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Neuroscience

पूर्व वीवो मिर्गी के ड्रोसोफिला मॉडल के लिए कैल्शियम इमेजिंग

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

यहां, हम एपिलेप्टिफॉर्म गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से वयस्क ड्रोसोफिला में ictal घटनाओं की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है, सेलुलर स्तर पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है।

Abstract

मिर्गी एक न्यूरोलॉजिकल विकार है जो आवर्तक दौरे की विशेषता है, आंशिक रूप से आनुवंशिक उत्पत्ति के साथ सहसंबद्ध है, जो दुनिया भर में 70 मिलियन से अधिक व्यक्तियों को प्रभावित करता है। मिर्गी के नैदानिक महत्व के बावजूद, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में तंत्रिका गतिविधि का कार्यात्मक विश्लेषण अभी भी विकसित किया जाना है। इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों, जैसे कि GCaMP6 की स्थिर अभिव्यक्ति के संयोजन में, मस्तिष्क-व्यापी और एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन स्तरों दोनों पर मिर्गी के अध्ययन में क्रांति ला दी है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर अपने परिष्कृत आणविक आनुवंशिकी और व्यवहार परख के कारण मिर्गी के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में उभरा है। इस अध्ययन में, हम मिर्गी गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक उपन्यास और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पूरे मस्तिष्क को सीएसी, एक प्रसिद्ध मिर्गी जीन से तैयार किया जाता है, जो बैंग-संवेदनशील जब्ती-जैसे व्यवहार परख के अनुवर्ती के रूप में तंत्रिका गतिविधि की पहचान करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कैल्शियम इमेजिंग के लिए नॉकडाउन मक्खियों को मारता है। सीएसी नॉकडाउन मक्खियों ने जब्ती जैसे व्यवहार और असामान्य कैल्शियम गतिविधियों की उच्च दर दिखाई, जिसमें जंगली प्रकार की मक्खियों की तुलना में अधिक बड़े स्पाइक्स और कम छोटे स्पाइक्स शामिल हैं। कैल्शियम गतिविधियों को जब्ती जैसे व्यवहार से सहसंबद्ध किया गया था। यह पद्धति मिर्गी के लिए रोगजनक जीन की जांच करने और सेलुलर स्तर पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज करने में एक कुशल पद्धति के रूप में कार्य करती है।

Introduction

मिर्गी, एक जटिल पुरानी न्यूरोलॉजिकल विकार जो सहज और अकारण बरामदगी और असामान्य न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि की पुनरावृत्ति की विशेषता है, ने दुनिया भर में 70 मिलियन से अधिक व्यक्तियों को प्रभावित किया है, जिससे यह सबसे आम न्यूरोलॉजिकलबीमारियों में से एक है 1 और परिवारों और समाज के भारी बोझ के लिए अग्रणी। मिर्गी के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, दौरे के एटियलजि की पहचान करने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं, जिनमें से आनुवंशिकी को कई प्रकार के मिर्गी या मिर्गी सिंड्रोम2 के प्राथमिक कारण के रूप में अनुमोदित किया गया है। पिछले दशकों से, जीनोमिक प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने उपन्यास मिर्गी से जुड़े जीन, जो आयन चैनल और गैर-आयन चैनल जीन 3,4 सहित जब्ती घटना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, की खोज में तेजी से वृद्धि हुई है। हालांकि, जीन और मिर्गी के फेनोटाइप के बीच अंतर्निहित तंत्र और कार्यात्मक विश्लेषण अपूर्ण रूप से समझा जाता है। मिर्गी से जुड़े जीन और तंत्र की पहचान कुशलतापूर्वक 5,6 रोगियों के प्रबंधन के लिए संभावना प्रदान करता है.

साइटोसोलिक कैल्शियम सिग्नल न्यूरोनल गतिविधि और सिनैप्टिक ट्रांसमिशन में महत्वपूर्ण तत्व हैं। मस्तिष्क स्लाइस7 सहित कैल्शियम इमेजिंग, विवो 8,9, और ईएक्स विवो10 में, 1970 के दशक12,13 के बाद से न्यूरोनल उत्तेजना के लिए एक मार्कर के रूप में न्यूरोनल गतिविधि11 की निगरानी के लिए उपयोग किया गया है। इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हाल की प्रगति, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) के साथ संयोजन में, जैसे कि जीसीएएमपी 6, ने मस्तिष्क-व्यापी और एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन स्तर 14,15,16 दोनों पर मिर्गी के अध्ययन में क्रांति ला दी है, जिसमें उच्च स्तर की स्थानिक परिशुद्धता है। कैल्शियम एकाग्रता और यात्रियों में परिवर्तन कार्रवाई क्षमता और synaptic संचरण में मनाया गया, क्रमशः14, intracellular कैल्शियम के स्तर के परिवर्तन का संकेत न्यूरॉन्स 17,18 की विद्युत excitability के साथ एक सख्त सहसंबंध प्रदर्शित करता है. कैल्शियम इमेजिंग भी एक विकासात्मक जब्ती मॉडल9 के रूप में लागू किया गया है और एंटीकोनवल्सी यौगिकों19 स्क्रीनिंग के लिए ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया गया है.

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वैज्ञानिक अनुसंधान में एक शक्तिशाली मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है, जैसे कि मिर्गी, इसके परिष्कृत आणविक आनुवंशिकी और व्यवहार परख20,21,22 के लिए। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में उन्नत आनुवंशिक उपकरणों ने आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक GCaMP6 की अभिव्यक्ति में योगदान दिया है। उदाहरण के लिए, Gal4 और UAS- आधारित बाइनरी ट्रांसक्रिप्शनल सिस्टम GCaMP6 की विशिष्ट अभिव्यक्ति को स्थानिक और अस्थायी रूप से नियंत्रित तरीके से सक्षम करते हैं। ड्रोसोफिला एक छोटे से जीव है, विवो कैल्शियम इमेजिंग में कुशल आपरेशन कौशल की आवश्यकता होती है एक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप, जिसमें मस्तिष्क के पृष्ठीय का केवल एक छोटा सा हिस्सा14,23 एक छोटी सी खिड़की के माध्यम से उजागर किया गया था प्रदर्शन करने के लिए. इसी समय, ड्रोसोफिला के बरकरार मस्तिष्क में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग पूरे मस्तिष्क के ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) की निगरानी के लिए किया जा सकता है।

इस अध्ययन में, हम मिर्गी गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग प्रस्तुत करते हैं। CACNA1A एक प्रसिद्ध मिर्गी जीन है, सीएसी कैव 2 चैनल से संबंधित है, जो CACNA1A के लिए एक होमोलॉग है। हमने cac knockdown मक्खियों टब-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi के दिमाग को विच्छेदित करके और xyt स्कैनिंग मोड के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उन्हें इमेजिंग करके शुरू किया। हमने तब संकेतकों की गणना करके आरओआई के कैल्शियम संकेतों में परिवर्तन का विश्लेषण किया जो सहज जब्ती जैसी घटनाओं की मात्रा निर्धारित करते हैं, जैसे कि % ΔF / F मान और GCaMP6 प्रतिदीप्ति की कैल्शियम घटनाएं। इसके अतिरिक्त, हमने कैल्शियम इमेजिंग के परिणामों को मान्य करने के लिए सीएसी-नॉकडाउन मक्खियों पर जब्ती व्यवहार परीक्षणों को प्रेरित करने के लिए भंवर मशीन द्वारा यांत्रिक उत्तेजना का प्रदर्शन किया। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से वयस्क ड्रोसोफिला में ictal घटनाओं की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है, जो सेलुलर स्तरों पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

1. बैंग-संवेदनशील परख के लिए प्रोटोकॉल

  1. Gal4/UAS सिस्टम21 के माध्यम से UAS-cac-RNAi लाइन के साथ टब-Gal4 ड्राइवर लाइन को पार करके प्रयोगात्मक मक्खियों की स्थापना करें। टब-Gal4 लाइन की कुंवारी मक्खियों और UAS-cac-RNAi लाइन के नर मक्खियों लीजिए. फिर, कुंवारी और नर मक्खियों को संतानों की कटाई के लिए एक ही शीशी में स्थानांतरित करें।
    नोट: टब-गैल 4 ड्राइवर लाइन सीएसी जीन के वैश्विक नॉकडाउन को प्राप्त करने की अनुमति देगी। नियंत्रण समूह के रूप में UAS-cac-RNAi लाइन का उपयोग करें।
  2. 3-5 दिनों के संलग्नक के बाद, धीरे 100% सीओ2 (सीओ2 संज्ञाहरण उपकरण) का उपयोग करके मक्खियों को संवेदनाहारी करें और टब-गैल4>यूएएस-सीएसी-आरएनएआई मक्खियों और यूएएस-सीएसी-आरएनएआई दोनों को ब्रश से इकट्ठा करें। इन मक्खियों को नए, स्वच्छ भोजन की शीशियों में स्थानांतरित करें परीक्षण से 1 दिन पहले यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे अच्छी तरह से तैयार हैं।
  3. धीरे सीओ2 का उपयोग मक्खियों anesthetize. एक बार संवेदनाहारी, ध्यान से व्यक्तिगत ताजा शीशियों में 4-6 मक्खियों जगह. मक्खियों के बारे में 1 घंटे के लिए संज्ञाहरण से ठीक करने के लिए परीक्षण के साथ आगे बढ़ने से पहले अनुमति दें.
    नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, पांच परीक्षणों की एक न्यूनतम परीक्षण का परीक्षण किया गया, और प्रत्येक परीक्षण मक्खियों के छह शीशियों के शामिल थे.
  4. रिकॉर्डिंग उपकरण सेट करें। एक कैमरा (720-1080P, 30-60 FPS कम से कम, AF लॉक) को व्हाइटबोर्ड के सामने एक तिपाई पर रखें। स्पष्ट और सटीक फुटेज सुनिश्चित करने के लिए एक खाली शीशी का उपयोग करके कैमरे के फ़ोकस को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
  5. यंत्रवत् प्रेरित जब्ती की तरह व्यवहार करने के लिए एक भंवर मिक्सर का प्रयोग करें. भंवर मिक्सर पर 4-6 मक्खियों युक्त प्रत्येक शीशी प्लेस और ठीक 10 एस के लिए उच्चतम सेटिंग (2800 आरपीएम) पर चलाने के लिए. भंवर के बाद, तुरंत व्हाइटबोर्ड पर शीशी जगह.
  6. मक्खियों का निरीक्षण करें और उनके द्वारा प्रदर्शित किसी भी जब्ती जैसे व्यवहार को रिकॉर्ड करें।
    नोट: मक्खियों में मनाया जब्ती की तरह व्यवहार तीन चरणों के होते हैं: जब्ती (हिल पंखों के रूप में प्रकट), पक्षाघात, और वसूली24. परीक्षण की गई मक्खियों के लिए जब्ती मक्खियों के अनुपात को जब्ती दर के रूप में परिभाषित किया गया था।
    1. भंवर के बाद आवश्यक समय के रूप में वसूली समय को मापें जब तक मक्खियों को सीधे खड़े होने की क्षमता हासिल न हो जाए25.

2. पूर्व विवो मस्तिष्क के कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल

  1. क्रमशः टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम और टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम/सीएसी-आरएनएआई लाइन मक्खियों की स्थापना करें। पूर्व विवो मस्तिष्क में कैल्शियम गतिविधि की निगरानी की अनुमति देने के लिए Gal4/UAS बाइनरी अभिव्यक्ति प्रणाली21 का उपयोग करके मक्खियों को उत्पन्न करें।
  2. विच्छेदन समाधान तैयार के रूप में प्रदान की नुस्खा (तालिका 1)26 में वर्णित है.
    1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में बाहरी समाधान तैयार करें। NaOH के साथ पीएच 7.2 में समायोजित करें और परासरणीयता को 250-255 mOsm/L पर समायोजित करें।
      नोट: बाहरी समाधान 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. विच्छेदन समाधान तैयार करने के लिए, बाहरी समाधान के 600 माइक्रोन में पपैन निलंबन और एल-लाइसिन (2 मिलीग्राम / एमएल) की 9 इकाइयां जोड़ें। समाधान भंवर और समाधान स्पष्ट है जब तक 15 मिनट प्रतीक्षा करें.
      नोट: यह 4 घंटे के भीतर विच्छेदन समाधान का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
  3. उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए ऑक्सीजन युक्त खारा (95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) के साथ बाहरी समाधान छिड़कना। एक पेट्री डिश के लिए विच्छेदन समाधान के बारे में 10 माइक्रोन हस्तांतरण करने के लिए विंदुक का प्रयोग करें. यह समाधान मस्तिष्क विच्छेदन और इमेजिंग के लिए आवश्यक शर्तें प्रदान करेगा।
  4. सिरिंज सुइयों और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम और टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम/सीएसी-आरएनएआई लाइनों के दिमाग को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें। मस्तिष्क27 विच्छेदन के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करें.
  5. ताजा बाहरी समाधान के 5 एमएल युक्त एक रिकॉर्डिंग डिश में तैयार मस्तिष्क हस्तांतरण करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें और वसूली के लिए 3-5 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग पकवान में एक सी-तेज धारक का उपयोग कर मस्तिष्क स्थिरीकरण.
    नोट: सी-शार्प धारक एक धातु अर्धवृत्त से बना था जिसमें 7 मिमी व्यास समानांतर फाइबर 0.5 मिमी अलग से पार हो गया था।
  6. Confocal इमेजिंग सेटअप और अधिग्रहण
    1. confocal इमेजिंग के लिए, एक 20x उद्देश्य और xyt स्कैनिंग मोड के साथ प्रत्येक मस्तिष्क पर कब्जा. 20x ऑप्टिकल प्रवर्धन के आधार पर एक अतिरिक्त 4.5x डिजिटल प्रवर्धन के साथ मशरूम शरीर न्यूरॉन्स की पहचान करें।
      नोट: प्रत्येक पूर्व विवो मस्तिष्क को 1 घंटे से अधिक के लिए चित्रित किया जा सकता है।
    2. 16 μw लेजर शक्ति के साथ 488 एनएम लेजर उत्तेजना पर पूरे मस्तिष्क-GCaMP6m उत्सर्जन प्राप्त करें। स्कैनिंग मापदंडों को 400 की गति पर सेट करें, जिसमें पिक्सेल आकार 256 पिक्सेल x 256 पिक्सेल है। 3 मिनट की अवधि के लिए 5.3 हर्ट्ज अधिग्रहण दर और रिकॉर्ड का उपयोग करें।
  7. हर मस्तिष्क में 5-8 आरओआई की पहचान करें और प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करें। मैन्युअल रूप से ब्याज28 के क्षेत्र के रूप में मशरूम शरीर न्यूरॉन्स के सेल शरीर का निर्धारण.
    1. पहचाने गए न्यूरॉन्स को लेबल करें और इमेजजे द्वारा उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें। % ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B) के माध्यम से GCaMP6m के प्रतिदीप्ति डेटा का विश्लेषण करें। इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति को परिभाषित करें, बेसलाइन के ऊपर 2 और 2.5 मानक विचलन के बीच बढ़ते हुए, छोटे स्पाइक्स के रूप में, और इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति, बेसलाइन के ऊपर 2.5 मानक विचलन से अधिक बढ़ते हुए, बड़े स्पाइक्स के रूप में। छात्र के टी-टेस्ट द्वारा कैल्शियम स्पाइक्स की आवृत्ति का विश्लेषण करें।
      नोट: F0 को ROIs में प्रारंभिक 5 फ़्रेमों की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा आधार रेखा के रूप में परिभाषित किया गया था, F1 को दिए गए समय बिंदु की प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में, और B को प्रतिदीप्ति के बिना पृष्ठभूमि के रूप में। न्यूरॉन्स की अस्थायी शारीरिक गतिविधियां भी उन्हें शोर संकेतों से अलग करने में सहायक होती हैं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि सीएसी नॉकडाउन मक्खियों ने डब्ल्यूटी मक्खियों (17.00 ± 2.99 [एन = 6] बनाम 4.50 ± 2.03 [एन = 6]; पी = 0.0061; छात्र का टी-परीक्षण, चित्र 1 ए)। अधिकांश टब-गैल4>यूएएस-सीएसी-आरएनएआई मक्खियों को 1-5 सेकंड के भीतर बरामद किया गया, जबकि यूएएस-सीएसी-आरएनएआई मक्खियों को 2 एस के भीतर बरामद किया गया। 1 s के भीतर CAC नॉकडाउन मक्खियों का पुनर्प्राप्ति प्रतिशत WT मक्खियों (88.08 ± 1.89 [n = 6] बनाम 96.50 ± 1.82 [n = 6]; पी = 0.0093; छात्र का टी-परीक्षण, चित्र 1 बी)। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, मक्खियों के मशरूम शरीर में कैल्शियम संकेत देखे गए। सीएसी नॉकडाउन मक्खियों (टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम/सीएसी-आरएनएआई, 2.97 ± 0.96 [एन = 13] बनाम टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम, 5.33 ± 1.31 [एन = 13]; पी < 0.0001; छात्र का टी-परीक्षण), जबकि सीएसी नॉकडाउन मक्खियों (टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम/सीएसी-आरएनएआई, 2.87 ± 0.63 [एन = 13] बनाम टब-गैल4>यूएएस-जीसीएएमपी6एम, 1.72 ± 0.62 [एन = 13]; पी < 0.0001)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मक्खियों में मनाया कैल्शियम संकेत न्यूरोनल गतिविधि के साथ अत्यधिक संबंध है और सीएसी नॉकडाउन मक्खियों में जब्ती की तरह व्यवहार के साथ स्थिरता दिखाया.

Figure 1
चित्रा 1: मक्खियों में शास्त्रीय जब्ती दर और वसूली का समय। (ए) सीएसी नॉकडाउन मक्खियों में दौरे उच्च दर पर हुए। (बी) जब्ती से वसूली का समय। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मक्खियों के मशरूम शरीर में प्रतिनिधि कैल्शियम संकेत। (ए) मक्खियों के मशरूम शरीर में चयनित 5 कोशिकाओं में कैल्शियम संकेत। (बी) विशिष्ट ट्रेस: नॉकडाउन और जंगली प्रकार की फाइलों में मशरूम शरीर के एक व्यक्तिगत सेल से समय के साथ प्रतिदीप्ति (ΔF/F) में परिवर्तन। (सी) मक्खियों के मशरूम शरीर में होने वाली वैश्विक या न्यूरोनल कैल्शियम घटनाएं छोटे और बड़े स्पाइक्स में प्रतिष्ठित होती हैं। (डी) नॉकडाउन मक्खियों और नियंत्रण के पूरे मस्तिष्क में कैल्शियम स्पाइक्स। यह आंकड़ा लियू एट अल.29 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रिकॉर्डिंग और विच्छेदन समाधान बनाने के लिए बाहरी समाधान.
सादा नमक 101 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 3 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड 1 मिमी
मैग्नीशियम क्लोराइड 4 मिमी
ग्‍लूकोज़ 5 मिमी
सोडियम फॉस्फेट मोनोबैसिक 1.25 मिमी
सोडियम बाइकार्बोनेट 20.7 मिमी
विच्छेदन समाधान
बाहरी समाधान 600 माइक्रोन
पपैन निलंबन 9 यू
एल-लाइसिन 2 मिलीग्राम/एमएल

तालिका 1: बाहरी और विच्छेदन समाधान की संरचना.

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Discussion

कैल्शियम आयन एक महत्वपूर्ण दूसरे संदेशवाहक के रूप में कार्य करता है, जो रासायनिक और विद्युत गड़बड़ी दोनों के लिए शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, मानव CACNA1A जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रीसानेप्टिक पी/क्यू चैनलों के टोपोलॉजिकल तत्व को ग्लूटामेट30,31,32 सहित विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर के निर्वहन की मध्यस्थता के लिए जिम्मेदार के रूप में पहचाना गया है, और मिर्गी33,34 से निकटता से जुड़ा हुआ है। इससे पहले, सीएसी नॉकडाउन मक्खियों के व्यवहार ने कुछ म्यूटेंट में रिपोर्ट की गई गंभीरता का प्रदर्शन नहीं किया और यहां तक कि कुछ डबल म्यूटेंट मक्खियों35 में दमनकारी प्रभाव भी प्रदर्शित किया। इस अध्ययन के निष्कर्षों से पता चलता है कि सीएसी नॉकडाउन मक्खियों को उनके जंगली प्रकार के समकक्षों की तुलना में दौरे का खतरा अधिक होता है। यह अवलोकन इस तथ्य से मेल खाती है कि रोगियों और अन्य पशु मॉडल CACNA1A नुकसान-के-फ़ंक्शन वेरिएंट मिर्गी28,36 से पीड़ित हैं। विश्व स्तर पर, सीएसी की दस्तक सीधे मोटर न्यूरॉन्स में न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन को बाधित कर सकती है। हालांकि वयस्कों और लार्वा में हरकत जब्ती संवेदनशीलता के गैर-भविष्य कहनेवाला पाया गया था, जब्ती व्यवहार में मोटर न्यूरॉन्स 'सीएसी के योगदान को आगे37 की जांच करने की आवश्यकता है। लगातार, पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग में, हमने जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) मक्खियों की तुलना में सीएसी नॉकडाउन मक्खियों के मशरूम शरीर में कैल्शियम की घटनाओं का एक बड़ा अनुपात देखा, जिसने न्यूरोनल फायरिंग9 की उच्च आवृत्ति का संकेत दिया। मक्खियों के मशरूम शरीर को स्तनधारी मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स के समान माना जाता है। चूंकि दौरे आमतौर पर मनुष्यों के हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था में होते हैं, इसलिए मशरूम शरीर का उपयोग इस अध्ययन में जब्ती से संबंधित तंत्रिका कैल्शियम गतिविधि का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। अंत में, इस अध्ययन ने ड्रोसोफिला में बैंग-संवेदनशील जब्ती-जैसी परख और कैल्शियम इमेजिंग की स्थिरता स्थापित की।

कैल्शियम इमेजिंग के क्षेत्र में, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में कैल्शियम संकेतक GCaMP6 का उपयोग विभिन्न संदर्भों जैसे कि विवो में, सेल संस्कृतियों में, मस्तिष्क स्लाइस में, और ड्रोसोफिला मॉडल के पूर्व विवो बरकरार मस्तिष्क ऊतक में कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन की निगरानी को सक्षम बनाता है। हालांकि, यह आमतौर पर समझा जाता है कि ड्रोसोफिला के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर कैल्शियम फ्लक्स के विवो इमेजिंग में मस्तिष्क तक ऑप्टिकल पहुंच प्राप्त करने के लिए एक परिष्कृत सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है; यह बाधा व्यावहारिकता और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं 8,16 में इस तकनीक की प्रगति को बाधित कर सकते हैं. मिर्गी का अध्ययन करने के लिए ज़ेब्राफिश भी एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल है। विवो कैल्शियम इमेजिंग विधि में भी पहले36 स्थापित किया गया था। हालांकि, विवो इमेजिंग रिकॉर्डिंग में केवल जेब्राफिश लार्वा का उपयोग किया जा सकता है। दूसरी ओर, हालांकि सेल संस्कृति और मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान कर सकते हैं, मस्तिष्क और उसके तंत्रिका नेटवर्क की अखंडता को संरचनात्मक व्यवधान के कारण सेल संस्कृति या मस्तिष्क स्लाइस में पूरी तरह से दोहराया नहीं जा सकता है। वर्तमान अध्ययन कैल्शियम इमेजिंग के लिए पृथक बरकरार ड्रोसोफिला मस्तिष्क के ऊतकों को लागू करके इन मुद्दों को संबोधित करता है, इस प्रकार जटिल सर्जिकल तकनीकों की आवश्यकता से बचता है और बिना किसी व्यवधान के मस्तिष्क और तंत्रिका नेटवर्क की अखंडता को संरक्षित करता है। पूर्व विवो दृष्टिकोण भी विवो इमेजिंग तकनीकों की तुलना में एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात पैदा करता है।

वर्तमान अध्ययन टब-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi लाइन मक्खियों की पीढ़ी से संबंधित प्रोटोकॉल में विभिन्न निर्णायक प्रक्रियाओं को स्पष्ट करता है। प्रारंभ में, डबल बैलेंसर ने वांछनीय मक्खियों को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। चिह्नित बैलेंसर शोधकर्ताओं को जटिल बहु-पीढ़ी के पार38 के माध्यम से एलील और गुणसूत्रों का पालन करने की अनुमति देते हैं। इसके बाद, बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों के कुशल पृथक्करण और बेहतर सूक्ष्म दृश्य के लिए, मस्तिष्क की सतह फाइबर को नरम करने के लिए पपैन निलंबन का उपयोग करना अनिवार्य था। इसके अलावा, मस्तिष्क को स्थिर करने और प्रयोग के दौरान न्यूरोनल क्षति को रोकने के लिए, नायलॉन crosshair के साथ एक सी तेज धारक का उपयोग आवश्यक27 समझा गया था.

अंत में, ड्रोसोफिला में बैंग-संवेदनशील जब्ती जैसी व्यवहार परख के साथ यहां लागू कैल्शियम इमेजिंग मिर्गी से जुड़े जीन की जांच करने और सेलुलर स्तर पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है। निश्चित रूप से, यह तकनीक विवो विधियों में अन्य की तरह पशु व्यवहार से संबंधित वास्तविक समय कैल्शियम संकेतों का अध्ययन नहीं कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को ग्वांगडोंग बेसिक एंड एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2022A1515111123 से जिंग-दा किआओ) द्वारा समर्थित किया गया था और जीएमयू (जिंग-दा किआओ) में वैज्ञानिक अनुसंधान को बढ़ाने की योजना है। इस काम को गुआंगज़ौ मेडिकल यूनिवर्सिटी स्टूडेंट इनोवेशन एबिलिटी एनिसमेंट प्लान (फंडिंग नंबर 02-408-2304-02038XM) द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

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References

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