PCR ذات قاع شفاف 384 في غطاء زراعة الأنسجة والأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة بدون غطاء.
    2. قم بإزالة وسط النمو من iPSCs (انظر جدول المواد) واغسل الآبار باستخدام PBS.
    3. أضف 0.5 مل من كاشف تفكك الخلايا اللطيف الذي تم تسخينه مسبقا (انظر جدول المواد) إلى كل بئر واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. راقب الخلايا كل 5 دقائق حتى تصبح iPSCs خلايا مفردة أو مجاميع صغيرة مرفوعة في التعليق.
    4. إعادة تعليق تعليق الخلية بماصة سعة 1 مل لضمان تعليق خلية واحدة.
    5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في وسائط IMDM-EB (الخطوة 1.1.1) ، وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
    7. احسب الحجم المناسب لتعليق الخلية المطلوب لتحقيق 5000-25000 خلية لكل بئر من لوحة 384 بئر مع 25 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر.
      ملاحظة: بشكل عام ، يمكن ل 2-3 آبار متقاربة (70٪ -80٪) من لوحة 6 آبار أن تصنع EBs في لوحة واحدة من 384 بئرا. سيتم تحديد حجم الخلايا لكل EB تجريبيا. بالنسبة للوحة 384 بئرا كاملة ، يجب استخدام 9.6 مل من تعليق الخلية ، 25 ميكرولتر لكل بئر.
    8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لأسفل مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسائط IMDM-EB و 10 ميكرومتر من Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (المخزون: 10 mM ، 1000x ، انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي 15 مل مبرد مسبقا.
    10. أضف مصفوفة غشاء القاع القابلة للذوبان على البارد (1 مجم لكل 384 صفيحة بئر من EBs) إلى المخروط (انظر جدول المواد).
    11. توزيع 25 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل بئر. ضع غطاء معقم على الطبق وقم بتدويره عند 450 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    12. في اليوم 2 ، انقل الخلايا إلى لوحة 100 مم مع 3 مل من وسائط IMDM-EB الدافئة مسبقا.
    13. انقل EBs إلى قوارير T75 المخصصة المطلية بالبولي هيما مع 10 مل من IMDM-EB. اضبط مستوى الصوت وفقا لحجم وعاء الاستزراع. اسمح ل EBs بالنمو لمدة 3 أيام.
    14. في اليوم 5 ، انقل EBs إلى قوارير T75 المطلية بالجيلاتين مع 10 مل من وسائط IMDM-EB. اضبط مستوى الصوت وفقا لحجم وعاء الاستزراع. قم بزيادة EBs لمدة 3 أيام أخرى في التعليق.
    15. في اليوم 8، تأكد من مراعاة نوعين من EBs: EBs المرفقة بالقارورة، وEBs غير المرفقة. اغسل EBs غير المرفقة من القارورة باستخدام PBS.
    16. إلى EBs المرفقة ، أضف وسائط IMDM-EB المكملة ب TGFβ-1 (10 نانوغرام / مل) (انظر جدول المواد) واسمح لها بالنمو لمدة يومين.
    17. في اليوم 10 ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط MSC. يجب تغذية الخلايا مرتين في الأسبوع. بمجرد التقاء 70٪ ، انتقل إلى "بروتوكول خلايا الرفع القياسي" لإعادة طلاء الخلايا. أعد طلاء الخلايا على ألواح مغلفة بالجيلاتين.
  3. بروتوكول خلايا الرفع القياسي
    1. بمجرد أن تصل الخلايا الملتصقة إلى التقاء 70٪ ، قم باستنشاق وسط النمو من الألواح واغسله باستخدام برنامج تلفزيوني.
    2. ارفع الخلايا بإضافة 5 مل من التربسين المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ إلى كل طبق 150 مم واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضبط حجم التربسين وفقا لحجم وعاء الاستزراع.
    3. تحت المجهر ، تحقق من رفع معظم الخلايا من كل لوحة. إذا كانت لا تزال هناك خلايا متصلة ، فانقر برفق على جوانب الألواح لإزاحة الخلايا.
    4. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي عن طريق إضافة ضعف حجم وسط النمو الذي تم تسخينه مسبقا.
    5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية وانتقل إلى الخطوات التالية.
  4. تقييم قياس التدفق الخلوي لتعبير علامة MSC
    ملاحظة: يجب استخدام MSCs البشرية ، مثل MSCs نخاع العظم ، كعنصر تحكم إيجابي.
    1. قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي" (الخطوة 1.3).
    2. أعد تعليق المادة الطافية ب 3 مل من المخزن المؤقت FACS وانقل الحجم بالكامل إلى أنابيب FACS.
    3. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. كرر خطوة الغسيل باستخدام المخزن المؤقت FACS مرتين أخريين.
    4. إلى الأنابيب الملطخة ، أضف 2 ميكرولتر من CD90-FITC المضاد للفأر ، و CD44-APC المضاد للفأر ، و CD105-PE المضاد للإنسان (انظر جدول المواد) واحتضانه لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. إلى أنابيب التحكم في النمط المتماثل ، أضف 20 ميكرولتر من الماوس IgG2a-FITC والماوس IgG1-PB والماوس IgG1-PE (انظر جدول المواد).
    6. احتضان في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل جميع الأنابيب بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت FACS والطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة). أعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل أنبوب.
    7. تحليل تعبير علامات سطح MSCs باستخدام قياس التدفقالخلوي 14. يجب أن تكون الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث: CD90-FITC ، ذروة الإثارة عند 495 نانومتر وذروة الانبعاث عند 519 نانومتر ؛ CD44-APC ، ذروة الإثارة عند 640 وذروة الانبعاثات عند 660 نانومتر ؛ CD105-PE ، ذروة الإثارة عند 561 نانومتر وذروة الانبعاثات عند 574 نانومتر.

2. تمرير iMSC والتوسع

  1. تحضير الكواشف
    1. قم بإعداد وسائط تجميد MSC.
      1. اجمع بين 30 مل من DMEM منخفض الجلوكوز ، و 5 مل من DMSO ، و 15 مل من FBS (التركيزات النهائية: 60٪ ، 10٪ ، 30٪ ، على التوالي.)
      2. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح معقم 0.45 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. المرور
    ملاحظة: بعد الحث ، يجب زراعة iMSCs على ألواح مغلفة بالجيلاتين لمدة 2 ممرات إضافية قبل الفطام لتنمو على ألواح زراعة الأنسجة البلاستيكية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تمرير الخلايا بنسبة تقسيم 1: 3 عند التقاء 70٪.
    1. قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي" (الخطوة 1.3).
    2. أعد تعليق الخلايا في وسائط MSC ، وقم بتوزيع الخلايا بالتساوي في ثلاث لوحات جديدة مقاس 150 مم من قوارير T175 مع 20 مل من الوسائط لكل قارورة. أعد الخلايا إلى 37 درجة مئوية.
    3. قم بتغذية الخلايا مرتين في الأسبوع عن طريق استبدال وسط النمو بوسائط MSC مسبقة التسخين.
  3. تجميد
    1. نفذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي".
    2. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط تجميد MSC. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى cryovial واحفظه في وعاء تجميد لمدة 24 ساعة عند -80 درجة مئوية قبل نقله إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
  4. ذوبان الجليد
    1. قم بإعداد 10 مل من وسائط MSC الدافئة مسبقا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. استرجع المبرد ، واغمسه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، وقم بتحريكه حتى تبقى كرة ثلج بحجم حبة البازلاء (حوالي 1-2 دقيقة).
    3. في غطاء زراعة الخلايا ، أضف ببطء 1 مل من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا إلى cryovial و ماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
    4. انقل تعليق الخلية من cryovial إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل المحضر مع وسائط تم تسخينها مسبقا ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة).
    5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها بوسائط جديدة. أضف تعليق الخلية إلى لوحة 150 مم بحجم إجمالي 20 مل. اضبط مستوى الصوت وفقا لحجم قارورة الثقافة.
    6. احتضان الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للانقسام.

3. الهندسة الوراثية ل iMSCs للإفراط في التعبير عن SCX باستخدام نقل الفيروسات العدسية

ملاحظة: يستغرق هذا القسم من البروتوكول أسبوعين حتى يكتمل.

  1. تحضير الوسائط والكواشف
    1. تحضير وسائط الخلية HEK293T/17.
      1. تكملة 445 مل من الحد الأدنى للوسط الأساسي النسر (EMEM) مع 50 مل من FBS و 5 مل من AAS (التركيزات النهائية: 10٪ ، 1٪ ، على التوالي).
    2. قم بإعداد وسائط التعبئة العدسية MSC.
      1. حضري السيروم المعطل بالحرارة عن طريق تسخين 50 مل من FBS بدرجة حرارة الغرفة في حمام مائي على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. اجمع بين 445 مل من DMEM منخفض الجلوكوز مع FBS المعطل بالحرارة و 5 مل من L-glutamine (التركيزات النهائية: 10٪ ، 2 mM ، على التوالي.)
    3. إعداد مجمع النقل.
      1. اسمح لمكونات مجمع النقل (انظر جدول المواد) بالذوبان على الجليد: تغليف البلازميدات VSV-G و Delta و SCX plasmid و BioT15,16.
      2. دوامة بلطف وتدور أسفل البلازميدات. قياس تركيزات الحمض النووي.
      3. بناء على تركيزات الحمض النووي وعدد القوارير المخصصة للنقل ، احسب حجم كل مكون مطلوب: بالنسبة لقارورة T75 واحدة ، سيتكون مجمع النقل من 750 ميكرولتر وسط خال من المصل (مثل DMEM الخالي من المصل أو PBS) ، 7.5 ميكروغرام SCX بلازميد ، 0.75 ميكروغرام VSV-G بلازميد ، 6.75 ميكروغرام دلتا بلازميد ، و 22.5 ميكرولتر BioT. ضع في اعتبارك المزيد لخطأ الماصة.
      4. تخلط عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل. تدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة واستخدامها على الفور.
  2. نقل وإنتاج الفيروسات العدسية
    تنبيه: بدءا من اليوم 3 ، يستلزم البروتوكول العمل مع فيروس lentivirus ، وبالتالي ، يجب تنفيذ العمل باستخدام إجراءات تشغيلية من مستوى الاحتواء 2+. يجب على العمال ارتداء معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك طبقتين من القفازات وأغطية المعصم ونظارات السلامة والقناع والسراويل الطويلة والأحذية المغلقة. يجب تطهير جميع النفايات والمواد ، بما في ذلك أطراف الماصة والقوارير والوسط السائل ، بالمبيض (هيبوكلوريت الصوديوم النهائي 1٪) لمدة 20 دقيقة على الأقل. لا تستخدم الفراغ.
    1. البذور HEK293T/17 خلية.
      1. قبل حوالي 18-24 ساعة من النقل (اليوم 0) ، ارفع الخلايا 293T وقم بوضعها في قوارير T75. تفترض المجلدات التالية أن T75 هو وعاء الاستزراع. اضبط مستوى الصوت وفقا لوعاء زراعة الخلية المستخدم.
      2. قم بإزالة وسط الاستزراع من القوارير واغسله ب 5 مل من برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: ترفع الخلايا بسهولة من سطح القارورة. أضف PBS إلى جانب القارورة وتجنب الإضافة المباشرة للمحلول إلى الخلايا.
      3. أضف 3 مل من التربسين المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ إلى كل دورق واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
      4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد التعليق في وسائط 293T ، وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
      5. ضع الخلايا في درجة حرارة 5.3 × 104 خلايا / سم2 واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      6. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بإعداد مجمع النقل. استبدل وسط النمو من الخلايا ب 5 مل من وسط MSC للتغليف العدسي المسخن مسبقا (الخطوة 3.1.2).
      7. أضف مجمع النقل بالتنقيط إلى الخلايا. قم بإمالة الطبق برفق لضمان التعرض المتساوي لمجمع النقل للخلايا. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
        ملاحظة: يجب ملاحظة السمية بعد 24 ساعة (اليوم 2).
      8. بعد 48 ساعة (اليوم 3) ، اجمع الوسط المحتوي على الفيروس بعناية في أنبوب مخروطي منفصل باستخدام ماصة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة).
      9. أضف 5 مل من وسيط تغليف MSC lenti الدافئ مسبقا إلى قارورة T75 المكونة من 293 خلية T والعودة إلى الحاضنة طوال الليل.
      10. بعد الطرد المركزي ، قم بتصفية المادة الطافية بمرشح معقم 0.45 ميكرومتر عن طريق سحب المادة الطافية مباشرة من خلال الفلتر. قم بتخزين الوسط المحتوي على الفيروس في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
      11. بعد 24 ساعة أخرى (اليوم 4) ، قم مرة أخرى بجمع الوسط المحتوي على الفيروس بعناية في أنبوب مخروطي منفصل باستخدام ماصة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة).
      12. ادمج الفيروس مع فيروس يوم التجميع السابق واخلطه لضمان حل متجانس. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا وإعادة تشغيله لاحقا ، اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي. يمكن تسعير الفيروس العدسي وتجميده عند -80 درجة مئوية ، أو يمكن تخزين الفيروس العدسي على الجليد أثناء متابعة "نقل iMSCs مع SCX" (الخطوة 3.3).
        ملاحظة: بمجرد تجميد حصص الفيروس العدسي وإذابتها ، لا تقم بإعادة التجميد.
  3. نقل iMSCs مع SCX
    1. أداء نقل لوحة العيار.
      1. في اليوم 0 ، قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي".
      2. أعد تعليق الخلايا في وسائط MSC وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
      3. في لوحة 6 آبار ، أضف 4 × 103 خلايا / سم2. أعد طلاء الباقي في لوحة إضافية مقاس 150 مم مع 20 مل من وسائط MSC (ستكون هذه هي لوحة التحكم). احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      4. في اليوم التالي (اليوم 1) ، يجب أن تكون الخلايا ~ 40٪ متقاربة. سخن وسط نمو عبوة العدس وقم بإذابة البوليبرين وحوالي 3 مل من فيروس العدس على الثلج (أو إذا تم ذلك في نفس يوم جمع الفيروسات ، قم بتخزينه على الثلج حتى الاستخدام).
      5. أضف وسط نمو عبوة lenti وفيروس lentivirus إلى الآبار بناء على التتر المطلوب (أي 12.5٪ ، 25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، 100٪). أضف 0.5 ميكرولتر من البوليبرين لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل (تركيز المخزون: 10 مجم / مل ، انظر جدول المواد).
      6. قم بتدوير اللوحة حولها لضمان التعرض المتساوي لجميع الخلايا. أعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    2. تقييم كفاءة عيار الفيروس العدسي SCX باستخدام قياس التدفق الخلوي.
      1. بعد 48 ساعة ، قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي".
      2. أعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
      3. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في 3 مل من المخزن المؤقت FACS لغسلها. انقل تعليق الخلية إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
      4. كرر غسل المخزن المؤقت FACS مرتين أخريين وأعد تعليق كريات الخلية النهائية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تقييم تعبير GFP لكل عيار باستخدام آلة قياس التدفق الخلوي.
      5. بناء على عدد التتر وصلاحية الخلية ، حدد عيار فيروس العدس المناسب للمضي قدما في النقل. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا وإعادة تشغيله لاحقا ، اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي.
    3. إجراء نقل SCX على نطاق واسع.
      ملاحظة: وحدات التخزين المدرجة هي لكل لوحة 1x 150 مم أو 1x T175 قارورة. يمكن تعديل ذلك وفقا لذلك اعتمادا على حجم الوعاء المطلوب وحجم النقل.
      1. في اليوم 0 ، قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي".
      2. أعد تعليق الخلايا في وسائط MSC وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا. بذر الخلايا في 4 × 103 خلايا / سم2. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      3. في اليوم التالي (اليوم 1) ، يجب أن تكون الخلايا ~ 40٪ متقاربة. قم بتسخين وسط نمو عبوة العدس وقم بإذابة البوليبرين والكمية المحسوبة مسبقا من فيروس العدس على الجليد.
      4. بناء على العيار المحدد ، أضف الكمية المطلوبة من وسط نمو عبوات العدس وفيروس العدس إلى الآبار. أضف 5 ميكروغرام / مل من البوليبرين (تركيز المخزون: 10 مجم / مل).
      5. في يوم 3 ، راقب الخلايا تحت مجهر الفلورسنت. يجب أن يتألق iMSCSCX + المنتج حديثا ب GFP. استبدل الوسط المحتوي على الفيروس بوسائط MSC التي تم تسخينها مسبقا. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا وإعادة تشغيله لاحقا ، اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي.

4. iMSCSCX + المرور والتوسع

  1. قم بإجراء تمرير وتوسيع وتجميد وذوبان iMSCSCX + باتباع نفس iMSCs ، كما هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول.

5. التحميل الميكانيكي

ملاحظة: يستغرق هذا القسم ما لا يقل عن 4 أيام ولكن يمكن أن يكون أطول اعتمادا على ما إذا كان قد لوحظ تقلص الخلايا.

  1. إعداد التجربة
    1. تحضير لوحات السيليكون.
      1. الأوتوكلاف 2 لوحات سيليكون (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، في ظل ظروف معقمة ، قم بإزالة ألواح السيليكون من كيس الأوتوكلاف وضعها في ألواح 150 مم.
      2. اجمع بين 130 ميكرولتر من الفبرونيكتين (100x ، انظر جدول المواد) مع 13 مل من PBS المعقم في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اقلب الأنبوب عدة مرات للخلط.
      3. أضف 400 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين إلى كل بئر من ألواح السيليكون. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو طوال الليل.
      4. قبل الاستخدام ، قم بنضح محلول الفبرونيكتين واترك الألواح تجف في الهواء في غطاء زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح لمحلول الفبرونيكتين بالتبخر تماما.
        ملاحظة: يمكن إزالة محلول الفبرونيكتين من الآبار في وقت مبكر ، ويمكن أن تجلس الألواح المطلية الآن عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين حتى الاستخدام.
    2. قم بإعداد وسائط MSC الممتدة.
      1. قم بإعداد وسائط تمدد MSC بإضافة 140 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك (المخزون: 100x ، التركيز النهائي: 50 ميكروغرام / مل) إلى 14 مل من وسائط MSC التي تم تسخينها مسبقا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
        ملاحظة: يجب إضافة حمض الأسكوربيك طازجا إلى وسائط MSC قبل كل تغيير في الوسائط.
  2. بذر iMSCSCX + في ألواح السيليكون
    1. قم بتنفيذ "بروتوكول خلايا الرفع القياسي" (الخطوة 1.3).
    2. أعد تعليق الخلايا في وسائط MSC وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
    3. احسب حجم تعليق الخلية اللازم للحصول على 1.25 × 104 خلايا / سم2.
    4. قم بإزالة هذا الحجم من وسائط التمدد MSC من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. أضف الخلايا المستهدفة. عكس لمتجانسة تعليق الخلية الجديدة.
    5. أضف 400 ميكرولتر من تعليق الخلية الجديد إلى كل بئر من كلا لوحتي السيليكون.
    6. ضع الغطاء مرة أخرى على ألواح 150 مم وأعدها إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. التوتر أحادي المحور
    1. في اليوم التالي ، اشطف جهاز التمدد (انظر جدول المواد) باستخدام ddH2O متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. امسح الجهاز ، ضعه في غطاء زراعة الخلايا ، والأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    2. استرجع الألواح المصنفة وافحص الآبار بحثا عن ارتباط جيد بالخلية.
    3. اترك صفيحة واحدة في الحاضنة (تحكم ثابت) وضع صفيحة السيليكون المصنفة الثانية في جهاز التمدد عن طريق محاذاة البراغي مع الفتحات الموجودة في لوحة السيليكون. استبدل الغطاء الموجود على الجهاز لضمان العقم.
    4. قم بتوصيل الجهاز بلوحة السيليكون المصنفة بالمصدر الإلكتروني (انظر جدول المواد) وضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
    5. في البرنامج ، اضبط بروتوكول التمدد الدوري على 4٪ سلالة جيبية ، 0.5 هرتز ، 2 ساعة في اليوم. ابدأ التمدد بالضغط على زر البدء مرة واحدة. يجب أن تبدأ التمدد على الفور.
    6. تمتد الخلايا لمدة لا تقل عن 3 أيام. راقب الخلايا يوميا وأوقف بروتوكول التمدد إذا كان من الممكن ملاحظة تقلص الخلايا. قم بتغيير الوسائط إلى وسائط MSC Stretch جديدة كل يوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمايز iPSCs البشرية إلى iMSCs
كما هو موضح سابقا ، فإن البروتوكول الحالي للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs ينطوي على تكوين أجسام جنينية2. تستغرق هذه العملية حوالي عشرة أيام للحث على iMSCs من iPSCs (الشكل 1A). ومع ذلك ، يوصى بشدة بتمرير iMSCs التي تم إنشاؤها حديثا مرتين على الأقل. هذا لا يساعد فقط في التخلص من الحاجة إلى الألواح المطلية بالجيلاتين ولكنه يؤسس أيضا تعبيرا مستقرا عن MSC. يوضح قياس التدفق الخلوي ، الذي تم إجراؤه بعد ستة مقاطع بعد التمايز ، وجود عدد خلايا نقي تقريبا مع تعبير عال عن علامات سطح MSC الكلاسيكية ، بما في ذلك CD44 (83.1٪) و CD90 (88.4٪) و CD105 (99.2٪) 17,18 (الشكل 1B). من حيث التشكل ، يجب أن تشبه iMSCs إلى حد كبير MSCs نخاع العظم ، وتظهر ممدودة وتشبه الخلايا الليفية (الشكل 1C).

الهندسة الوراثية ل iMSCs للإفراط في التعبير عن SCX باستخدام نقل الفيروسات العدسية
تم إنتاج فيروسات Lentiviruses عن طريق نقل خلايا HEK293T/17 باستخدام ناقل pLenti-C-mGFP ، حيث تم إدخال SCXB للتعبير عن SCX-GFP + ، جنبا إلى جنب مع اثنين من بلازميدات التعبئة. تم إجراء عمليات النقل باستخدام طريقة BioT15,16 بنسبة 1.5: 1 من BioT (μl) إلى DNA (μg).

تم زرع HEK293T/17 خلية بكثافة 5.3 × 104 خلايا / سم2 18-24 ساعة قبل النقل. في وقت النقل ، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -95٪ لتجنب التتر منخفض الكفاءة (الشكل 2B1 ، يسار). في غضون 24 ساعة من إضافة كوكتيل البلازميد ، لوحظت بعض السمية ، والتي بلغت ذروتها عند 48 ساعة (الشكل 2B2). نظرا لأن ناقل الفيروس العدسي SCX مقترن ب GFP ، يجب أن يكون تعبير GFP قابلا للملاحظة بعد 48 ساعة (الشكل 2B3). يعد وجود سمية عالية جنبا إلى جنب مع تعبير GFP مؤشرا موثوقا للانتقال الناجح. تم جمع الفيروس العدسي في 48 ساعة و 72 ساعة ، وتم تقييم كفاءة النقل باستخدام قياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني. تم استخدام الكثافة المطلقة للخلايا الإيجابية ل GFP كوكيل لعمليات تكامل SCX ، وكانت أعلى بكثير في التتر الأعلى (الشكل 3 أ). أظهرت كفاءة النقل ، المقاسة كنسبة مئوية من خلايا SCX-GFP + ، تأثير استجابة الجرعة بناء على الحمل الفيروسي العدسي (الشكل 3 ب). كما أظهر قياس التدفق الخلوي ل iMSCSCX + في ممرات مختلفة استقرارا عاليا ، مع عدم وجود تغييرات في مستويات التعبير الجيني أو نسبة الخلايا المنقولة (الشكل 3C). بالإضافة إلى ذلك ، بعد 4 أسابيع من الاستزراع المنتظم دون فرز ، حافظ iMSCSCX + على تعبير مفرط مستقر عن SCX (الشكل 3D). تم إجراء نقل واسع النطاق بناء على العيار ، باستخدام 75٪ من فيروس lentivirus (الشكل 2C).

التحميل الميكانيكي ل iMSCSCX +
تم زرع خلايا iMSCSCX + على ألواح سيليكون قابلة للتشوه بكثافة خلية تبلغ 1.25 × 104 خلايا / سم2 (الشكل 4A ، B) للسماح بربط الخلية قبل بدء بروتوكول التمدد. تم تحسين كثافة البذر النهائية لمنع فرط النمو أحادي الطبقة. تجدر الإشارة إلى أن كثافات البذر العالية بشكل مفرط أدت إلى تقلص الخلايا المبكر وموت الخلايا المبكر (الشكل 4 د). بالنسبة لمجموعة التحكم الثابتة ، تم طلاء الخلايا بألواح متطابقة ولكن دون الخضوع لأي تمدد. تعرضت خلايا iMSCSCX + للتمدد في مفاعل حيوي ثنائي الأبعاد لمدة لا تقل عن ثلاثة أيام ، حتى سبعة أيام ، عند إجهاد أحادي المحور بنسبة 4٪ و 0.5 هرتز لمدة ساعتين في اليوم. يتوافق نظام التمدد هذا مع ما تم وصفه بأنه ذو صلة فسيولوجية9. بعد عدة أيام من التمدد ، يمكن ملاحظة درجة معينة من تنظيم الخلية مقارنة بالمجموعة الثابتة ، والتي أظهرت تنظيما عشوائيا للخلايا (الشكل 4C). يسلط تلطيخ Phalloidin لخيوط الأكتين الضوء بشكل أكبر على كيفية نمو الخلايا بشكل عمودي على اتجاه التمدد ، على عكس تنظيم الخلايا العشوائي الذي لوحظ في الصفائح الثابتة (الشكل 4E). لتوصيف الخلايا الجذعية المتولدة حديثا ، تم جمع الخلايا في ثلاثة وسبعة أيام لتحليل التعبير الجيني ، كما ورد سابقا14. يكشف تحليل التعبير الجيني أن خلايا iMSCSCX + مستجيبة ميكانيكيا ، حيث يوجد تنظيم كبير في جينات tenogenic (SCX و THBS4 و COL1a1 و BGN و MKX و TPPP3) 5،7،19،20 في كل من ثلاثة وسبعة أيام ، مقارنة ب iMSCs فقط في اليوم 0 (الشكل 5A). بالإضافة إلى ذلك ، كان ترسب الكولاجين في الوسائط بعد 7 أيام من التمدد أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة iMSCSCX + الممتدة مقارنة بجميع المجموعات الأخرى (الشكل 5B).

Figure 1
الشكل 1: التمايز iMSC التخطيطي وتوصيف التدفق الخلوي. (أ) التخطيط العام لتوليد الخلايا الخيطية والجدول الزمني لتحريض iMSC. مستنسخة بإذن من Papalamprou A. et al.14. (ب) يظهر القياس الكمي لقياس التدفق الخلوي نسبة عالية من الخلايا التي تعبر عن علامات سطح MSC الكلاسيكية ل MSCs المشتقة من iPSC بعد 6 مقاطع بعد التمايز. مقتبس بإذن من Sheyn D. et al.2. (ج) توضح صور تباين الطور للخلايا بعد التمايز مورفولوجيا شبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط إنتاج iMSCSCX + . (أ) مخطط عام للنقلباستخدام الجيل الثاني من ناقلات الفيروسات العدسية SCX ونقل iMSCs. مستنسخة بإذن من Papalamprou A. et al.14. (ب1) HEK293T/17 خلية قبل إضافة كوكتيل البلازميد. (ب2) خلايا HEK293T/17 ، بعد 48 ساعة ، تعبر عن GFP وتعرض السمية. (ب 3) يشير التعبير عن GFP الذي يمكن ملاحظته في خلايا HEK293T/17 إلى نجاح النقل. (C) خلايا iMSCSCX + المتولدة (مع عيار 75٪) تعبر عن SCX-GFP + في النوى. قضبان المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد كفاءة النقل باستخدام قياس التدفق الخلوي والتعبير الجيني. تم استخدام الكثافة المطلقة للخلايا الموجبة ل GFP كبديل لعمليات تكامل SCX باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم التحقق من صحة التتر المتجه عن طريق تحليل التدفق الخلوي لجميع الخلايا لتقييم MOI الفيروسي العدسي. (أ) التألق المطلق لكل عيار فيروس. (ب) تقييم كفاءة النقل كنسبة مئوية من خلايا SCX-GFP + . لوحظ تأثير استجابة الجرعة للحمل الفيروسي العدسي في كفاءة النقل عندما تم تقديم نتائج التدفق كنسبة مئوية من خلايا GFP +. وزارة الداخلية ، تعدد العدوى ، ن = 3 عمليات نقل مستقلة. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة التتر. البيانات تعني ± SD ؛ * ص < 0.05. (C) يشير قياس التدفق الخلوي ل iMSCSCX + بعد عدة جولات من المرور إلى عدم وجود تغيير في مستوى التعبير الجيني المستقر وعدم وجود تغيير في نسبة الخلايا المحصلة. لاحظ أن iMSCs المحولة بعيار 100٪ توقفت عن الانقسام عند P3. (د) تم تحويل iMSCs باستخدام ناقل الفيروس العدسي SCX-GFP + (75٪ ، MOI = 2.9 e5 TU / mL) وتقييم التعبير الجيني ل SCX في 4 أسابيع من المزرعة العادية دون فرز. تم تنظيم تعبير SCX بشكل كبير في iMSCSCX + مما يدل على تعبير مفرط مستقر عن SCX بعد 4 أسابيع. TU ، وحدات النقل ؛ البيانات تعني ± SD ، ** p > 0.01. مستنسخة بإذن من Papalamprou A. et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: iMSCSCX + المصنف في مفاعل حيوي ثنائي الأبعاد ويخضع لتمدد دوري. (أ) مخطط المفاعل الحيوي 2D. مستنسخة بإذن من بابالامبرو أ. وآخرون 12. (ب) تزرع الخلايا أولا في ألواح سيليكون مرنة وتوضع عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق قبل التمدد الدوري في المفاعل الحيوي 2D. (C) تم تمديد iMSCSCX + في مفاعل حيوي 2D لمدة تصل إلى 7 أيام. بالنسبة للضوابط الثابتة ، تم طلاء الخلايا بألواح متطابقة ولكن بدون تمدد. (ج1) لوحة تحكم ثابتة بعد 7 أيام تعرض الترتيب العشوائي للخلايا. (ج2) لوحة امتدت بعد 7 أيام يظهر تنظيم الخلايا أكثر نسبيا. (د) ثلاثة أمثلة لما لا ينبغي مراعاته. عندما تكون كثافة بذر الخلية عالية جدا أو تتمدد الخلايا لعدة أيام ، تبدأ الخلايا في الانفصال. (د1) الخلايا متضخمة قليلا فقط. تشير الأسهم الصفراء إلى بداية تقلص الخلايا المبكر. (د2) مستوى معتدل من النمو الزائد. تبدأ الخلايا في الانفصال عن اللوحة. (د3) مستوى حاد من فرط النمو. الخلايا لم تعد تنمو في طبقة واحدة وشكلت هياكل 3D. قضبان المقياس الأسود = 400 ميكرومتر. قضبان المقياس الأبيض = 1000 ميكرومتر. (ه) بعد 7 أيام من التمدد (أو في ثقافة الصفيحة الثابتة) ، تم تثبيت الخلايا بالقضيب لخيوط الأكتين (الأحمر) ومضادتها ب DAPI للنوى (الأزرق). قضبان المقياس الأبيض = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحفيز التعبير الجيني لعلامة التينوجين عن طريق التعبير المفرط ل Scx والتمدد أحادي المحور في مفاعل حيوي ثنائي الأبعاد. (أ) تم تمديد iMSCSCX + في مفاعل حيوي ثنائي الأبعاد لمدة 7 أيام. بالنسبة للضوابط الثابتة ، تم طلاء الخلايا بألواح متطابقة ولكن بدون تمدد. تكشف تحليلات التعبير الجيني أن iMSCSCX + مستجيب ميكانيكيا. ND = لا يوجد كشف. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة التعبير الجيني في كل نقطة زمنية مقابل. د0. ن = 8 / مجموعة. (ب) ترسب الكولاجين بعد 7 أيام من التمدد في المفاعل الحيوي 2D. البيانات هي متوسط ± SD. ن = 8 / مجموعة ؛ * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001. مستنسخة بإذن من بابالامبرو أ. وآخرون 12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء iTenocytes من خلال ثلاث خطوات رئيسية: (1) تحريض iPSCs إلى iMSCs ، (2) الإفراط في التعبير عن SCX باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، و (3) نضوج الخلايا من خلال التوتر أحادي المحور ثنائي الأبعاد.

تم وصف البروتوكول المقدم للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs مسبقا من قبل مجموعتنا2. منذ هذا النشر ، تم تطوير العديد من البروتوكولات ، بما في ذلك بروتوكول راسخ لاستخدام iMSCs في التجارب السريرية21،22،23 ، بالإضافة إلى مجموعات التمايز المتاحة تجاريا. كما تم التحقيق في مراجعة إمكانات النسب الثلاثي ل iMSCs سابقا2. على الرغم من اختلاف المنهجيات ، تؤكد جميع البروتوكولات على الحاجة إلى توسيع iMSCs بعد التمايز لعدة مقاطع لضمان التعبير المستقر عن علامات سطح MSC. في هذه المرحلة ، سيؤدي استخدام نسبة الانقسام 1: 3 عند التقاء 70٪ تقريبا إلى لوحة متقاربة نسبيا في غضون 4-6 أيام بعد المرور.

عند اختيار العيار الأمثل للتنبيغ ، من الضروري تحقيق توازن بين صلاحية الخلية وكفاءتها. في حين أن iMSCs المحولة بعيار 100٪ قد تظهر أعلى مستوى من الخلايا الإيجابية SCX-GFP ، تجدر الإشارة إلى أن هذه الخلايا توقفت عن تقسيم ثلاثة ممرات بعد التنبيغ (الشكل 3C) ، ربما بسبب السمية التي يسببها الحمض النووي. لذلك ، ينصح باستخدام عيار أقل من 100٪. قبل بذر ألواح السيليكون ، يوصى بإعادة تقييم مستويات SCX-GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي. إذا كانت البيانات تشير إلى أن الكفاءة أقل من الحد المطلوب ، فمن المستحسن فرز خلايا iMSCSCX + قبل البذر ، خاصة بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي .

بمجرد زرع خلايا iMSCSCX + في ألواح السيليكون ، يجب تحضينها عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح بربط الخلية قبل التمدد. تم تحسين كثافة الخلية الموصوفة البالغة 1.25 × 104 خلايا / سم2 في ألواح السيليكون لمنع فرط نمو الطبقة الأحادية ، والذي يمكن أن يساهم في التوتر الساكن24. بالإضافة إلى ذلك ، تشير الدراسات إلى أن الاتصال المباشر من خلية إلى خلية في الثقافات المتقاربة في ركائز متفاوتة الصلابة يمكن أن يغير سلوك الخلية24،25،26. خلال التجارب التجريبية ، لوحظ بعض انفصال الخلايا المرئية عن ألواح السيليكون ، خاصة في نقاط زمنية لاحقة (الشكل 4D). يمكن أن يعزى ذلك إلى تكوين صفائح خلايا ECM بسبب الالتقاءالزائد 24. لذلك ، تشمل المعلمات الحرجة كثافة الخلية وعدد نوبات التمدد. في الطرق الحالية ، تم جمع الخلايا في اليومين 3 و 7 لتقييم إمكانات tenogenic عن طريق تحليل التعبير الجيني. ومع ذلك ، فمن المستحسن أن تمتد الخلايا في المفاعل الحيوي 2D لمدة ثلاثة أيام على الأقل ، مع المراقبة اللاحقة للألواح الممتدة والثابتة لمنع فرط النمو وانفصال الخلايا.

بعد عدة نوبات تمدد ، يمكن ملاحظة درجة من محاذاة الخلايا وتنظيمها (الشكل 4C1 ، E). يتماشى هذا مع العديد من الدراسات حيث يتم ملاحظة محاذاة الخلايا بشكل عمودي على محور الإجهاد استجابة للإجهاد أحادي المحور في المختبر24,27. بالمقارنة ، تعرض اللوحة الثابتة تنظيم الخلايا العشوائية (الشكل 4C2 ، E).

على حد علمنا ، استكشفت دراسات قليلة فقط التأثيرات التآزرية للإفراط في التعبير SCX والتحفيز الميكانيكي لتمايز MSCs إلى خلايا وترية أو خلايا أربطة24،28،29. استخدم Gaspar et al. نظام مفاعل حيوي ثنائي الأبعاد مشابه للنظام الموصوف هنا ولكنه طبق مستويات أعلى من الإجهاد الكلي (10٪ عند 1 هرتز لمدة 12 ساعة / يوم). ومن المثير للاهتمام ، أنهم لم يتمكنوا من اكتشاف التغييرات في التعبير عن SCX و TNMD و COL1a1 في BM-MSCs والخلايا الوترية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أن يعزى ذلك إلى السلالات المطبقة الأعلى المستخدمة في دراستهم24. استخدم Chen et al. ناقلا عدسيا للتعبير المفرط عن SCX في hESC-MSCs المجمعة في صفائح متعددة الطبقات. قاموا بتطبيق الحمل الدوري أحادي المحور (إجهاد 10٪ عند 1 هرتز لمدة ساعتين / يوم لمدة تصل إلى 21 يوما) ولاحظوا تنظيم COL1a1 و COL1a2 و COL14 و TNMD ، بالإضافة إلى زيادة ترسب ECM29. قام نيكولز وآخرون بنقل خلايا C3H10T1/2 بشكل عابر باستخدام فأر كامل الطول Scx cDNA وزرع الخلايا في هلاميات الكولاجين ثلاثية الأبعاد تحت سلالة دورية أحادية المحور (1٪ ، 1 هرتز ، 30 دقيقة / يوم لمدة تصل إلى 14 يوما). على غرار النتائج التي توصلنا إليها ، لاحظت مجموعتهم تعبيرا مرتفعا عن SCX و COL1A1 في التركيبات المتوترة والمفرطة التعبير عنها ولكنها لم تجد أي تغيير في تعبير TNMD استجابة للتمدد الدوري28.

بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من المثير للاهتمام التفكير في الإفراط في التعبير عن العلامات الأخرى المتعلقة بالوتر مثل MKX. استكشف Tsutsumi et al. التأثير المشترك للإفراط في التعبير عن MKX في خلايا C3H10T1/2 وإخضاعها للتمدد الميكانيكي الدوري في نظام 3D. لقد أظهروا تنظيما كبيرا ل SCX و COL1a1 و DCN و COL3a1 ، جنبا إلى جنب مع محاذاة حزم ألياف الكولاجين وخيوط الأكتين30.

من المهم أن نعترف بأن هذه الطريقة لتوليد الخلايا الخيطية لها حدودها. في حين أن المفاعل الحيوي 2D المتاح تجاريا مفيد لعمل إثبات المفهوم ، فإن حجمه يقيد العائد. إذا كانت هذه الخلايا ضرورية للمقايسات عالية الإنتاجية أو كمصدر محتمل للخلايا الجاهزة لعلاجات إصلاح الأوتار ، فيجب النظر في استكشاف الأنظمة القادرة على تنفيذ التمدد أحادي المحور على نطاق أوسع. علاوة على ذلك ، يجب أن تشمل التحقيقات الإضافية توسع الخلايا iTenocytes لتأكيد التعبير المستقر عن التينولجين ، وتقييم مساهمتها في التجديد في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لتقييم إمكاناتها الجينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل NIH / NIAMS K01AR071512 و CIRM DISC0-14350 إلى ديمتري شين. كانت بلازميدات تغليف الفيروسات العدسية هدية من مختبر سيمون نوت (قسم العلوم الطبية الحيوية ، مركز Cedars-Sinai الطبي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 205،
توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات <em>المشتقة من الخلايا الجذعية عن طريق</em> الإفراط في التعبير عن التصلب المشترك والتوتر أحادي المحور 2D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter