Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.

Abstract

האתגרים הקיימים כיום בתיקון גידים ורצועות מחייבים איתור מועמד מתאים ויעיל לטיפול תאי לקידום התחדשות הגידים. תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) נחקרו כאסטרטגיה פוטנציאלית להנדסת רקמות לתיקון גידים. בעוד שהם רב-פוטנטיים ויש להם פוטנציאל התחדשות in vivo, הם מוגבלים ביכולת ההתחדשות העצמית שלהם ומפגינים הטרוגניות פנוטיפית. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים לעקוף מגבלות אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית הגבוהה שלהם והפלסטיות ההתפתחותית שאין דומה לה. בהתפתחות טנוציטים, סקלרקסיס (Scx) הוא וסת מולקולרי ישיר חיוני של התמיינות גידים. בנוסף, הוכח כי מכנורגולציה היא מרכיב מרכזי המנחה את התפתחות וריפוי הגידים העובריים. לכן, פיתחנו פרוטוקול לתמצת את ההשפעה הסינרגטית של גירוי ביולוגי ומכני שעשוי להיות חיוני ליצירת טנוציטים. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו לתאי סטרומה מזנכימליים (iMSCs) ואופיינו בסמנים קלאסיים של תאי סטרומה מזנכימליים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, באמצעות וקטור לנטי-ויראלי, ה-iMSCs הומרו ל-SCX בעל ביטוי יתר יציב (iMSCSCX+). תאי iMSCSCX+ אלה יכולים להבשיל עוד יותר ל-iTenocytes באמצעות העמסת מתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי. התאים שהתקבלו אופיינו על ידי התבוננות upregulation של סמנים גידים מוקדמים ומאוחרים, כמו גם שקיעת קולגן. שיטה זו של יצירת iTenocytes יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים בפיתוח מקור תאים אלוגני בלתי מוגבל מהמדף עבור יישומי טיפול בתאי גידים.

Introduction

כדי להתמודד עם הבעיות העכשוויות בתיקון גידים ורצועות, יש דרישה למועמד מתאים מתאים לטיפולים מבוססי תאים. אפיק מחקר אחד בהנדסת רקמות לתיקון גידים כרוך בחקר תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם במח עצם (BM-MSCs) ותאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן (ASC) כאסטרטגיות אפשריות. תאים אלה הם בעלי יכולת רב-עוצמה, שפע רב ופוטנציאל התחדשות in vivo. בנוסף, הם הראו יכולת ריפוי משופרת ותוצאות תפקודיות משופרות במודלים של בעלי חיים1. עם זאת, תאים אלה מפגינים יכולות התחדשות עצמית מוגבלות, מגוון פנוטיפי, ובעיקר, יכולת מוגבלת ליצירת גידים. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מציעה פתרון לאילוצים אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית יוצאת הדופן שלה ויכולת ההסתגלות ההתפתחותית שאין דומה לה. צוות המחקר שלנו ואחרים השיגו התמיינות מוצלחת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לישויות דמויות תאי סטרומה מזנכימליים (iMSCs)2,3. ככאלה, iMSCs יש פוטנציאל להיות מקור allogenic עבור יישומים טיפול בתאי גידים.

סקלרקסיס (SCX) הוא גורם שעתוק חיוני להתפתחות הגידים ונחשב לסמן המוקדם ביותר הניתן לגילוי עבור טנוציטים ממוינים. בנוסף, SCX מפעיל סמני התמיינות גידים במורד הזרם, כולל קולגן שרשרת 1a1 סוג 1 (COL1a1), מוהוק (MKX) וטנומודולין (TNMD), בין היתר 4,5,6. גנים אחרים המתבטאים במהלך הבשלת הגידים כוללים חלבון מקדם פילמור טובולין 3 (TPPP3) וקולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRa)7. בעוד גנים אלה חיוניים להתפתחות הגידים ולהבשלתם, למרבה הצער הם אינם ייחודיים לרקמת הגידים ומתבטאים ברקמות שרירים ושלד אחרות כמו עצם או סחוס 5,7.

בנוסף לביטוי הסמנים במהלך התפתחות הגיד, מכנוסטימולציה היא מרכיב חיוני להתפתחות וריפוי גידים עובריים 4,5,6. הגידים הם מכניים, ודפוסי הצמיחה שלהם משתנים בתגובה לסביבתם. ברמה המולקולרית, רמזים ביומכניים משפיעים על ההתפתחות, ההתבגרות, התחזוקה והריפוי של טנוציטים8. מערכות ביוריאקטורים שונות שימשו למידול עומסים פיזיולוגיים ורמזים ביומכניים. חלק ממערכות מודל אלה כוללות העמסת רקמות ex vivo, מערכות העמסת תאים דו-ממדיות המפעילות מתח דו-צירי או חד-צירי, ומערכות תלת-ממדיות המשתמשות בפיגומים והידרוג'לים 9,10. למערכות דו-ממדיות יש יתרון כאשר הן חוקרות את השפעות הגירוי המכני על גנים ספציפיים לגיד או על המורפולוגיה של התאים בהקשר של גורל התא, בעוד שמערכות תלת-ממדיות יכולות לשכפל בצורה מדויקת יותר אינטראקציות תא-ECM 9,10.

במערכות העמסה דו-ממדית, המתח בין התאים למצע התרבית הוא הומוגני, כלומר ניתן לשלוט באופן מלא בעומס המופעל על שלד התא. בהשוואה להעמסה דו-צירית, העמסה חד-צירית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית, שכן טנוציטים נתונים בעיקר להעמסה חד-צירית מצרורות קולגן in vivo9. נמצא כי במהלך הפעילות היומיומית, הגידים נתונים לעומס מתיחה חד צירי עד 6% מתח11. באופן ספציפי, מחקרים קודמים מצאו כי העמסה בטווח הפיזיולוגי של 4%-5% הוכחה כמקדמת התמיינות טנוגנית על ידי שימור ביטוי סמנים הקשורים לגידים כמו SCX ו- TNMD, כמו גם ייצור קולגן מוגבר 9,10. זנים של יותר מ -10% עשויים להיות רלוונטיים טראומטית אך לא רלוונטיים פיזיולוגית12,13.

כאן מוצג פרוטוקול שלוקח בחשבון את ההשפעה הסינרגטית של גירוי מכני וביולוגי שעשוי להיות חיוני לייצור טנוציטים. תחילה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור להשראת iPSCs לתוך iMSCs באמצעות חשיפה לטווח קצר של גופים עובריים לגורמי גדילה, שאושרה על ידי סמני פני השטח של MSC באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת התמרה לנטיויראלית כדי להנדס iMSCs כך שיהיו בעלי ביטוי יתר יציב של SCX (iMSCSCX+). להבשלת תאים נוספת, iMSCSCX+ נזרעים לתוך לוחות סיליקון מצופים פיברונקטין ועוברים פרוטוקול מתח חד-צירי אופטימלי באמצעות ביוריאקטור CellScale MCFX. הפוטנציאל הטנוגני אושר על ידי התבוננות בהגברת הוויסות של סמני גידים מוקדמים ומאוחרים, כמו גם שקיעת קולגן14. שיטה זו ליצירת iTenocytes היא הוכחת היתכנות שעשויה להציע מקור אלוגני ללא הגבלה מהמדף ליישומי טיפול בתאי גידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה לייצור iTenocytes יכול להתבצע בשלושה שלבים עיקריים: iPSCs ל- iMSCs (10 ימים), iMSC ל- iMSCSCX+ (שבועיים), iMSCSCX+ ל- iTenocytes (מינימום 4 ימים). ניתן להשהות כל שלב משמעותי בפרוטוקול ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר, בהתאם לציר הזמן של הניסוי. עבור שיטות הכרוכות בגידול תאים, יש להשתמש בטכניקות סטריליות. יש לגדל את כל התאים בפרוטוקול זה בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-95% לחות.

1. החדרת iPSC אנושי לתאי סטרומה מזנכימליים מושרים (iMSCs)

  1. הכנת הניסוי
    1. הכינו את המדיה Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) של Dulbecco של Iscove.
      1. תוספת 50 מ"ל של מדיה בסיסית IMDM עם 8.5 מ"ל של החלפת סרום נוק-אאוט, 500 μL של חומצות אמינו לא חיוניות Minimal Essential Medium (MEM), 0.385 μL (מלאי 110 mM) בטא-מרקפטואתנול, ו-500 μL תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (AAS) (ריכוזים סופיים: 17%, 1%, 110 μM, 1%, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים).
    2. הכן מדיה של תאי סטרומה מזנכימליים (MSC).
      1. תוסף 440 מ"ל של גלוקוז נמוך מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5 מ"ל של תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (AAS), ו-5 מ"ל של L-גלוטמין (ריכוזים סופיים: 10%, 1%, 2 מילימול, בהתאמה).
    3. הכינו לוחות מצופים פולי(2-הידרוקסיאתיל מתקרילט) (poly-HEMA).
      1. יש להוסיף 10 גרם של פולי-HEMA (ראו טבלת חומרים) לבקבוק סטרילי.
      2. מוסיפים מערבל מגנטי לבקבוק, ותוך כדי ערבוב מוסיפים באיטיות 500 מ"ל 95% EtOH.
      3. לאחר הוספת כל ה-EtOH, הפעל את מצב הערבוב במהירות 1200 סל"ד עם חום נמוך נוסף למשך 6 שעות לפחות. ניתן לאחסן את תמיסת Poly-HEMA בטמפרטורת החדר עד שנה.
      4. בתנאים סטריליים, יש להוסיף 2.5 מיקרוגרם/ס"מ2 ב-9 מ"ל לצלוחית T75. התאימו את עוצמת הקול בהתאם לגודל כלי התרבית.
      5. שמירה על סטריליות, לאפשר את הכלים להתייבש באוויר עבור EtOH להתאדות לחלוטין לפני השימוש. זה בדרך כלל לוקח 24-72 שעות.
    4. הכינו צלוחיות מצופות ג'לטין.
      1. שטפו בקבוק זכוכית עם NaOH והקדישו אותו להכנת הג'לטין. אין להשתמש בחומר ניקוי.
      2. הכינו תמיסת ג'לטין 1% (5 גרם ג'לטין ו-500 מ"ל מים נטולי אנדוטוקסין). Autoclave בקבוק זכוכית עם תמיסת ג'לטין במשך 30 דקות.
      3. תנו לתמיסת הג'לטין להתקרר, וניתן לאחסן אותה בטמפרטורת החדר.
      4. יש לצפות בקבוק T75 אחד בתמיסת ג'לטין במינון 5 מ"ל לכל בקבוק ולדגור לפחות שעה אחת לפני הזריעה של תאים. ניתן להכין צלוחיות מצופות ג'לטין יום אחד מראש.
    5. הכן מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
      1. ערבבו PBS עם אלבומין בסרום בקר 2% ונתרן אזיד 0.1%. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. יצירת גופים עובריים (EBs)
    הערה: תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים צריכים להיות מתורבתים בצלחת של 6 בארות ולהגיע למפגש של 70%-80% לפני השימוש.
    1. ביום 0, הביאו צלחת PCR עם תחתית שקופה 384 במכסה המנוע של תרבית הרקמה ו-UV למשך 15 דקות ללא מכסה.
    2. הסר את מצע הגידול מה- iPSCs (ראה טבלת חומרים) ושטוף את הבארות עם PBS.
    3. הוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאי עדין שחומם מראש (ראו טבלת חומרים) לכל באר ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. התבונן בתאים כל 5 דקות עד שה- iPSCs הפכו לתאים בודדים או לצברים קטנים שהורמו בהשעיה.
    4. השהה מחדש את תרחיף התא עם פיפטה של 1 מ"ל כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.
    5. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את supernatant, resuspend במדיה IMDM-EB (שלב 1.1.1), וספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer או מונה תאים.
    7. חשב את הנפח המתאים של תרחיף התא הדרוש כדי להשיג 5,000-25,000 תאים לכל באר של צלחת 384 באר עם 25 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר.
      הערה: באופן כללי, 2-3 בארות מפגש (70%-80%) של צלחת 6 בארות יכולות לייצר EBs בצלחת אחת של 384 בארות. גודל התאים לכל EB ייקבע אמפירית. עבור צלחת שלמה 384-באר, 9.6 מ"ל של השעיית התא חייב לשמש, 25 μL לכל באר.
    8. צנטריפוגה את התאים שוב למטה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים בנפח מתאים של מדיה IMDM-EB ו- 10 מיקרומטר של Y-27632 דיהידרוכלוריד (מלאי: 10 mM, 1000x, ראה טבלת חומרים) בצינור חרוטי 15 מ"ל מקורר מראש.
    10. הוסף מטריצת קרום מרתף מסיס קר (1 מ"ג לכל צלחת 384 באר בשווי EBs) לחרוט (ראה טבלת חומרים).
    11. מפזרים 25 μL של תרחיף התא לכל באר. מניחים מכסה סטרילי על הצלחת ומסובבים ב 450 x גרם ב 4 ° C במשך 7 דקות. לדגור ב 37 ° C במשך 48 שעות.
    12. ביום השני, העבירו את התאים לצלחת של 100 מ"מ עם 3 מ"ל של מדיה IMDM-EB שחוממה מראש.
    13. העבר את ה- EBs לצלוחיות T75 ייעודיות מצופות Poly-HEMA עם 10 מ"ל של IMDM-EB. התאימו את עוצמת הקול בהתאם לגודל כלי התרבית. אפשרו ל-EBs לגדול במשך 3 ימים.
    14. ביום 5, העבירו את ה-EBs לצלוחיות T75 מצופות ג'לטין מוכנות עם 10 מ"ל של מדיה IMDM-EB. התאימו את עוצמת הקול בהתאם לגודל כלי התרבית. הגדל את ה- EBs למשך 3 ימים נוספים בהשעיה.
    15. ביום 8, ודא כי שני סוגים של EBs נצפים: EBs המחוברים לצלוחית, ו- EBs שאינם מחוברים. שטפו את ה-EBs שאינם מחוברים מהבקבוק עם PBS.
    16. ל- EBs המצורפים, הוסף מדיה IMDM-EB בתוספת TGFβ-1 (10 ננוגרם/מ"ל) (ראה טבלת חומרים) ואפשר להם לגדול במשך יומיים.
    17. ביום ה-10, שנה את המדיום למדיום MSC. תאים צריך להיות מוזן פעמיים בשבוע. לאחר ש-70% נפגשים, המשך ל"פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטיים" כדי ללוות מחדש תאים. החזירו את התאים על לוחות מצופים ג'לטין.
  3. פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטי
    1. לאחר שהתאים הדבקים הגיעו למפגש של 70%, שאפו את מצע הגידול מהצלחות ושטפו עם PBS.
    2. הרימו את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של 0.25% טריפסין שחומם מראש לכל צלחת בקוטר 150 מ"מ ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. התאם את נפח הטריפסין בהתאם לגודל כלי התרבית.
    3. תחת מיקרוסקופ, בדקו שרוב התאים הורמו מכל לוחית. אם עדיין מחוברים תאים, טפחו בעדינות על צידי הלוחות כדי לעקור את התאים.
    4. אספו את התאים לתוך צינור חרוטי על ידי הוספת נפח כפול של מצע הגידול שחומם מראש.
    5. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב 300 x גרם. הסר את supernatant ולהמשיך לשלבים הבאים.
  4. הערכת ציטומטריית זרימה עבור ביטוי סמן MSC
    הערה: MSCs אנושיים, כמו MSCs מח עצם, צריכים לשמש כבקרה חיובית.
    1. בצע את "פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטיים" (שלב 1.3).
    2. השהה מחדש את הסופרנאטנט עם 3 מ"ל של מאגר FACS והעבר את כל הנפח לצינורות FACS.
    3. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב 300 x גרם. חזור על שלב הכביסה עם מאגר FACS פעמיים נוספות.
    4. לצינורות מוכתמים, הוסף 2 μL של CD90-FITC אנטי-אנושי עכבר, CD44-APC אנטי-אנושי עכבר ו- CD105-PE אנטי-אנושי (ראה טבלת חומרים) ודגור במשך 45 דקות ב- 4 ° C.
    5. לצינורות הבקרה של האיזוטיפ, הוסף 20 μL של עכבר IgG2a-FITC, עכבר IgG1-PB ועכבר IgG1-PE (ראה טבלת חומרים).
    6. יש לדגור בחושך ב-4°C למשך 15 דקות. שטפו את כל הצינורות על ידי הוספת 3 מ"ל של חיץ FACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם (בטמפרטורת החדר). השהה מחדש את התאים ב 250 μL של מאגר FACS עבור כל צינור.
    7. נתח את הביטוי של סמני פני השטח של MSCs באמצעות ציטומטריית זרימה14. אורכי גל עירור ופליטה צריכים להיות: CD90-FITC, שיא עירור ב 495 ננומטר ושיא פליטה ב 519 ננומטר; CD44-APC, שיא עירור ב-640 ושיא פליטה ב-660 ננומטר; CD105-PE, שיא עירור ב-561 ננומטר ושיא פליטה ב-574 ננומטר.

2. מעבר והרחבה של iMSC

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכנת מדיה להקפאת MSC.
      1. שלב 30 מ"ל של DMEM גלוקוז נמוך, 5 מ"ל של DMSO, ו 15 מ"ל של FBS (ריכוזים סופיים: 60%, 10%, 30%, בהתאמה.)
      2. סנן את התמיסה באמצעות מסנן סטרילי של 0.45 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. פס"ד
    הערה: לאחר האינדוקציה, יש לגדל iMSCs על צלחות מצופות ג'לטין במשך 2 מעברים נוספים לפני הגמילה לגידול על צלחות תרבית רקמת פלסטיק. בנוסף, יש להעביר תאים ביחס פיצול של 1:3 כאשר 70% נפגשים.
    1. בצע את "פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטיים" (שלב 1.3).
    2. השהה מחדש את התאים במדיה של MSC, ופזר את התאים באופן שווה לשלושה לוחות חדשים בקוטר 150 מ"מ של צלוחיות T175 עם 20 מ"ל מדיה לכל בקבוק. החזרת התאים ל- 37°C.
    3. האכילו את התאים פעמיים בשבוע על ידי החלפת מדיום הגידול במדיה MSC שחוממה מראש.
  3. הקפאה
    1. בצע את "פרוטוקול תאי ההרמה הסטנדרטי".
    2. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של MSC להקפיא מדיה. הוסף את 1 מ"ל של תרחיף התא לקריביאל ואחסן במיכל הקפאה למשך 24 שעות ב -80 ° C לפני המעבר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  4. הפשרה
    1. הכן 10 מ"ל של מדיה MSC שחוממה מראש בצינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. מוציאים את הקריוביאלי, טובלים אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומערבלים עד שנשאר כדור קרח בגודל אפונה (בערך 1-2 דקות).
    3. במכסה המנוע של תרבית התא, הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של המדיה המחוממת מראש לקריביאל ולפיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    4. מעבירים את תרחיף התא מהקריוביאל לצינור החרוטי המוכן של 15 מ"ל עם מדיה מחוממת מראש, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם (בטמפרטורת החדר).
    5. הסר את supernatant ו resuspend עם מדיה חדשה. הוסף את מתלה התא לצלחת 150 מ"מ עם נפח כולל של 20 מ"ל. התאימו את עוצמת הקול בהתאם לגודל בקבוק התרבית.
    6. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C עד שהם מוכנים לפיצול.

3. הנדסה גנטית של iMSCs לביטוי יתר של SCX באמצעות התמרה לנטיויראלית

הערה: השלמת חלק זה של הפרוטוקול נמשכת שבועיים.

  1. הכנת מדיה וריאגנטים
    1. הכן מדיה סלולרית HEK293T/17.
      1. תוספת 445 מ"ל של Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) עם 50 מ"ל FBS ו-5 מ"ל AAS (ריכוזים סופיים: 10%, 1%, בהתאמה).
    2. הכן מדיית אריזה של MSC lenti.
      1. הכינו את הסרום המנוטרל בחום על ידי חימום 50 מ"ל של FBS בטמפרטורת החדר באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      2. שלב 445 מ"ל של DMEM גלוקוז נמוך עם FBS מומת חום ו 5 מ"ל של L-גלוטמין (ריכוזים סופיים: 10%, 2 mM, בהתאמה.)
    3. הכינו קומפלקס טרנספקציה.
      1. אפשר להפשיר רכיבים מורכבים של טרנספקציה (ראו טבלת חומרים) על קרח: פלסמידים באריזה VSV-G ודלתא, פלסמיד SCX ו-BioT15,16.
      2. מערבלים בעדינות ומסובבים את הפלסמידים. למדוד את ריכוזי הדנ"א.
      3. בהתבסס על ריכוזי הדנ"א ומספר הצלוחיות המיועדות לטרנספקציה, חשב את הנפח של כל רכיב הדרוש: עבור בקבוק T75 אחד, קומפלקס הטרנספקציה יכלול 750 מיקרוליטר תווך ללא סרום (כמו DMEM ללא סרום או PBS), 7.5 מיקרוגרם פלסמיד SCX, 0.75 מיקרוגרם פלסמיד VSV-G, 6.75 מיקרוגרם פלסמיד דלתא, ו- 22.5 מיקרוליטר BioT. שקול תוספת עבור טעות pipetting.
      4. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה. מסתובבים לרגע בצנטריפוגה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ולהשתמש מיד.
  2. טרנספקציה וייצור לנטי-ויראלי
    זהירות: החל מהיום השלישי, הפרוטוקול כרוך בעבודה עם לנטיוירוס, ולכן העבודה חייבת להתבצע באמצעות נהלי תפעול ברמת הכלה 2+. העובדים חייבים ללבוש ציוד מגן אישי, כולל שתי שכבות של כפפות, כיסויי שורש כף היד, משקפי בטיחות, מסכה, מכנסיים ארוכים ונעליים סגורות. כל הפסולת והחומרים, כולל קצות פיפטה, צלוחיות ומדיום נוזלי, חייבים לעבור טיהור עם אקונומיקה (1% נתרן היפוכלוריט סופי) למשך 20 דקות לפחות. אין להשתמש בשואב האבק.
    1. זרע HEK293T/17 תאים.
      1. בערך 18-24 שעות לפני הטרנספקציה (יום 0), הרימו ופלטו את תאי 293T לצלוחיות T75. הכרכים הבאים מניחים את T75 ככלי תרבות. התאימו את עוצמת הקול בהתאם לכלי תרבית התאים בו נעשה שימוש.
      2. הסר את מדיום התרבות מן הצלוחיות ולשטוף עם 5 מ"ל של PBS.
        הערה: התאים מתרוממים בקלות רבה מפני השטח של הצלוחית. הוסיפו PBS לצד הבקבוק והימנעו מהוספה ישירה של תמיסה לתאים.
      3. הוסיפו 3 מ"ל של 0.25% טריפסין שחומם מראש לכל בקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. אספו את התאים לתוך צינור חרוטי וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
      4. הסר את supernatant, resuspend במדיה 293T, ולספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer או מונה תאים.
      5. צלחת את התאים ב 5.3 x 104 תאים / ס"מ2 לדגור ב 37 ° C במשך הלילה.
      6. למחרת (יום 1), להכין את קומפלקס transfection. החלף את מדיום הגידול מהתאים ב- 5 מ"ל של מדיום אריזת MSC מחומם מראש (שלב 3.1.2).
      7. הוסף את קומפלקס transfection טיפה לתאים. הטו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח חשיפה אחידה של קומפלקס הטרנספקציה לתאים. להחזיר את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות.
        הערה: יש לצפות ברעילות לאחר 24 שעות (יום 2).
      8. לאחר 48 שעות (יום 3), לאסוף בזהירות את המדיום המכיל וירוס לתוך צינור חרוטי נפרד באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם (בטמפרטורת החדר).
      9. הוסיפו 5 מ"ל של מדיום אריזת MSC שחומם מראש לבקבוק T75 של 293T וחזרו לאינקובטור למשך הלילה.
      10. לאחר הצנטריפוגה, מסננים את הסופרנאטנט עם מסנן סטרילי של 0.45 מיקרומטר על ידי הזרמה ישירה של הסופרנאטנט דרך המסנן. יש לאחסן את המדיום המכיל וירוס בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
      11. לאחר 24 שעות נוספות (יום 4), שוב לאסוף בזהירות את המדיום המכיל וירוס לתוך צינור חרוטי נפרד באמצעות פיפטה, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם (בטמפרטורת החדר).
      12. שלבו את הנגיף עם וירוס יום האיסוף הקודם וערבבו כדי להבטיח פתרון הומוגני. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר, בהתאם לציר הזמן של הניסוי. lentivirus יכול להיות aliquoted וקפוא ב -80 ° C, או lentivirus יכול להיות מאוחסן על קרח תוך המשך "Transduction של iMSCs עם SCX" (שלב 3.3).
        הערה: לאחר הקפאת והפשרת ה- aliquots של lentivirus, אין להקפיא מחדש.
  3. התמרה של iMSCs עם SCX
    1. בצע התמרה של צלחת טיטר (titer plate transduction).
      1. ביום 0, בצע את "פרוטוקול תאי ההרמה הסטנדרטיים".
      2. השהה מחדש את התאים במדיה של MSC וספור את התאים הקיימים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
      3. בצלחת 6 בארות מוסיפים 4X103 תאים/ס"מ2. החזר את הנותרים בצלחת נוספת של 150 מ"מ עם 20 מ"ל של מדיה MSC (זו תהיה צלחת הבקרה). לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C.
      4. למחרת (יום 1), התאים צריכים להיות ~ 40% במפגש. מחממים מראש את מצע הגידול באריזת הלנטי ומפשירים את הפוליברן וכ-3 מ"ל של לנטיוירוס על קרח (או אם נעשה באותו יום של איסוף הנגיפים, יש לאחסן על קרח עד לשימוש).
      5. הוסף לבארות מצע גידול אריזות לנטי ולנטיוירוס על בסיס הטיטרים הרצויים (כלומר, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%). הוסף 0.5 מיקרוליטר פוליברן כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל (ריכוז במלאי: 10 מ"ג/מ"ל, ראה טבלת חומרים).
      6. סובבו את הצלחת סביב כדי להבטיח חשיפה אחידה לכל התאים. להחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C במשך 48 שעות.
    2. הערך את יעילות הטיטר של SCX lentivirus באמצעות ציטומטריית זרימה.
      1. לאחר 48 שעות, בצע את "פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטיים".
      2. השהה מחדש את התאים ב- PBS וספור תאים קיימא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
      3. הסר את supernatant ו resuspend אותו 3 מ"ל של חיץ FACS כדי לשטוף. העבר את מתלה התא לצינורות ציטומטריה זורמים וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 300 x גרם.
      4. חזור על שטיפת מאגר FACS פעמיים נוספות והשהה מחדש את כדורי התא הסופיים ב- 300 μL של מאגר FACS. הערך את הביטוי של GFP עבור כל טיטר באמצעות מכונת ציטומטריית זרימה.
      5. בהתבסס על הטיטרים וספירות הכדאיות של התא, לקבוע את titer lentivirus המתאים להמשיך עם transduction. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר, בהתאם לציר הזמן של הניסוי.
    3. בצע התמרה SCX בקנה מידה גדול.
      הערה: אמצעי האחסון המפורטים הם לכל צלחת 1x 150 מ"מ או צלוחיות T175 אחת. זה עשוי להיות מותאם בהתאם לגודל כלי הרצוי ואת קנה המידה של transduction.
      1. ביום 0, בצע את "פרוטוקול תאי ההרמה הסטנדרטיים".
      2. השהה מחדש את התאים במדיה של MSC וספור את התאים הקיימים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים. זרעו את התאים ב 4 x 103 תאים / ס"מ2. לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C.
      3. למחרת (יום 1), התאים צריכים להיות ~ 40% במפגש. מחממים מראש את מצע הגידול באריזת הלנטי ומפשירים את הפוליברן ואת הכמות המחושבת מראש של לנטיוירוס על קרח.
      4. בהתבסס על הטיטר שהוחלט להוסיף את הכמות הרצויה של מצע גידול אריזות לנטי ולנטיוירוס לבארות. הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן (ריכוז במלאי: 10 מ"ג/מ"ל).
      5. ביום השלישי, התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. iMSCSCX+ החדש שיוצר צריך פלואורס GFP. החלף את המדיום המכיל וירוס במדיית MSC שחוממה מראש. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר, בהתאם לציר הזמן של הניסוי.

4. מעבר והרחבה של iMSCSCX+

  1. בצע העברה, הרחבה, הקפאה והפשרה של iMSCSCX+ לאחר ביצוע כמו עבור iMSCs, כמתואר בשלב 2 של הפרוטוקול.

5. עומס מכני

הערה: סעיף זה נמשך לפחות 4 ימים, אך יכול להיות ארוך יותר, תלוי אם נצפתה התכווצות תאים.

  1. הכנת הניסוי
    1. מכינים את לוחות הסיליקון.
      1. Autoclave 2 לוחות סיליקון (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, בתנאים סטריליים, מוציאים את לוחות הסיליקון משקית האוטוקלאבה ומניחים אותם בצלחות 150 מ"מ.
      2. ערבבו 130 מיקרוליטר של פיברונקטין (100x, ראו טבלת חומרים) עם 13 מ"ל PBS סטרילי בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב.
      3. הוסף 400 μL של תמיסת פיברונקטין לכל באר של לוחות סיליקון. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך מינימום של 2 שעות או לילה.
      4. לפני השימוש, שאפו את תמיסת הפיברונקטין ותנו לצלחות להתייבש באוויר במכסה המנוע של תרבית התאים למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר לתמיסת הפיברונקטין להתאדות לחלוטין.
        הערה: ניתן להסיר את תמיסת הפיברונקטין מהבארות מבעוד מועד, והצלחות המצופות כעת יכולות לשבת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים עד לשימוש.
    2. הכן את מדיית המתיחה של MSC.
      1. הכן את מדיית המתיחה של MSC על-ידי הוספת 140 מיקרוליטר חומצה אסקורבית (מלאי: 100x, ריכוז סופי: 50 מיקרוגרם/מ"ל) ל-14 מ"ל של מדיית MSC מחוממת מראש בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
        הערה: יש להוסיף את החומצה האסקורבית טרייה למדיית MSC לפני כל שינוי מדיה.
  2. זריעה של iMSCSCX+ בלוחות הסיליקון
    1. בצע את "פרוטוקול תאי הרמה סטנדרטיים" (שלב 1.3).
    2. השהה מחדש את התאים במדיה של MSC וספור את התאים הקיימים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
    3. חשב את נפח תרחיף התא הדרוש להשגת 1.25 x 104 תאים לסמ"מ2.
    4. הסר נפח זה של מדיית מתיחה MSC מצינור החרוט של 15 מ"ל. הוסף את תאי היעד. הפוך להומוגני את מתלה התא החדש.
    5. הוסף 400 μL של מתלה התא החדש לכל באר של שני לוחות הסיליקון.
    6. החזירו את המכסה ללוחות 150 מ"מ והחזירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. מתח חד צירי
    1. למחרת, שטפו את מנגנון המתיחה (ראו טבלת חומרים) עם ddH2O ואחריו 70% אתנול. נגבו את המנגנון, הניחו אותו במכסה המנוע של תרבית התאים והפעילו UV למשך 15 דקות.
    2. אחזר את לוחות הזרעים ובדוק את הבארות עבור חיבור תאים טוב.
    3. השאירו צלחת אחת באינקובטור (בקרה סטטית) והניחו את צלחת הסיליקון השנייה במנגנון המתיחה על ידי יישור הברגים עם החורים בלוח הסיליקון. החלף את המכסה על המכשיר כדי להבטיח סטריליות.
    4. חברו את המכשיר עם צלחת הסיליקון למקור האלקטרוני (ראו טבלת חומרים) והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37°C.
    5. בתוכנית, הגדר את פרוטוקול המתיחה המחזורית ל -4% מתח סינוסואידלי, 0.5 הרץ, שעתיים ביום. התחל את המתיחה על ידי לחיצה על לחצן התחל פעם אחת. המתיחה צריכה להתחיל מיד.
    6. מתח את התאים במשך מינימום של 3 ימים. עקוב אחר התאים מדי יום ועצור את פרוטוקול המתיחה אם ניתן להבחין בהתכווצות התא. שנה את המדיה למדיית מתיחה חדשה של MSC אחת ליומיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לתאי iMSC
כפי שתואר קודם לכן, הפרוטוקול הנוכחי להבחנה בין iPSCs ל- iMSCs כרוך בהיווצרות גופים עובריים2. התהליך הזה לוקח בערך עשרה ימים לגרום ל-iMSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (איור 1A). עם זאת, מומלץ מאוד לעבור את iMSCs שנוצרו לאחרונה לפחות פעמיים. זה לא רק עוזר לבטל את הצורך לוחות מצופים ג'לטין, אלא גם יוצר ביטוי MSC יציב. כימות ציטומטריית זרימה, שנערך לאחר שישה קטעים לאחר התמיינות, מדגים אוכלוסיית תאים כמעט טהורה עם ביטוי גבוה של סמני פני השטח הקלאסיים של MSC, כולל CD44 (83.1%), CD90 (88.4%) ו-CD105 (99.2%)17,18 (איור 1B). במונחים של מורפולוגיה, iMSCs צריכים להיות דומים מאוד למח עצם MSCs, ולהיראות מוארכים ודמויי פיברובלסטים (איור 1C).

הנדסה גנטית של iMSCs לביטוי יתר של SCX באמצעות התמרה לנטיויראלית
Lentiviruses הופקו על ידי הדבקת תאי HEK293T/17 עם וקטור pLenti-C-mGFP, שבו SCXB הוכנס כדי לבטא SCX-GFP+, יחד עם שני פלסמידים אריזה. הטרנספקציות בוצעו בשיטת BioT15,16 עם יחס של 1.5:1 בין BioT (μl) ל-DNA (μg).

HEK293T/17 תאים נזרעו בצפיפות של 5.3 x 104 תאים/ס"מ2 18-24 שעות לפני הטרנספקציה. בזמן הטרנספקציה, תאים צריכים להגיע למפגש של 80%-95% כדי להימנע מטיטרים בעלי יעילות נמוכה (איור 2B1, משמאל). בתוך 24 שעות מהוספת קוקטייל הפלסמיד, נצפתה רעילות מסוימת, שהגיעה לשיא של 48 שעות (איור 2B2). מאחר שהווקטור הלנטיויראלי SCX מצומד ל-GFP, יש לצפות בביטוי GFP לאחר 48 שעות (איור 2B3). נוכחות של רעילות גבוהה בשילוב עם ביטוי GFP הוא אינדיקטור אמין של transfection מוצלח. נגיף הלנטי נאסף ב-48 שעות וב-72 שעות, ויעילות הטרנסדוקציה הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה וניתוח ביטוי גנים. העוצמה האבסולוטית של תאים חיוביים ל-GFP שימשה כפרוקסי לשילובי SCX, והיא הייתה גבוהה משמעותית בתאים הגבוהים יותר (איור 3A). יעילות ההתמרה, שנמדדה כאחוז תאי SCX-GFP+ , הדגימה אפקט מנה-תגובה בהתבסס על העומס הלנטיוויראלי (איור 3B). ציטומטריית זרימה של iMSCSCX+ במעברים שונים הראתה גם היא יציבות גבוהה, ללא שינויים ברמות ביטוי הטרנסגנים או בשיעור התאים המומרים (איור 3C). בנוסף, לאחר 4 שבועות של תרבית רגילה ללא מיון, iMSCSCX+ שמר על ביטוי יתר יציב של SCX (איור 3D). התמרה בקנה מידה גדול בוצעה על בסיס הטיטר, תוך שימוש ב-75% לנטי-וירוס (איור 2C).

טעינה מכנית של iMSCSCX+
תאי iMSCSCX+ נזרעו על לוחות סיליקון מעוותים בצפיפות תאים של 1.25 x 104 תאים/ס"מ2 (איור 4A,B) כדי לאפשר חיבור תאים לפני תחילת פרוטוקול המתיחה. צפיפות הזריעה הסופית הותאמה כדי למנוע צמיחת יתר חד-שכבתית. ראוי לציין שצפיפויות זריעה גבוהות מדי גרמו להתכווצות מוקדמת של התאים ולמוות מוקדם של תאים (איור 4D). עבור קבוצת הביקורת הסטטית, התאים היו מצופים בלוחות זהים אך מבלי לעבור כל מתיחה. תאי iMSCSCX+ היו נתונים למתיחה בביוריאקטור דו-ממדי למשך שלושה ימים לפחות, עד שבעה ימים, במאמץ חד-צירי של 4% ו-0.5 הרץ במשך שעתיים ביום. משטר מתיחה זה עולה בקנה אחד עם מה שתואר כרלוונטי מבחינה פיזיולוגית9. לאחר מספר ימים של מתיחה, ניתן לראות מידה מסוימת של ארגון התא בהשוואה לקבוצה הסטטית, אשר הציגה ארגון תאים אקראי (איור 4C). צביעת פלואדין של חוטי האקטין מדגישה עוד יותר כיצד נראה שהתאים גדלים בניצב לכיוון המתיחה, בניגוד לארגון התאים האקראי שנצפה בלוחות הסטטיים (איור 4E). כדי לאפיין את ה- iTenocytes החדשים שנוצרו, תאים נאספו תוך שלושה ושבעה ימים לניתוח ביטוי גנים, כפי שדווח בעבר14. ניתוח ביטוי גנים מגלה שתאי iMSCSCX+ הם מכניים, מאחר שיש עלייה משמעותית בגנים הטנוגניים (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX ו-TPPP3)5,7,19,20 בשלושה ובשבעה ימים, בהשוואה רק לתאי iMSC ביום 0 (איור 5A). נוסף על כך, שקיעת הקולגן במדיה לאחר 7 ימים של מתיחות הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת iMSCSCX+ שנמתחה בהשוואה לכל הקבוצות האחרות (איור 5B).

Figure 1
איור 1: אפיון סכמת התמיינות iMSC וציטומטריית זרימה. (A) סכמה כוללת של יצירת iTenocyte וציר זמן עבור אינדוקציה iMSC. הועתק באישור Papalamprou A. et al.14. (B) כימות ציטומטריית זרימה מראה אחוז גבוה של תאים המבטאים סמני פני שטח קלאסיים של MSC עבור MSCs שמקורם ב-iPSC לאחר 6 מעברים לאחר ההתמיינות. הותאם באישור Sheyn D. et al.2. (C) תמונות ניגודיות פאזה של תאים לאחר התמיינות מדגימות מורפולוגיה דמוית פיברובלסט. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכימת ייצור iMSCSCX+ . (A) סכמה כוללת של טרנספקציה באמצעות וקטור לנטיוירוס SCXדור שני וטרנסדוקציה של iMSCs. הועתק באישור Papalamprou A. et al.14. (ב1) HEK293T/17 תאים לפני הוספת קוקטייל פלסמיד. (ב2) תאי HEK293T/17, לאחר 48 שעות, מבטאים GFP ומציגים רעילות. (ב3) ביטוי של GFP שניתן לראות בתאי HEK293T/17 מצביע על טרנספקציה מוצלחת. (C) תאי iMSCSCX+ שנוצרו (עם 75% titer) מבטאים SCX-GFP+ בגרעינים. פסי קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת יעילות ההולכה באמצעות ציטומטריית זרימה וביטוי גנים. העוצמה האבסולוטית של תאים חיוביים ל-GFP שימשה כפרוקסי לשילובי SCX באמצעות ציטומטריית זרימה. טיטרים וקטוריים אומתו על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה עבור כל התאים כדי להעריך MOI לנטיויראלי. (A) פלואורסצנטיות מוחלטת לכל טיטר וירוס. (B) יעילות התמרה מוערכת כאחוז תאי SCX-GFP+ . השפעת מנה-תגובה של עומס לנטיויראלי ביעילות ההולכה נצפתה כאשר תוצאות הזרימה הוצגו כאחוז מתאי GFP+. MOI, ריבוי זיהום, n = 3 טרנסדוקציות עצמאיות. ANOVA חד-כיווני שימש להשוואת טיטרים; הנתונים הם ממוצעים ± SD; *P < 0.05. (C) ציטומטריית זרימה של iMSCSCX+ לאחר מספר סבבי מעבר מצביעה על כך שאין שינוי ברמת ביטוי הטרנסגנים היציב ואין שינוי בשיעור התאים המותמרים. שימו לב שתאי iMSC שהותמרו עם 100% טיטרים הפסיקו להתחלק ב-P3. (D) iMSCs הותמרו עם וקטור לנטיוירוס SCX-GFP+ (75%, MOI = 2.9 e5 TU/mL) והעריכו את ביטוי הגנים של SCX לאחר 4 שבועות של תרבית רגילה ללא מיון. ביטוי SCX היה מווסת באופן משמעותי ב- iMSCSCX+ והראה ביטוי יתר יציב של SCX לאחר 4 שבועות. TU, יחידות טרנסדוקציה; הנתונים הם ממוצעים ± SD, **p > 0.01. הועתק באישור Papalamprou A. et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: iMSCSCX+ שנזרע לתוך ביוריאקטור דו-ממדי ועובר מתיחה מחזורית. (A) סכמת ביוריאקטור דו-ממדית. הועתק באישור Papalamprou A. et al.12. (B) התאים נזרעים תחילה לתוך לוחות סיליקון גמישים ומודגרים בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר התקשרות לפני מתיחה מחזורית בביוריאקטור הדו-ממדי. (C) iMSCSCX+ נמתחו בביוריאקטור דו-ממדי למשך עד 7 ימים. עבור בקרות סטטיות, התאים היו מצופים בלוחות זהים אך ללא מתיחה. (ג1) לוח בקרה סטטי לאחר 7 ימים מציג סידור סטוכסטי של תאים. (ג2) צלחת מתוחה לאחר 7 ימים מראה יחסית יותר ארגון התא. (ד) שלוש דוגמאות למה שאין לראות. כאשר צפיפות זריעת התאים גבוהה מדי או שהתאים נמתחו במשך ימים רבים מדי, התאים מתחילים להתנתק. (ד1) התאים גדלים רק במעט. חיצים צהובים מציינים את תחילתה של התכווצות תאים מוקדמת. (ד2) רמה מתונה של צמיחת יתר. תאים מתחילים להתנתק מהצלחת. (ד3) רמה חמורה של צמיחת יתר. תאים כבר לא גדלים בחד-שכבתיים ויצרו מבנים תלת-ממדיים. פסי קנה מידה שחור = 400 מיקרומטר. פסי קשקשים לבנים = 1000 מיקרומטר. (E) לאחר 7 ימים של מתיחה (או בתרבית עבור הלוח הסטטי), התאים תוקנו עם פלואידין עבור חוטי אקטין (אדום) ומוכתמים נגדית עם DAPI עבור גרעינים (כחול). פסי קנה מידה לבנים = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: גירוי של ביטוי גנים של סמן טנוגני על-ידי ביטוי יתר של Scx ומתיחה חד-צירית בביוריאקטור דו-ממדי. (A) iMSCSCX+ נמתחו בביוריאקטור דו-ממדי במשך 7 ימים. עבור בקרות סטטיות, התאים היו מצופים בלוחות זהים אך ללא מתיחה. ניתוחי ביטוי גנים מגלים כי iMSCSCX+ הוא מכני. ND = אין זיהוי. ANOVA חד-כיווני שימש להשוואת ביטוי גנים בכל נקודת זמן לעומת ד0. N = 8/קבוצה. (B) שקיעת קולגן לאחר 7 ימים של מתיחה בביוריאקטור הדו-ממדי. הנתונים הם ממוצעים ± SD; n = 8/קבוצה; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. הועתק באישור Papalamprou A. et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, iTenocytes נוצרים באמצעות שלושה שלבים עיקריים: (1) אינדוקציה של iPSCs ל- iMSCs, (2) ביטוי יתר של SCX באמצעות וקטור לנטיויראלי, ו- (3) הבשלה של תאים באמצעות מתח חד צירי דו-ממדי.

הפרוטוקול שהוצג להבחנה בין iPSCs ל- iMSCs תואר בעבר על ידי קבוצה2 שלנו. מאז פרסום זה, פותחו פרוטוקולים רבים, כולל פרוטוקול מבוסס לשימוש ב- iMSCs בניסויים קליניים 21,22,23, כמו גם ערכות בידול זמינות מסחרית. סקירה של פוטנציאל הטרי-שושלת של iMSCs נחקרה גם בעבר2. בעוד המתודולוגיות שונות, כל הפרוטוקולים מדגישים את הצורך בהרחבה לאחר בידול של iMSCs עבור מספר מעברים כדי להבטיח ביטוי יציב של סמני פני השטח של MSC. בשלב זה, שימוש ביחס פיצול של 1:3 במפגש של כ-70% יביא להצלחת יחסית תוך 4-6 ימים לאחר המעבר.

בעת בחירת הטיטר האופטימלי להתמרה, חיוני לאזן בין כדאיות התא לבין יעילותו. בעוד שתאי iMSC שהותמרו עם טיטר 100% עשויים להראות את הרמה הגבוהה ביותר של תאים חיוביים SCX-GFP, ראוי לציין שהתאים האלה הפסיקו לחלק שלושה מעברים לאחר ההתמרה (איור 3C), אולי בגלל רעילות הנגרמת על ידי דנ"א. לכן, מומלץ להשתמש titer פחות מ 100%. לפני זריעת לוחות הסיליקון, מומלץ להעריך מחדש את רמות SCX-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה. אם הנתונים מצביעים על כך שהיעילות נמוכה מהסף הרצוי, מומלץ למיין את תאיiMSC SCX+ לפני הזריעה, במיוחד עבור יישומי in vivo .

לאחר שתאי iMSCSCX+ נזרעו בלוחות הסיליקון, יש לדגור עליהם בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי לאפשר חיבור תאים לפני המתיחה. צפיפות התאים המתוארת של 1.25 x 104 תאים/ס"מ2 בלוחות הסיליקון הותאמה כדי למנוע צמיחת יתר של חד-שכבתיות, מה שיכול לתרום למתח סטטי24. בנוסף, מחקרים מצביעים על כך שמגע ישיר בין תאים בתרביות במצעים בעלי קשיחות משתנה יכול לשנות את התנהגות התא 24,25,26. במהלך ניסויי פיילוט נצפתה התנתקות מסוימת של תאים גלויים מלוחות הסיליקון, במיוחד בנקודות זמן מאוחרות יותר (איור 4D). ניתן לייחס זאת להיווצרות גיליונות תאי ECM עקב מפגש יתר24. לכן, פרמטרים קריטיים כוללים צפיפות תאים ומספר התקפי מתיחה. בשיטות הנוכחיות נאספו תאים בימים 3 ו-7 להערכת פוטנציאל טנוגני באמצעות ניתוח ביטוי גנים. עם זאת, מומלץ למתוח תאים בביוריאקטור הדו-ממדי למשך שלושה ימים לפחות, עם ניטור עוקב של לוחות מתוחים וסטטיים כדי למנוע צמיחת יתר וניתוק תאים.

לאחר מספר התקפי מתיחה, ניתן לראות מידה מסוימת של יישור וארגון תאים (איור 4C1,E). זה מתיישב עם מחקרים רבים שבהם יישור תאים בניצב לציר המתח נצפה בתגובה לזן חד צירי במבחנה 24,27. לשם השוואה, הלוח הסטטי מציג ארגון תאים סטוכסטי (איור 4C2,E).

למיטב ידיעתנו, רק מחקרים מעטים בחנו את ההשפעות הסינרגטיות של ביטוי יתר של SCX וגירוי מכני להתמיינות של MSCs לטנוציטים או ליגמנטוציטים 24,28,29. Gaspar et al. השתמשו במערכת ביוריאקטור דו-ממדית דומה לזו שתוארה כאן, אך יישמו רמות גבוהות יותר של מאמץ כולל (10% ב-1 הרץ במשך 12 שעות ביום). באופן מעניין, הם לא הצליחו לזהות שינויים בביטוי של SCX, TNMD ו-COL1a1 ב-BM-MSCs ובטנוציטים אנושיים. עם זאת, ניתן לייחס זאת לזנים המיושמים הגבוהים יותר ששימשו במחקר שלהם24. צ'ן ועמיתיו השתמשו בווקטור לנטיויראלי כדי לבטא יתר על המידה SCX ב-hESC-MSCs שהורכבו ביריעות רב-שכבתיות. הם הפעילו עומס מחזורי חד-צירי (מאמץ של 10% ב-1 הרץ למשך שעתיים ביום למשך עד 21 יום) והבחינו בשיפור הרגולציה של COL1a1, COL1a2, COL14 ו-TNMD, כמו גם שיקוע ECMמוגבר 29. ניקולס ועמיתיו הדביקו באופן זמני C3H10T1/2 תאים עם cDNA Scx באורך מלא של מורין ותרבו את התאים בהידרוג'ל קולגן תלת-ממדי תחת זן מחזורי חד-צירי (1%, 1 הרץ, 30 דקות ליום למשך עד 14 יום). בדומה לממצאים שלנו, הקבוצה שלהם הבחינה בביטוי מוגבר של SCX ו-COL1A1 במבנים מתוחים ומבוטאים יתר על המידה, אך לא מצאה שינוי בביטוי TNMD בתגובה למתיחה מחזורית28.

בנוסף, זה עשוי להיות מסקרן לשקול ביטוי יתר של סמנים אחרים הקשורים לגידים כמו MKX. Tsutsumi et al. חקרו את ההשפעה המשולבת של ביטוי יתר של MKX בתאי C3H10T1/2 וחשיפתם למתיחה מכנית מחזורית במערכת תלת-ממדית. הם הדגימו שיפור משמעותי ברגולציה של SCX, COL1a1, DCN ו-COL3a1, יחד עם יישור צרורות סיבי קולגן וחוטי אקטין30.

חשוב להכיר בכך שלשיטה זו ליצירת iTenocytes יש מגבלות. בעוד שהביוריאקטור הדו-ממדי הזמין מסחרית הוא יתרון לעבודת הוכחת היתכנות, גודלו מגביל את התפוקה. אם תאים אלה נחוצים לבדיקות תפוקה גבוהה או כמקור תאי מדף פוטנציאלי לטיפולים בתיקון גידים, יש לשקול לבחון מערכות המסוגלות ליישם מתיחה חד-צירית בקנה מידה גדול יותר. יתר על כן, חקירות נוספות צריכות להקיף את הרחבת iTenocytes כדי לאשר ביטוי טנוגני יציב, והערכת תרומתם להתחדשות in vivo חיונית להערכת הפוטנציאל הטנוגני שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לכל המחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך חלקית על ידי NIH/NIAMS K01AR071512 ו- CIRM DISC0-14350 לדמיטרי שיין. שני פלסמידים באריזות לנטיוירוס היו מתנה ממעבדת סיימון נוט (המחלקה למדעים ביו-רפואיים, המרכז הרפואי סידרס-סיני).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 205
יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע <em>באמצעות</em> ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter