Summary
Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.
Abstract
Los desafíos actuales en la reparación de tendones y ligamentos requieren la identificación de un candidato adecuado y eficaz para la terapia basada en células para promover la regeneración de los tendones. Las células estromales mesenquimales (MSC) se han explorado como una posible estrategia de ingeniería de tejidos para la reparación de tendones. Si bien son multipotentes y tienen potencial regenerativo in vivo, están limitados en su capacidad de autorrenovación y exhiben heterogeneidad fenotípica. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden eludir estas limitaciones debido a su alta capacidad de autorrenovación y a su plasticidad de desarrollo sin precedentes. En el desarrollo de los tenocitos, la escleraxis (Scx) es un regulador molecular directo crucial de la diferenciación de los tendones. Además, se ha demostrado que la mecanorregulación es un elemento central que guía el desarrollo y la curación de los tendones embrionarios. Como tal, hemos desarrollado un protocolo para encapsular el efecto sinérgico de la estimulación biológica y mecánica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. Las iPSC fueron inducidas a convertirse en células estromales mesenquimales (iMSC) y se caracterizaron con marcadores clásicos de células estromales mesenquimales mediante citometría de flujo. A continuación, utilizando un vector lentiviral, las iMSCs se transducieron a una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Estas célulasiMSC SCX+ pueden madurar aún más en iTenocitos mediante carga de tracción uniaxial utilizando un biorreactor 2D. Las células resultantes se caracterizaron por la observación de la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno. Este método de generación de iTenocitos se puede utilizar para ayudar a los investigadores a desarrollar una fuente celular alogénica potencialmente ilimitada para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
Introduction
Para hacer frente a los problemas contemporáneos en la reparación de tendones y ligamentos, se requiere una célula candidata pertinente adecuada para las terapias basadas en células. Una vía de investigación en ingeniería de tejidos para la reparación de tendones implica la exploración de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) y células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como posibles estrategias. Estas células tienen capacidad multipotente, gran abundancia y potencial regenerativo in vivo. Además, han demostrado una mayor capacidad de curación y mejores resultados funcionales en modelos animales1. No obstante, estas células exhiben capacidades restringidas de autorrenovación, diversidad fenotípica y, en particular, una capacidad limitada para la formación de tendones. La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ofrece una solución a estas limitaciones debido a su notable capacidad de autorrenovación y a su inigualable adaptabilidad al desarrollo. Nuestro equipo de investigación y otros han logrado una diferenciación exitosa de las iPSC en entidades similares a las células estromales mesenquimales (iMSCs)2,3. Como tal, las iMSC tienen el potencial de ser una fuente alogénica para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
La escleraxis (SCX) es un factor de transcripción esencial para el desarrollo de los tendones y se considera el marcador detectable más temprano para los tenocitos diferenciados. Además, SCX activa marcadores de diferenciación tendinosa aguas abajo, incluyendo el colágeno de cadena tipo 1a1 1 (COL1a1), mohawk (MKX) y tenomodulina (TNMD), entre otros 4,5,6. Otros genes expresados durante la maduración del tendón incluyen el miembro 3 de la familia de proteínas promotoras de la polimerización de la tubulina (TPPP3) y el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa)7. Si bien estos genes son esenciales para el desarrollo y la maduración de los tendones, desafortunadamente no son exclusivos del tejido tendinoso y se expresan en otros tejidos musculoesqueléticos como el hueso o el cartílago 5,7.
Además de la expresión de marcadores durante el desarrollo del tendón, la mecanoestimulación es un elemento esencial para el desarrollo y la cicatrización del tendón embrionario 4,5,6. Los tendones son mecanosensibles y sus patrones de crecimiento cambian en respuesta a su entorno. A nivel molecular, las señales biomecánicas afectan el desarrollo, la maduración, el mantenimiento y las respuestas de curación de los tenocitos8. Se han utilizado varios sistemas de biorreactores para modelar cargas fisiológicas y señales biomecánicas. Algunos de estos sistemas modelo incluyen la carga tisular ex vivo, los sistemas de carga celular 2D que aplican tensión biaxial o uniaxial y los sistemas 3D que utilizan andamios e hidrogeles 9,10. Los sistemas 2D son ventajosos cuando se estudian los efectos de la estimulación mecánica en genes específicos del tendón o en la morfología de las células en el contexto del destino celular, mientras que los sistemas 3D pueden replicar con mayor precisión las interacciones célula-ECM 9,10.
En los sistemas de carga 2D, la tensión entre las células y el sustrato de cultivo es homogénea, lo que significa que la carga aplicada en el citoesqueleto de las células puede controlarse por completo. En comparación con la carga biaxial, la carga uniaxial es fisiológicamente más relevante, ya que los tenocitos están predominantemente sujetos a la carga uniaxial de los haces de colágeno in vivo9. Se encuentra que durante las actividades diarias, los tendones están sometidos a una carga de tracción uniaxial de hasta un 6% de deformación11. Específicamente, estudios previos han encontrado que la carga dentro de los rangos fisiológicos del 4%-5% ha demostrado promover la diferenciación tenogénica al preservar la expresión de marcadores relacionados con tendones como SCX y TNMD, así como el aumento de la producción de colágeno 9,10. Las cepas de más del 10% pueden ser traumáticamente relevantes, pero no fisiológicamente relevantes12,13.
Aquí se presenta un protocolo que tiene en cuenta el efecto sinérgico de la estimulación mecánica y biológica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. En primer lugar, describimos un método reproducible para inducir iPSCs en iMSCs a través de la exposición a corto plazo de cuerpos embrioides a factores de crecimiento, confirmado por marcadores de superficie de MSC mediante citometría de flujo. A continuación, detallamos un método de transducción lentiviral para diseñar iMSCs para que tengan una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Para una mayor maduración celular, los iMSCSCX+ se siembran en placas de silicona recubiertas de fibronectina y se someten a un protocolo de tensión uniaxial optimizado utilizando el biorreactor CellScale MCFX. El potencial tenógeno se confirmó al observar la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno14. Este método de generación de iTenocitos es una prueba de concepto que puede ofrecer una fuente alogénica ilimitada lista para usar para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
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Protocol
Este protocolo para producir iTenocytes se puede llevar a cabo en tres pasos principales: iPSC a iMSC (10 días), iMSC a iMSCSCX+ (2 semanas), iMSCSCX+ a iTenocytes (mínimo 4 días). Cada paso importante del protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, según el cronograma experimental. Para los métodos relacionados con el cultivo de células, se deben emplear técnicas estériles. Todas las células de este protocolo deben cultivarse a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
1. Inducción de iPSC humanas en células estromales mesenquimales inducidas (iMSC)
- Preparación del experimento
- Preparar el medio de Dulbecco modificado de Iscove - Cuerpos embrioides (IMDM-EB).
- Suplementar 50 mL de medio basal IMDM con 8,5 mL de reemplazo sérico knock-out, 500 μL de aminoácidos no esenciales del Medio Esencial Mínimo (MEM), 0,385 μL (110 mM stock) de beta-mercaptoetanol y 500 μL de solución antibiótica-antimicótica (AAS) (concentraciones finales: 17%, 1%, 110 μM, 1%, respectivamente) (ver Tabla de Materiales).
- Prepare los medios de células estromales mesenquimales (MSC).
- Suplementar 440 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa con 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de solución antibiótica-antimicótica (AAS) y 5 mL de L-glutamina (concentraciones finales: 10%, 1%, 2 mM, respectivamente).
- Prepare placas recubiertas de poli(2-hidroxietilometacrilato) (poli-HEMA).
- Agregue 10 g de poli-HEMA (ver Tabla de materiales) a un frasco estéril.
- Agregue un agitador magnético a la botella y, mientras revuelve, agregue lentamente 500 ml de EtOH al 95%.
- Una vez que se haya agregado todo el EtOH, active el modo de agitación a 1200 rpm con calor lento adicional durante al menos 6 h. La solución poly-HEMA se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por un año.
- En condiciones estériles, añadir 2,5 μg/cm2 en 9 mL a un matraz T75. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo.
- Manteniendo la esterilidad, deje que los recipientes se sequen al aire para que el EtOH se evapore por completo antes de su uso. Esto suele tardar entre 24 y 72 horas.
- Prepara matraces recubiertos de gelatina.
- Lavar una botella de vidrio con NaOH y dedicarla a la preparación de la gelatina. No use detergente.
- Preparar solución de gelatina al 1% (5 g de gelatina y 500 ml de agua libre de endotoxinas). Esterilizar en autoclave el frasco de vidrio con la solución de gelatina durante 30 min.
- Deje que la solución de gelatina se enfríe y se puede almacenar a temperatura ambiente.
- Cubra un matraz T75 con 5 ml de solución de gelatina por matraz e incube durante al menos 1 h antes de sembrar las células. Los frascos recubiertos de gelatina se pueden preparar con 1 día de anticipación.
- Prepare el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
- Mezclar PBS con albúmina sérica bovina al 2% y azida sódica al 0,1%. Conservar a 4 °C.
- Preparar el medio de Dulbecco modificado de Iscove - Cuerpos embrioides (IMDM-EB).
- Generación de cuerpos embrioides (EBs)
NOTA: Las iPSC deben cultivarse en una placa de 6 pocillos y deben alcanzar una confluencia del 70%-80% antes de su uso.- El día 0, coloque una placa de PCR de fondo transparente 384 en la campana de cultivo de tejidos y UV durante 15 minutos sin tapa.
- Retire el medio de crecimiento de las iPSC (consulte la Tabla de materiales) y lave los pocillos con PBS.
- Añadir 0,5 ml de reactivo de disociación celular suave precalentado (ver Tabla de materiales) a cada pocillo e incubar durante 5 min a 37 °C. Observe las células cada 5 minutos hasta que las iPSC se hayan convertido en células individuales o pequeños agregados levantados en suspensión.
- Resuspendió la suspensión celular con una pipeta de 1 ml para garantizar una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retirar el sobrenadante, volver a suspender en medio IMDM-EB (paso 1.1.1) y contar las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
- Calcule el volumen apropiado de suspensión celular requerido para lograr 5,000-25,000 celdas por pocillo de la placa de 384 pocillos con 25 μL de suspensión celular por pocillo.
NOTA: Generalmente, 2-3 pocillos confluentes (70%-80%) de una placa de 6 pocillos pueden producir EB en una placa de 384 pocillos. El tamaño de las células por EB se determinará empíricamente. Para una placa completa de 384 pocillos, se deben utilizar 9,6 ml de suspensión celular, 25 μl por pocillo. - Centrifugar las células de nuevo a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retirar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen adecuado de medio IMDM-EB y 10 μM de diclorhidrato de Y-27632 (stock: 10 mM, 1000x, ver Tabla de Materiales) en un tubo cónico preenfriado de 15 mL.
- Agregue la matriz de membrana basal solubilizada en frío (1 mg por placa de 384 pocillos de EB) al cónico (ver Tabla de Materiales).
- Distribuya 25 μL de la suspensión celular a cada pocillo. Coloque una tapa estéril en el plato y gírelo a 450 x g a 4 °C durante 7 min. Incubar a 37 °C durante 48 h.
- El día 2, transfiera las células a una placa de 100 mm con 3 ml de medios IMDM-EB precalentados.
- Transfiera los EB a los matraces T75 recubiertos de poli-HEMA con 10 ml de IMDM-EB. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo. Deje que los EB crezcan durante 3 días.
- El día 5, transfiera los EB a los matraces T75 recubiertos de gelatina preparados con 10 ml de medios IMDM-EB. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo. Cultive los EB durante 3 días más en suspensión.
- En el día 8, asegúrese de que se observan dos tipos de EB: EB que están unidos al matraz y EB no conectados. Lave los EB no adheridos del matraz con PBS.
- A los EB adjuntos, agregue medios IMDM-EB suplementados con TGFβ-1 (10 ng/mL) (ver Tabla de Materiales) y déjelos crecer durante 2 días.
- El día 10, cambie el medio a MSC medio. Las células deben alimentarse dos veces por semana. Una vez que el 70% confluya, proceda al "Protocolo estándar de celdas de elevación" para recubrir las celdas. Vuelva a colocar las células en placas recubiertas de gelatina.
- Protocolo estándar de células de elevación
- Una vez que las células adherentes hayan alcanzado el 70% de confluencia, aspire el medio de crecimiento de las placas y lávese con PBS.
- Levante las células añadiendo 5 ml de tripsina precalentada al 0,25% a cada placa de 150 mm e incube durante 5 minutos a 37 °C. Ajuste el volumen de tripsina de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo.
- Bajo un microscopio, verifique que la mayoría de las células se hayan levantado de cada placa. Si todavía hay células adheridas, golpee suavemente los lados de las placas para desalojarlas.
- Recoja las células en un tubo cónico agregando el doble del volumen del medio de crecimiento precalentado.
- Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante y continúe con los siguientes pasos.
- Evaluación de citometría de flujo para la expresión del marcador MSC
NOTA: Las MSC humanas, al igual que las MSC de médula ósea, deben utilizarse como control positivo.- Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
- Vuelva a suspender el sobrenadante con 3 ml de tampón FACS y transfiera todo el volumen a los tubos FACS.
- Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Repita el paso de lavado con el tampón FACS dos veces más.
- A los tubos teñidos, añadir 2 μL de CD90-FITC antihumano de ratón, CD44-APC antihumano de ratón y CD105-PE antihumano (ver Tabla de materiales) e incubar durante 45 min a 4 °C.
- A los tubos de control del isotipo, añadir 20 μL de IgG2a-FITC, IgG1-PB de ratón e IgG1-PE de ratón (véase la tabla de materiales).
- Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 15 min. Lavar todos los tubos añadiendo 3 ml de tampón FACS y centrifugar durante 5 min a 300 x g (a temperatura ambiente). Vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón FACS para cada tubo.
- Analizar la expresión de los marcadores de superficie de las MSCs mediante citometría de flujo14. Las longitudes de onda de excitación y emisión deben ser: CD90-FITC, pico de excitación a 495 nm y pico de emisión a 519 nm; CD44-APC, pico de excitación a 640 nm y pico de emisión a 660 nm; CD105-PE, pico de excitación a 561 nm y pico de emisión a 574 nm.
2. Aprobación y expansión de iMSC
- Preparación de reactivos
- Prepare los medios de congelación MSC.
- Combine 30 ml de DMEM bajo en glucosa, 5 ml de DMSO y 15 ml de FBS (concentraciones finales: 60%, 10%, 30%, respectivamente).
- Filtrar la solución con un filtro estéril de 0,45 μm. Conservar a 4 °C.
- Prepare los medios de congelación MSC.
- Fallecimiento
NOTA: Después de la inducción, las iMSC deben cultivarse en placas recubiertas de gelatina durante 2 pasadas adicionales antes de pasar a crecer en placas de cultivo de tejidos de plástico. Además, las celdas deben pasar con una relación de división de 1:3 cuando el 70% confluye.- Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
- Resuspenda las células en medios MSC y distribuya equitativamente las células en tres nuevas placas de 150 mm de matraces T175 con 20 ml de medio por matraz. Vuelva a colocar las celdas a 37 °C.
- Alimente las células dos veces por semana reemplazando el medio de crecimiento con medios MSC precalentados.
- Congelación
- Realice el "Protocolo estándar de celdas de elevación".
- Vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de congelación MSC. Añadir 1 ml de suspensión celular a un criovial y almacenar en un recipiente de congelación durante 24 h a -80 °C antes de transferirlo a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
- Descongelación
- Prepare 10 ml de medios MSC precalentados en un tubo cónico de 15 ml.
- Recupere el criovial, sumérjalo en un baño de agua a 37 °C y agite hasta que quede una bola de hielo del tamaño de un guisante (aproximadamente 1-2 minutos).
- En la campana de cultivo celular, agregue lentamente 1 ml del medio precalentado al criovial y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
- Transfiera la suspensión celular del criovial al tubo cónico preparado de 15 ml con medios precalentados y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender con medios nuevos. Añadir la suspensión celular a una placa de 150 mm con un volumen total de 20 mL. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del matraz de cultivo.
- Incubar las células a 37 °C hasta que estén listas para partir.
3. Ingeniería genética de iMSCs para sobreexpresar SCX mediante transducción lentiviral
NOTA: Esta sección del protocolo tarda dos semanas en completarse.
- Preparación de medios y reactivos
- Prepare medios celulares HEK293T/17.
- Suplementar 445 mL de Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) con 50 mL de FBS y 5 mL de AAS (concentraciones finales: 10%, 1%, respectivamente).
- Prepare los medios de empaquetado de MSC.
- Prepare el suero inactivado por calor calentando 50 ml de FBS a temperatura ambiente en un baño de agua a 60 °C durante 30 min.
- Combine 445 ml de DMEM bajo en glucosa con el FBS inactivado por calor y 5 ml de L-glutamina (concentraciones finales: 10%, 2 mM, respectivamente).
- Preparar complejo de transfección.
- Permitir que los componentes del complejo de transfección (ver Tabla de Materiales) se descongelen en hielo: plásmidos de empaquetamiento VSV-G y Delta, plásmido SCX y BioT15,16.
- Suavemente vórtice y gire hacia abajo los plásmidos. Mide las concentraciones de ADN.
- En función de las concentraciones de ADN y del número de frascos destinados a la transfección, calcule el volumen de cada componente necesario: para un matraz T75, el complejo de transfección consistirá en 750 μL de medio libre de suero (como DMEM o PBS sin suero), 7,5 μg de plásmido SCX, 0,75 μg de plásmido VSV-G, 6,75 μg de plásmido Delta y 22,5 μL de BioT. Considere un extra para el error de pipeteo.
- Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar brevemente en una centrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos y usar inmediatamente.
- Prepare medios celulares HEK293T/17.
- Transfección y producción lentiviral
PRECAUCIÓN: A partir del día 3, el protocolo implica trabajar con lentivirus y, por lo tanto, el trabajo debe llevarse a cabo utilizando procedimientos operativos de nivel de contención 2+. Los trabajadores deben usar equipo de protección personal, que incluye dos capas de guantes, cubiertas para las muñecas, gafas de seguridad, una mascarilla, pantalones largos y zapatos cerrados. Todos los residuos y materiales, incluidas las puntas de pipeta, los matraces y el medio líquido, deben descontaminarse con lejía (hipoclorito de sodio final al 1%) durante al menos 20 minutos. No utilice la aspiradora.- Semilla HEK293T/17 células.
- Aproximadamente 18-24 h antes de la transfección (día 0), levante y coloque las células 293T en matraces T75. Los siguientes volúmenes asumen T75 como el recipiente de cultivo. Ajuste el volumen de acuerdo con el recipiente de cultivo celular utilizado.
- Retire el medio de cultivo de los matraces y lávelos con 5 ml de PBS.
NOTA: Las células se levantan muy fácilmente de la superficie del matraz. Agregue PBS al costado del matraz y evite la adición directa de solución a las celdas. - Añadir 3 ml de tripsina precalentada al 0,25% a cada matraz e incubar a 37 °C durante 5 min. Recoja las células en un tubo cónico y centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g.
- Retire el sobrenadante, vuelva a suspender en medio 293T y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
- Coloque las células a 5,3 x 104 células/cm2 e incube a 37 °C durante la noche.
- Al día siguiente (día 1), prepare el complejo de transfección. Sustituya el medio de crecimiento de las células por 5 ml de medio de envasado de MSC precalentado (paso 3.1.2).
- Agregue el complejo de transfección gota a gota a las células. Incline suavemente el plato para asegurar una exposición uniforme del complejo de transfección a las células. Regrese las celdas a la incubadora durante 48 h.
NOTA: La toxicidad debe observarse después de 24 h (día 2). - Después de 48 h (día 3), recoja cuidadosamente el medio que contiene el virus en un tubo cónico separado con una pipeta y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
- Agregue 5 ml de medio de envasado MSC precalentado al matraz T75 de células 293T y devuélvalo a la incubadora durante la noche.
- Después de la centrifugación, filtre el sobrenadante con un filtro estéril de 0,45 μm pipeteando directamente el sobrenadante a través del filtro. Almacene el medio que contiene virus a 4 °C durante la noche.
- Después de otras 24 h (día 4), una vez más recoja cuidadosamente el medio que contiene el virus en un tubo cónico separado con una pipeta y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
- Combine el virus con el virus del día anterior de la recolección y mezcle para garantizar una solución homogénea. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental. El lentivirus puede ser alícuota y congelado a -80 °C, o el lentivirus puede ser almacenado en hielo mientras se procede con la "Transducción de iMSCs con SCX" (paso 3.3).
NOTA: Una vez que las alícuotas de lentivirus estén congeladas y descongeladas, no vuelva a congelar.
- Semilla HEK293T/17 células.
- Transducción de iMSCs con SCX
- Realice la transducción de la placa de titulación.
- El día 0, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
- Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
- En una placa de 6 pocillos, agregue 4 x 103 celdas/cm2. Vuelva a colocar el resto en una placa adicional de 150 mm con 20 ml de medios MSC (esta será la placa de control). Incubar las células durante 24 h a 37 °C.
- Al día siguiente (día 1), las celdas deben ser ~40% confluentes. Precaliente el medio de crecimiento de empaque de lenti y descongele el polibreno y aproximadamente 3 ml de lentivirus en hielo (o si se hace el mismo día de la recolección del virus, guárdelo en hielo hasta su uso).
- Agregue medio de crecimiento de lenti-empaque y lentivirus a los pocillos en función de los títulos deseados (es decir, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Añadir 0,5 μL de polibreno para conseguir una concentración final de 5 μg/mL (concentración de stock: 10 mg/mL, ver Tabla de Materiales).
- Gire la placa para asegurar una exposición uniforme a todas las células. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C durante 48 h.
- Evalúe la eficiencia del título de lentivirus SCX con citometría de flujo.
- Después de 48 h, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
- Vuelva a suspender las células en PBS y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 3 mL de tampón FACS para lavar. Transfiera la suspensión celular a los tubos de citometría de flujo y centrifugue durante 5 min a 300 x g.
- Repita el lavado con tampón FACS dos veces más y vuelva a suspender los gránulos celulares finales en 300 μL de tampón FACS. Evaluar la expresión de GFP para cada título utilizando una máquina de citometría de flujo.
- Con base en los títulos y los recuentos de viabilidad celular, determine el título de lentivirus apropiado para proceder con la transducción. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental.
- Realice transducción SCX a gran escala.
NOTA: Los volúmenes indicados son por 1 placa de 150 mm o 1 matraz T175. Esto se puede ajustar en consecuencia según el tamaño deseado del recipiente y la escala de transducción.- El día 0, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
- Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células. Siembre las celdas a 4 x 103 celdas/cm2. Incubar las células durante 24 h a 37 °C.
- Al día siguiente (día 1), las celdas deben ser ~40% confluentes. Precaliente el medio de crecimiento de envase de lenti y descongele el polibreno y la cantidad precalculada de lentivirus en hielo.
- Con base en el título decidido, agregue la cantidad deseada de medio de crecimiento de empaquetamiento de lenti y lentivirus a los pocillos. Añadir 5 μg/mL de polibreno (concentración de stock: 10 mg/mL).
- El día 3, observe las células bajo un microscopio fluorescente. El nuevo iMSCSCX+ debería emitir fluorescencia GFP. Sustituya el medio que contiene virus por un medio MSC precalentado. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental.
- Realice la transducción de la placa de titulación.
4. Pasaje y expansión del iMSCSCX+
- Realice el paso, la expansión, la congelación y la descongelación de iMSCSCX+ siguiendo lo mismo que para iMSC, como se describe en el paso 2 del protocolo.
5. Carga mecánica
NOTA: Esta sección tarda un mínimo de 4 días, pero puede ser más larga dependiendo de si se observa contracción celular.
- Preparación del experimento
- Prepara las placas de silicona.
- Autoclave 2 placas de silicona (ver Tabla de Materiales). Después, en condiciones estériles, retire las placas de silicona de la bolsa de autoclave y colóquelas en placas de 150 mm.
- Combine 130 μL de fibronectina (100x, ver Tabla de Materiales) con 13 mL de PBS estéril en un tubo cónico de 15 mL. Invierte el tubo varias veces para mezclar.
- Añadir 400 μL de solución de fibronectina a cada pocillo de las placas de silicona. Incubar las placas a 37 °C durante un mínimo de 2 h o toda la noche.
- Antes de usar, aspire la solución de fibronectina y deje que las placas se sequen al aire en la campana de cultivo celular durante al menos 30 minutos para que la solución de fibronectina se evapore por completo.
NOTA: La solución de fibronectina se puede retirar de los pocillos con anticipación, y las placas ahora recubiertas pueden reposar a 37 ° C hasta un par de semanas hasta su uso.
- Prepare el medio estirable MSC.
- Prepare los medios estirables de MSC añadiendo 140 μl de ácido ascórbico (stock: 100x, concentración final: 50 μg/mL) a 14 ml de medios MSC precalentados en un tubo cónico de 15 ml.
NOTA: El ácido ascórbico debe agregarse fresco al medio MSC antes de cada cambio de medio.
- Prepare los medios estirables de MSC añadiendo 140 μl de ácido ascórbico (stock: 100x, concentración final: 50 μg/mL) a 14 ml de medios MSC precalentados en un tubo cónico de 15 ml.
- Prepara las placas de silicona.
- Siembra de iMSCSCX+ en las placas de silicona
- Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
- Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
- Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener 1,25 x 104 células/cm2.
- Retire este volumen de medios elásticos MSC del tubo cónico de 15 ml. Agregue las celdas de destino. Invertir para homogeneizar la nueva suspensión celular.
- Agregue 400 μL de la nueva suspensión celular a cada pocillo de ambas placas de silicona.
- Vuelva a colocar la tapa en las placas de 150 mm y devuélvalas a la incubadora a 37 °C durante 24 h.
- Tensión uniaxial
- Al día siguiente, enjuague el aparato de estiramiento (ver Tabla de Materiales) con ddH2O seguido de etanol al 70%. Limpie el aparato, colóquelo en la campana de cultivo celular y aplique rayos UV durante 15 minutos.
- Recupere las placas sembradas y verifique que los pocillos se adhieran bien a las células.
- Deje una placa en la incubadora (control estático) y coloque la placa de silicona de segunda semilla en el aparato de estiramiento alineando los tornillos con los orificios de la placa de silicona. Vuelva a colocar la tapa del aparato para garantizar la esterilidad.
- Coloque el aparato con la placa de silicona sembrada en la fuente electrónica (consulte la tabla de materiales) y colóquelo en la incubadora a 37 °C.
- En el programa, ajuste el protocolo de estiramiento cíclico al 4% de deformación sinusoidal, 0,5 Hz, 2 h por día. Comience el estiramiento presionando el botón de inicio una vez. El estiramiento debe comenzar de inmediato.
- Estirar las células durante un mínimo de 3 días. Controle las células diariamente y detenga el protocolo de estiramiento si se puede observar la contracción celular. Cambie el soporte a un nuevo medio estirable MSC cada dos días.
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Representative Results
Diferenciación de las iPSCs humanas a las iMSCs
Como se ha descrito anteriormente, el protocolo actual para diferenciar las iPSCs en iMSCs implica la formación de cuerpos embrioides2. Este proceso tarda aproximadamente diez días en inducir iMSCs a partir de iPSCs (Figura 1A). Sin embargo, se recomienda encarecidamente pasar los iMSC recién generados al menos dos veces. Esto no solo ayuda a eliminar la necesidad de placas recubiertas de gelatina, sino que también establece una expresión estable de MSC. La cuantificación por citometría de flujo, realizada después de seis pasadas después de la diferenciación, demuestra una población celular casi pura con alta expresión de marcadores de superficie clásicos de MSC, incluyendo CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) y CD105 (99,2%)17,18 (Figura 1B). En cuanto a la morfología, las iMSC deben parecerse mucho a las MSC de la médula ósea, apareciendo alargadas y similares a fibroblastos (Figura 1C).
Ingeniería genética de iMSCs para sobreexpresar SCX mediante transducción lentiviral
Los lentivirus se produjeron mediante la transfección de células HEK293T/17 con el vector pLenti-C-mGFP, en el que se ha insertado SCXB para expresar SCX-GFP+, junto con dos plásmidos de empaquetamiento. Las transfecciones se realizaron mediante el método BioT15,16 con una relación de 1,5:1 entre BioT (μl) y ADN (μg).
HEK293T/17 células se sembraron a una densidad de 5,3 x 104 células/cm2 18-24 h antes de la transfección. En el momento de la transfección, las células deben alcanzar una confluencia del 80%-95% para evitar títulos de baja eficiencia (Figura 2B1, izquierda). A las 24 h de la adición del cóctel de plásmidos, se observó cierta toxicidad, que alcanzó su punto máximo a las 48 h (Figura 2B2). Dado que el vector lentiviral SCX está conjugado con GFP, la expresión de GFP debería ser observable después de 48 h (Figura 2B3). La presencia de alta toxicidad combinada con la expresión de GFP es un indicador fiable de éxito de la transfección. El lentivirus se colectó a las 48 h y a las 72 h, y se evaluó la eficiencia de la transducción mediante citometría de flujo y análisis de expresión génica. La intensidad absoluta de las células positivas para GFP se utilizó como proxy de las integraciones de SCX, y fue significativamente mayor en los títulos más altos (Figura 3A). La eficiencia de transducción, medida como el porcentaje de células SCX-GFP+ , demostró un efecto dosis-respuesta basado en la carga lentiviral (Figura 3B). La citometría de flujo del iMSCSCX+ en diferentes pasajes también mostró una alta estabilidad, sin cambios en los niveles de expresión transgénica ni en la proporción de células transducidas (Figura 3C). Además, después de 4 semanas de cultivo regular sin clasificar, el iMSCSCX+ mantuvo una sobreexpresión estable de SCX (Figura 3D). La transducción a gran escala se realizó en base al título, utilizando lentivirus al 75% (Figura 2C).
Carga mecánica de iMSCSCX+
Las célulasiMSC SCX+ se sembraron en placas de silicona deformables a una densidad celular de 1,25 x 104 células/cm2 (Figura 4A,B) para permitir la unión celular antes de iniciar el protocolo de estiramiento. La densidad final de siembra se optimizó para evitar el crecimiento excesivo de una sola capa. Vale la pena señalar que las densidades de siembra excesivamente altas resultaron en una contracción celular prematura y muerte celular temprana (Figura 4D). Para el grupo de control estático, las células se colocaron en placas idénticas pero sin someterse a ningún estiramiento. Las célulasiMSC SCX+ se sometieron a estiramiento en un biorreactor 2D durante un mínimo de tres días, hasta siete días, al 4% de deformación uniaxial y 0,5 Hz durante 2 h al día. Este régimen de estiramiento es consistente con lo que se ha descrito como fisiológicamente relevante9. Después de varios días de estiramiento, se puede observar cierto grado de organización celular en comparación con el grupo estático, que exhibió una organización celular aleatoria (Figura 4C). La tinción con faloidina de los filamentos de actina resalta aún más cómo las células parecen crecer perpendiculares a la dirección del estiramiento, en contraste con la organización celular aleatoria observada en las placas estáticas (Figura 4E). Para caracterizar los iTenocitos recién generados, se recolectaron células a los tres y siete días para el análisis de expresión génica, como se informó previamente14. El análisis de la expresión génica revela que las célulasiMSC SCX+ son mecanosensibles, ya que existe una regulación positiva significativa en los genes tenógenos (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX y TPPP3)5,7,19,20 tanto a los tres como a los siete días, en comparación con solo las iMSC en el día 0 (Figura 5A). Además, la deposición de colágeno en los medios después de 7 días de estiramiento fue significativamente mayor en el grupo estirado iMSCSCX+ en comparación con todos los demás grupos (Figura 5B).
Figura 1: Esquema de diferenciación de iMSC y caracterización de citometría de flujo. (A) Esquema general de la generación de iTenocitos y cronograma para la inducción de iMSC. Reproducido con permiso de Papalamprou A. et al.14. (B) La cuantificación por citometría de flujo muestra un alto porcentaje de células que expresan marcadores de superficie de MSC clásicos para MSC derivadas de iPSC después de 6 pasadas después de la diferenciación. Adaptado con permiso de Sheyn D. et al.2. (C) Las imágenes de contraste de fase de las células después de la diferenciación demuestran una morfología similar a la de los fibroblastos. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de producción de iMSCSCX+ . (A) Esquema general de la transfección utilizando el vector de lentivirus SCX de2ª generación y la transducción de iMSCs. Reproducido con permiso de Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 células antes de la adición del cóctel de plásmidos. (B2) HEK293T/17 células, después de 48 h, expresan GFP y muestran toxicidad. (B3) La expresión de GFP que se puede observar en las células HEK293T/17 indica una transfección exitosa. (C) Las célulasiMSC SCX+ generadas (con un título del 75%) expresan SCX-GFP+ en los núcleos. Barras de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación de la eficiencia de la transducción con citometría de flujo y expresión génica. La intensidad absoluta de las células positivas para GFP se utilizó como proxy para las integraciones de SCX mediante citometría de flujo. Los títulos vectoriales se validaron mediante análisis de citometría de flujo para todas las células con el fin de evaluar el MOI lentiviral. (A) Fluorescencia absoluta por título de virus. (B) Eficiencia de transducción evaluada como el porcentaje de células SCX-GFP+ . Se observó un efecto dosis-respuesta de la carga lentiviral en la eficiencia de la transducción cuando los resultados del flujo se presentaron como un porcentaje de células GFP+. MOI: multiplicidad de infecciones, n = 3 transducciones independientes. Se utilizó ANOVA de un factor para comparar títulos; los datos son medias ± DE; *p < 0,05. (C) La citometría de flujo de iMSCSCX+ después de varias rondas de pases no indica ningún cambio en el nivel de expresión estable del transgén ni ningún cambio en la proporción de células transducidas. Tenga en cuenta que las iMSC transducidas con títulos del 100% dejaron de dividirse en P3. (D) iMSCs transducidas con el vector lentivirus SCX-GFP+ (75%, MOI = 2,9 e5 TU/mL) y evaluadas la expresión génica de SCX a las 4 semanas de cultivo regular sin clasificar. La expresión de SCX se reguló significativamente al alza en iMSCSCX+ , mostrando una sobreexpresión estable de SCX después de 4 semanas. TU, unidades de transducción; los datos son medios ± DE, **p > 0,01. Reproducido con permiso de Papalamprou A. et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: iMSCSCX+ sembrado en un biorreactor 2D y sometido a un estiramiento cíclico. (A) Esquema del biorreactor 2D. Reproducido con permiso de Papalamprou A. et al.12. (B) Las células se siembran primero en placas de silicona flexibles y se incuban a 37 °C para permitir la unión antes del estiramiento cíclico en el biorreactor 2D. (C) Los iMSCSCX+ se estiraron en un biorreactor 2D durante un máximo de 7 días. Para los controles estáticos, las celdas se colocaron en placas idénticas pero sin estiramiento. (C1) La placa de control estático después de 7 días exhibe una disposición estocástica de las células. (C2) La placa estirada después de 7 días muestra una organización celular relativamente mayor. (D) Tres ejemplos de lo que no debe observarse. Cuando la densidad de siembra celular es demasiado alta o las células se han estirado durante demasiados días, las células comienzan a desprenderse. (D1) Las células solo están ligeramente crecidas. Las flechas amarillas indican el comienzo de la contracción celular prematura. (D2) Nivel moderado de sobrecrecimiento. Las células comienzan a desprenderse de la placa. (D3) Nivel severo de crecimiento excesivo. Las células ya no crecen en monocapa y han formado estructuras 3D. Barras negras = 400 μm. Barras de escamas blancas = 1000 μm. (E) Después de 7 días de estiramiento (o en cultivo para la placa estática), las células se fijaron con faloidina para los filamentos de actina (rojo) y se contratiñeron con DAPI para los núcleos (azul). Barras blancas = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estimulación de la expresión génica de marcadores tenogénicos mediante sobreexpresión de Scx y estiramiento uniaxial en un biorreactor 2D. (A) Los iMSCSCX+ se estiraron en un biorreactor 2D durante 7 días. Para los controles estáticos, las celdas se colocaron en placas idénticas pero sin estiramiento. Los análisis de expresión génica revelan que iMSCSCX+ es mecanosensible. ND = sin detección. Se utilizó ANOVA de un factor para comparar la expresión génica en cada punto de tiempo vs. d0. N = 8/grupo. (B) Deposición de colágeno después de 7 días de estiramiento en el biorreactor 2D. Los datos son medias ± DE; n = 8/grupo; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Reproducido con permiso de Papalamprou A. et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, los iTenocitos se generan a través de tres pasos principales: (1) inducción de iPSCs a iMSCs, (2) sobreexpresión de SCX utilizando un vector lentiviral y (3) maduración de células a través de tensión uniaxial 2D.
El protocolo presentado para diferenciar las iPSCs en iMSCs ha sido descrito previamente por nuestro grupo2. Desde esa publicación, se han desarrollado numerosos protocolos, incluido un protocolo establecido para el uso de iMSC en ensayos clínicos 21,22,23, así como kits de diferenciación disponibles comercialmente. También se ha investigado previamente una revisión del potencial trilinaje de las iMSC2. Si bien las metodologías difieren, todos los protocolos enfatizan la necesidad de una expansión posterior a la diferenciación de las iMSC para varios pasajes para garantizar una expresión estable de los marcadores de superficie de MSC. En esta etapa, el uso de una relación de división de 1:3 con aproximadamente un 70% de confluencia dará como resultado una placa relativamente confluente dentro de los 4-6 días posteriores al paso.
A la hora de seleccionar el título óptimo para la transducción, es crucial lograr un equilibrio entre la viabilidad y la eficiencia de la célula. Si bien las iMSC transducidas con el título del 100% pueden mostrar el nivel más alto de células SCX-GFP positivas, vale la pena señalar que estas células dejaron de dividirse tres pasajes después de la transducción (Figura 3C), posiblemente debido a la toxicidad inducida por el ADN. Por lo tanto, es recomendable utilizar un título inferior al 100%. Antes de sembrar las placas de silicona, se recomienda volver a evaluar los niveles de SCX-GFP mediante citometría de flujo. Si los datos indican que la eficiencia está por debajo del umbral deseado, es aconsejable clasificar las célulasiMSC SCX+ antes de sembrarlas, especialmente para aplicaciones in vivo .
Una vez que las células iMSCSCX+ se han sembrado en las placas de silicona, deben incubarse a 37 °C durante la noche para permitir la unión de las células antes de estirarlas. La densidad celular descrita de 1,25 x 104 células/cm2 en las placas de silicona se optimizó para evitar el crecimiento excesivo de monocapas, que puede contribuir a la tensión estática24. Además, los estudios sugieren que el contacto directo célula a célula en cultivos confluentes en sustratos de rigidez variable puede alterar el comportamiento celular 24,25,26. Durante los experimentos piloto, se observó cierto desprendimiento celular visible de las placas de silicona, particularmente en puntos de tiempo posteriores (Figura 4D). Esto podría atribuirse a la formación de láminas celulares de ECM debido a la sobreconfluencia24. Por lo tanto, los parámetros críticos incluyen la densidad celular y el número de episodios de estiramiento. En los métodos actuales, las células se recolectaron a los días 3 y 7 para la evaluación del potencial tenogénico a través del análisis de expresión génica. Sin embargo, se recomienda que las células se estiren en el biorreactor 2D durante al menos tres días, con el posterior monitoreo de las placas estiradas y estáticas para evitar el crecimiento excesivo y el desprendimiento celular.
Después de varios episodios de estiramiento, se puede observar un grado de alineación y organización celular (Figura 4C1, E). Esto se alinea con muchos estudios en los que se observa una alineación celular perpendicular al eje de deformación en respuesta a la deformación uniaxial in vitro24,27. En comparación, la placa estática muestra la organización estocástica de las células (Figura 4C2,E).
Hasta donde sabemos, solo unos pocos estudios han explorado los efectos sinérgicos de la sobreexpresión de SCX y la estimulación mecánica para la diferenciación de las MSC en tenocitos o ligamentocitos 24,28,29. Gaspar et al. emplearon un sistema de biorreactor 2D similar al aquí descrito, pero aplicaron niveles más altos de deformación total (10% a 1 Hz durante 12 h/día). Curiosamente, no pudieron detectar cambios en la expresión de SCX, TNMD y COL1a1 en BM-MSC y tenocitos humanos. Sin embargo, esto puede atribuirse a las cepas aplicadas más altas utilizadas en su estudio24. Chen et al. utilizaron un vector lentiviral para sobreexpresar SCX en hESC-MSC ensambladas en láminas de varias capas. Aplicaron carga cíclica uniaxial (10% de deformación a 1 Hz durante 2 h/día durante un máximo de 21 días) y observaron una regulación positiva de COL1a1, COL1a2, COL14 y TNMD, así como un aumento de la deposición de ECM29. Nichols et al. transfectaron transitoriamente células C3H10T1/2 con ADNc Scx murino de longitud completa y cultivaron las células en hidrogeles de colágeno 3D bajo una tensión cíclica uniaxial (1%, 1 Hz, 30 min/día durante un máximo de 14 días). De manera similar a nuestros hallazgos, su grupo observó una expresión elevada de SCX y COL1A1 en las construcciones tensadas y sobreexpresadas, pero no encontró cambios en la expresión de TNMD en respuesta al estiramiento cíclico28.
Además, podría ser intrigante considerar la sobreexpresión de otros marcadores relacionados con los tendones como MKX. Tsutsumi et al. exploraron el efecto combinado de la sobreexpresión de MKX en células C3H10T1/2 y su sometimiento a estiramiento mecánico cíclico en un sistema 3D. Demostraron una regulación positiva significativa de SCX, COL1a1, DCN y COL3a1, junto con la alineación de los haces de fibrillas de colágeno y los filamentos de actina30.
Es importante reconocer que este método para generar iTenocytes tiene sus limitaciones. Si bien el biorreactor 2D disponible en el mercado es ventajoso para el trabajo de prueba de concepto, su tamaño restringe el rendimiento. Si estas células son necesarias para ensayos de alto rendimiento o como una fuente celular potencial para terapias de reparación de tendones, se debe considerar la exploración de sistemas capaces de implementar el estiramiento uniaxial a mayor escala. Además, las investigaciones adicionales deben abarcar la expansión de los iTenocitos para confirmar la expresión tenogénica estable, y la evaluación de su contribución a la regeneración in vivo es crucial para evaluar su potencial tenógeno.
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Disclosures
Todos los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue parcialmente apoyado por el NIH/NIAMS K01AR071512 y CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. Los dos plásmidos de empaquetamiento de lentivirus fueron un regalo del laboratorio Simon Knott (Departamento de Ciencias Biomédicas, Centro Médico Cedars-Sinai).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
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