Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av induserte pluripotente stamcelleavledede iTenocytter via kombinert sklerakse-overekspresjon og 2D uniaxial spenning

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Denne artikkelen beskriver en prosedyre for å produsere iTenocytter ved å generere iPSC-avledede mesenkymale stromale celler med kombinert overekspresjon av Scleraxis ved hjelp av en lentiviral vektor og uniaxial strekking via en 2D-bioreaktor.

Abstract

Dagens utfordringer i sene og ligament reparasjon nødvendiggjør identifisering av en egnet og effektiv kandidat for cellebasert terapi for å fremme sene regenerering. Mesenkymale stromale celler (MSC) har blitt utforsket som en potensiell vevsteknisk strategi for senereparasjon. Mens de er multipotente og har regenerativt potensial in vivo, er de begrenset i sin selvfornyelseskapasitet og utviser fenotypisk heterogenitet. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan omgå disse begrensningene på grunn av deres høye selvfornyelseskapasitet og uovertruffen utviklingsplastisitet. I tenocyttutvikling er Scleraxis (Scx) en avgjørende direkte molekylær regulator av senedifferensiering. I tillegg har mekanoregulering vist seg å være et sentralt element som styrer embryonal seneutvikling og helbredelse. Som sådan har vi utviklet en protokoll for å innkapsle den synergistiske effekten av biologisk og mekanisk stimulering som kan være avgjørende for å generere tenocytter. iPSCs ble indusert til å bli mesenkymale stromale celler (iMSCs) og ble karakterisert med klassiske mesenkymale stromale cellemarkører via flowcytometri. Deretter ble iMSCene ved hjelp av en lentiviralvektor transdusert til stabilt overuttrykkende SCX (iMSCSCX+). Disse iMSCSCX+ -cellene kan modnes videre til iTenocytter via uniaxial strekkbelastning ved hjelp av en 2D-bioreaktor. De resulterende cellene ble karakterisert ved å observere oppregulering av tidlige og sene senemarkører, samt kollagenavsetning. Denne metoden for å generere iTenocytter kan brukes til å hjelpe forskere med å utvikle en potensielt ubegrenset allogen cellekilde for senecelleterapiapplikasjoner.

Introduction

For å takle de moderne problemene i sener og ligamentreparasjon, er det et krav om en relevant cellekandidat som er egnet for cellebaserte terapier. En undersøkelsesvei innen vevsteknikk for senereparasjon innebærer utforskning av benmargsavledede mesenkymale stromale celler (BM-MSC) og fettvevsavledede stromale celler (ASC) som potensielle strategier. Disse cellene har multipotent evne, stor overflod og regenerativt potensial in vivo. I tillegg har de vist forbedret helbredelseskapasitet og forbedrede funksjonelle resultater i dyremodeller1. Ikke desto mindre viser disse cellene begrensede selvfornyelsesevner, fenotypisk mangfold og spesielt begrenset kapasitet for senedannelse. Induced pluripotent stem cell (iPSC) teknologi tilbyr en løsning på disse begrensningene på grunn av sin bemerkelsesverdige selvfornyelseskapasitet og uovertruffen utviklingstilpasningsevne. Vårt forskningsteam og andre har oppnådd vellykket differensiering av iPSCs i mesenkymale stromale cellelignende enheter (iMSCs)2,3. Som sådan har iMSCs potensial til å være en allogen kilde for senecelleterapiapplikasjoner.

Sklerakse (SCX) er en transkripsjonsfaktor som er avgjørende for seneutvikling og regnes som den tidligste påvisbare markøren for differensierte tenocytter. I tillegg aktiverer SCX nedstrøms senedifferensieringsmarkører, inkludert type 1a1-kjedekollagen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) og tenomodulin (TNMD), blant annet 4,5,6. Andre gener uttrykt under senemodning inkluderer tubulinpolymerisasjonsfremmende proteinfamiliemedlem 3 (TPPP3) og blodplateavledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRa)7. Selv om disse genene er essensielle for seneutvikling og modning, er de dessverre ikke unike for senevev og uttrykkes i andre muskel- og skjelettvev som bein eller brusk 5,7.

I tillegg til uttrykk av markører under seneutvikling, er mekanostimering et viktig element for embryonal seneutvikling og helbredelse 4,5,6. Sener er mekanoresponsive, og deres vekstmønstre endres som svar på deres miljø. På molekylært nivå påvirker biomekaniske signaler utvikling, modning, vedlikehold og helbredende responser av tenocytter8. Ulike bioreaktorsystemer har blitt brukt til å modellere fysiologiske belastninger og biomekaniske tegn. Noen av disse modellsystemene inkluderer ex vivo vevsbelastning, 2D-cellelastingssystemer som bruker biaksial eller uniaxial spenning, og 3D-systemer ved bruk av stillaser og hydrogeler 9,10. 2D-systemer er fordelaktige når man studerer den mekaniske stimuleringens effekter på enten senespesifikke gener eller morfologien til cellene i sammenheng med celleskjebne, mens 3D-systemer mer nøyaktig kan replikere celle-ECM-interaksjoner 9,10.

I 2D-lastesystemer er belastningen mellom cellene og kultursubstratet homogen, noe som betyr at den påførte belastningen på cytoskjelettet til cellene kan kontrolleres fullt ut. Sammenlignet med biaksial belastning er uniaxial belastning mer fysiologisk relevant, da tenocytter hovedsakelig utsettes for uniaxial belastning fra kollagenbunter in vivo9. Det er funnet at under daglige aktiviteter blir sener utsatt for uniaxial strekkbelastning opp til 6% belastning11. Spesielt har tidligere studier funnet at belastning innenfor de fysiologiske områdene på 4% -5% har vist seg å fremme tenogen differensiering ved å bevare senerelatert markøruttrykk som SCX og TNMD, samt økt kollagenproduksjon 9,10. Stammer på mer enn 10% kan være traumatisk relevante, men ikke fysiologisk relevante12,13.

Her presenteres en protokoll som tar hensyn til den synergistiske effekten av mekanisk og biologisk stimulering som kan være avgjørende for generering av tenocytter. Vi beskriver først en reproduserbar metode for å indusere iPSCs i iMSCs via kortvarig eksponering av embryoidlegemer til vekstfaktorer, bekreftet av MSC-overflatemarkører ved bruk av flowcytometri. Deretter beskriver vi en lentiviral transduksjonsmetode for å konstruere iMSC-er for å ha stabilt overuttrykk av SCX (iMSCSCX+). For videre cellemodning blir iMSCSCX+ sådd til fibronektinbelagte silikonplater og gjennomgår en optimalisert uniaxial spenningsprotokoll ved bruk av CellScale MCFX-bioreaktor. Det tenogene potensialet ble bekreftet ved å observere oppregulering av tidlige og sene senemarkører, samt kollagenavsetning14. Denne metoden for å generere iTenocytter er et proof-of-concept som kan tilby en ubegrenset hyllevare, allogen kilde for senecelleterapiapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen for å produsere iTenocytter kan utføres i tre hovedtrinn: iPSCs til iMSCs (10 dager), iMSC til iMSCSCX + (2 uker), iMSCSCX + til iTenocytes (minimum 4 dager). Hvert hovedtrinn i protokollen kan settes på pause og startes på nytt senere, avhengig av den eksperimentelle tidslinjen. For metoder som er involvert i dyrking av celler, bør sterile teknikker benyttes. Alle celler i denne protokollen skal dyrkes ved 37 °C, 5% CO2 og 95% fuktighet.

1. Human iPSC-induksjon i induserte mesenkymale stromale celler (iMSCs)

  1. Forberedelse av eksperiment
    1. Forbered Iscoves modifiserte Dulbeccos medium - embryoide legemer (IMDM-EB) medier.
      1. Tillegg av 50 ml IMDM basalmedier med 8,5 ml utslått serumerstatning, 500 μL ikke-essensielle aminosyrer (MEM) uten essensielle medier, 0,385 μL (110 mM stam) beta-merkaptoetanol og 500 μL antibiotika-antimykotisk løsning (AAS) (endelige konsentrasjoner: henholdsvis 17 %, 1 %, 110 μM, 1 %) (se materialtabell).
    2. Forbered Mesenchymal Stromal Cell (MSC) media.
      1. Tillegg 440 ml lav glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 50 ml føtal bovint serum (FBS), 5 ml antibiotika-antimykotisk løsning (AAS) og 5 ml L-glutamin (endelige konsentrasjoner: henholdsvis 10%, 1%, 2 mM).
    3. Forbered poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (poly-HEMA) belagte plater.
      1. Tilsett 10 g poly-HEMA (se materialfortegnelse) til en steril flaske.
      2. Tilsett en magnetisk omrører i flasken, og tilsett sakte 500 ml 95 % EtOH under omrøring.
      3. Når all EtOH er lagt til, slår du på omrøringsmodus ved 1200 o / min med ekstra lav varme i minst 6 timer. Poly-HEMA oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur i opptil et år.
      4. Under sterile forhold, tilsett 2,5 μg/cm2 i 9 ml til en T75-kolbe. Juster volumet i henhold til størrelsen på kulturbeholderen.
      5. Ved å opprettholde steriliteten, la karene lufttørke for at EtOH skal fordampe helt før bruk. Dette tar vanligvis 24-72 timer.
    4. Forbered gelatinbelagte kolber.
      1. Vask en glassflaske med NaOH og dediker den til gelatinpreparatet. Ikke bruk vaskemiddel.
      2. Tilbered 1% gelatinoppløsning (5 g gelatin og 500 ml endotoksinfritt vann). Autoklav glassflasken med gelatinoppløsningen i 30 minutter.
      3. La gelatinløsningen avkjøles, og den kan oppbevares ved romtemperatur.
      4. Belegg en T75-kolbe med 5 ml gelatinoppløsning per kolbe og inkuber i minst 1 time før såceller. Gelatinbelagte kolber kan tilberedes 1 dag i forveien.
    5. Forbered buffer for fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
      1. Bland PBS med 2 % bovint serumalbumin og 0,1 % natriumazid. Oppbevares ved 4 °C.
  2. Generering av embryoide legemer (EB)
    MERK: iPSCs skal dyrkes i en 6-brønns plate og bør nå 70% -80% sammenløp før bruk.
    1. På dag 0, ta med en 384 klarbunnet PCR-plate i vevskulturhette og UV i 15 min uten lokk.
    2. Fjern vekstmediet fra iPSCene (se materialfortegnelse) og vask brønnene med PBS.
    3. Tilsett 0,5 ml forvarmet mildcelledissosiasjonsreagens (se materialfortegnelse) til hver brønn og inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Observer cellene hvert 5. minutt til iPSCene har blitt enkeltceller eller små aggregater løftet i suspensjon.
    4. Resuspendert cellesuspensjonen med en 1 ml pipette for å sikre en enkeltcellesuspensjon.
    5. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Fjern supernatanten, resuspender i IMDM-EB-mediet (trinn 1.1.1), og tell de levedyktige cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller.
    7. Beregne riktig volum cellesuspensjon som kreves for å oppnå 5.000-25.000 celler per brønn av 384-brønnplaten med 25 μL cellesuspensjon per brønn.
      MERK: Generelt kan 2-3 konfluente (70% -80%) brønner på en 6-brønnplate lage EB i en 384-brønnsplate. Størrelsen på celler per EB vil bli bestemt empirisk. For en hel 384-brønnplate må 9,6 ml cellesuspensjon brukes, 25 μL per brønn.
    8. Sentrifuger cellene ned igjen ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
    9. Fjern supernatanten og resuspender cellene i et passende volum IMDM-EB-medier og 10 μM Y-27632-dihydroklorid (stam: 10 mM, 1000x, se materialfortegnelse) i et forkjølt 15 ml konisk rør.
    10. Tilsett kaldløselig kjellermembranmatrise (1 mg per 384-brønnplate verdt EB) til den koniske (se materialfortegnelse).
    11. Fordel 25 μL av cellesuspensjonen til hver brønn. Legg et sterilt lokk på platen og sentrifugering ved 450 x g ved 4 °C i 7 minutter. Inkuber ved 37 °C i 48 timer.
    12. På dag 2, overfør cellene til en 100 mm plate med 3 ml forvarmede IMDM-EB-medier.
    13. Overfør EB-ene til de dedikerte poly-HEMA-belagte T75-kolbene med 10 ml IMDM-EB. Juster volumet i henhold til størrelsen på kulturbeholderen. La EB-ene vokse i 3 dager.
    14. På dag 5, overfør EB-ene til de tilberedte gelatinbelagte T75-kolbene med 10 ml IMDM-EB-medier. Juster volumet i henhold til størrelsen på kulturbeholderen. Dyrk EB-ene i ytterligere 3 dager i suspensjon.
    15. På dag 8, sørg for at to typer EB overholdes: EB-er som er festet til kolben, og ikke-tilknyttede EB-er. Vask ut de ikke-festede EB-ene fra kolben med PBS.
    16. Til de vedlagte EB-ene, legg til IMDM-EB-medier supplert med TGFβ-1 (10 ng / ml) (se materialfortegnelse) og la dem vokse i 2 dager.
    17. På dag 10, bytt medium til MSC medium. Cellene skal mates to ganger i uken. Når du er 70% sammenflytende, fortsett til "Standard løftecelleprotokoll" for å relatere celler. Replate cellene på gelatinbelagte plater.
  3. Standard protokoll for løfteceller
    1. Når de adherente cellene har nådd 70% sammenløp, aspirer vekstmediet fra platene og vask med PBS.
    2. Løft cellene ved å tilsette 5 ml forvarmet 0,25% trypsin til hver 150 mm plate og inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Juster trypsinvolumet i henhold til størrelsen på kulturbeholderen.
    3. Under et mikroskop, sjekk at de fleste cellene er løftet fra hver plate. Hvis det fortsatt er celler festet, banker du forsiktig på sidene av platene for å løsne cellene.
    4. Samle cellene i et konisk rør ved å legge til dobbelt volum av det forvarmede vekstmediet.
    5. Sentrifuger cellene ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten og fortsett til de neste trinnene.
  4. Flowcytometrivurdering for MSC-markøruttrykk
    MERK: Humane MSC-er, som benmargs-MSC, bør brukes som positiv kontroll.
    1. Utfør "Standard løftecelleprotokoll" (trinn 1.3).
    2. Resuspender supernatanten med 3 ml FACS-buffer og overfør hele volumet til FACS-rør.
    3. Sentrifuge ved romtemperatur i 5 min ved 300 x g. Gjenta vasketrinnet med FACS-buffer to ganger til.
    4. Til fargede rør, tilsett 2 μL mus antihuman CD90-FITC, mus antihuman CD44-APC og antihuman CD105-PE (se materialfortegnelse) og inkuber i 45 minutter ved 4 ° C.
    5. Til isotypekontrollrørene, tilsett 20 μL mus IgG2a-FITC, mus IgG1-PB og mus IgG1-PE (se materialfortegnelse).
    6. Rug i mørket ved 4 °C i 15 minutter. Vask alle rørene ved å tilsette 3 ml FACS-buffer og sentrifugere i 5 minutter ved 300 x g (ved romtemperatur). Resuspender cellene i 250 μL FACS-buffer for hvert rør.
    7. Analysere ekspresjonen av MSCs overflatemarkører ved hjelp av flowcytometri14. Eksitasjons- og utslippsbølgelengder skal være: CD90-FITC, eksitasjonstopp ved 495 nm og utslippstopp ved 519 nm; CD44-APC, eksitasjonstopp ved 640 og utslippstopp ved 660 nm; CD105-PE, eksitasjonstopp ved 561 nm og utslippstopp ved 574 nm.

2. iMSC passasje og utvidelse

  1. Forbereder reagenser
    1. Forbered MSC frysemedier.
      1. Kombiner 30 ml DMEM med lav glukose, 5 ml DMSO og 15 ml FBS (endelige konsentrasjoner: henholdsvis 60%, 10%, 30%).
      2. Filtrer løsningen med et sterilt 0,45 μm filter. Oppbevares ved 4 °C.
  2. Pasninger
    MERK: Etter induksjon må iMSC dyrkes på gelatinbelagte plater i ytterligere 2 passasjer før de avvennes til å vokse på plastvevskulturplater. I tillegg bør celler passeres med et 1: 3 delt forhold når 70% sammenflytende.
    1. Utfør "Standard løftecelleprotokoll" (trinn 1.3).
    2. Resuspender cellene i MSC-medier, og fordel cellene likt i tre nye 150 mm plater med T175-kolber med 20 ml media per kolbe. Sett cellene tilbake til 37 °C.
    3. Fôr cellene to ganger i uken ved å erstatte vekstmediet med forvarmede MSC-medier.
  3. Fryser
    1. Utfør "Standard løftecelleprotokoll".
    2. Bryt cellene i 1 ml MSC frysemedier. Tilsett 1 ml cellesuspensjon til en kryovial og oppbevar i en frysebeholder i 24 timer ved -80 °C før overføring til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
  4. Tining
    1. Klargjør 10 ml forvarmede MSC-medier i et 15 ml konisk rør.
    2. Hent kryovialet, dypp det i et vannbad på 37 °C og virvle til det gjenstår en isball på størrelse med en ert (ca. 1-2 min).
    3. I cellekulturhetten tilsettes sakte 1 ml av det forvarmede mediet til kryovialet og pipetten opp og ned for å blande.
    4. Overfør cellesuspensjonen fra kryovialen til det tilberedte 15 ml koniske røret med forvarmet medium, og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g (ved romtemperatur).
    5. Fjern supernatanten og sett den i oppløsning med nye medier. Legg celleopphenget til en 150 mm plate med et totalt volum på 20 ml. Juster volumet i henhold til størrelsen på kulturkolben.
    6. Inkuber cellene ved 37 °C til de er klare til å deles.

3. Genteknologi av iMSC for å overuttrykke SCX ved hjelp av lentiviral transduksjon

MERK: Denne delen av protokollen tar to uker å fullføre.

  1. Fremstilling av media og reagenser
    1. Forbered HEK293T/17 cellemedier.
      1. Tillegg 445 ml av Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml FBS og 5 ml AAS (endelige konsentrasjoner: 10%, henholdsvis).
    2. Klargjør MSC lenti-pakking medier.
      1. Forbered det varmeinaktiverte serumet ved å varme opp 50 ml romtemperatur FBS i et 60 °C vannbad i 30 minutter.
      2. Kombiner 445 ml DMEM med lav glukose med varmeinaktivert FBS og 5 ml L-glutamin (endelige konsentrasjoner: henholdsvis 10%, 2 mM.)
    3. Forbered transfeksjonskompleks.
      1. La transfeksjonskomplekse komponenter (se materialfortegnelse) tine på is: emballasjeplasmidene VSV-G og Delta, SCX-plasmid og BioT15,16.
      2. Virvel forsiktig og spinn ned plasmidene. Mål DNA-konsentrasjonene.
      3. Basert på DNA-konsentrasjonene og antall kolber beregnet for transfeksjon, beregne volumet av hver komponent som trengs: for en T75-kolbe vil transfeksjonskomplekset bestå av 750 μL serumfritt medium (som serumfritt DMEM eller PBS), 7,5 μg SCX-plasmid, 0,75 μg VSV-G-plasmid, 6,75 μg deltaplasmid og 22,5 μL BioT. Vurder ekstra for pipetteringsfeil.
      4. Bland ved å pipettere forsiktig opp og ned. Spinn kort i en sentrifuge. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter og bruk umiddelbart.
  2. Transfeksjon og lentiviral produksjon
    FORSIKTIG: Fra og med dag 3 innebærer protokollen arbeid med lentivirus, og arbeidet må derfor utføres ved bruk av inneslutningsnivå 2+ operasjonelle prosedyrer. Arbeidere må bruke personlig verneutstyr, inkludert to lag hansker, håndleddsbelegg, vernebriller, en maske og lange bukser og lukkede sko. Alt avfall og materialer, inkludert pipettespisser, kolber og flytende medium, må dekontamineres med blekemiddel (endelig 1 % natriumhypokloritt) i minst 20 minutter. Ikke bruk vakuumet.
    1. Frø HEK293T/17 celler.
      1. Omtrent 18-24 timer før transfeksjon (dag 0), løft og plate 293T-cellene i T75-kolber. Følgende bind forutsetter T75 som kulturfartøy. Juster volumet i henhold til cellekulturbeholderen som brukes.
      2. Fjern kulturmediet fra kolbene og vask med 5 ml PBS.
        MERK: Cellene løfter veldig lett fra overflaten av kolben. Legg PBS til siden av kolben og unngå direkte tilsetning av løsning til cellene.
      3. Tilsett 3 ml forvarmet 0,25 % trypsin i hver kolbe og inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Samle cellene i et konisk rør og sentrifuge ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 x g.
      4. Fjern supernatanten, resuspender i 293T-medier, og tell de levedyktige cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller.
      5. Plate cellene ved 5,3 x 104 celler/cm2 og inkuber ved 37 °C over natten.
      6. Neste dag (dag 1), klargjør transfeksjonskomplekset. Erstatt vekstmediet fra cellene med 5 ml forvarmet MSC lenti-emballasjemedium (trinn 3.1.2).
      7. Legg transfeksjonskomplekset dråpevis til cellene. Vipp fatet forsiktig for å sikre jevn eksponering av transfeksjonskomplekset til cellene. Returner cellene til inkubatoren i 48 timer.
        MERK: Toksisitet bør observeres etter 24 timer (dag 2).
      8. Etter 48 timer (dag 3) samles det virusholdige mediet forsiktig i et separat konisk rør ved hjelp av en pipette og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g (ved romtemperatur).
      9. Tilsett 5 ml forvarmet MSC lenti-pakkemedium til T75-kolben med 293T-celler og returner til inkubatoren over natten.
      10. Etter sentrifugering filtreres supernatanten med et 0,45 μm sterilt filter ved å pipettere supernatanten direkte gjennom filteret. Oppbevar det virusholdige mediet ved 4 °C over natten.
      11. Etter ytterligere 24 timer (dag 4), oppsamles igjen det virusholdige mediet forsiktig i et separat konisk rør ved hjelp av en pipette og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g (ved romtemperatur).
      12. Kombiner viruset med forrige innsamlingsdag virus og bland for å sikre en homogen løsning. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause og startes på nytt senere, avhengig av den eksperimentelle tidslinjen. Lentiviruset kan alisiteres og fryses ved -80 °C, eller lentiviruset kan lagres på is mens man fortsetter med "Transduksjon av iMSC med SCX" (trinn 3.3).
        MERK: Når lentivirusalikotene er frosset og tint, må du ikke fryse på nytt.
  3. Transduksjon av iMSC med SCX
    1. Utfør titerplatetransduksjon.
      1. På dag 0, utfør "Standard løftecelleprotokoll".
      2. Resuspender cellene i MSC-medier og tell de levedyktige cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller.
      3. I en 6-brønns plate, tilsett 4 x 103 celler / cm2. Sett de resterende på nytt i en ekstra 150 mm plate med 20 ml MSC-medier (dette vil være kontrollplaten). Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C.
      4. Neste dag (dag 1) skal cellene være ~ 40% sammenflytende. Forvarm vekstmediet for lenti-emballasje og tine polybren og ca. 3 ml lentivirus på is (eller, hvis det gjøres på samme dag som virusoppsamling, oppbevares på is til bruk).
      5. Tilsett vekstmedium for lenti-emballasje og lentivirus til brønnene basert på ønskede titere (dvs. 12,5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %). Tilsett 0,5 μL polybren for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml (stamkonsentrasjon: 10 mg/ml, se materialliste).
      6. Virvle platen rundt for å sikre jevn eksponering for alle cellene. Sett platen tilbake i inkubatoren ved 37 °C i 48 timer.
    2. Vurder effektiviteten til SCX lentivirustiter med flowcytometri.
      1. Etter 48 timer, utfør "Standard løftecelleprotokoll".
      2. Resuspendere cellene i PBS og telle levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer eller celleteller. Sentrifuger cellene ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 x g.
      3. Fjern supernatanten og reaktiver den i 3 ml FACS-buffer for vask. Overfør cellesuspensjonen til flowcytometrirør og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
      4. Gjenta FACS-buffervasken to ganger til og resuspender de endelige cellepelletsene i 300 μL FACS-buffer. Vurdere uttrykket av GFP for hver titer ved hjelp av en flowcytometrimaskin.
      5. Basert på titere og celle levedyktighet, bestemme passende lentivirus titer for å fortsette med transduksjonen. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause og startes på nytt senere, avhengig av den eksperimentelle tidslinjen.
    3. Utfør storskala SCX-transduksjon.
      MERK: De listede volumene er per 1x 150 mm plate eller 1x T175 kolbe. Dette kan justeres tilsvarende avhengig av ønsket fartøystørrelse og transduksjonsskala.
      1. På dag 0, utfør "Standard løftecelleprotokoll".
      2. Resuspender cellene i MSC-medier og tell de levedyktige cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller. Frø cellene ved 4 x 103 celler/cm2. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C.
      3. Neste dag (dag 1) skal cellene være ~ 40% sammenflytende. Forvarm vekstmediet for lenti-emballasje og tine polybren og forhåndsberegnet mengde lentivirus på is.
      4. Basert på den bestemte titeren, tilsett ønsket mengde lenti-packaging vekstmedium og lentivirus til brønnene. Tilsett 5 μg/ml polybren (stamkonsentrasjon: 10 mg/ml).
      5. På dag 3, observer cellene under et fluorescerende mikroskop. Den nyproduserte iMSCSCX+ skal fluorescere GFP. Erstatt det virusholdige mediet med forhåndsoppvarmede MSC-medier. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause og startes på nytt senere, avhengig av den eksperimentelle tidslinjen.

4. iMSCSCX+ -pass og utvidelse

  1. Utfør passering, utvidelse, frysing og tining av iMSCSCX+ ved å følge det samme som for iMSC-er, som beskrevet i trinn 2 i protokollen.

5. Mekanisk belastning

MERK: Denne delen tar minst 4 dager, men kan være lengre avhengig av om cellekontraksjon observeres.

  1. Forberedelse av eksperiment
    1. Forbered silikonplatene.
      1. Autoklav 2 silikonplater (se Materialfortegnelse). Etterpå, under sterile forhold, fjern silikonplatene fra autoklavposen og legg dem i 150 mm plater.
      2. Kombiner 130 μL fibronektin (100x, se materialtabell) med 13 ml steril PBS i et 15 ml konisk rør. Snu røret flere ganger for å blande.
      3. Tilsett 400 μL fibronektinoppløsning til hver brønn på silikonplatene. Inkuber platene ved 37 °C i minimum 2 timer eller over natten.
      4. Før bruk, aspirer fibronektinoppløsningen og la platene lufttørke i cellekulturhetten i minst 30 minutter for å la fibronektinoppløsningen fordampe helt.
        MERK: Fibronektinoppløsningen kan fjernes fra brønnene på forhånd, og de nå belagte platene kan sitte ved 37 ° C i opptil et par uker til bruk.
    2. Forbered MSC-strekkmediet.
      1. Klargjør MSC strekkmedier ved å tilsette 140 mikrol askorbinsyre (lager: 100x, endelig konsentrasjon: 50 μg/ml) til 14 ml forvarmede MSC-medier i et 15 ml konisk rør.
        MERK: Askorbinsyren må tilsettes MSC-mediet før hvert medieskifte.
  2. Såing av iMSCSCX+ i silikonplatene
    1. Utfør "Standard løftecelleprotokoll" (trinn 1.3).
    2. Resuspender cellene i MSC-medier og tell de levedyktige cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller.
    3. Beregn volumet av cellesuspensjon som trengs for å oppnå 1,25 x 104 celler/cm2.
    4. Fjern dette volumet av MSC strekkmedier fra det 15 ml koniske røret. Legg til i målcellene. Inverter til homogen den nye cellesuspensjonen.
    5. Tilsett 400 μL av den nye cellesuspensjonen til hver brønn i begge silikonplatene.
    6. Sett lokket tilbake på 150 mm platene og sett dem tilbake til inkubatoren ved 37 °C i 24 timer.
  3. Uniaxial spenning
    1. Neste dag, skyll strekkapparatet (se materialtabell) med ddH2O etterfulgt av 70% etanol. Tørk av apparatet, plasser det i cellekulturhetten og UV i 15 minutter.
    2. Hent de sådde platene og sjekk brønnene for god cellefeste.
    3. La en plate ligge i inkubatoren (statisk kontroll) og plasser den andrefrøede silikonplaten i strekkapparatet ved å justere skruene med hullene i silikonplaten. Sett på lokket på apparatet for å sikre sterilitet.
    4. Fest apparatet med den sådde silikonplaten til den elektroniske kilden (se materialfortegnelse) og plasser den i inkubatoren ved 37 °C.
    5. Sett den sykliske strekkeprotokollen på programmet til 4% sinusformet belastning, 0,5 Hz, 2 timer per dag. Begynn strekningen ved å trykke én gang på startknappen . Stretching bør begynne umiddelbart.
    6. Strekk cellene i minst 3 dager. Overvåk cellene daglig og stopp strekkprotokollen hvis cellekontraksjon kan observeres. Bytt media til ferske MSC-strekkmedier annenhver dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Human iPSCs differensiering til iMSCs
Som tidligere beskrevet innebærer den nåværende protokollen for differensiering av iPSCs til iMSCs dannelsen av embryoidlegemer2. Denne prosessen tar omtrent ti dager å indusere iMSC fra iPSCs (figur 1A). Det anbefales imidlertid sterkt å passere de nylig genererte iMSCene minst to ganger. Dette bidrar ikke bare til å eliminere behovet for gelatinbelagte plater, men etablerer også et stabilt MSC-uttrykk. Kvantifisering av flowcytometri, utført etter seks passeringer etter differensiering, viser en nesten ren cellepopulasjon med høyt uttrykk av klassiske MSC-overflatemarkører, inkludert CD44 (83,1 %), CD90 (88,4 %) og CD105 (99,2 %)17,18 (figur 1B). Når det gjelder morfologi, bør iMSC ligne på benmargs-MSC, og virke langstrakt og fibroblastlignende (figur 1C).

Genmanipulering av iMSC for å overuttrykke SCX ved hjelp av lentiviral transduksjon
Lentivirus ble produsert ved å transfektere HEK293T/17-celler med pLenti-C-mGFP-vektoren, hvor SCXB er satt inn for å uttrykke SCX-GFP +, sammen med to emballasjeplasmider. Transfeksjoner ble utført ved bruk av BioT-metoden15,16 med et 1,5:1-forhold mellom BioT (μl) og DNA (μg).

HEK293T/17 celler ble sådd med en tetthet på 5,3 x 104 celler/cm2 18-24 timer før transfeksjon. På transfeksjonstidspunktet bør cellene nå 80% -95% sammenløp for å unngå titere med lav effektivitet (figur 2B1, venstre). Innen 24 timer etter tilsetning av plasmidcocktailen ble det observert noe toksisitet, som toppet seg ved 48 timer (figur 2B2). Siden SCX lentiviralvektoren er GFP-konjugert, bør GFP-uttrykk kunne observeres etter 48 timer (figur 2B3). Tilstedeværelsen av høy toksisitet kombinert med GFP-uttrykk er en pålitelig indikator for vellykket transfeksjon. Lentiviruset ble samlet ved 48 timer og 72 timer, og transduksjonseffektiviteten ble vurdert ved hjelp av flowcytometri og genekspresjonsanalyse. Den absolutte intensiteten av GFP-positive celler ble brukt som en proxy for SCX-integrasjoner, og den var signifikant høyere i de høyere titerne (figur 3A). Transduksjonseffektiviteten, målt som prosentandel av SCX-GFP+ -celler, viste en dose-respons-effekt basert på lentiviral belastning (figur 3B). Flowcytometri av iMSCSCX+ ved ulike passasjer viste også høy stabilitet, uten endringer i transgenekspresjonsnivåer eller andel transduserte celler (figur 3C). I tillegg, etter 4 uker med vanlig kultur uten sortering, opprettholdt iMSCSCX + stabilt overuttrykk av SCX (figur 3D). Storskala transduksjon ble utført basert på titer, med 75 % lentivirus (figur 2C).

Mekanisk lasting av iMSCSCX+
iMSCSCX+-cellene ble sådd på deformerbare silikonplater med en celletetthet på 1,25 x 104 celler/cm2 (figur 4A,B) for å tillate cellefeste før strekkprotokollen ble startet. Den endelige såtettheten ble optimalisert for å forhindre gjengroing av monolag. Det er verdt å merke seg at for høy såtetthet resulterte i for tidlig cellekontraksjon og tidlig celledød (figur 4D). For den statiske kontrollgruppen ble celler belagt med identiske plater, men uten å gjennomgå noen strekking. iMSCSCX+-cellene ble utsatt for strekking i en 2D-bioreaktor i minst tre dager, opptil syv dager, ved 4 % uniaxial belastning og 0,5 Hz i 2 timer per dag. Dette tøyningsregimet er forenlig med det som er beskrevet som fysiologisk relevant9. Etter flere dager med strekking kan en viss grad av celleorganisering observeres sammenlignet med den statiske gruppen, som viste tilfeldig celleorganisasjon (figur 4C). Falloidinfarging av aktinfilamentene fremhever videre hvordan cellene ser ut til å vokse vinkelrett på strekkretningen, i motsetning til den tilfeldige celleorganisasjonen observert i de statiske platene (figur 4E). For å karakterisere de nylig genererte iTenocytter ble celler samlet på tre og syv dager for genuttrykksanalyse, som tidligere rapportert14. Genekspresjonsanalyse viser at iMSCSCX+-cellene er mekanoresponsive, da det er en signifikant oppregulering i tenogene gener (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX og TPPP3)5,7,19,20 på både tre og syv dager, sammenlignet med bare iMSCene på dag 0 (figur 5A). I tillegg var kollagenavsetning i media etter 7 dagers strekking signifikant høyere i iMSCSCX+-strukket gruppe sammenlignet med alle andre grupper (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: iMSC differensieringsskjematisk og flowcytometri karakterisering. (A) Overordnet skjematisk fremstilling av iTenocyttgenerering og tidslinje for iMSC-induksjon. Gjengitt med tillatelse fra Papalamprou A. et al.14. (B) Flowcytometrikvantifisering viser en høy prosentandel av celler som uttrykker klassiske MSC-overflatemarkører for iPSC-avledede MSC etter 6 passasjer etter differensiering. Bearbeidet med tillatelse fra Sheyn D. et al.2. (C) Fasekontrastbilder av celler etter differensiering viser fibroblastlignende morfologi. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: iMSCSCX+ produksjonsskjematisk. (A) Samlet skjematisk oversikt over transfeksjon ved bruk av 2. generasjons SCX lentivirusvektor og transduksjon av iMSCs. Gjengitt med tillatelse fra Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 celler før tilsetning av plasmidcocktail. (B2) HEK293T/17-celler, etter 48 timer, uttrykker GFP og viser toksisitet. (B3) Ekspresjon av GFP som kan observeres i HEK293T/17 celler indikerer vellykket transfeksjon. (C) Genererte iMSCSCX+ -celler (med 75 % titer) uttrykker SCX-GFP+ i kjernene. Skala barer = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse av transduksjonseffektivitet med flowcytometri og genuttrykk. Den absolutte intensiteten av GFP-positive celler ble brukt som proxy for SCX-integrasjoner ved bruk av flowcytometri. Vektortitere ble validert ved flowcytometrianalyse for alle celler for å vurdere lentiviral MOI. (A) Absolutt fluorescens per virustiter. (B) Transduksjonseffektivitet evaluert som prosentandelen av SCX-GFP + celler. En dose-respons-effekt av lentiviral belastning i transduksjonseffektivitet ble observert når strømningsresultater ble presentert som en prosentandel av GFP+-celler. MOI, mangfold av infeksjon, n = 3 uavhengige transduksjoner. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne titer; data er gjennomsnittlige ± SD; *p < 0,05. (C) Flowcytometri av iMSCSCX+ etter flere runder med passering indikerer ingen endring i nivået av stabilt transgenuttrykk og ingen endring i andelen transducerte celler. Merk at iMSC-er transdusert med 100 % titere sluttet å dele på P3. (D) iMSC transducerte med SCX-GFP + lentivirus vektor (75%, MOI = 2,9 e5 TU / ml) og vurderte genuttrykket av SCX ved 4 ukers vanlig kultur uten sortering. SCX-uttrykk ble signifikant oppregulert i iMSCSCX+ som viste stabilt overuttrykk av SCX etter 4 uker. TU, transduksjonsenheter; data er gjennomsnitt ± SD, **p > 0,01. Gjengitt med tillatelse fra Papalamprou A. et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: iMSCSCX + sådd i en 2D bioreaktor og gjennomgår syklisk strekking. (A) 2D bioreaktor skjematisk. Gjengitt med tillatelse fra Papalamprou A. et al.12. (B) Celler blir først sådd til fleksible silikonplater og inkuberes ved 37 ° C for å tillate festing før syklisk strekking i 2D-bioreaktoren. (C) iMSCSCX+ ble strukket i en 2D bioreaktor i opptil 7 dager. For statiske kontroller ble celler belagt i identiske plater, men uten strekking. (C1) Statisk kontrollplate etter 7 dager viser stokastisk arrangement av celler. (C2) Strukket plate etter 7 dager viser relativt mer celleorganisasjon. (D) Tre eksempler på hva som ikke skal overholdes. Når cellenes såtetthet er for høy eller cellene har blitt strukket i for mange dager, begynner cellene å løsne. (D1) Cellene er bare litt overgrodde. Gule piler indikerer begynnelsen på for tidlig cellekontraksjon. (D2) Moderat nivå av gjengroing. Celler begynner å løsne fra platen. (D3) Alvorlig nivå av gjengroing. Celler vokser ikke lenger i monolag og har dannet 3D-strukturer. Svarte skalastenger = 400 μm. Hvite skalastenger = 1000 μm. (E) Etter 7 dagers strekking (eller i kultur for den statiske platen) ble celler fiksert med falloidin for aktinfilamenter (rød) og motfarget med DAPI for kjerner (blå). Hvite skala barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Stimulering av tenogent markørgenuttrykk ved Scx-overekspresjon og uniaxial strekk i en 2D-bioreaktor. (A) iMSCSCX+ ble strukket i en 2D-bioreaktor i 7 dager. For statiske kontroller ble celler belagt i identiske plater, men uten strekking. Genekspresjonsanalyser viser at iMSCSCX+ er mekanoresponsiv. ND = ingen deteksjon. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne genuttrykk ved hvert tidspunkt vs. d0. N = 8/gruppe. (B) Kollagenavsetning etter 7 dagers strekk i 2D-bioreaktoren. Data er gjennomsnittlige ± SD; n = 8/gruppe; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Gjengitt med tillatelse fra Papalamprou A. et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen genereres iTenocytter gjennom tre hovedtrinn: (1) induksjon av iPSCs til iMSCs, (2) overekspresjon av SCX ved hjelp av en lentiviral vektor, og (3) modning av celler gjennom 2D uniaxial spenning.

Protokollen som presenteres for å differensiere iPSCer til iMSC-er er tidligere beskrevet av vår gruppe2. Siden den publikasjonen har mange protokoller blitt utviklet, inkludert en etablert protokoll for bruk av iMSC i kliniske studier 21,22,23, samt kommersielt tilgjengelige differensieringssett. En gjennomgang av trilineagepotensialet til iMSC har også blitt undersøkt tidligere2. Selv om metodene er forskjellige, understreker alle protokollene behovet for utvidelse av iMSC etter differensiering for flere passasjer for å sikre stabilt uttrykk for MSC-overflatemarkører. På dette stadiet vil bruk av et 1:3 delingsforhold ved ca. 70 % samløp resultere i en relativt sammenflytende plate innen 4-6 dager etter passering.

Når du velger den optimale titeren for transduksjon, er det avgjørende å finne en balanse mellom cellenes levedyktighet og effektivitet. Mens iMSCs transducert med 100% titer kan vise det høyeste nivået av SCX-GFP positive celler, er det verdt å merke seg at disse cellene sluttet å dele tre passasjer etter transduksjon (figur 3C), muligens på grunn av DNA-indusert toksisitet. Derfor anbefales det å bruke en titer mindre enn 100%. Før silikonplatene sees, anbefales det å revurdere SCX-GFP-nivåene ved hjelp av flowcytometri. Hvis dataene indikerer at effektiviteten er under ønsket terskel, anbefales det å sortere iMSCSCX+ -cellene før såing, spesielt for in vivo-applikasjoner .

Når iMSCSCX+-cellene har blitt sådd i silikonplatene, må de inkuberes ved 37 °C over natten for å tillate cellefeste før de strekker seg. Den beskrevne celletettheten på 1,25 x 104 celler/cm2 i silikonplatene ble optimalisert for å forhindre overvekst av monolag, noe som kan bidra til statisk spenning24. I tillegg tyder studier på at direkte celle-til-celle-kontakt i konfluente kulturer i substrater med varierende stivhet kan endre celleadferd 24,25,26. Under pilotforsøk ble det observert noe synlig celleløsrivelse fra silikonplatene, spesielt på senere tidspunkter (figur 4D). Dette kan tilskrives dannelsen av ECM-celleark på grunn av overkonfluens24. Derfor inkluderer kritiske parametere celletetthet og antall strekkkamper. I de nåværende metodene ble celler samlet på dag 3 og 7 for vurdering av tenogent potensial via genuttrykksanalyse. Det anbefales imidlertid at celler strekkes i 2D-bioreaktoren i minst tre dager, med påfølgende overvåking av strukkede og statiske plater for å forhindre gjengroing og celleløsrivelse.

Etter flere strekkanfall kan man observere en viss grad av cellejustering og organisering (figur 4C1,E). Dette stemmer overens med mange studier hvor cellejustering vinkelrett på stammeaksen observeres som respons på uniaxial stamme in vitro24,27. Til sammenligning viser den statiske platen stokastisk celleorganisasjon (figur 4C2, E).

Så vidt vi vet, har bare noen få studier undersøkt de synergistiske effektene av SCX-overekspresjon og mekanisk stimulering for differensiering av MSC i tenocytter eller ligamentocytter 24,28,29. Gaspar et al. benyttet et lignende 2D bioreaktorsystem som det som er beskrevet her, men brukte høyere nivåer av total belastning (10% ved 1 Hz i 12 timer / dag). Interessant nok var de ikke i stand til å oppdage endringer i uttrykket av SCX, TNMD og COL1a1 i BM-MSC og menneskelige tenocytter. Dette kan imidlertid tilskrives de høyere anvendte stammene som ble brukt i studien24. Chen et al. brukte en lentiviral vektor for å overuttrykke SCX i hESC-MSC samlet i flerlags ark. De påførte uniaxial syklisk belastning (10% belastning ved 1 Hz i 2 timer / dag i opptil 21 dager) og observerte oppregulering av COL1a1, COL1a2, COL14 og TNMD, samt økt ECM-avsetning29. Nichols et al. transfektet forbigående C3H10T1/2 celler med full lengde murine Scx cDNA og dyrket cellene i 3D kollagenhydrogeler under uniaxial syklisk belastning (1%, 1 Hz, 30 min / dag i opptil 14 dager). I likhet med våre funn observerte deres gruppe forhøyet uttrykk av SCX og COL1A1 i de anstrengte og overuttrykte konstruksjonene, men fant ingen endring i TNMD-uttrykk som respons på syklisk strekking28.

I tillegg kan det være spennende å vurdere overuttrykket til andre senerelaterte markører som MKX. Tsutsumi et al. utforsket den kombinerte effekten av å overuttrykke MKX i C3H10T1/2-celler og utsette dem for syklisk mekanisk strekking i et 3D-system. De demonstrerte en betydelig oppregulering av SCX, COL1a1, DCN og COL3a1, sammen med justering av kollagenfibrillerunter og aktinfilamenter30.

Det er viktig å erkjenne at denne metoden for å generere iTenocytter har sine begrensninger. Mens den kommersielt tilgjengelige 2D-bioreaktoren er fordelaktig for proof-of-concept-arbeid, begrenser størrelsen utbyttet. Hvis disse cellene er nødvendige for analyser med høy gjennomstrømning eller som en potensiell hyllecellekilde for senereparasjonsterapier, bør det vurderes å utforske systemer som er i stand til å implementere uniaxial strekking i større skala. Videre bør videre undersøkelser omfatte utvidelse av iTenocytter for å bekrefte stabilt tenogent uttrykk, og vurdering av deres bidrag til in vivo regenerering er avgjørende for å evaluere deres tenogene potensial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Denne studien ble delvis støttet av NIH/NIAMS K01AR071512 og CIRM DISC0-14350 til Dmitriy Sheyn. De to lentivirusemballasjeplasmidene var en gave fra Simon Knott-laboratoriet (Institutt for biomedisinsk vitenskap, Cedars-Sinai Medical Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

Bioteknologi utgave 205
Generering av induserte pluripotente stamcelleavledede iTenocytter <em>via</em> kombinert sklerakse-overekspresjon og 2D uniaxial spenning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter