Summary
Her præsenterer vi en protokol for ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila til overvågning af epileptiforme aktiviteter. Protokollen giver et værdifuldt værktøj til undersøgelse af ictale hændelser hos voksne Drosophila gennem ex vivo calciumbilleddannelse, hvilket giver mulighed for udforskning af de potentielle mekanismer for epilepsi på celleniveau.
Abstract
Epilepsi er en neurologisk lidelse karakteriseret ved tilbagevendende anfald, delvist korreleret med genetisk oprindelse, der påvirker over 70 millioner individer over hele verden. På trods af den kliniske betydning af epilepsi mangler den funktionelle analyse af neural aktivitet i centralnervesystemet stadig at blive udviklet. Nylige fremskridt inden for billeddannelsesteknologi i kombination med stabil ekspression af genetisk kodede calciumindikatorer, såsom GCaMP6, har revolutioneret undersøgelsen af epilepsi på både hjernedækkende og enkeltcelleopløsningsniveauer. Drosophila melanogaster er opstået som et værktøj til at undersøge de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for epilepsi på grund af dets sofistikerede molekylære genetik og adfærdsmæssige assays. I denne undersøgelse præsenterer vi en ny og effektiv protokol til ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila til overvågning af epileptiforme aktiviteter. Hele hjernen er fremstillet af cac, et velkendt epilepsi-gen, knockdown-fluer til calciumbilleddannelse med et konfokalmikroskop for at identificere den neurale aktivitet som opfølgning på det bang-følsomme anfaldslignende adfærdsassay. Cac knockdown-fluerne viste en højere anfaldslignende adfærd og unormale calciumaktiviteter, herunder flere store pigge og færre små pigge end vildtypefluer. Kalciumaktiviteterne var korreleret med anfaldslignende adfærd. Denne metode fungerer som en effektiv metode til screening af de patogene gener for epilepsi og udforskning af den potentielle mekanisme for epilepsi på celleniveau.
Introduction
Epilepsi, en kompleks kronisk neurologisk lidelse karakteriseret ved gentagelse af spontane og uprovokerede anfald og afvigende neuronal netværksaktivitet, har påvirket over 70 millioner individer over hele verden, hvilket gør det til en af de mest almindelige neurologiske sygdomme1 og fører til de tunge byrder for familier og samfund. I betragtning af virkningen af epilepsi er der udført mange undersøgelser for at identificere ætiologien af anfald, hvoraf genetik er blevet godkendt som en primær årsag til mange typer epilepsier eller epileptiske syndromer2. I de seneste årtier har fremskridt inden for genomiske teknologier ført til en hurtig stigning i opdagelsen af nye epilepsiassocierede gener, som spiller en afgørende rolle i forekomsten af anfald, herunder ionkanaler og ikke-ionkanalgener 3,4. Imidlertid forstås de underliggende mekanismer og funktionel analyse mellem generne og epileptiske fænotyper ufuldstændigt. Identifikation af epilepsiassocierede gener og mekanismer giver mulighed for effektiv behandling af patienter 5,6.
Cytosoliske calciumsignaler er centrale elementer i neuronal aktivitet og synaptisk transmission. Calciumbilleddannelse, herunder hjerneskiver7, in vivo 8,9 og ex vivo10, er blevet brugt til at overvåge neuronal aktivitet11 som markør for neuronal excitabilitet siden 1970'erne12,13. Nylige fremskridt inden for billeddannelsesteknologi i kombination med de genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er), såsom GCaMP6, har revolutioneret undersøgelsen af epilepsi på både hjernedækkende og enkeltcelleopløsningsniveauer 14,15,16, som har et højt niveau af rumlig tidsmæssig præcision. Ændringer i calciumkoncentration og transienter blev observeret i henholdsvis aktionspotentialer og synaptisk transmission14, hvilket indikerer, at ændringen af intracellulære calciumniveauer udviser en streng korrelation med neuronernes elektriske excitabilitet17,18. Calciumbilleddannelse er også blevet anvendt som en udviklingsbeslaglæggelsesmodel9 og udført i Drosophila til screening af antikonvulsive forbindelser19.
Drosophila melanogaster har været ved at fremstå som en stærk modelorganisme i videnskabelig forskning, såsom epilepsi, for sin sofistikerede molekylære genetik og adfærdsmæssige assays 20,21,22. Desuden har de avancerede genetiske værktøjer i Drosophila bidraget til ekspressionen af genetisk kodet calciumindikator GCaMP6. For eksempel muliggør de Gal4- og UAS-baserede binære transkriptionssystemer specifikt udtryk for GCaMP6 på en rumligt og tidsmæssigt kontrolleret måde. Da Drosophila er en lille organisme, kræver in vivo calciumbilleddannelse dygtige operationsfærdigheder for at udføre et kirurgisk indgreb, hvor kun en lille del af hjernens dorsal blev udsat gennem et lille vindue14,23. Samtidig kan ex vivo calciumbilleddannelse i den intakte hjerne af Drosophila bruges til at overvåge interesseområderne (ROI'er) i hele hjernen.
I denne undersøgelse præsenterer vi ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila for at overvåge epileptiforme aktiviteter. CACNA1A er et velkendt epilepsi-gen, tilhører cac Cav2-kanalen, som er en homolog til CACNA1A. Vi begyndte med at dissekere hjernen hos cac knockdown fluer tub-Gal4>GCaMP6m / cac-RNAi og billeddannelse dem ved hjælp af et konfokalmikroskop med xyt scanningstilstand. Vi analyserede derefter ændringerne i calciumsignaler for ROI'er ved at beregne indikatorer, der kvantificerer spontane anfaldslignende hændelser, såsom% ΔF / F-værdi og calciumhændelser af GCaMP6-fluorescens. Derudover udførte vi mekanisk stimulus af hvirvelmaskine for også at fremkalde anfaldsadfærdstest på cac-knockdown-fluer for at validere resultaterne af calciumbilleddannelse. Samlet set giver denne protokol et værdifuldt værktøj til undersøgelse af ictale hændelser hos voksne Drosophila gennem ex vivo calciumbilleddannelse, hvilket giver mulighed for udforskning af de potentielle mekanismer for epilepsi på celleniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protokol for bang-følsom analyse
- De eksperimentelle fluer etableres ved at krydse tub-Gal4-driverlinjen med UAS-cac-RNAi-linjen via Gal4/UAS-systemet21. Saml jomfrufluerne i tub-Gal4-linjen og hanfluerne i UAS-cac-RNAi-linjen . Overfør derefter jomfru og hanfluer i det samme hætteglas for at høste afkom.
BEMÆRK: Tub-Gal4-driverlinjen gør det muligt at opnå global knockdown af cac-genet . Brug UAS-cac-RNAi-linjen som kontrolgruppe. - Efter 3-5 dages lukning bedøves fluerne forsigtigt ved hjælp af 100% CO2 (CO2 anæstesiudstyr) og samler både karbad-Gal4>UAS-cac-RNAi-fluerne og UAS-cac-RNAi-fluerne med en børste. Overfør disse fluer til nye, rene hætteglas med mad 1 dag før testning for at sikre, at de er velforberedte.
- Bedøv forsigtigt fluerne ved hjælp af CO2. Når bedøvelsen er bedøvet, placeres forsigtigt 4-6 fluer i individuelle friske hætteglas. Lad fluerne komme sig efter anæstesi i ca. 1 time, før du fortsætter med testen.
BEMÆRK: For hver genotype blev mindst fem forsøg testet, og hvert forsøg bestod af seks hætteglas med fluer. - Opsæt kontrolapparatet. Placer et kamera (720-1080P, mindst 30-60 FPS, AF-låst) på et stativ foran et whiteboard. Juster kameraets fokus manuelt ved hjælp af et tomt hætteglas for at sikre klare og nøjagtige optagelser.
- Brug en hvirvelblander til at udføre den mekanisk inducerede anfaldslignende adfærd. Placer hvert hætteglas indeholdende 4-6 fluer på hvirvelblanderen og kør det ved den højeste indstilling (2800 o / min) i nøjagtigt 10 sekunder. Efter hvirvelstrømmen skal hætteglasset straks placeres på whiteboardet.
- Overhold fluerne og registrer enhver anfaldslignende adfærd, de udviser.
BEMÆRK: Anfaldslignende adfærd observeret hos fluer består af tre faser: anfald (manifesterer sig som vibrerende vinger), lammelse og genopretning24. Forholdet mellem anfaldsfluer og testede fluer blev defineret som anfaldshastighed.- Mål restitutionstiden som den tid, der kræves efter hvirvelstrøm, indtil fluer genvinder evnen til at stå oprejst25.
2. Protokol for calciumbilleddannelse af ex vivo-hjerne
- Opret henholdsvis tub-Gal4>UAS-GCaMP6m og tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi-linjefluer . Generer fluerne ved hjælp af Gal4/UAS binære ekspressionssystem21 for at muliggøre overvågning af calciumaktivitet i ex vivo-hjernen .
- Forbered dissektionsopløsningen som beskrevet i den medfølgende opskrift (tabel 1)26.
- Forbered den eksterne opløsning som beskrevet i tabel 1. Juster til pH 7,2 med NaOH og juster osmolariteten til 250-255 mOsm/L.
BEMÆRK: Den eksterne opløsning kan opbevares ved 4 °C i 1 uge. - Til fremstilling af dissektionsopløsningen tilsættes 9 enheder papainsuspension og L-lysin (2 mg/ml) til 600 μL af den eksterne opløsning. Vortex opløsningen og vent 15 minutter, indtil opløsningen er klar.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge dissektionsopløsningen inden for 4 timer.
- Forbered den eksterne opløsning som beskrevet i tabel 1. Juster til pH 7,2 med NaOH og juster osmolariteten til 250-255 mOsm/L.
- Perfus den eksterne opløsning med iltet saltvand (95% ilt og 5% kuldioxid) i 5 minutter før brug. Brug pipetten til at overføre ca. 10 μL af dissektionsopløsningen til en petriskål. Denne løsning vil give de nødvendige betingelser for hjernedissektion og billeddannelse.
- Dissekere omhyggeligt hjernen i både tub-Gal4>UAS-GCaMP6m og tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjerne ved hjælp af sprøjtenålene og mikroskopet. Følg den etablerede protokol for hjernedissektion27.
- Brug en pipette til at overføre den tilberedte hjerne til en optageskål, der indeholder 5 ml frisk ekstern opløsning, og immobiliser hjernen ved hjælp af en C-skarp holder i optageskålen i 3-5 minutter til restitution.
BEMÆRK: Den C-skarpe holder var lavet af en metalhalvcirkel med 7 mm diameter krydset af parallelle fibre 0,5 mm fra hinanden. - Opsætning og anskaffelse af konfokal billeddannelse
- For konfokal billeddannelse skal du fange hver hjerne med en 20x objektiv og xyt scanningstilstand. Identificer svampekroppens neuroner med en yderligere 4,5x digital forstærkning baseret på 20x optisk forstærkning.
BEMÆRK: Hver ex vivo hjerne kan afbildes i mere end 1 time. - Få hele hjerne-GCaMP6m-emissionen ved 488 nm laserexcitation med 16 μw lasereffekt. Indstil scanningsparametrene til en hastighed på 400 med en pixelstørrelse på 256 pixels x 256 pixels. Brug en 5,3 Hz anskaffelseshastighed, og optag i en varighed på 3 min.
- For konfokal billeddannelse skal du fange hver hjerne med en 20x objektiv og xyt scanningstilstand. Identificer svampekroppens neuroner med en yderligere 4,5x digital forstærkning baseret på 20x optisk forstærkning.
- Identificer 5-8 ROI'er i hver hjerne og analyser fluorescensen. Bestem manuelt cellekroppen af svampekropsneuroner som interesseområde28.
- Mærk de identificerede neuroner og mål deres fluorescensintensiteter ved hjælp af ImageJ. Analyser fluorescensdataene for GCaMP6m via% ΔF / F = (F1-F0) / (F0-B). Definer den intracellulære fluorescens, der stiger mellem 2 og 2,5 standardafvigelser over basislinjen, som små pigge, og intracellulær fluorescens, der øges mere end 2,5 standardafvigelser over basislinjen, som store pigge. Analyser hyppigheden af calciumspidser ved hjælp af elevens t-test.
BEMÆRK: F0 blev defineret som basislinjen ved den gennemsnitlige fluorescensintensitet af de første 5 billeder i ROI'er, F1 som fluorescensintensiteten for det givne tidspunkt og B som baggrund uden fluorescens. Neuronernes tidsmæssige fysiologiske aktiviteter er også nyttige til at skelne dem fra støjtegn.
- Mærk de identificerede neuroner og mål deres fluorescensintensiteter ved hjælp af ImageJ. Analyser fluorescensdataene for GCaMP6m via% ΔF / F = (F1-F0) / (F0-B). Definer den intracellulære fluorescens, der stiger mellem 2 og 2,5 standardafvigelser over basislinjen, som små pigge, og intracellulær fluorescens, der øges mere end 2,5 standardafvigelser over basislinjen, som store pigge. Analyser hyppigheden af calciumspidser ved hjælp af elevens t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol fandt vi, at cac knockdown-fluer viste signifikant højere anfaldslignende adfærd end WT-fluerne (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Elevens t-test, figur 1A). De fleste tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-fluer kom sig inden for 1-5 s, mens UAS-cac-RNAi-fluer kom sig inden for 2 s. Restitutionsprocenten for cac knockdown-fluer inden for 1 s var signifikant lavere end WT-fluerne (88,08 ± 1,89 [n = 6] vs 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; Elevens t-test, figur 1B). Som vist i figur 2 blev calciumsignaler observeret i fluernes svampekrop. Små pigge forekom mindre i cac knockdown-fluer (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Studentens t-test), mens store pigge forekom mere i cac knockdown-fluer (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Disse resultater indikerer, at calciumsignalerne observeret i fluer korrelerer stærkt med neuronal aktivitet og viste konsistens med den anfaldslignende adfærd i cac knockdown-fluer.
Figur 1: Klassiske anfaldsrater og restitutionstid hos fluer. (A) Beslaglæggelser forekom med en højere hastighed i cac knockdown-fluer. (B) Restitutionstiden efter beslaglæggelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative calciumsignaler i fluernes svampekrop. (A) Calciumsignaler i udvalgte 5 celler i fluernes svampekrop. (B) Typisk spor: Ændring i fluorescens (ΔF / F) over tid fra en individuel celle i svampelegemet i knockdown- og vildtypefiler. (C) Globale eller neuronale calciumhændelser, der forekommer i fluernes svampekrop, skelnes i små og store pigge. (D) Calciumpigge i hele hjernen på knockdown-fluer og kontroller. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Liu et al.29. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ekstern løsning til optagelse og fremstilling af dissektionsløsning. | |
| Natriumchlorid | 101 mM |
| Kaliumchlorid | 3 mM |
| Calciumchlorid | 1 mM |
| Magnesiumchlorid | 4 mM |
| Glukose | 5 mM |
| Natriumphosphat monobasisk | 1,25 mM |
| Natriumbicarbonat | 20,7 mM |
| Dissektion løsning | |
| Ekstern løsning | 600 μL |
| Papain suspension | 9 U |
| L-lysin | 2 mg/ml |
Tabel 1: Sammensætning af eksterne og dissektionsopløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calciumionen fungerer som en afgørende anden budbringer, der spiller en afgørende rolle i en række fysiologiske og patofysiologiske reaktioner på både kemiske og elektriske forstyrrelser. Desuden er det topologiske element i de præsynaptiske P / Q-kanaler, kodet af det humane CACNA1A gen, blevet identificeret som ansvarlig for formidling af udledningen af forskellige neurotransmittere, herunder glutamat 30,31,32, og er tæt forbundet med epilepsi 33,34. Tidligere udviste Cac knockdown-fluernes opførsel ikke den sværhedsgrad, der blev rapporteret i nogle mutanter og viste endda undertrykkende virkninger i visse dobbeltmutante fluer35 . Resultaterne af denne undersøgelse afslører, at cac knockdown-fluer er mere tilbøjelige til anfald end deres vildtype-kolleger. Denne observation stemmer overens med, at patienter og andre dyremodeller, der bærer CACNA1A funktionstabsvarianter, er ramt af epilepsi28,36. Globalt kan knockdown af cac direkte forstyrre neuromuskulær transmission i motorneuroner. Selvom bevægelse hos voksne og larver viste sig ikke at være prædiktiv for anfaldsmodtagelighed, skal bidraget fra motorneuroners cac i anfaldsadfærd undersøges yderligere37. Konsekvent bemærkede vi i ex vivo calciumbilleddannelse en større andel af calciumhændelser i svampekroppen af cac knockdown-fluer end for vildtypefluerne (WT), hvilket indikerede en højere frekvens af neuronal affyring9. Svampekroppen af fluer betragtes som løst analog med hippocampus og cortex i pattedyrhjernen. Da anfald normalt forekommer i hippocampus og cortex hos mennesker, bruges svampekroppen til at studere anfaldsrelateret neural calciumaktivitet i denne undersøgelse. Afslutningsvis fastslog denne undersøgelse konsistensen af det bangfølsomme anfaldslignende assay og calciumbilleddannelse i Drosophila.
Inden for calciumbilleddannelse muliggør anvendelse af calciumindikatoren GCaMP6 i kombination med konfokal mikroskopi overvågning af ændringer i calciumkoncentration inden for forskellige sammenhænge såsom in vivo, i cellekulturer, i hjerneskiver og i ex vivo intakt hjernevæv i Drosophila-modellen. Det er imidlertid almindeligt forstået, at in vivo-billeddannelse af calciumfluxer i centralnervesystemet i Drosophila nødvendiggør et raffineret kirurgisk indgreb for at opnå optisk adgang til hjernen; Denne hindring kan hæmme denne tekniks praktiske anvendelighed og udvikling i de enkelte laboratorier 8,16. Zebrafisk er også en vigtig dyremodel til at studere epilepsi. In vivo calciumbilleddannelsesmetoden blev også etableret tidligere36. Det er dog kun zebrafisklarver, der kan bruges til in vivo-billeddannelse. På den anden side, selvom cellekultur og hjerneskivemodeller kan give billeder med højere opløsning, kan hjernens integritet og dens neurale netværk ikke replikeres fuldt ud i cellekultur eller hjerneskiver på grund af strukturforstyrrelser. Den nuværende undersøgelse behandler disse spørgsmål ved at implementere isoleret intakt Drosophila-hjernevæv til calciumbilleddannelse og dermed undgå behovet for komplekse kirurgiske teknikker og bevare hjernens og neurale netværks integritet uden afbrydelse. Ex vivo-tilgangen giver også et overlegent signal-støj-forhold sammenlignet med in vivo-billeddannelsesteknikker.
Denne undersøgelse belyser forskellige centrale procedurer i protokollen vedrørende dannelsen af tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjefluer . Indledningsvis spillede dobbeltbalanceren en afgørende rolle for at opnå de ønskelige fluer. Markerede balancere giver forskere mulighed for at følge alleler og kromosomer gennem komplekse krydsninger i flere generationer38. Efterfølgende var det vigtigt at bruge Papain-suspension til at blødgøre hjernens overfladefiber for at blødgøre hjernens overfladefiber for effektiv adskillelse af det intakte hjernevæv og forbedret mikroskopisk visualisering. For at stabilisere hjernen og forhindre neuronskader under eksperimentering blev det desuden anset for nødvendigt at bruge en C-skarp holder med nylonsigtekorn27.
Afslutningsvis er calciumbilleddannelse, der anvendes her sammen med det bang-følsomme anfaldslignende adfærdsassay i Drosophila , et kraftfuldt system til screening af de epilepsiassocierede gener og udforskning af den potentielle mekanisme for epilepsi på celleniveau. Denne teknik kan bestemt ikke studere calciumsignalerne i realtid, der er korreleret med dyrs adfærd som andre in vivo-metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (bevilling nr. 2022A1515111123 til Jing-Da Qiao) og planlægger at forbedre videnskabelig forskning i GMU (Jing-Da Qiao). Dette arbejde blev også støttet af Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (finansiering nr. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
