Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering af inducerede pluripotente stamcelleafledte iTenocytter via kombineret scleraksoverekspression og 2D uniaxial spænding

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Denne artikel beskriver en procedure til fremstilling af iTenocytter ved at generere iPSC-afledte mesenkymale stromale celler med kombineret overekspression af Scleraxis ved hjælp af en lentiviral vektor og uniaxial strækning via en 2D-bioreaktor.

Abstract

Dagens udfordringer inden for sene- og ledbåndsreparation kræver identifikation af en passende og effektiv kandidat til cellebaseret terapi for at fremme seneregenerering. Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er blevet undersøgt som en potentiel vævsteknisk strategi til reparation af sener. Mens de er multipotente og har regenerativt potentiale in vivo, er de begrænsede i deres selvfornyelseskapacitet og udviser fænotypisk heterogenitet. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) kan omgå disse begrænsninger på grund af deres høje selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingsmæssige plasticitet. I tenocytudvikling er Scleraxis (Scx) en afgørende direkte molekylær regulator af senedifferentiering. Derudover har mekanoregulering vist sig at være et centralt element, der styrer embryonal seneudvikling og heling. Som sådan har vi udviklet en protokol til at indkapsle den synergistiske virkning af biologisk og mekanisk stimulering, der kan være afgørende for generering af tenocytter. iPSC'er blev induceret til at blive mesenkymale stromale celler (iMSC'er) og blev karakteriseret med klassiske mesenkymale stromale cellemarkører via flowcytometri. Dernæst blev iMSC'erne ved hjælp af en lentiviral vektor transduceret til stabilt at overudtrykke SCX (iMSCSCX+). Disse iMSCSCX+ celler kan modnes yderligere til iTenocytter via uniaxial trækbelastning ved hjælp af en 2D bioreaktor. De resulterende celler blev karakteriseret ved at observere opreguleringen af tidlige og sene senemarkører såvel som kollagenaflejring. Denne metode til generering af iTenocytter kan bruges til at hjælpe forskere med at udvikle en potentielt ubegrænset allogen cellekilde til senecelleterapiapplikationer.

Introduction

For at tackle de moderne problemer i sener og ledbåndsreparation er der et krav om en relevant cellekandidat, der er egnet til cellebaserede terapier. En undersøgelsesvej inden for vævsteknik til senereparation involverer udforskning af knoglemarvsafledte mesenkymale stromale celler (BM-MSC'er) og fedtvævsafledte stromale celler (ASC'er) som potentielle strategier. Disse celler har multipotent kapacitet, stor overflod og regenerativt potentiale in vivo. Derudover har de vist forbedret helingsevne og forbedrede funktionelle resultater i dyremodeller1. Ikke desto mindre udviser disse celler begrænsede selvfornyelsesevner, fænotypisk mangfoldighed og især begrænset kapacitet til senedannelse. Induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) tilbyder en løsning på disse begrænsninger på grund af dens bemærkelsesværdige selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingstilpasningsevne. Vores forskerteam og andre har opnået en vellykket differentiering af iPSC'er i mesenkymale stromale cellelignende enheder (iMSC'er)2,3. Som sådan har iMSC'er potentialet til at være en allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.

Scleraxis (SCX) er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for seneudvikling og betragtes som den tidligste detekterbare markør for differentierede tenocytter. Derudover aktiverer SCX nedstrøms senedifferentieringsmarkører, herunder type 1a1 kædekollagen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) og tenomodulin (TNMD), blandt andet 4,5,6. Andre gener udtrykt under senemodning omfatter tubulinpolymerisationsfremmende proteinfamiliemedlem 3 (TPPP3) og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRa)7. Mens disse gener er afgørende for seneudvikling og modning, er de desværre ikke unikke for senevæv og udtrykkes i andre muskuloskeletale væv som knogler eller brusk 5,7.

Ud over ekspressionen af markører under seneudvikling er mekanostimulering et væsentligt element for embryonal seneudvikling og heling 4,5,6. Sener er mekanoresponsive, og deres vækstmønstre ændres som reaktion på deres miljø. På molekylært niveau påvirker biomekaniske signaler udviklingen, modningen, vedligeholdelsen og helingsresponserne af tenocytter8. Forskellige bioreaktorsystemer er blevet brugt til at modellere fysiologiske belastninger og biomekaniske signaler. Nogle af disse modelsystemer inkluderer ex vivo-vævsbelastning, 2D-cellebelastningssystemer, der anvender biaksial eller uniaxial spænding, og 3D-systemer, der bruger stilladser og hydrogeler 9,10. 2D-systemer er fordelagtige, når man studerer den mekaniske stimulerings virkninger på enten senespecifikke gener eller cellernes morfologi i forbindelse med celleskæbne, mens 3D-systemer mere præcist kan replikere celle-ECM-interaktioner 9,10.

I 2D-belastningssystemer er belastningen mellem cellerne og kultursubstratet homogen, hvilket betyder, at den påførte belastning på cellernes cytoskelet kan kontrolleres fuldt ud. I sammenligning med bi-aksial belastning er uniaxial belastning mere fysiologisk relevant, da tenocytter overvejende udsættes for uniaxial belastning fra kollagenbundter in vivo9. Det konstateres, at sener under daglige aktiviteter udsættes for uniaxial trækbelastning op til 6% belastning11. Specifikt har tidligere undersøgelser vist, at belastning inden for de fysiologiske områder på 4% -5% har vist sig at fremme tenogen differentiering ved at bevare senerelateret markørekspression som SCX og TNMD samt øget kollagenproduktion 9,10. Stammer på mere end 10% kan være traumatisk relevante, men ikke fysiologisk relevante12,13.

Her præsenteres en protokol, der tager højde for den synergistiske virkning af mekanisk og biologisk stimulering, som kan være afgørende for dannelsen af tenocytter. Vi beskriver først en reproducerbar metode til at inducere iPSC'er i iMSC'er via kortvarig eksponering af embryoidlegemer for vækstfaktorer, bekræftet af MSC-overflademarkører ved hjælp af flowcytometri. Vi beskriver derefter en lentiviral transduktionsmetode til at konstruere iMSC'er til at have stabil overekspression af SCX (iMSCSCX+). For yderligere cellemodning podes iMSCSCX+ i fibronectinbelagte silikoneplader og gennemgår en optimeret uniaxial spændingsprotokol ved hjælp af CellScale MCFX-bioreaktor. Det tenogene potentiale blev bekræftet ved at observere opregulering af tidlige og sene senemarkører samt kollagenaflejring14. Denne metode til generering af iTenocytter er et proof-of-concept, der kan tilbyde en ubegrænset hyldevare, allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol til fremstilling af iTenocytter kan udføres i tre hovedtrin: iPSC'er til iMSC'er (10 dage), iMSC til iMSCSCX+ (2 uger), iMSCSCX+ til iTenocytter (minimum 4 dage). Hvert større trin i protokollen kan sættes på pause og genstartes senere, afhængigt af den eksperimentelle tidslinje. For metoder til dyrkning af celler bør sterile teknikker anvendes. Alle celler i denne protokol skal dyrkes ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed.

1. Human iPSC-induktion i inducerede mesenkymale stromale celler (iMSC'er)

  1. Forberedelse af eksperiment
    1. Forbered Iscoves modificerede Dulbeccos medier Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB).
      1. Supplement 50 ml IMDM basalmedier med 8,5 ml knock-out serum erstatning, 500 μL Minimal Essential Medium (MEM) ikke-essentielle aminosyrer, 0,385 μL (110 mM stock) beta-mercaptoethanol og 500 μL antibiotika-antimykotisk opløsning (AAS) (endelige koncentrationer: henholdsvis 17%, 1%, 110 μM, 1%) (se tabel over materialer).
    2. Forbered MSC-medier (Mesenchymal Stromal Cell).
      1. Supplement 440 ml lav glukose Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml antibiotika-antimykotisk opløsning (AAS) og 5 ml L-glutamin (endelige koncentrationer: henholdsvis 10%, 1%, 2 mM).
    3. Forbered poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (poly-HEMA) belagte plader.
      1. Tilsæt 10 g poly-HEMA (se materialetabel) til en steril flaske.
      2. Tilsæt en magnetisk omrører til flasken, og tilsæt langsomt 500 ml 95% EtOH under omrøring.
      3. Når al EtOH er tilføjet, tændes omrøringstilstanden ved 1200 o / min med yderligere lav varme i mindst 6 timer. Poly-HEMA-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i op til et år.
      4. Under sterile forhold tilsættes 2,5 μg/cm2 i 9 ml til en T75-kolbe. Juster lydstyrken efter kulturbeholderens størrelse.
      5. Opretholdelse af sterilitet, lad beholderne lufttørre, så EtOH kan fordampe fuldstændigt før brug. Dette tager normalt 24-72 timer.
    4. Forbered gelatinebelagte kolber.
      1. Vask en glasflaske med NaOH og dediker den til gelatinepræparatet. Brug ikke vaskemiddel.
      2. Forbered 1% gelatineopløsning (5 g gelatine og 500 ml endotoksinfrit vand). Autoklave glasflasken med gelatineopløsningen i 30 min.
      3. Lad gelatineopløsningen afkøle, og den kan opbevares ved stuetemperatur.
      4. Overtræk en T75-kolbe med 5 ml gelatineopløsning pr. kolbe og inkuber i mindst 1 time før såning af celler. Gelatinebelagte kolber kan tilberedes 1 dag i forvejen.
    5. Forbered FACS-buffer (fluorescensaktiveret cellesortering).
      1. Bland PBS med 2% bovin serumalbumin og 0,1% natriumazid. Opbevares ved 4 °C.
  2. Generering af embryoidlegemer (EB'er)
    BEMÆRK: iPSC'er skal dyrkes i en 6-brønds plade og skal nå 70% -80% sammenløb før brug.
    1. På dag 0 medbringes en 384 klarbundet PCR-plade i vævskulturhætten og UV i 15 minutter uden låg.
    2. Fjern vækstmediet fra iPSC'erne (se materialetabellen), og vask hullerne med PBS.
    3. Der tilsættes 0,5 ml forvarmet blid celledissociationsreagens (se materialetabel) til hvert hul og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C. Overhold cellerne hvert 5. minut, indtil iPSC'erne er blevet til enkeltceller eller små aggregater, der løftes i suspension.
    4. Resuspenderet cellesuspensionen med en 1 ml pipette for at sikre en enkelt cellesuspension.
    5. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    6. Supernatanten fjernes, resuspenderes i IMDM-EB-medier (trin 1.1.1), og de levedygtige celler tælles med et hæmocytometer eller en celletæller.
    7. Beregn det passende volumen cellesuspension, der kræves for at opnå 5.000-25.000 celler pr. hul i 384-brøndpladen med 25 μL cellesuspension pr. hul.
      BEMÆRK: Generelt kan 2-3 sammenflydende (70% -80%) brønde i en 6-brøndplade lave EB'er i en 384-brøndplade. Størrelsen af celler pr. EB bestemmes empirisk. For en hel plade med 384 brønde skal der anvendes 9,6 ml cellesuspension, 25 μL pr. Hul.
    8. Centrifuger cellerne ned igen ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    9. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i et passende volumen IMDM-EB-substrat og 10 μM Y-27632-dihydrochlorid (lager: 10 mM, 1000x, se materialetabellen) i et forkølet konisk rør på 15 ml.
    10. Tilsæt koldopløselig kældermembranmatrix (1 mg pr. 384-brøndpladeværdi af EB'er) til den koniske (se materialetabel).
    11. 25 μL af cellesuspensionen fordeles i hvert hul. Anbring et sterilt låg på pladen og drej ved 450 x g ved 4 °C i 7 minutter. Der inkuberes ved 37 °C i 48 timer.
    12. På dag 2 overføres cellerne til en 100 mm plade med 3 ml forvarmet IMDM-EB-medie.
    13. Overfør EB'erne til de dedikerede poly-HEMA-coatede T75-kolber med 10 ml IMDM-EB. Juster lydstyrken efter kulturbeholderens størrelse. Lad EB'erne vokse i 3 dage.
    14. På dag 5 overføres EB'erne til de tilberedte gelatinebelagte T75-kolber med 10 ml IMDM-EB-medier. Juster lydstyrken efter kulturbeholderens størrelse. Dyrk EB'erne i yderligere 3 dage i suspension.
    15. På dag 8 skal du sikre dig, at der observeres to typer EB'er: EB'er, der er fastgjort til kolben, og ikke-vedhæftede EB'er. De ikke-fastgjorte EB'er vaskes ud af kolben med PBS.
    16. Til de vedhæftede EB'er tilsættes IMDM-EB-medier suppleret med TGFβ-1 (10 ng/ml) (se materialetabellen) og lader dem vokse i 2 dage.
    17. På dag 10 skal du ændre mediet til MSC-mediet. Celler skal fodres to gange om ugen. Når 70% er sammenflydende, skal du fortsætte til "Standard løftecelleprotokol" for at omplade celler. Omplade cellerne på gelatinebelagte plader.
  3. Standard løftecelleprotokol
    1. Når de klæbende celler har nået 70% sammenløb, aspireres vækstmediet fra pladerne og vaskes med PBS.
    2. Cellerne løftes ved at tilsætte 5 ml forvarmet 0,25% trypsin til hver 150 mm plade og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C. Juster trypsinvolumen i henhold til kulturbeholderens størrelse.
    3. Under et mikroskop skal du kontrollere, at de fleste celler er blevet løftet fra hver plade. Hvis der stadig er celler fastgjort, skal du forsigtigt banke på siderne af pladerne for at løsne cellerne.
    4. Saml cellerne i et konisk rør ved at tilføje dobbelt volumen af det forvarmede vækstmedium.
    5. Centrifuger cellerne ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g. Supernatanten fjernes og fortsættes til næste trin.
  4. Vurdering af flowcytometri for MSC-markørekspression
    BEMÆRK: Humane MSC'er, som knoglemarvs-MSC'er, bør anvendes som den positive kontrol.
    1. Udfør "Standard løftecelleprotokol" (trin 1.3).
    2. Supernatanten resuspenderes med 3 ml FACS-buffer, og hele rumfanget overføres til FACS-reagensglas.
    3. Centrifuger ved stuetemperatur i 5 min ved 300 x g. Gentag vasketrinnet med FACS-buffer to gange mere.
    4. Til farvede rør tilsættes 2 μL antihuman CD90-FITC fra mus, antihuman CD44-APC fra mus og antihuman CD105-PE (se materialetabel), og der inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
    5. Til isotype-kontrolrørene tilsættes 20 μL mus IgG2a-FITC, mus IgG1-PB og mus IgG1-PE (se materialetabel).
    6. Inkuber i mørke ved 4 °C i 15 minutter. Alle glassene vaskes ved at tilsætte 3 ml FACS-buffer og centrifugere i 5 minutter ved 300 x g (ved stuetemperatur). Resuspender cellerne i 250 μL FACS-buffer for hvert glas.
    7. Analysér ekspressionen af MSC'ernes overflademarkører ved hjælp af flowcytometri14. Excitations- og emissionsbølgelængder bør være: CD90-FITC, excitationspeak ved 495 nm og emissionspeak ved 519 nm; CD44-APC, excitationstop ved 640 og emissionstop ved 660 nm; CD105-PE, excitationstop ved 561 nm og emissionstop ved 574 nm.

2. iMSC-passaging og -udvidelse

  1. Fremstilling af reagenser
    1. Klargør MSC-frysemedier.
      1. Kombiner 30 ml DMEM med lav glukose, 5 ml DMSO og 15 ml FBS (endelige koncentrationer: henholdsvis 60%, 10%, 30%).
      2. Opløsningen filtreres ved hjælp af et sterilt 0,45 μm filter. Opbevares ved 4 °C.
  2. Bestået
    BEMÆRK: Efter induktion skal iMSC'er dyrkes på gelatinebelagte plader i yderligere 2 passager, før de fravænnes til dyrkning på plastvævskulturplader. Derudover skal celler passeres med et 1: 3 splitforhold, når 70% sammenflydende.
    1. Udfør "Standard løftecelleprotokol" (trin 1.3).
    2. Cellerne i MSC-medier opløses igen, og cellerne fordeles ligeligt i tre nye 150 mm plader af T175-kolber med 20 ml medier pr. kolbe. Cellerne sættes tilbage til 37 °C.
    3. Foder cellerne to gange om ugen ved at erstatte vækstmediet med forvarmede MSC-medier.
  3. Frysning
    1. Udfør "Standard løftecelleprotokol".
    2. Resuspender cellerne i 1 ml MSC-frysemedier. Der tilsættes 1 ml cellesuspension til en kryovial og opbevares i en frysebeholder i 24 timer ved -80 °C, inden den overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
  4. Optøning
    1. Forbered 10 ml forvarmede MSC-medier i et 15 ml konisk rør.
    2. Hent kryovialen, dypp den i et 37 °C vandbad, og hvirvl rundt, indtil der er en iskugle på størrelse med en ært tilbage (ca. 1-2 min).
    3. I cellekulturhætten tilsættes langsomt 1 ml af det forvarmede medie til kryoialen og pipetteres op og ned for at blande.
    4. Cellesuspensionen overføres fra kryovialrøret til det fremstillede koniske 15 ml koniske rør med forvarmet medie, og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g (ved stuetemperatur).
    5. Supernatanten fjernes og opslæmmes igen med friske medier. Cellesuspensionen tilsættes til en 150 mm plade med et samlet volumen på 20 ml. Juster lydstyrken i henhold til kulturkolbens størrelse.
    6. Cellerne inkuberes ved 37 °C, indtil de er klar til opdeling.

3. Gensplejsning af iMSC'er til overekspression af SCX ved hjælp af lentiviral transduktion

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen tager to uger at fuldføre.

  1. Fremstilling af medier og reagenser
    1. Forbered HEK293T/17 cellemedier.
      1. Supplement 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml FBS og 5 ml AAS (endelige koncentrationer: henholdsvis 10%, 1%).
    2. Klargør MSC lenti-pakkemedier.
      1. Forbered det varmeinaktiverede serum ved at opvarme 50 ml stuetemperatur FBS i et 60 °C vandbad i 30 minutter.
      2. Kombiner 445 ml DMEM med lav glukose med den varmeinaktiverede FBS og 5 ml L-glutamin (endelige koncentrationer: henholdsvis 10%, 2 mM.)
    3. Forbered transfektionskompleks.
      1. Lad transfektionskomplekse komponenter (se materialetabel) tø op på is: emballageplasmider VSV-G og Delta, SCX-plasmid og BioT15,16.
      2. Forsigtigt hvirvel og spin ned plasmiderne. Mål DNA-koncentrationerne.
      3. Baseret på DNA-koncentrationerne og antallet af kolber beregnet til transfektion beregnes volumenet af hver nødvendig komponent: For en T75-kolbe vil transfektionskomplekset bestå af 750 μL serumfrit medium (som serumfrit DMEM eller PBS), 7,5 μg SCX-plasmid, 0,75 μg VSV-G-plasmid, 6,75 μg Delta plasmid og 22,5 μL BioT. Overvej ekstra for pipetteringsfejl.
      4. Bland ved forsigtigt at pipettere op og ned. Spin kort i en centrifuge. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min og brug straks.
  2. Transfektion og lentiviral produktion
    FORSIGTIG: Fra dag 3 indebærer protokollen at arbejde med lentivirus, og arbejdet skal derfor udføres ved hjælp af operationelle procedurer på indeslutningsniveau 2+. Arbejdstagere skal bære personlige værnemidler, herunder to lag handsker, håndledsbeklædning, sikkerhedsbriller, en maske og lange bukser og lukkede sko. Alt affald og materialer, herunder pipettespidser, kolber og flydende medium, skal dekontamineres med blegemiddel (endelig 1% natriumhypochlorit) i mindst 20 minutter. Brug ikke støvsugeren.
    1. Frø HEK293T/17 celler.
      1. Ca. 18-24 timer før transfektion (dag 0) løftes og plades 293T-cellerne i T75-kolber. I de følgende bind antages T75 som kulturbeholder. Juster lydstyrken i henhold til den anvendte cellekulturbeholder.
      2. Dyrkningsmediet tages ud af kolberne og vaskes med 5 ml PBS.
        BEMÆRK: Cellerne løftes meget let fra kolbens overflade. Der tilsættes PBS på siden af kolben, og der undgås direkte tilsætning af opløsning til cellerne.
      3. Der tilsættes 3 ml forvarmet 0,25% trypsin til hver kolbe og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter. Saml cellerne i et konisk rør og centrifuger ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g.
      4. Supernatanten fjernes, resuspenderes i 293T-medier, og de levedygtige celler tælles ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller.
      5. Pladerne cellerne ved 5,3 x 104 celler/cm2 og inkuberes ved 37 °C natten over.
      6. Den næste dag (dag 1) skal du forberede transfektionskomplekset. Vækstmediet fra cellerne erstattes med 5 ml forvarmet MSC lenti-emballagesubstrat (trin 3.1.2).
      7. Tilsæt transfektionskomplekset dråbevis til cellerne. Vip forsigtigt skålen for at sikre jævn eksponering af transfektionskomplekset til cellerne. Returner cellerne til inkubatoren i 48 timer.
        BEMÆRK: Toksicitet skal observeres efter 24 timer (dag 2).
      8. Efter 48 timer (dag 3) opsamles det virusholdige medium forsigtigt i et separat konisk rør ved hjælp af en pipette og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g (ved stuetemperatur).
      9. Der tilsættes 5 ml forvarmet MSC lenti-emballagesubstrat til T75-kolben med 293T-celler, og vend tilbage til inkubatoren natten over.
      10. Efter centrifugering filtreres supernatanten med et 0,45 μm sterilt filter ved direkte pipettering af supernatanten gennem filteret. Det virusholdige substrat opbevares ved 4 °C natten over.
      11. Efter yderligere 24 timer (dag 4) samles det virusholdige medium igen forsigtigt i et separat konisk rør ved hjælp af en pipette og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g (ved stuetemperatur).
      12. Kombiner virussen med den foregående indsamlingsdagsvirus og bland for at sikre en homogen opløsning. På dette tidspunkt kan protokollen sættes på pause og genstartes senere, afhængigt af den eksperimentelle tidslinje. Lentivirus kan alikveres og fryses ved -80 °C, eller lentivirus kan opbevares på is, mens der fortsættes med "Transduktion af iMSC'er med SCX" (trin 3.3).
        BEMÆRK: Når lentivirus-alikvoterne er frosset og optøet, må de ikke fryses igen.
  3. Transduktion af iMSC'er med SCX
    1. Udfør titerpladetransduktion.
      1. På dag 0 skal du udføre "Standard løftecelleprotokol".
      2. Resuspender cellerne i MSC-medier, og tæl de levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller.
      3. I en plade med 6 brønde tilsættes 4 x 103 celler/cm2. Pladerne de resterende i en ekstra 150 mm plade med 20 ml MSC-medier (dette vil være kontrolpladen). Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
      4. Den næste dag (dag 1) skal cellerne være ~ 40% sammenflydende. Forvarm vækstmediet for lentiemballagen, og optø polybren og ca. 3 ml lentivirus på is (eller, hvis det gøres samme dag som virusopsamlingen, opbevares på is indtil brug).
      5. Tilsæt lenti-emballage vækstmedium og lentivirus til brøndene baseret på de ønskede titere (dvs. 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Der tilsættes 0,5 μL polybren for at opnå en slutkoncentration på 5 μg/ml (stamkoncentration: 10 mg/ml, se materialetabel).
      6. Hvirvl pladen rundt for at sikre jævn eksponering for alle cellerne. Pladen sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C i 48 timer.
    2. Vurder SCX lentivirustitereffektiviteten med flowcytometri.
      1. Efter 48 timer udføres "Standard løftecelleprotokol".
      2. Resuspender cellerne i PBS og tæl levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer eller celletæller. Centrifuger cellerne ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g.
      3. Supernatanten fjernes og opslæmmes igen i 3 ml FACS-buffer for at vaske. Overfør cellesuspensionen til flowcytometrirør og centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
      4. FACS-buffervasken gentages yderligere to gange, og de endelige cellepellets resuspenderes i 300 μL FACS-buffer. Vurder ekspressionen af GFP for hver titer ved hjælp af en flowcytometrimaskine.
      5. Baseret på titere og cellelevedygtighedstællinger bestemmes den passende lentivirustiter for at fortsætte med transduktionen. På dette tidspunkt kan protokollen sættes på pause og genstartes senere, afhængigt af den eksperimentelle tidslinje.
    3. Udfør SCX-transduktion i stor skala.
      BEMÆRK: De angivne volumener er pr. 1x 150 mm plade eller 1x T175-kolbe. Dette kan justeres i overensstemmelse hermed afhængigt af ønsket beholderstørrelse og transduktionsomfang.
      1. På dag 0 skal du udføre "Standard løftecelleprotokol".
      2. Resuspender cellerne i MSC-medier, og tæl de levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller. Frø cellerne ved 4 x 103 celler /cm 2. Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
      3. Den næste dag (dag 1) skal cellerne være ~ 40% sammenflydende. Forvarm vækstmediet lenti-emballage og optø polybren og forudberegnet mængde lentivirus på is.
      4. Baseret på den besluttede titer tilsættes den ønskede mængde vækstmedium og lentivirus til brøndene. Der tilsættes 5 μg/ml polybren (stamkoncentration: 10 mg/ml).
      5. På dag 3 skal du observere cellerne under et fluorescerende mikroskop. Den nyproducerede iMSCSCX+ bør fluorescere GFP. Udskift det virusholdige medie med forvarmede MSC-medier. På dette tidspunkt kan protokollen sættes på pause og genstartes senere, afhængigt af den eksperimentelle tidslinje.

4. iMSCSCX+ passaging og udvidelse

  1. Udfør passering, udvidelse, frysning og optøning af iMSCSCX+ på samme måde som for iMSC'er, som beskrevet i trin 2 i protokollen.

5. Mekanisk belastning

BEMÆRK: Dette afsnit tager mindst 4 dage, men kan være længere afhængigt af om cellekontraktion observeres.

  1. Forberedelse af eksperiment
    1. Forbered silikonepladerne.
      1. Autoklave 2 silikoneplader (se Materialetabel). Derefter fjernes silikonepladerne under sterile forhold fra autoklaveposen og anbringes i 150 mm plader.
      2. Kombiner 130 μL fibronectin (100x, se materialetabel) med 13 ml steril PBS i et 15 ml konisk rør. Vend røret flere gange for at blande.
      3. Tilsæt 400 μL fibronectinopløsning til hver brønd i silikonepladerne. Pladerne inkuberes ved 37 °C i mindst 2 timer eller natten over.
      4. Før brug aspireres fibronectinopløsningen og lad pladerne lufttørre i cellekulturhætten i mindst 30 minutter for at lade fibronectinopløsningen fordampe fuldstændigt.
        BEMÆRK: Fibronectinopløsningen kan fjernes fra brøndene på forhånd, og de nu coatede plader kan sidde ved 37 ° C i op til et par uger indtil brug.
    2. Klargør MSC-strækmediet.
      1. Forbered MSC-strækmedier ved at tilsætte 140 μL ascorbinsyre (lager: 100x, slutkoncentration: 50 μg/ml) til 14 ml forvarmede MSC-medier i et 15 ml konisk rør.
        BEMÆRK: Ascorbinsyren skal tilsættes frisk til MSC-mediet før hver medieændring.
  2. Såning af iMSCSCX+ i silikonepladerne
    1. Udfør "Standard løftecelleprotokol" (trin 1.3).
    2. Resuspender cellerne i MSC-medier, og tæl de levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller.
    3. Beregn det volumen cellesuspension, der er nødvendigt for at opnå 1,25 x 104 celler/cm2.
    4. Fjern denne mængde MSC-strækmedier fra det koniske 15 ml rør. Tilføj målcellerne. Inverter den nye cellesuspension til homogen.
    5. Tilsæt 400 μL af den nye cellesuspension til hvert hul i begge silikoneplader.
    6. Sæt låget tilbage på 150 mm pladerne, og sæt dem tilbage i inkubatoren ved 37 °C i 24 timer.
  3. Uniaxial spænding
    1. Den næste dag skylles strækapparatet (se materialetabellen) med ddH2O efterfulgt af 70% ethanol. Tør apparatet af, anbring det i cellekulturhætten og UV i 15 minutter.
    2. Hent de frøede plader og kontroller brøndene for god cellefastgørelse.
    3. Lad en plade være i inkubatoren (statisk kontrol) og læg den andenfrøede silikoneplade i strækningsapparatet ved at justere skruerne med hullerne i silikonepladen. Sæt låget på apparatet igen for at sikre sterilitet.
    4. Fastgør apparatet med den frøede silikoneplade til den elektroniske kilde (se materialetabellen) og anbring det i inkubatoren ved 37 °C.
    5. På programmet indstilles den cykliske strækningsprotokol til 4% sinusformet belastning, 0,5 Hz, 2 timer pr. Dag. Start strækningen ved at trykke én gang på startknappen . Strækning skal begynde straks.
    6. Stræk cellerne i mindst 3 dage. Overvåg cellerne dagligt og stop strækningsprotokollen, hvis cellekontraktion kan observeres. Skift mediet til friske MSC-strækmedier hver anden dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Differentiering af menneskelige iPSC'er i forhold til iMSC'er
Som tidligere beskrevet indebærer den nuværende protokol til differentiering af iPSC'er i iMSC'er dannelsen af embryoidlegemer2. Denne proces tager ca. ti dage at inducere iMSC'er fra iPSC'er (figur 1A). Det anbefales dog stærkt at passere de nyligt genererede iMSC'er mindst to gange. Dette hjælper ikke kun med at eliminere behovet for gelatinebelagte plader, men etablerer også stabil MSC-ekspression. Flowcytometrikvantificering, udført efter seks passager efter differentiering, viser en næsten ren cellepopulation med høj ekspression af klassiske MSC-overflademarkører, herunder CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) og CD105 (99,2%)17,18 (figur 1B). Med hensyn til morfologi skal iMSC'er ligne knoglemarvs-MSC'er, der fremstår aflange og fibroblastlignende (figur 1C).

Gensplejsning af iMSC'er til overekspression af SCX ved hjælp af lentiviral transduktion
Lentivirus blev fremstillet ved at transfektere HEK293T/17-celler med pLenti-C-mGFP-vektoren, hvori SCXB er indsat for at udtrykke SCX-GFP+ sammen med to emballageplasmider. Transfektioner blev udført ved hjælp af BioT-metoden15,16 med et forhold på 1,5: 1 BioT (μl) til DNA (μg).

HEK293T/17 celler blev podet med en densitet på 5,3 x 104 celler/cm2 18-24 timer før transfektion. På tidspunktet for transfektion skal cellerne nå 80% -95% sammenløb for at undgå laveffektive titere (figur 2B1, venstre). Inden for 24 timer efter tilsætning af plasmidcocktailen blev der observeret en vis toksicitet, som toppede ved 48 timer (figur 2B2). Da SCX-lentiviral vektor er GFP-konjugeret, bør GFP-ekspression kunne observeres efter 48 timer (figur 2B3). Tilstedeværelsen af høj toksicitet kombineret med GFP-ekspression er en pålidelig indikator for vellykket transfektion. Lentivirus blev opsamlet ved 48 timer og 72 timer, og transduktionseffektiviteten blev vurderet ved hjælp af flowcytometri og genekspressionsanalyse. Den absolutte intensitet af GFP-positive celler blev brugt som proxy for SCX-integrationer, og den var signifikant højere i de højere titere (figur 3A). Transduktionseffektiviteten, målt som procentdelen af SCX-GFP+ -celler, viste en dosis-respons-effekt baseret på lentiviral belastning (figur 3B). Flowcytometri af iMSCSCX+ ved forskellige passager viste også høj stabilitet uden ændringer i transgenekspressionsniveauer eller andelen af transducerede celler (figur 3C). Derudover opretholdt iMSCSCX+ efter 4 ugers regelmæssig dyrkning uden sortering stabil overekspression af SCX (figur 3D). Storskala transduktion blev udført baseret på titeren under anvendelse af 75% lentivirus (figur 2C).

Mekanisk belastning af iMSCSCX+
iMSCSCX+-cellerne blev podet på deformerbare silikoneplader med en celletæthed på 1,25 x 104 celler/cm2 (figur 4A,B) for at muliggøre cellefastgørelse, før strækningsprotokollen blev påbegyndt. Den endelige såtæthed blev optimeret for at forhindre overvækst af enkeltlag. Det er værd at bemærke, at for høje såtætheder resulterede i for tidlig cellekontraktion og tidlig celledød (figur 4D). For den statiske kontrolgruppe blev cellerne belagt i identiske plader, men uden at gennemgå nogen strækning. iMSCSCX+-cellerne blev udsat for strækning i en 2D-bioreaktor i mindst tre dage, op til syv dage, ved 4% uniaxial belastning og 0,5 Hz i 2 timer om dagen. Dette strækningsregime er i overensstemmelse med det, der er blevet beskrevet som fysiologisk relevant9. Efter flere dages strækning kan der observeres en vis grad af celleorganisation sammenlignet med den statiske gruppe, som udviste tilfældig celleorganisation (figur 4C). Phalloidinfarvning af actinfilamenterne fremhæver yderligere, hvordan cellerne ser ud til at vokse vinkelret på strækningsretningen, i modsætning til den tilfældige celleorganisation, der observeres i de statiske plader (figur 4E). For at karakterisere de nyligt genererede iTenocytter blev celler indsamlet efter tre og syv dage til genekspressionsanalyse, som tidligere rapporteret14. Genekspressionsanalyse afslører, at iMSCSCX+-cellerne er mekanoresponsive, da der er en signifikant opregulering i tenogene gener (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX og TPPP3)5,7,19,20 efter både tre og syv dage sammenlignet med kun iMSC'erne på dag 0 (figur 5A). Derudover var kollagenaflejring i medierne efter 7 dages udstrækning signifikant højere i iMSCSCX+ stretched gruppen sammenlignet med alle andre grupper (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: iMSC-differentieringsskematisk og flowcytometrikarakterisering. (A) Samlet skematisk oversigt over iTenocytgenerering og tidslinje for iMSC-induktion. Gengivet med tilladelse fra Papalamprou A. et al.14. (B) Flowcytometrikvantificering viser en høj procentdel af celler, der udtrykker klassiske MSC-overflademarkører for iPSC-afledte MSC'er efter 6 passager efter differentiering. Tilpasset med tilladelse fra Sheyn D. et al.2. (C) Fasekontrastbilleder af celler efter differentiering viser fibroblastlignende morfologi. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: iMSCSCX+ produktionsskema. (A) Samlet skematisk oversigt over transfektion ved hjælp af 2. generations SCX lentivirusvektor og transduktion af iMSC'er. Gengivet med tilladelse fra Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 celler før tilsætning af plasmidcocktail. (B2) HEK293T/17 celler, efter 48 timer, udtrykker GFP og viser toksicitet. (B3) Ekspression af GFP, der kan observeres i HEK293T/17 celler, indikerer vellykket transfektion. (C) Genererede iMSCSCX+ -celler (med 75 % titer) udtrykker SCX-GFP+ i kernerne. Skalabjælker = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af transduktionseffektiviteten med flowcytometri og genekspression. Den absolutte intensitet af GFP-positive celler blev anvendt som en proxy for SCX-integrationer ved hjælp af flowcytometri. Vektortitere blev valideret ved flowcytometrianalyse for alle celler for at vurdere lentiviral MOI. (A) Absolut fluorescens pr. virustiter. B) Transduktionseffektivitet evalueret som procentdelen af SCX-GFP+ -celler. En dosis-respons-effekt af lentiviral belastning i transduktionseffektivitet blev observeret, når flowresultater blev præsenteret som en procentdel af GFP+-celler. MOI, mangfoldighed af infektion, n = 3 uafhængige transduktioner. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne titere; data er gennemsnitlige ± SD; *p < 0,05. (C) Flowcytometri af iMSCSCX+ efter flere passagerunder indikerer ingen ændring i niveauet af stabil transgenekspression og ingen ændring i andelen af transducerede celler. Bemærk, at iMSC'er transduceret med 100% titere stoppede med at dele sig ved P3. D) iMSC'er transduceret med SCX-GFP+ lentivirusvektor (75 %, MOI = 2,9 e5 TU/ml) og vurderede genekspressionen af SCX ved 4 ugers regelmæssig dyrkning uden sortering. SCX-ekspression blev signifikant opreguleret i iMSCSCX+ , der viste stabil overekspression af SCX efter 4 uger. TU, transduktionsenheder; data er gennemsnitlig ± SD, **p > 0,01. Gengivet med tilladelse fra Papalamprou A. et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: iMSCSCX+ sået ind i en 2D-bioreaktor og gennemgår cyklisk strækning. A) 2D-bioreaktorskematisk. Gengivet med tilladelse fra Papalamprou A. et al.12. (B) Celler podes først i fleksible silikoneplader og inkuberes ved 37 °C for at muliggøre fastgørelse inden cyklisk strækning i 2D-bioreaktoren. (C) iMSCSCX+ blev strakt i en 2D-bioreaktor i op til 7 dage. Til statiske kontroller blev celler belagt i identiske plader, men uden strækning. (C1) Statisk kontrolplade efter 7 dage udviser stokastisk arrangement af celler. (C2) Strakt plade efter 7 dage viser relativt mere celleorganisation. (D) Tre eksempler på, hvad der ikke bør overholdes. Når cellesåningstætheden er for høj, eller cellerne er blevet strakt i for mange dage, begynder cellerne at løsne sig. (D1) Celler er kun lidt overgroet. Gule pile angiver begyndelsen på for tidlig cellekontraktion. (D2) Moderat niveau af tilgroning. Celler begynder at løsne sig fra pladen. (D3) Alvorligt niveau af tilgroning. Celler vokser ikke længere i monolag og har dannet 3D-strukturer. Sorte skalastænger = 400 μm. Hvide skalastænger = 1000 μm. (E) Efter 7 dages strækning (eller i kultur for den statiske plade) blev celler fastgjort med phalloidin til actinfilamenter (rød) og modfarvet med DAPI for kerner (blå). Hvide skalastænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Stimulering af tenogen markørgenekspression ved Scx-overekspression og uniaxial strækning i en 2D-bioreaktor. (A) iMSCSCX+ blev strakt i en 2D-bioreaktor i 7 dage. Til statiske kontroller blev celler belagt i identiske plader, men uden strækning. Genekspressionsanalyser afslører, at iMSCSCX+ er mekanoresponsiv. ND = ingen detektion. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne genekspression på hvert tidspunkt vs. d0. N = 8/gruppe. (B) Kollagenaflejring efter 7 dages strækning i 2D-bioreaktoren. Data er gennemsnitlige ± SD; n = 8/gruppe; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Gengivet med tilladelse fra Papalamprou A. et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol genereres iTenocytter gennem tre hovedtrin: (1) induktion af iPSC'er til iMSC'er, (2) overekspression af SCX ved hjælp af en lentiviral vektor og (3) modning af celler gennem 2D uniaxial spænding.

Den protokol, der præsenteres for differentiering af iPSC'er i iMSC'er, er tidligere beskrevet af vores gruppe2. Siden denne offentliggørelse er der udviklet adskillige protokoller, herunder en etableret protokol til brug af iMSC'er i kliniske forsøg 21,22,23 samt kommercielt tilgængelige differentieringssæt. En gennemgang af iMSC'ers trilineagepotentiale er også tidligere blevet undersøgt2. Selvom metoderne er forskellige, understreger alle protokoller behovet for postdifferentieringsudvidelse af iMSC'er i flere passager for at sikre stabil ekspression af MSC-overflademarkører. På dette stadium vil anvendelse af et 1: 3 splitforhold ved ca. 70% sammenløb resultere i en relativt sammenflydende plade inden for 4-6 dage efter passage.

Når du vælger den optimale titer til transduktion, er det afgørende at finde en balance mellem cellelevedygtighed og effektivitet. Mens iMSC'erne transduceret med 100% titeren kan vise det højeste niveau af SCX-GFP-positive celler, er det værd at bemærke, at disse celler ophørte med at dele tre passager efter transduktion (figur 3C), muligvis på grund af DNA-induceret toksicitet. Derfor anbefales det at bruge en titer mindre end 100%. Før såning af silikonepladerne anbefales det at revurdere SCX-GFP-niveauerne ved hjælp af flowcytometri. Hvis dataene indikerer, at effektiviteten er under den ønskede tærskel, anbefales det at sortere iMSCSCX+ -cellerne før såning, især til in vivo-applikationer .

Når iMSCSCX+-cellerne er blevet podet i silikonepladerne, skal de inkuberes ved 37 °C natten over for at muliggøre cellefastgørelse, før de strækkes. Den beskrevne celletæthed på 1,25 x 104 celler/cm2 i silikonepladerne blev optimeret til at forhindre overvækst af enkeltlag, hvilket kan bidrage til statisk spænding24. Derudover tyder undersøgelser på, at direkte celle-til-celle-kontakt i sammenflydende kulturer i substrater med varierende stivhed kan ændre celleadfærd 24,25,26. Under pilotforsøg blev der observeret en vis synlig celleløsrivelse fra silikonepladerne, især på senere tidspunkter (figur 4D). Dette kan tilskrives dannelsen af ECM-celleark på grund af oversammenløb24. Derfor inkluderer kritiske parametre celletæthed og antallet af strækanfald. I de nuværende metoder blev celler indsamlet på dag 3 og 7 til vurdering af tenogent potentiale via genekspressionsanalyse. Det anbefales dog, at celler strækkes i 2D-bioreaktoren i mindst tre dage med efterfølgende overvågning af strakte og statiske plader for at forhindre tilgroning og cellefrigørelse.

Efter flere strækningsanfald kan der observeres en grad af cellejustering og organisering (figur 4C1, E). Dette stemmer overens med mange undersøgelser, hvor cellejustering vinkelret på stammeaksen observeres som reaktion på uniaxial stamme in vitro24,27. Til sammenligning viser den statiske plade stokastisk celleorganisation (figur 4C2, E).

Så vidt vi ved, har kun få undersøgelser undersøgt de synergistiske virkninger af SCX-overekspression og mekanisk stimulering til differentiering af MSC'er i tenocytter eller ligamentocytter 24,28,29. Gaspar et al. anvendte et lignende 2D-bioreaktorsystem som det, der er beskrevet her, men anvendte højere niveauer af total belastning (10% ved 1 Hz i 12 timer / dag). Interessant nok var de ikke i stand til at opdage ændringer i ekspressionen af SCX, TNMD og COL1a1 i BM-MSC'er og humane tenocytter. Dette kan imidlertid tilskrives de højere anvendte stammer, der blev anvendt i deres undersøgelse24. Chen et al. brugte en lentiviral vektor til at overudtrykke SCX i hESC-MSC'er samlet i flerlagsark. De anvendte uniaxial cyklisk belastning (10% belastning ved 1 Hz i 2 timer / dag i op til 21 dage) og observerede opregulering af COL1a1, COL1a2, COL14 og TNMD samt øget ECM-aflejring29. Nichols et al. transfekterede forbigående C3H10T1/2-celler med murin Scx cDNA i fuld længde og dyrkede cellerne i 3D-kollagenhydrogeler under uniaxial cyklisk stamme (1%, 1 Hz, 30 min/dag i op til 14 dage). I lighed med vores resultater observerede deres gruppe forhøjet ekspression af SCX og COL1A1 i de anstrengte og overudtrykte konstruktioner, men fandt ingen ændring i TNMD-ekspression som reaktion på cyklisk strækning28.

Derudover kan det være spændende at overveje overekspression af andre senerelaterede markører som MKX. Tsutsumi et al. udforskede den kombinerede effekt af at overudtrykke MKX i C3H10T1/2 celler og udsætte dem for cyklisk mekanisk strækning i et 3D-system. De demonstrerede en signifikant opregulering af SCX, COL1a1, DCN og COL3a1 sammen med justeringen af kollagenfibrilbundter og actinfilamenter30.

Det er vigtigt at erkende, at denne metode til generering af iTenocytter har sine begrænsninger. Mens den kommercielt tilgængelige 2D-bioreaktor er fordelagtig til proof-of-concept-arbejde, begrænser dens størrelse udbyttet. Hvis disse celler er nødvendige for assays med høj kapacitet eller som en potentiel hyldecellekilde til senereparationsterapier, bør det overvejes at udforske systemer, der er i stand til at implementere uniaxial strækning i større skala. Desuden bør yderligere undersøgelser omfatte udvidelse af iTenocytter for at bekræfte stabil tenogen ekspression, og vurdering af deres bidrag til in vivo-regenerering er afgørende for at evaluere deres tenogene potentiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev delvist støttet af NIH / NIAMS K01AR071512 og CIRM DISC0-14350 til Dmitriy Sheyn. De to lentivirusemballageplasmider var en gave fra Simon Knott-laboratoriet (Institut for Biomedicinsk Videnskab, Cedars-Sinai Medical Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

Bioengineering nr. 205
Generering af inducerede pluripotente stamcelleafledte iTenocytter <em>via</em> kombineret scleraksoverekspression og 2D uniaxial spænding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter