Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av inducerade pluripotenta stamcellshärledda iTenocyter via kombinerat skleraxisöveruttryck och 2D enaxlig spänning

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Den här artikeln beskriver en procedur för att producera iTenocyter genom att generera iPSC-härledda mesenkymala stromaceller med kombinerat överuttryck av Scleraxis med hjälp av en lentiviral vektor och enaxlig sträckning via en 2D-bioreaktor.

Abstract

Dagens utmaningar inom sen- och ligamentreparation gör det nödvändigt att identifiera en lämplig och effektiv kandidat för cellbaserad terapi för att främja senregenerering. Mesenkymala stromaceller (MSC) har undersökts som en potentiell vävnadsteknisk strategi för senreparation. Även om de är multipotenta och har regenerativ potential in vivo, är de begränsade i sin förmåga till självförnyelse och uppvisar fenotypisk heterogenitet. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) kan kringgå dessa begränsningar på grund av deras höga självförnyelseförmåga och oöverträffade utvecklingsplasticitet. I tenocytutveckling är Scleraxis (Scx) en avgörande direkt molekylär regulator för sendifferentiering. Dessutom har mekanoreglering visat sig vara en central faktor som styr utvecklingen och läkningen av embryonala senor. Som sådan har vi utvecklat ett protokoll för att kapsla in den synergistiska effekten av biologisk och mekanisk stimulering som kan vara avgörande för att generera tenocyter. iPSCs inducerades till att bli mesenkymala stromaceller (iMSCs) och karakteriserades med klassiska mesenkymala stromacellsmarkörer via flödescytometri. Därefter, med hjälp av en lentiviral vektor, transducerades iMSCs för att stabilt överuttrycka SCX (iMSCSCX+). Dessa iMSCSCX+ -celler kan vidaremogna till iTenocyter via enaxlig dragbelastning med hjälp av en 2D-bioreaktor. De resulterande cellerna karakteriserades genom att observera uppreglering av tidiga och sena senmarkörer, samt kollagenavlagring. Denna metod för att generera iTenocyter kan användas för att hjälpa forskare att utveckla en potentiellt obegränsad allogen cellkälla för sencellsterapiapplikationer.

Introduction

För att ta itu med de samtida problemen inom reparation av senor och ligament finns det ett krav på en relevant cellkandidat som är lämplig för cellbaserade terapier. En forskningsväg inom vävnadsteknik för senreparation involverar utforskning av benmärgshärledda mesenkymala stromaceller (BM-MSC) och fettvävnadshärledda stromaceller (ASC) som potentiella strategier. Dessa celler har multipotent förmåga, stor förekomst och regenerativ potential in vivo. Dessutom har de visat förbättrad läkningsförmåga och förbättrade funktionella resultat i djurmodeller1. Icke desto mindre uppvisar dessa celler begränsad förmåga till självförnyelse, fenotypisk mångfald och framför allt begränsad kapacitet för senbildning. Inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) erbjuder en lösning på dessa begränsningar på grund av dess anmärkningsvärda självförnyelseförmåga och oöverträffade utvecklingsanpassningsförmåga. Vår forskargrupp och andra har uppnått framgångsrik differentiering av iPSCs till mesenkymala stromacellsliknande enheter (iMSCs)2,3. Som sådan har iMSC potential att vara en allogen källa för sencellsterapiapplikationer.

Scleraxis (SCX) är en transkriptionsfaktor som är nödvändig för senutveckling och anses vara den tidigaste detekterbara markören för differentierade tenocyter. Dessutom aktiverar SCX nedströms sendifferentieringsmarkörer, inklusive kollagen av typ 1a1 (COL1a1), mohawk (MKX) och tenomodulin (TNMD), bland annat 4,5,6. Andra gener som uttrycks under senmognad inkluderar tubulinpolymerisationsfrämjande proteinfamiljemedlem 3 (TPPP3) och trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRa)7. Även om dessa gener är viktiga för senutveckling och mognad, är de tyvärr inte unika för senvävnad och uttrycks i andra muskuloskeletala vävnader som ben eller brosk 5,7.

Förutom uttrycket av markörer under senutvecklingen är mekanostimulering ett viktigt element för embryonal senutveckling och läkning 4,5,6. Senor är mekanoresponsiva och deras tillväxtmönster förändras som svar på deras miljö. På molekylär nivå påverkar biomekaniska signaler utvecklingen, mognaden, underhållet och läkningsresponsen hos tenocyter8. Olika bioreaktorsystem har använts för att modellera fysiologiska belastningar och biomekaniska signaler. Några av dessa modellsystem inkluderar ex vivo vävnadsladdning, 2D-cellladdningssystem som applicerar bi-axiell eller enaxlig spänning och 3D-system som använder ställningar och hydrogeler 9,10. 2D-system är fördelaktiga när man studerar den mekaniska stimuleringens effekter på antingen senspecifika gener eller cellernas morfologi i samband med cellens öde, medan 3D-system mer exakt kan replikera cell-ECM-interaktioner 9,10.

I 2D-belastningssystem är belastningen mellan cellerna och odlingssubstratet homogen, vilket innebär att den applicerade belastningen på cellernas cytoskelett kan kontrolleras fullt ut. I jämförelse med tvåaxlig belastning är enaxlig belastning mer fysiologiskt relevant, eftersom tenocyter huvudsakligen utsätts för enaxlig belastning från kollagenbuntar in vivo9. Det har visat sig att senor under dagliga aktiviteter utsätts för enaxlig dragbelastning upp till 6 % belastning11. Specifikt har tidigare studier visat att belastning inom de fysiologiska intervallen på 4%-5% har visat sig främja tenogen differentiering genom att bevara senrelaterat marköruttryck som SCX och TNMD, samt ökad kollagenproduktion 9,10. Stammar på mer än 10 % kan vara traumatiskt relevanta men inte fysiologiskt relevanta12,13.

Här presenteras ett protokoll som tar hänsyn till den synergistiska effekten av mekanisk och biologisk stimulering som kan vara avgörande för generering av tenocyter. Vi beskriver först en reproducerbar metod för att inducera iPSCs i iMSCs via kortvarig exponering av embryoidkroppar för tillväxtfaktorer, bekräftad av MSC-ytmarkörer med hjälp av flödescytometri. Vi beskriver sedan en lentiviral transduktionsmetod för att konstruera iMSCs för att få stabilt överuttryck av SCX (iMSCSCX+). För ytterligare cellmognad sås iMSCSCX+ in i fibronektinbelagda silikonplattor och genomgår ett optimerat enaxligt spänningsprotokoll med hjälp av CellScale MCFX-bioreaktor. Den tenogena potentialen bekräftades genom att observera uppreglering av tidiga och sena senmarkörer, samt kollagendeposition14. Denna metod för att generera iTenocyter är ett proof-of-concept som kan erbjuda en obegränsad lagringsbar, allogen källa för sencellsterapiapplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll för att producera iTenocyter kan utföras i tre huvudsteg: iPSCs till iMSCs (10 dagar), iMSC till iMSCSCX+ (2 veckor), iMSCSCX+ till iTenocytes (minst 4 dagar). Varje större steg i protokollet kan pausas och startas om senare, beroende på den experimentella tidslinjen. För metoder som används för odling av celler bör sterila metoder användas. Alla celler i detta protokoll bör odlas vid 37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet.

1. Human iPSC-induktion i inducerade mesenkymala stromaceller (iMSC)

  1. Förberedelse av experiment
    1. Förbered Iscoves modifierade Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) media.
      1. Tillägg av 50 ml IMDM basalmedia med 8,5 ml knock-out-serumersättning, 500 μL icke-essentiella aminosyror (Minimal Essential Medium, MEM), 0,385 μL (110 mM stam) beta-merkaptoetanol och 500 μL antibiotika-antimykotisk lösning (AAS) (slutliga koncentrationer: 17 %, 1 %, 110 μM, 1 %, respektive) (se materialförteckning).
    2. Förbered mesenkymala stromacellsmedier (MSC).
      1. Komplettera 440 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med lågt glukos med 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 5 ml antibiotika-antimykotisk lösning (AAS) och 5 ml L-glutamin (slutliga koncentrationer: 10 %, 1 %, 2 mM, respektive).
    3. Förbered poly(2-hydroxietylmetakrylat) (poly-HEMA) belagda plattor.
      1. Tillsätt 10 g poly-HEMA (se Materialförteckning) i en steril flaska.
      2. Tillsätt en magnetomrörare i flaskan och tillsätt långsamt 500 ml 95 % EtOH under omrörning.
      3. När all EtOH har tillsatts, slå på omrörningsläget vid 1200 rpm med extra låg värme i minst 6 timmar. Poly-HEMA-lösningen kan förvaras i rumstemperatur i upp till ett år.
      4. Under sterila förhållanden, tillsätt 2,5 μg/cm2 i 9 ml till en T75-kolv. Justera volymen efter odlingskärlets storlek.
      5. För att bibehålla steriliteten, låt kärlen lufttorka så att EtOH kan avdunsta helt före användning. Detta tar vanligtvis 24-72 timmar.
    4. Bered gelatinöverdragna kolvar.
      1. Tvätta en glasflaska med NaOH och ägna den åt gelatinberedningen. Använd inte tvättmedel.
      2. Bered 1 % gelatinlösning (5 g gelatin och 500 ml endotoxinfritt vatten). Autoklavera glasflaskan med gelatinlösningen i 30 minuter.
      3. Låt gelatinlösningen svalna och den kan förvaras i rumstemperatur.
      4. Bestryk en T75-kolv med 5 ml gelatinlösning per kolv och inkubera i minst 1 timme före såddcellerna. Gelatinbelagda kolvar kan förberedas 1 dag i förväg.
    5. Förbered fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS).
      1. Blanda PBS med 2 % bovint serumalbumin och 0,1 % natriumazid. Förvaras vid 4 °C.
  2. Generering av embryoidkroppar (EB)
    OBS: iPSCs bör odlas i en 6-hålsplatta och bör nå 70%-80% sammanflöde före användning.
    1. På dag 0, ta med en 384 klarbottnad PCR-platta i vävnadsodlingshuven och UV i 15 minuter utan lock.
    2. Ta bort odlingsmediet från iPSC:erna (se materialförteckning) och tvätta brunnarna med PBS.
    3. Tillsätt 0,5 ml förvärmt reagens för skonsam celldissociation (se materialtabell) till varje brunn och inkubera i 5 minuter vid 37 °C. Observera cellerna var 5:e minut tills iPSC:erna har blivit enstaka celler eller små aggregat som lyfts i suspension.
    4. Återsuspenderad cellsuspensionen med en 1 ml pipett för att säkerställa en encellssuspension.
    5. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    6. Ta bort supernatanten, suspendera på nytt i IMDM-EB-media (steg 1.1.1) och räkna de livsdugliga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare.
    7. Beräkna den lämpliga volym cellsuspension som krävs för att uppnå 5 000–25 000 celler per brunn på plattan med 384 brunnar med 25 μl cellsuspension per brunn.
      OBS: I allmänhet kan 2-3 sammanflytande (70%-80%) brunnar av en 6-brunnsplatta göra EB i en 384-brunnars platta. Storleken på celler per EB kommer att bestämmas empiriskt. För en hel 384-hålsplatta måste 9,6 ml cellsuspension användas, 25 μL per brunn.
    8. Centrifugera cellerna igen vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    9. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i en lämplig volym IMDM-EB-media och 10 μM Y-27632-dihydroklorid (stam: 10 mM, 1000x, se materialtabell) i ett förkylt 15 ml koniskt rör.
    10. Tillsätt kallsolubiliserad basalmembranmatris (1 mg per 384-brunnars platta värde av EB) till den koniska (se materialtabell).
    11. Fördela 25 μl av cellsuspensionen till varje brunn. Lägg ett sterilt lock på plattan och centrifugera i 450 x g vid 4 °C i 7 minuter. Inkubera vid 37 °C i 48 timmar.
    12. På dag 2 överförs cellerna till en 100 mm platta med 3 ml förvärmt IMDM-EB-media.
    13. Överför EB till de särskilda T75-kolvarna med poly-HEMA-beläggning med 10 ml IMDM-EB. Justera volymen efter odlingskärlets storlek. Låt EB växa i 3 dagar.
    14. På dag 5 överförs EB till de beredda gelatindragerade T75-kolvarna med 10 ml IMDM-EB-medium. Justera volymen efter odlingskärlets storlek. Odla EB i ytterligare 3 dagar i suspension.
    15. På dag 8 ska du se till att två typer av EB observeras: EB som är fäst vid kolven och icke-anslutna EB. Skölj ur de ofästa EB från kolven med PBS.
    16. Till de bifogade EB:erna, tillsätt IMDM-EB-media kompletterat med TGFβ-1 (10 ng/ml) (se materialförteckning) och låt dem växa i 2 dagar.
    17. På dag 10, byt medium till MSC-medium. Cellerna ska matas två gånger i veckan. När 70 % är sammanflytande, fortsätt till "Standard lifting cells protocol" för att omplätera celler. Omplätera cellerna på gelatinbelagda plattor.
  3. Standardprotokoll för lyftceller
    1. När de vidhäftande cellerna har nått 70 % sammanflöde, aspirera tillväxtmediet från plattorna och tvätta med PBS.
    2. Lyft cellerna genom att tillsätta 5 ml förvärmt 0,25 % trypsin till varje 150 mm platta och inkubera i 5 minuter vid 37 °C. Justera trypsinvolymen efter odlingskärlets storlek.
    3. Kontrollera under ett mikroskop att de flesta cellerna har lyfts från varje platta. Om det fortfarande finns celler fästa, knacka försiktigt på sidorna av plattorna för att lossa cellerna.
    4. Samla cellerna i ett koniskt rör genom att tillsätta dubbelt så stor volym som det förvärmda odlingsmediet.
    5. Centrifugera cellerna i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g. Ta bort supernatanten och fortsätt till nästa steg.
  4. Flödescytometribedömning för MSC-marköruttryck
    OBS: Humana MSC, som MSC i benmärgen, bör användas som positiv kontroll.
    1. Utför "Standard lifting cells protocol" (steg 1.3).
    2. Återsuspendera supernatanten med 3 ml FACS-buffert och överför hela volymen till FACS-rören.
    3. Centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g. Upprepa tvättsteget med FACS-buffert två gånger till.
    4. Tillsätt 2 μl CD90-FITC, CD44-APC från möss och CD105-PE från möss till färgade rör (se materialtabell) och inkubera i 45 minuter vid 4 °C.
    5. Tillsätt 20 μl mus IgG2a-FITC, mus IgG1-PB och mus IgG1-PE till isotypkontrollrören (se materialförteckning).
    6. Inkubera i mörker vid 4 °C i 15 min. Tvätta alla rör genom att tillsätta 3 ml FACS-buffert och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g (vid rumstemperatur). Återsuspendera cellerna i 250 μl FACS-buffert för varje rör.
    7. Analysera uttrycket av MSC:s ytmarkörer med hjälp av flödescytometri14. Excitations- och emissionsvåglängderna bör vara: CD90-FITC, excitationstopp vid 495 nm och emissionstopp vid 519 nm; CD44-APC, excitationstopp vid 640 och emissionstopp vid 660 nm; CD105-PE, excitationstopp vid 561 nm och emissionstopp vid 574 nm.

2. iMSC-passage och expansion

  1. Beredning av reagenser
    1. Förbered MSC frysmedel.
      1. Kombinera 30 ml DMEM med lågt glukos, 5 ml DMSO och 15 ml FBS (slutliga koncentrationer: 60 %, 10 %, 30 % respektive.)
      2. Filtrera lösningen med ett sterilt 0,45 μm filter. Förvaras vid 4 °C.
  2. Passaging
    OBS: Efter induktion måste iMSCs odlas på gelatinbelagda plattor i ytterligare 2 passager innan de avvänjs till att växa på plastvävnadsodlingsplattor. Dessutom bör celler passeras med ett delningsförhållande på 1:3 när 70 % flyter samman.
    1. Utför "Standard lifting cells protocol" (steg 1.3).
    2. Omsuspendera cellerna i MSC-medier och fördela cellerna jämnt i tre nya 150 mm-plattor med T175-kolvar med 20 ml media per kolv. Återställ cellerna till 37 °C.
    3. Mata cellerna två gånger i veckan genom att byta ut odlingsmediet mot förvärmda MSC-medier.
  3. Frysning
    1. Utför "Standardprotokoll för lyftceller".
    2. Återsuspendera cellerna i 1 ml MSC frysmedium. Tillsätt 1 ml cellsuspension till en kryovial och förvara i en frysbehållare i 24 timmar vid -80 °C innan den överförs till flytande kväve för långtidsförvaring.
  4. Upptining
    1. Förbered 10 ml förvärmda MSC-medier i ett 15 ml koniskt rör.
    2. Ta upp kryovialen, doppa den i ett 37 °C vattenbad och snurra tills en ärtstor isboll återstår (cirka 1-2 min).
    3. I cellodlingshuven, tillsätt långsamt 1 ml av det förvärmda mediet till kryovialen och pipettera upp och ner för att blanda.
    4. Överför cellsuspensionen från kryovialen till det förberedda 15 ml koniska röret med förvärmt medium och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g (vid rumstemperatur).
    5. Ta bort supernatanten och blanda den på nytt med nytt medium. Tillsätt cellsuspensionen till en 150 mm platta med en total volym på 20 ml. Justera volymen efter odlingskolvens storlek.
    6. Inkubera cellerna vid 37 °C tills de är redo att delas.

3. Genmodifiering av iMSCs för att överuttrycka SCX med hjälp av lentiviral transduktion

OBS: Den här delen av protokollet tar två veckor att slutföra.

  1. Beredning av medier och reagenser
    1. Förbered HEK293T/17 cellmedia.
      1. Komplettera 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml FBS och 5 ml AAS (slutliga koncentrationer: 10 %, 1 % respektive).
    2. Förbered MSC lenti-förpackningsmedia.
      1. Bered det värmeinaktiverade serumet genom att värma 50 ml rumstemperatur FBS i ett 60 °C vattenbad i 30 minuter.
      2. Kombinera 445 ml DMEM med lågt glukos med värmeinaktiverad FBS och 5 ml L-glutamin (slutliga koncentrationer: 10 %, 2 mM, respektive.)
    3. Förbered transfektionskomplexet.
      1. Låt transfektionskomplexa komponenter (se materialtabell) tina på is: förpackningsplasmiderna VSV-G och Delta, SCX-plasmiden och BioT15,16.
      2. Virvla försiktigt och snurra ner plasmiderna. Mät DNA-koncentrationerna.
      3. Baserat på DNA-koncentrationerna och antalet flaskor avsedda för transfektion, beräkna volymen av varje komponent som behövs: för en T75-kolv kommer transfektionskomplexet att bestå av 750 μL serumfritt medium (som serumfritt DMEM eller PBS), 7,5 μg SCX-plasmid, 0,75 μg VSV-G-plasmid, 6,75 μg Delta-plasmid och 22,5 μL BioT. Överväg extra för pipetteringsfel.
      4. Blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner. Centrifugera kort i en centrifug. Inkubera i rumstemperatur i 15 minuter och använd omedelbart.
  2. Transfektion och lentiviral produktion
    VARNING: Från och med dag 3 innebär protokollet att man arbetar med lentivirus, och därför måste arbetet utföras med hjälp av driftsrutiner på inneslutningsnivå 2+. Arbetstagare måste bära personlig skyddsutrustning, inklusive två lager handskar, handledsskydd, skyddsglasögon, en mask och långbyxor och stängda skor. Allt avfall och material, inklusive pipettspetsar, kolvar och flytande medium, måste dekontamineras med blekmedel (slutlig 1 % natriumhypoklorit) i minst 20 minuter. Använd inte dammsugaren.
    1. Frö HEK293T/17 celler.
      1. Cirka 18-24 timmar före transfektionen (dag 0) lyfts och plattas 293T-cellerna till T75-kolvar. De följande volymerna utgår från T75 som odlingskärl. Justera volymen efter det cellodlingskärl som används.
      2. Ta bort odlingsmediet från kolvarna och tvätta med 5 ml PBS.
        OBS: Cellerna lyfts mycket lätt från kolvens yta. Tillsätt PBS på sidan av kolven och undvik direkt tillsats av lösning till cellerna.
      3. Tillsätt 3 ml förvärmt 0,25 % trypsin till varje kolv och inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Samla cellerna i ett koniskt rör och centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g.
      4. Avlägsna supernatanten, återsuspendera i 293T-media och räkna de livsdugliga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare.
      5. Platta cellerna vid 5,3 x 104 celler/cm2 och inkubera vid 37 °C över natten.
      6. Nästa dag (dag 1) förbereder du transfektionskomplexet. Byt ut cellernas odlingsmedium mot 5 ml förvärmt MSC-förpackningsmedium (punkt 3.1.2).
      7. Tillsätt transfektionskomplexet droppvis till cellerna. Luta försiktigt skålen för att säkerställa jämn exponering av transfektionskomplexet för cellerna. Lägg tillbaka cellerna i inkubatorn i 48 timmar.
        OBS: Toxicitet bör observeras efter 24 timmar (dag 2).
      8. Efter 48 timmar (dag 3) samlar du försiktigt upp det virusinnehållande mediet i ett separat koniskt rör med hjälp av en pipett och centrifugerar i 5 minuter vid 300 x g (vid rumstemperatur).
      9. Tillsätt 5 ml förvärmt MSC-lentiförpackningsmedium till T75-kolven med 293T-celler och lägg tillbaka den i inkubatorn över natten.
      10. Efter centrifugeringen filtreras supernatanten med ett 0,45 μm sterilt filter genom att supernatanten pipetteras direkt genom filtret. Förvara det virusinnehållande mediet vid 4 °C över natten.
      11. Efter ytterligare 24 timmar (dag 4) samlar du återigen försiktigt upp det virusinnehållande mediet i ett separat koniskt rör med hjälp av en pipett och centrifugerar i 5 minuter vid 300 x g (vid rumstemperatur).
      12. Kombinera viruset med föregående skördedagsvirus och blanda för att säkerställa en homogen lösning. I det här läget kan protokollet pausas och startas om senare, beroende på den experimentella tidslinjen. Lentiviruset kan aliciteras och frysas vid -80 °C, eller så kan lentiviruset förvaras på is medan "Transduction of iMSCs with SCX" fortsätter (steg 3.3).
        OBS: När lentivirusalikvoter har frysts och tinats ska du inte frysa in dem igen.
  3. Transduktion av iMSCs med SCX
    1. Utför titerplattetransduktion.
      1. På dag 0, utför "Standard lifting cells protocol".
      2. Återsuspendera cellerna i MSC-media och räkna de livsdugliga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare.
      3. I en 6-håls platta, tillsätt 4 x 103 celler/cm2. Plätera om resten i en extra 150 mm platta med 20 ml MSC-media (detta kommer att vara kontrollplattan). Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C.
      4. Nästa dag (dag 1) bör cellerna vara ~40% konfluenta. Förvärm odlingsmediet på lentiförpackningen och tina polybrenen och cirka 3 ml lentivirus på is (eller om det görs samma dag som virusinsamlingen, förvara på is tills det används).
      5. Tillsätt lenti-förpackningsmedium och lentivirus till brunnarna baserat på önskade titer (dvs. 12,5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %). Tillsätt 0,5 μl polybren för att uppnå en slutlig koncentration på 5 μg/ml (stamkoncentration: 10 mg/ml, se materialförteckning).
      6. Snurra runt plattan för att säkerställa jämn exponering för alla celler. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn vid 37 °C i 48 timmar.
    2. Bedöm SCX lentivirus-titerns effektivitet med flödescytometri.
      1. Efter 48 timmar, utför "Standard lifting cells protocol".
      2. Återsuspendera cellerna i PBS och räkna livsdugliga celler med hjälp av en hemocytometer eller cellräknare. Centrifugera cellerna i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g.
      3. Ta bort supernatanten och suspendera den på nytt i 3 ml FACS-buffert för att tvätta. Överför cellsuspensionen till flödescytometrirören och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g.
      4. Upprepa FACS-bufferttvätten ytterligare två gånger och återsuspendera de slutliga cellpelletsen i 300 μL FACS-buffert. Bedöm uttrycket av GFP för varje titer med hjälp av en flödescytometrimaskin.
      5. Baserat på titrar och antal cellviabiliteter, bestäm lämplig lentivirustiter för att fortsätta med transduktionen. I det här läget kan protokollet pausas och startas om senare, beroende på den experimentella tidslinjen.
    3. Utför storskalig SCX-transduktion.
      OBS: De angivna volymerna är per 1x 150 mm plåt eller 1x T175-kolv. Detta kan justeras i enlighet med detta beroende på önskad kärlstorlek och transduktionsskala.
      1. På dag 0, utför "Standard lifting cells protocol".
      2. Återsuspendera cellerna i MSC-media och räkna de livsdugliga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare. Frö cellerna vid 4 x 103 celler/cm2. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C.
      3. Nästa dag (dag 1) bör cellerna vara ~40% konfluenta. Förvärm odlingsmediet för lentiförpackning och tina polybrene och den förberäknade mängden lentivirus på is.
      4. Baserat på den beslutade titern, tillsätt önskad mängd lentipackande odlingsmedium och lentivirus till brunnarna. Tillsätt 5 μg/ml polybrene (stamkoncentration: 10 mg/ml).
      5. På dag 3, observera cellerna under ett fluorescerande mikroskop. Den nyproducerade iMSCSCX+ ska fluorescera GFP. Byt ut det virusinnehållande mediet mot förvärmda MSC-medier. I det här läget kan protokollet pausas och startas om senare, beroende på den experimentella tidslinjen.

4. iMSCSCX+ passering och expansion

  1. Utför passering, expandering, frysning och upptining av iMSCSCX+ enligt samma som för iMSCs, enligt beskrivningen i steg 2 i protokollet.

5. Mekanisk belastning

OBS: Detta avsnitt tar minst 4 dagar men kan vara längre beroende på om cellkontraktion observeras.

  1. Förberedelse av experiment
    1. Förbered silikonplattorna.
      1. Autoklav 2 silikonplattor (se materialförteckning). Ta sedan bort silikonplattorna från autoklavpåsen under sterila förhållanden och placera dem i 150 mm plattor.
      2. Kombinera 130 μl fibronektin (100x, se materialtabell) med 13 ml steril PBS i ett 15 ml koniskt rör. Vänd röret flera gånger för att blanda.
      3. Tillsätt 400 μl fibronektinlösning till varje brunn på silikonplattorna. Inkubera plattorna vid 37 °C i minst 2 timmar eller över natten.
      4. Före användning, aspirera fibronektinlösningen och låt plattorna lufttorka i cellodlingshuven i minst 30 minuter för att låta fibronektinlösningen avdunsta helt.
        OBS: Fibronektinlösningen kan avlägsnas från brunnarna i förväg, och de nu belagda plattorna kan sitta vid 37 °C i upp till ett par veckor fram till användning.
    2. Förbered MSC stretchmedia.
      1. Bered MSC-stretchmedia genom att tillsätta 140 μl askorbinsyra (stam: 100x, slutkoncentration: 50 μg/ml) till 14 ml förvärmda MSC-medier i ett 15 ml koniskt rör.
        OBS: Askorbinsyran måste tillsättas färsk till MSC-mediet före varje mediebyte.
  2. Sådd av iMSCSCX+ i silikonplattorna
    1. Utför "Standard lifting cells protocol" (steg 1.3).
    2. Återsuspendera cellerna i MSC-media och räkna de livsdugliga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare.
    3. Beräkna volymen cellsuspension som behövs för att erhålla 1,25 x 104 celler/cm2.
    4. Ta bort denna volym MSC-stretchmedia från det 15 ml koniska röret. Lägg till målcellerna. Vänd upp och ner på den nya cellsuspensionen så att den blir homogen.
    5. Tillsätt 400 μl av den nya cellsuspensionen till varje brunn på båda silikonplattorna.
    6. Sätt tillbaka locket på 150 mm-plattorna och lägg tillbaka dem i inkubatorn vid 37 °C i 24 timmar.
  3. Enaxlig spänning
    1. Nästa dag, skölj sträckapparaten (se materialtabell) med ddH2O följt av 70 % etanol. Torka av apparaten, placera den i cellodlingskåpan och UV i 15 minuter.
    2. Hämta de sådda plattorna och kontrollera brunnarna för god cellfäste.
    3. Lämna en platta i inkubatorn (statisk kontroll) och placera den andra sådda silikonplattan i sträckapparaten genom att rikta in skruvarna med hålen i silikonplattan. Sätt tillbaka locket på apparaten för att säkerställa sterilitet.
    4. Fäst apparaten med den sådda silikonplattan på den elektroniska källan (se materialtabell) och placera den i inkubatorn vid 37 °C.
    5. Ställ in det cykliska stretchprotokollet på 4 % sinusformad belastning, 0.5 Hz, 2 timmar per dag i programmet. Börja stretchen genom att trycka på startknappen en gång. Stretching bör påbörjas omedelbart.
    6. Sträck ut cellerna i minst 3 dagar. Övervaka cellerna dagligen och stoppa stretchingprotokollet om cellkontraktion kan observeras. Byt ut materialet till nytt MSC stretch-material varannan dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Humana iPSCs differentiering till iMSCs
Som tidigare beskrivits innebär det nuvarande protokollet för differentiering av iPSCs till iMSCs bildandet av embryoidkroppar2. Denna process tar cirka tio dagar att inducera iMSC från iPSCs (Figur 1A). Det rekommenderas dock starkt att passera de nygenererade iMSC:erna minst två gånger. Detta hjälper inte bara till att eliminera behovet av gelatinbelagda plattor utan skapar också ett stabilt MSC-uttryck. Flödescytometrikvantifiering, utförd efter sex passager efter differentiering, visar en nästan ren cellpopulation med högt uttryck av klassiska MSC-ytmarkörer, inklusive CD44 (83,1 %), CD90 (88,4 %) och CD105 (99,2 %)17,18 (Figur 1B). När det gäller morfologi bör iMSC likna MSC i benmärgen och verka långsträckta och fibroblastliknande (Figur 1C).

Genteknik av iMSCs för att överuttrycka SCX med hjälp av lentiviral transduktion
Lentivirus framställdes genom transfektering av HEK293T/17-celler med pLenti-C-mGFP-vektorn, i vilken SCXB har satts in för att uttrycka SCX-GFP+, tillsammans med två förpackningsplasmider. Transfektioner utfördes med BioT-metoden15,16 med ett 1,5:1-förhållande mellan BioT (μl) och DNA (μg).

HEK293T/17 celler såddes med en densitet av 5,3 x 104 celler/cm2 18-24 timmar före transfektion. Vid tidpunkten för transfektion bör cellerna nå 80-95 % sammanflöde för att undvika titrar med låg effektivitet (figur 2B1, till vänster). Inom 24 timmar efter tillsats av plasmidcocktailen observerades en viss toxicitet, som nådde en topp efter 48 timmar (figur 2B2). Eftersom den lentivirala SCX-vektorn är GFP-konjugerad bör GFP-uttrycket kunna observeras efter 48 timmar (figur 2B3). Förekomsten av hög toxicitet i kombination med GFP-uttryck är en tillförlitlig indikator på framgångsrik transfektion. Lentiviruset samlades in vid 48 timmar och 72 timmar, och transduktionseffektiviteten utvärderades med hjälp av flödescytometri och genuttrycksanalys. Den absoluta intensiteten av GFP-positiva celler användes som en proxy för SCX-integrationer, och den var signifikant högre i de högre titrarna (Figur 3A). Transduktionseffektiviteten, mätt som procentandelen SCX-GFP+ -celler, visade en dos-responseffekt baserad på lentivirusmängden (figur 3B). Flödescytometri för iMSCSCX+ vid olika passager visade också hög stabilitet, utan förändringar i transgenuttrycksnivåer eller andelen transducerade celler (Figur 3C). Dessutom, efter 4 veckors regelbunden odling utan sortering, bibehöll iMSCSCX+ ett stabilt överuttryck av SCX (Figur 3D). Storskalig transduktion utfördes baserat på titern, med användning av 75 % lentivirus (Figur 2C).

Mekanisk belastning av iMSCSCX+
iMSCSCX+-cellerna såddes på deformerbara silikonplattor med en celldensitet på 1,25 x 104 celler/cm2 (Figur 4A,B) för att möjliggöra cellbindning innan stretchingprotokollet påbörjades. Den slutliga såddtätheten optimerades för att förhindra överväxt i flera lager. Det är värt att notera att alltför höga såddtätheter resulterade i för tidig cellkontraktion och tidig celldöd (Figur 4D). För den statiska kontrollgruppen pläterades cellerna i identiska plattor men utan att genomgå någon sträckning. iMSCSCX+-cellerna utsattes för sträckning i en 2D-bioreaktor i minst tre dagar, upp till sju dagar, vid 4 % enaxlig töjning och 0,5 Hz i 2 timmar per dag. Denna stretching är förenlig med vad som har beskrivits som fysiologiskt relevant9. Efter flera dagars stretching kan en viss grad av cellorganisation observeras jämfört med den statiska gruppen, som uppvisade slumpmässig cellorganisation (Figur 4C). Falloidinfärgning av aktinfilamenten belyser ytterligare hur cellerna verkar växa vinkelrätt mot sträckningsriktningen, i motsats till den slumpmässiga cellorganisationen som observerats i de statiska plattorna (Figur 4E). För att karakterisera de nybildade iTenocyterna samlades cellerna in efter tre och sju dagar för analys av genuttryck, som tidigare rapporterats14. Genuttrycksanalys avslöjar att iMSCSCX+-cellerna är mekanoresponsiva, eftersom det finns en signifikant uppreglering av tenogena gener (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX och TPPP3)5,7,19,20 vid både tre och sju dagar, jämfört med bara iMSCs vid dag 0 (Figur 5A). Dessutom var kollagendepositionen i media efter 7 dagars stretching signifikant högre i iMSCSCX+-gruppen jämfört med alla andra grupper (Figur 5B).

Figure 1
Figur 1: Schematisk iMSC-differentiering och karakterisering av flödescytometri. (A) Övergripande schema över iTenocytgenerering och tidslinje för iMSC-induktion. Återges med tillstånd från Papalamprou A. et al.14. (B) Flödescytometrikvantifiering visar en hög procent av cellerna som uttrycker klassiska MSC-ytmarkörer för iPSC-härledda MSC efter 6 passager efter differentiering. Anpassad med tillstånd från Sheyn D. et al.2. (C) Faskontrastbilder av celler efter differentiering visar fibroblastliknande morfologi. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Produktionsschema för iMSCSCX+ . (A) Övergripande schema för transfektion med användning av 2:a generationens SCX-lentivirusvektor och transduktion av iMSCs. Återges med tillstånd från Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 celler före tillsats av plasmidcocktail. (B2) HEK293T/17 celler, efter 48 timmar, uttrycker GFP och uppvisar toxicitet. (B3) Uttryck av GFP som kan observeras i HEK293T/17-celler indikerar framgångsrik transfektion. (C) Genererade iMSCSCX+ -celler (med 75 % titer) uttrycker SCX-GFP+ i kärnorna. Skalstreck = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av transduktionseffektiviteten med flödescytometri och genuttryck. Den absoluta intensiteten av GFP-positiva celler användes som en proxy för SCX-integrationer med hjälp av flödescytometri. Vektortitrar validerades genom flödescytometrianalys för alla celler för att bedöma lentiviral MOI. (A) Absolut fluorescens per virustiter. (B) Transduktionseffektivitet utvärderad som procentandelen SCX-GFP+ -celler. En dos-responseffekt av lentiviral belastning i transduktionseffektivitet observerades när flödesresultaten presenterades som en procentandel GFP+-celler. MOI, multiplicitet av infektioner, n = 3 oberoende transduktioner. Envägs ANOVA användes för att jämföra titrar; data är medelvärdet ± SD; *p < 0,05. (C) Flödescytometri för iMSCSCX+ efter flera omgångar av passage indikerar ingen förändring i nivån av stabilt transgenuttryck och ingen förändring i andelen transducerade celler. Observera att iMSCs transducerade med 100 % titrar slutade dela sig vid P3. (D) iMSCs transducerade med SCX-GFP+ lentivirusvektor (75 %, MOI = 2,9 e5 TU/ml) och bedömde genuttrycket av SCX vid 4 veckors regelbunden odling utan sortering. SCX-uttrycket var signifikant uppreglerat i iMSCSCX+ och visade stabilt överuttryck av SCX efter 4 veckor. TU, transduktionsenheter; data är medelvärdet ± SD, **p > 0,01. Återges med tillstånd från Papalamprou A. et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: iMSCSCX+ sådd i en 2D-bioreaktor och genomgår cyklisk sträckning. (A) Schematisk 2D-bioreaktor. Återges med tillstånd från Papalamprou A. et al.12. (B) Cellerna sås först in i flexibla silikonplattor och inkuberas vid 37 °C för att möjliggöra fastsättning före cyklisk sträckning i 2D-bioreaktorn. (C) iMSCSCX+ sträcktes ut i en 2D-bioreaktor i upp till 7 dagar. För statiska kontroller pläterades cellerna i identiska plattor men utan sträckning. (C1) Statisk kontrollplatta efter 7 dagar uppvisar stokastiskt arrangemang av celler. (C2) Sträckt platta efter 7 dagar visar relativt mer cellorganisation. (D) Tre exempel på vad som inte bör observeras. När cellsåddstätheten är för hög eller cellerna har sträckts ut i för många dagar börjar cellerna lossna. (D1) Cellerna är bara något övervuxna. Gula pilar indikerar början på för tidig cellkontraktion. (D2) Måttlig överväxt. Cellerna börjar lossna från plattan. (D3) Allvarlig överväxt. Cellerna växer inte längre i monolager och har bildat 3D-strukturer. Svarta skalstreck = 400 μm. Vita skalstreck = 1000 μm. (E) Efter 7 dagars sträckning (eller i odling för den statiska plattan) fixerades cellerna med falloidin för aktinfilament (röd) och motfärgades med DAPI för kärnor (blå). Vita skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Stimulering av tenogena markörgenuttryck genom Scx-överuttryck och enaxlig sträckning i en 2D-bioreaktor. (A) iMSCSCX+ sträcktes ut i en 2D-bioreaktor i 7 dagar. För statiska kontroller pläterades cellerna i identiska plattor men utan sträckning. Genuttrycksanalyser visar att iMSCSCX+ är mekanoresponsivt. ND = ingen detektion. Envägs ANOVA användes för att jämföra genuttryck vid varje tidpunkt vs. d0. N = 8/grupp. (B) Kollagendeposition efter 7 dagars sträckning i 2D-bioreaktorn. Data är medelvärde ± SD; n = 8/grupp; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Återges med tillstånd från Papalamprou A. et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll genereras iTenocyter genom tre huvudsteg: (1) induktion av iPSCs till iMSCs, (2) överuttryck av SCX med hjälp av en lentiviral vektor och (3) mognad av celler genom 2D enaxlig spänning.

Protokollet som presenteras för att differentiera iPSC:er till iMSCs har tidigare beskrivits av vår grupp2. Sedan den publiceringen har många protokoll utvecklats, inklusive ett etablerat protokoll för användning av iMSC i kliniska prövningar 21,22,23, samt kommersiellt tillgängliga differentieringssatser. En genomgång av trilineagepotentialen hos iMSCs har också undersökts tidigare2. Även om metoderna skiljer sig åt, betonar alla protokoll behovet av expansion av iMSC efter differentiering för flera passager för att säkerställa ett stabilt uttryck av MSC-ytmarkörer. I detta skede, att använda ett 1:3 delningsförhållande vid cirka 70 % sammanflöde kommer att resultera i en relativt sammanflytande platta inom 4-6 dagar efter passering.

När man väljer den optimala titern för transduktion är det viktigt att hitta en balans mellan cellviabilitet och effektivitet. Även om de iMSCs som transducerats med 100%-titern kan visa den högsta nivån av SCX-GFP-positiva celler, är det värt att notera att dessa celler upphörde att dela sig tre passager efter transduktion (Figur 3C), möjligen på grund av DNA-inducerad toxicitet. Därför är det lämpligt att använda en titer som är mindre än 100%. Innan du sår silikonplattorna rekommenderas det att omvärdera SCX-GFP-nivåerna med hjälp av flödescytometri. Om data indikerar att effektiviteten är under det önskade tröskelvärdet är det lämpligt att sortera iMSCSCX+ -cellerna före sådd, särskilt för in vivo-tillämpningar .

När iMSCSCX+-cellerna har planterats i silikonplattorna måste de inkuberas vid 37 °C över natten för att cellerna ska kunna fästas innan de sträcks ut. Den beskrivna celltätheten på 1,25 x 104 celler/cm2 i silikonplattorna optimerades för att förhindra överväxt av monolager, vilket kan bidra till statisk spänning24. Dessutom tyder studier på att direkt cell-till-cell-kontakt i konfluenta kulturer i substrat med varierande styvhet kan förändra cellbeteendet 24,25,26. Under pilotförsök observerades en viss synlig cellavlossning från silikonplattorna, särskilt vid senare tidpunkter (Figur 4D). Detta kan tillskrivas bildandet av ECM-cellark på grund av överkonfluens24. Därför inkluderar kritiska parametrar celldensitet och antalet sträckanfall. I de nuvarande metoderna samlades celler in dag 3 och 7 för bedömning av tenogen potential via genuttrycksanalys. Det rekommenderas dock att cellerna sträcks ut i 2D-bioreaktorn i minst tre dagar, med efterföljande övervakning av sträckta och statiska plattor för att förhindra överväxt och cellavlossning.

Efter flera sträckanfall kan en viss grad av cellanpassning och organisation observeras (Figur 4C1,E). Detta är i linje med många studier där cellinriktning vinkelrätt mot stamaxeln observeras som svar på enaxlig stam in vitro24,27. Som jämförelse visar den statiska plattan stokastisk cellorganisation (Figur 4C2,E).

Så vitt vi vet har endast ett fåtal studier undersökt de synergistiska effekterna av SCX-överuttryck och mekanisk stimulering för differentiering av MSC till tenocyter eller ligamentocyter 24,28,29. Gaspar et al. använde ett liknande 2D-bioreaktorsystem som det som beskrivs här, men tillämpade högre nivåer av total belastning (10 % vid 1 Hz under 12 timmar/dag). Intressant nog kunde de inte upptäcka förändringar i uttrycket av SCX, TNMD och COL1a1 i BM-MSC och humana tenocyter. Detta kan dock tillskrivas de högre applicerade stammarna som användes i deras studie24. Chen et al. använde en lentiviral vektor för att överuttrycka SCX i hESC-MSCs sammansatta i flerskiktade ark. De applicerade enaxlig cyklisk belastning (10 % töjning vid 1 Hz i 2 timmar/dag i upp till 21 dagar) och observerade uppreglering av COL1a1, COL1a2, COL14 och TNMD, samt ökad ECM-deposition29. Nichols et al. transfekterade tillfälligt C3H10T1/2-celler med mus-Scx cDNA i full längd och odlade cellerna i 3D-kollagenhydrogeler under enaxlig cyklisk belastning (1 %, 1 Hz, 30 min/dag i upp till 14 dagar). I likhet med våra resultat observerade deras grupp förhöjt uttryck av SCX och COL1A1 i de ansträngda och överuttryckta konstruktionerna men fann ingen förändring i TNMD-uttryck som svar på cyklisk sträckning28.

Dessutom kan det vara spännande att överväga överuttrycket av andra senrelaterade markörer som MKX. Tsutsumi et al. utforskade den kombinerade effekten av att överuttrycka MKX i C3H10T1/2-celler och utsätta dem för cyklisk mekanisk sträckning i ett 3D-system. De visade en signifikant uppreglering av SCX, COL1a1, DCN och COL3a1, tillsammans med anpassningen av kollagenfibrillbuntar och aktinfilament30.

Det är viktigt att erkänna att denna metod för att generera iTenocyter har sina begränsningar. Även om den kommersiellt tillgängliga 2D-bioreaktorn är fördelaktig för proof-of-concept-arbete, begränsar dess storlek utbytet. Om dessa celler behövs för analyser med hög kapacitet eller som en potentiell lagringsbar cellkälla för senreparationsterapier, bör man överväga att utforska system som kan implementera enaxlig stretching i större skala. Dessutom bör ytterligare undersökningar omfatta expansion av iTenocyter för att bekräfta stabilt tenogent uttryck, och att bedöma deras bidrag till in vivo-regenerering är avgörande för att utvärdera deras tenogena potential.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Samtliga författare har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Denna studie stöddes delvis av NIH/NIAMS K01AR071512 och CIRM DISC0-14350 till Dmitriy Sheyn. De två lentivirusförpackningsplasmiderna var en gåva från Simon Knott-laboratoriet (Institutionen för biomedicinska vetenskaper, Cedars-Sinai Medical Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

Bioteknik utgåva 205
Generering av inducerade pluripotenta stamcellshärledda iTenocyter <em>via</em> kombinerat skleraxisöveruttryck och 2D enaxlig spänning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter