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Neuroscience

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Abstract

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.

Introduction

A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns1 e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a um rápido aumento na descoberta de novos genes associados à epilepsia, que desempenham um papel crucial na ocorrência de crises, incluindo canais iônicos e genes de canais não iônicos 3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes e a análise funcional entre os genes e fenótipos epilépticos são incompletamente compreendidos. A identificação de genes e mecanismos associados à epilepsia oferece a possibilidade de um manejo eficiente dos pacientes 5,6.

Sinais citosólicos de cálcio são elementos fundamentais na atividade neuronal e transmissão sináptica. A imagem do cálcio, incluindo os cortes cerebrais7, in vivo8,9 ee x vivo10, tem sido utilizada para monitorar a atividade neuronal11 como marcador de excitabilidade neuronal desde a década de 197012,13. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com os indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais 14,15,16, que apresenta um alto nível de precisão espaço-temporal. Alterações na concentração de cálcio e transientes foram observados nos potenciais de ação e transmissão sináptica, respectivamente14, indicando que a alteração dos níveis intracelulares de cálcio apresenta estreita correlação com a excitabilidade elétrica dos neurônios17,18. A cintilografia com cálcio também tem sido aplicada como modelo de crise do desenvolvimento9 e realizada em Drosophila para triagem de compostos anticonvulsivantes19.

Drosophila melanogaster vem emergindo como um poderoso organismo modelo em pesquisas científicas, como a epilepsia, por sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais20,21,22. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas em Drosophila têm contribuído para a expressão do indicador de cálcio codificado geneticamente GCaMP6. Por exemplo, os sistemas transcricionais binários baseados em Gal4 e UAS permitem a expressão específica do GCaMP6 de forma controlada espacial e temporalmente. Como a Drosophila é um organismo minúsculo, a imagem do cálcio in vivo requer habilidades operacionais proficientes para realizar uma intervenção cirúrgica, na qual apenas uma pequena parte do dorso do cérebro foi exposta através de uma pequena janela14,23. Ao mesmo tempo, imagens de cálcio ex vivo no cérebro intacto de Drosophila podem ser usadas para monitorar as regiões de interesse (ROIs) de todo o cérebro.

Neste estudo, apresentamos imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. CACNA1A é um gene bem conhecido da epilepsia, o cac pertence ao canal Cav2, que é um homólogo ao CACNA1A. Começamos dissecando os cérebros de moscas knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e imageando-os usando um microscópio confocal com modo de varredura xyt. Em seguida, analisamos as mudanças nos sinais de cálcio das ROIs por meio do cálculo de indicadores que quantificam eventos espontâneos semelhantes a crises, como o valor de %ΔF/F e eventos de cálcio da fluorescência GCaMP6. Adicionalmente, realizamos estímulos mecânicos por máquina de vórtice para induzir testes de comportamento convulsivo em moscas cac-knockdown, bem como para validar os resultados da imagem de cálcio. Em geral, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos Drosophila através de imagens de cálcio ex vivo, permitindo a exploração dos mecanismos potenciais da epilepsia em nível celular.

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Protocol

1. Protocolo para ensaio bang-sensitive

  1. Estabelecer as moscas experimentais cruzando a linha condutora tub-Gal4 com a linha UAS-cac-RNAi através do sistema Gal4/UAS21. Coletar as moscas virgens da linhagem tub-Gal4 e as moscas machos da linhagem UAS-cac-RNAi . Em seguida, transfira as moscas virgens e machos para o mesmo frasco para colher a prole.
    NOTA: A linha de driver tub-Gal4 permitirá alcançar o knockdown global do gene cac . Use a linha UAS-cac-RNAi como grupo controle.
  2. Após 3-5 dias de eclosão, anestesiar suavemente as moscas usando o CO2 a 100% (equipamento de anestesia CO2 ) e coletar as moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi e UAS-cac-RNAi com uma escova. Transfira essas moscas para frascos de alimentos novos e limpos 1 dia antes do teste para garantir que estejam bem preparadas.
  3. Anestesie suavemente as moscas usando o CO2. Uma vez anestesiado, coloque cuidadosamente 4-6 moscas em frascos frescos individuais. Permita que as moscas se recuperem da anestesia por cerca de 1 h antes de prosseguir com o teste.
    NOTA: Para cada genótipo, um mínimo de cinco ensaios foram testados, e cada ensaio consistiu de seis frascos de moscas.
  4. Configure o aparelho de controlo. Posicione uma câmera (720-1080P, 30-60 FPS pelo menos, AF travado) em um tripé na frente de um quadro branco. Ajuste o foco da câmera manualmente usando um frasco para injetáveis vazio para garantir imagens claras e precisas.
  5. Use um misturador de vórtices para executar o comportamento semelhante a uma convulsão induzida mecanicamente. Coloque cada frasco para injetáveis contendo 4-6 moscas no misturador de vórtices e execute-o na configuração mais alta (2800 rpm) durante exactamente 10 s. Após o vórtice, coloque imediatamente o frasco para injetáveis no quadro branco.
  6. Observe as moscas e registre qualquer comportamento semelhante a uma convulsão que elas exibem.
    NOTA: O comportamento semelhante a uma convulsão observado em moscas consiste em três estágios: convulsão (manifestando-se como asas vibratórias), paralisia e recuperação24. A proporção de moscas convulsivas para moscas testadas foi definida como taxa de crises.
    1. Meça o tempo de recuperação como o tempo necessário após o vórtice até que as moscas recuperem a capacidade de ficar em pé25.

2. Protocolo para cintilografia de cálcio em cérebro ex vivo

  1. Estabeleça as moscas da linha tub-Gal4>UAS-GCaMP6m e tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , respectivamente. Gerar as moscas usando o sistema de expressão binária Gal4/UAS21 para permitir o monitoramento da atividade de cálcio no cérebro ex vivo .
  2. Preparar a solução de dissecção conforme descrito na receita fornecida (Tabela 1)26.
    1. Prepare a solução externa conforme descrito na Tabela 1. Ajustar para pH 7,2 com NaOH e ajustar a osmolaridade para 250-255 mOsm/L.
      NOTA: A solução externa pode ser armazenada a 4 °C durante 1 semana.
    2. Para preparar a solução de dissecção, adicionar 9 unidades de suspensão de papaína e L-lisina (2 mg/mL) a 600 μL da solução externa. Vórtice a solução e aguarde 15 minutos até que a solução esteja límpida.
      NOTA: Recomenda-se usar a solução de dissecção dentro de 4 h.
  3. Perfundir a solução externa com soro fisiológico oxigenado (oxigênio a 95% e dióxido de carbono a 5%) por 5 minutos antes do uso. Use a pipeta para transferir cerca de 10 μL da solução de dissecção para uma placa de Petri. Esta solução fornecerá as condições necessárias para a dissecção cerebral e exames de imagem.
  4. Disseque cuidadosamente os cérebros das linhas tub-Gal4>UAS-GCaMP6m e tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi usando as agulhas da seringa e o microscópio. Seguir o protocolo estabelecido para dissecçãocerebral27.
  5. Use uma pipeta para transferir o cérebro preparado para uma placa de gravação contendo 5 mL de solução externa fresca e imobilize o cérebro usando um suporte C-sharp na placa de gravação por 3-5 min para recuperação.
    OBS: O suporte em C afiado foi confeccionado em semicírculo metálico com 7 mm de diâmetro atravessado por fibras paralelas a 0,5 mm de distância.
  6. Configuração e aquisição de imagens confocais
    1. Para imagens confocais, capture cada cérebro com uma objetiva de 20x e o Modo de Varredura xyt. Identifique os neurônios do corpo do cogumelo com uma amplificação digital adicional de 4,5x baseada em amplificação óptica de 20x.
      NOTA: Cada cérebro ex vivo pode ser fotografado por mais de 1 h.
    2. Adquira toda a emissão cérebro-GCaMP6m a 488 nm de excitação a laser com potência de laser de 16 μw. Defina os parâmetros de digitalização para uma velocidade de 400, com um tamanho de pixel de 256 pixels x 256 pixels. Use uma taxa de aquisição de 5,3 Hz e registre por uma duração de 3 min.
  7. Identifique 5-8 ROIs em cada cérebro e analise a fluorescência. Determinar manualmente o corpo celular dos neurônios do corpo do cogumelo como a região de interesse28.
    1. Rotule os neurônios identificados e meça suas intensidades de fluorescência pelo ImageJ. Analise os dados de fluorescência de GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definir a fluorescência intracelular, aumentando entre 2 e 2,5 desvios padrão acima da linha de base, como pequenas pontas, e a fluorescência intracelular, aumentando acima de 2,5 desvios padrão acima da linha de base, como grandes espículas. Analise a frequência de picos de cálcio pelo teste t de Student.
      NOTA: F0 foi definido como a linha de base pela intensidade média da fluorescência dos 5 quadros iniciais em ROIs, F1 como a intensidade de fluorescência do ponto de tempo dado e B como o fundo sem fluorescência. As atividades fisiológicas temporais dos neurônios também são úteis para distingui-los dos sinais de ruído.

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Representative Results

Usando este protocolo, descobrimos que as moscas knockdown cac mostraram taxas significativamente mais altas de comportamento semelhante a convulsões do que as moscas WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Teste t de Student, Figura 1A). A maioria das moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 1-5 s, enquanto UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 2 s. A porcentagem de recuperação de moscas knockdown de cac dentro de 1 s foi significativamente menor do que as moscas WT (88,08 ± 1,89 [n = 6] vs 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; Teste t de Student, Figura 1B). Como mostrado na Figura 2, sinais de cálcio foram observados no corpo do cogumelo das moscas. Pequenos picos ocorreram menos em moscas knockdown cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; teste t de Student), enquanto grandes picos ocorreram mais em moscas knockdown cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Estes resultados indicam que os sinais de cálcio observados em moscas correlacionam-se altamente com a atividade neuronal e mostraram consistência com o comportamento de convulsão em moscas knockdown de cac .

Figure 1
Figura 1: Taxas clássicas de convulsões e tempo de recuperação em moscas. (A) As convulsões ocorreram em uma taxa maior em moscas knockdown cac . (B) O tempo de recuperação da convulsão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Sinais representativos de cálcio no corpo do cogumelo das moscas. (A) Sinais de cálcio em 5 células selecionadas no corpo do cogumelo das moscas. (B) Traço típico: Mudança na fluorescência (ΔF/F) ao longo do tempo a partir de uma célula individual do corpo do cogumelo em arquivos knockdown e selvagem. (C) Eventos globais ou neuronais de cálcio que ocorrem no corpo do cogumelo de moscas distinguidos em pequenas e grandes espigas. (D) Picos de cálcio em todo o cérebro de moscas knockdown e controles. Esse valor foi modificado com a permissão de Liu et al.29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução externa para gravação e confecção de solução de dissecção.
Cloreto de sódio 101 mM
Cloreto de potássio 3 mM
Cloreto de cálcio 1 mM
Cloreto de magnésio 4 mM
Glicose 5 mM
Fosfato de sódio monobásico 1,25 mM
Bicarbonato de sódio 20,7 mM
Solução de dissecção
Solução externa 600 μL
Suspensão de papaína 9 U
L-lisina 2 mg/mL

Tabela 1: Composição das soluções externas e de dissecção.

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Discussion

O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia 33,34. Anteriormente, o comportamento das moscas knockdown Cac não exibia a severidade relatada em alguns mutantes e até exibia efeitos supressivos em certas moscas mutantes duplas35 . Os resultados deste estudo revelam que as moscas derrubadas do cac são mais propensas a convulsões do que suas contrapartes selvagens. Essa observação corresponde ao fato de que pacientes e outros modelos animais portadores de variantes de perda de função CACNA1A são acometidos de epilepsia28,36. Globalmente, o knockdown do cac poderia interromper diretamente a transmissão neuromuscular nos neurônios motores. Embora a locomoção em adultos e larvas não tenha sido preditiva de suscetibilidade a crises, a contribuição do cac dos neurônios motores no comportamento convulsivo precisa ser mais bem investigada37. Consistentemente, em imagens ex vivo de cálcio, observamos uma maior proporção de eventos de cálcio no corpo do cogumelo de moscas knockdown de cac do que em moscas selvagens (WT), o que indicou uma maior frequência de disparo neuronal9. O corpo de moscas do cogumelo é considerado vagamente análogo ao hipocampo e córtex no cérebro de mamíferos. Uma vez que as convulsões geralmente ocorrem no hipocampo e córtex de humanos, o corpo do cogumelo é usado para estudar a atividade neural de cálcio relacionada a convulsões neste estudo. Em conclusão, este estudo estabeleceu a consistência do ensaio bang-sensitive seizure-like e da imagem de cálcio em Drosophila.

No campo da imagem de cálcio, a utilização do indicador de cálcio GCaMP6 em combinação com a microscopia confocal permite o monitoramento de alterações na concentração de cálcio em vários contextos, como in vivo, em culturas de células, em fatias cerebrais e em tecido cerebral intacto ex vivo do modelo de Drosophila. No entanto, é comumente entendido que a imagem in vivo dos fluxos de cálcio dentro do sistema nervoso central de Drosophila requer uma intervenção cirúrgica refinada para obter acesso óptico ao cérebro; Esse obstáculo pode inibir a praticidade e o progresso dessa técnica em laboratórios individuais 8,16. O peixe-zebra também é um importante modelo animal para o estudo da epilepsia. O método de imagem com cálcio in vivo também foi estabelecido anteriormente36. No entanto, apenas larvas de peixe-zebra podem ser usadas para registro de imagens in vivo. Por outro lado, embora a cultura celular e os modelos de fatias cerebrais possam fornecer imagens de maior resolução, a integridade do cérebro e suas redes neurais não podem ser totalmente replicadas em cultura de células ou fatias cerebrais devido à ruptura estrutural. O presente estudo aborda essas questões implementando tecidos cerebrais isolados intactos de Drosophila para imagens de cálcio, evitando assim a necessidade de técnicas cirúrgicas complexas e preservando a integridade do cérebro e das redes neurais sem ruptura. A abordagem ex vivo também produz uma relação sinal-ruído superior quando comparada às técnicas de imagem in vivo.

O presente estudo elucida vários procedimentos fundamentais no protocolo de geração das moscas da linhagem tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi . Inicialmente, o balanceador duplo desempenhou um papel crucial na obtenção das moscas desejáveis. Balanceadores marcados permitem que os pesquisadores acompanhem alelos e cromossomos através de cruzamentos multigeracionais complexos38. Posteriormente, para a separação eficiente do tecido cerebral intacto e melhor visualização microscópica, era imperativo usar a suspensão de papaína para suavizar a fibra de superfície do cérebro. Além disso, para estabilizar o cérebro e prevenir danos neuronais durante a experimentação, considerou-se necessário o uso de um suporte em C afiado com mira de náilon27.

Em conclusão, a imagem de cálcio aplicada aqui juntamente com o ensaio de comportamento semelhante a crises sensíveis ao Bang em Drosophila é um sistema poderoso para rastrear os genes associados à epilepsia e explorar o mecanismo potencial da epilepsia em nível celular. Certamente, esta técnica não pode estudar os sinais de cálcio em tempo real correlacionados com o comportamento animal como outros métodos in vivo.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Investigação Básica e Básica Aplicada de Guangdong (bolsa n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e pretende melhorar a investigação científica em GMU (Jing-Da Qiao). Este trabalho também foi apoiado pelo Plano de Capacitação de Inovação de Estudantes da Universidade de Medicina de Guangzhou (Financiamento No. 02-408-2304-02038XM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

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References

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Imagem de cálcio ex vivo Modelo de Drosophila Epilepsia Distúrbio neurológico Convulsões recorrentes Origem genética Tecnologia de imagem Indicadores de cálcio codificados geneticamente GCaMP6 Resolução em todo o cérebro Resolução de célula única Genética molecular Ensaios comportamentais Protocolo Drosophila adulta Atividades epileptiformes Microscópio confocal Atividade neural Ensaio de comportamento semelhante a convulsões sensível a Bang Moscas knockdown do gene Cac Atividades anormais de cálcio Triagem gênica patogênica
<em>Ex Vivo</em> Imagem de cálcio para <em>Drosophila</em> Modelo de Epilepsia
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He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., … More

He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., Lin, Y. M., Mao, Y. L., Qiao, J. D. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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