Summary
在这里，我们提出了一种在表达 GCaMP6 的成年果蝇中进行离体钙成像以监测癫痫样活动的方案。该协议为通过离体钙成像研究成年果蝇的发作事件提供了有价值的工具，从而可以在细胞水平上探索癫痫的潜在机制。
Abstract
癫痫是一种以反复发作为特征的神经系统疾病，部分与遗传起源相关，影响全球超过7000万人。尽管癫痫具有临床重要性，但中枢神经系统神经活动的功能分析仍有待开发。成像技术的最新进展，结合遗传编码钙指示剂（如GCaMP6）的稳定表达，在全脑和单细胞分辨率水平上彻底改变了癫痫的研究。黑腹果蝇因其复杂的分子遗传学和行为分析而成为研究癫痫分子和细胞机制的工具。在这项研究中，我们提出了一种新颖有效的方案，用于在表达 GCaMP6 的成年果蝇中进行离体钙成像以监测癫痫样活动。整个大脑由众所周知的癫痫基因 cac 制备，敲低苍蝇用共聚焦显微镜进行钙成像，以识别神经活动，作为爆炸敏感癫痫样行为测定的后续行动。与野生型苍蝇相比，cac敲除果蝇表现出更高的癫痫样行为和异常钙活性，包括更多的大尖峰和更少的小尖峰。钙活性与癫痫样行为相关。该方法在细胞水平上筛选癫痫致病基因和探索癫痫的潜在机制方面是一种有效的方法。
Introduction
癫痫是一种复杂的慢性神经系统疾病，其特征是自发性和无诱因性癫痫发作的复发以及神经元网络活动异常，已影响全球超过7000万人，使其成为最常见的神经系统疾病之一1，并导致家庭和社会的沉重负担。考虑到癫痫的影响，已经进行了许多研究以确定癫痫发作的病因，其中遗传学已被批准为许多类型的癫痫或癫痫综合征的主要原因2。在过去的几十年里，基因组技术的进步导致新的癫痫相关基因的发现迅速增加，这些基因在癫痫发作中起着至关重要的作用，包括离子通道和非离子通道基因3,4。然而，基因和癫痫表型之间的潜在机制和功能分析尚不完全清楚。鉴定癫痫相关基因和机制为有效管理患者提供了可能性5,6。
胞质钙信号是神经元活动和突触传递的关键元件。自 1970 年代以来，钙成像（包括脑切片7、体内8、9 和 ex 体内10）已被用于监测神经元活动11 作为神经元兴奋性的标志物12,13。成像技术的最新进展，结合基因编码的钙指示剂（GECI），如GCaMP6，在全脑和单细胞分辨率水平14,15,16上彻底改变了癫痫的研究，具有高水平的时空精度。分别在动作电位和突触传递中观察到钙浓度和瞬态的变化14，表明细胞内钙水平的改变与神经元的电兴奋性表现出严格的相关性17,18。钙成像也已被用作发育性癫痫发作模型9，并在果蝇中用于筛选抗惊厥化合物19。
黑腹果蝇因其复杂的分子遗传学和行为测定而成为科学研究中强大的模式生物，例如癫痫20,21,22。此外，果蝇中先进的遗传工具有助于遗传编码的钙指示剂GCaMP6的表达。例如，基于 Gal4 和 UAS 的二元转录系统能够以空间和时间控制的方式特异性表达 GCaMP6。由于果蝇是一种微小的生物，体内钙成像需要熟练的操作技能来执行手术干预，其中只有一小部分大脑背侧通过小窗口暴露14,23。同时，果蝇完整大脑中的离体钙成像可用于监测整个大脑的感兴趣区域（ROI）。
在这项研究中，我们在表达 GCaMP6 的成年果蝇中进行了离体钙成像，以监测癫痫样活动。CACNA1A是众所周知的癫痫基因，cac属于Cav2通道，是CACNA1A的同源物。我们首先解剖了cac敲低果蝇tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi的大脑，并使用具有xyt扫描模式的共聚焦显微镜对它们进行成像。然后，我们通过计算量化自发性癫痫样事件的指标来分析ROIs的钙信号变化，例如GCaMP6荧光的%ΔF/F值和钙事件。此外，我们通过涡旋机进行机械刺激，以诱导对 cac 敲除苍蝇的癫痫发作行为测试，以验证钙成像的结果。总体而言，该协议为通过离体钙成像研究成年果蝇的发作事件提供了有价值的工具，从而可以在细胞水平上探索癫痫的潜在机制。
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Protocol
1. 爆炸敏感测定方案
- 通过Gal4/UAS系统21将tub-Gal4驱动线与UAS-cac-RNAi线交叉，建立实验果蝇。收集tub-Gal4系的处女果蝇和UAS-cac-RNAi系的雄性果蝇。然后，将处女苍蝇和雄性苍蝇转移到同一个小瓶中以收获后代。
注意： tub-Gal4 驱动系将允许实现 cac 基因的全局敲低。使用 UAS-cac-RNAi 系作为对照组。 - 闭合3-5天后，使用100%CO2 （CO2 麻醉设备）轻轻麻醉苍蝇，并用刷子收集 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 苍蝇和 UAS-cac-RNAi 苍蝇。在测试前 1 天将这些苍蝇转移到新的、干净的食品瓶中，以确保它们做好充分准备。
- 使用 CO2 轻轻麻醉苍蝇。麻醉后，小心地将4-6只苍蝇放入单个新鲜小瓶中。在进行测试之前，让苍蝇从麻醉中恢复约1小时。
注意：对于每种基因型，至少测试了五项试验，每项试验由六瓶果蝇组成。 - 设置录音设备。将相机（720-1080P，至少 30-60 FPS，自动对焦锁定）放在白板前的三脚架上。使用空瓶手动调整相机的焦距，以确保清晰准确的镜头。
- 使用涡流混合器执行机械诱导的癫痫样行为。将每个装有 4-6 只苍蝇的小瓶放在涡旋混合器上，并以最高设置 （2800 rpm） 运行 10 秒。涡旋后，立即将小瓶放在白板上。
- 观察苍蝇并记录它们表现出的任何类似癫痫发作的行为。
注意：在苍蝇中观察到的癫痫样行为包括三个阶段：癫痫发作（表现为振动的翅膀）、瘫痪和恢复24。缉获苍蝇与被测苍蝇的比率定义为缉获率。- 测量恢复时间作为涡旋后所需的时间，直到苍蝇恢复直立的能力25.
2. 离体 脑钙成像方案
- 分别建立 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 和 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 系苍蝇。使用 Gal4/UAS 二元表达系统21 生成果蝇，以允许监测 离体 脑中的钙活性。
- 按照提供的配方（表1）26中的描述制备解剖溶液。
- 如 表1所述准备外部溶液。用NaOH调节至pH 7.2，并将渗透压调节至250-255 mOsm/L。
注意：外部溶液可以在4°C下储存1周。 - 为了制备解剖溶液，将 9 单位的木瓜蛋白酶悬浮液和 L-赖氨酸 （2 mg/mL） 加入 600 μL 外部溶液中。涡旋溶液并等待 15 分钟，直到溶液变清。
注意：建议在4小时内使用解剖溶液。
- 如 表1所述准备外部溶液。用NaOH调节至pH 7.2，并将渗透压调节至250-255 mOsm/L。
- 使用前用含氧盐水（95%氧气和5%二氧化碳）灌注外部溶液5分钟。使用移液管将约10μL的解剖溶液转移到培养皿中。该解决方案将为脑解剖和成像提供必要的条件。
- 使用注射器针头和显微镜仔细剖析 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 和 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi 细胞系的大脑。遵循既定的脑解剖方案27.
- 使用移液管将准备好的大脑转移到含有 5 mL 新鲜外部溶液的记录培养皿中，并使用记录皿中的 C 尖支架固定大脑 3-5 分钟以进行恢复。
注意： C-sharp 支架由直径为 7 毫米的金属半圆制成，由相距 0.5 毫米的平行纤维交叉。 - 共聚焦成像设置和采集
- 对于共聚焦成像，使用 20 倍物镜和 xyt 扫描模式捕获每个大脑。通过基于 20 倍光学扩增的额外 4.5 倍数字扩增来识别蘑菇体神经元。
注意：每个 离体 脑可以成像超过1小时。 - 在 488 nm 激光激发下以 16 μw 激光功率获取整个大脑 GCaMP6m 发射。将扫描参数设置为 400 的速度，像素大小为 256 像素 x 256 像素。使用 5.3 Hz 采集速率并记录 3 分钟。
- 对于共聚焦成像，使用 20 倍物镜和 xyt 扫描模式捕获每个大脑。通过基于 20 倍光学扩增的额外 4.5 倍数字扩增来识别蘑菇体神经元。
- 识别每个大脑中的 5-8 个 ROI 并分析荧光。手动确定蘑菇体神经元的细胞体作为感兴趣的区域28。
- 标记已识别的神经元并通过 ImageJ 测量它们的荧光强度。通过%ΔF/F = （F1-F0）/（F0-B）分析GCaMP6m的荧光数据。将细胞内荧光（比基线增加 2 到 2.5 个标准差）定义为小尖峰，将细胞内荧光（比基线增加超过 2.5 个标准差）定义为大尖峰。通过学生 t 检验分析钙峰值的频率。
注意：F0 定义为 ROI 中初始 5 帧的平均荧光强度的基线，F1 是给定时间点的荧光强度，B 是没有荧光的背景。神经元的时间生理活动也有助于将它们与噪声征区分开来。
- 标记已识别的神经元并通过 ImageJ 测量它们的荧光强度。通过%ΔF/F = （F1-F0）/（F0-B）分析GCaMP6m的荧光数据。将细胞内荧光（比基线增加 2 到 2.5 个标准差）定义为小尖峰，将细胞内荧光（比基线增加超过 2.5 个标准差）定义为大尖峰。通过学生 t 检验分析钙峰值的频率。
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Representative Results
使用该方案，我们发现 cac 敲低果蝇表现出明显高于WT果蝇的癫痫样行为率（17.00±2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061;学生的 t 检验， 图 1A）。大多数tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 果蝇在1-5秒内恢复，而 UAS-cac-RNAi 果蝇在2秒内恢复。1 s内 cac 敲除果蝇的回收率显著低于WT果蝇（88.08±1.89 [n = 6] vs 96.50 ± 1.82 [n = 6]）; P = 0.0093;学生的 t 检验， 图 1B）。如 图2所示，在果蝇的蘑菇体中观察到钙信号。 cac 敲低果蝇 （tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi， 2.97 ± 0.96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m， 5.33 ± 1.31 [n = 13]; P < 0.0001;学生的 t 检验），而 cac 敲低果蝇 （tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi， 2.87 ± 0.63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m， 1.72 ± 0.62 [n = 13]; P < 0.0001）。这些结果表明，在果蝇中观察到的钙信号与神经元活动高度相关，并且与 cac 敲除果蝇的癫痫样行为一致。
图1：果蝇的典型癫痫发作率和恢复时间。 （A） cac 敲除果蝇的癫痫发作率较高。（B） 癫痫发作后的恢复时间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：果蝇蘑菇体内的代表性钙信号。 （A） 果蝇蘑菇体中选定的 5 个细胞中的钙信号。（B） 典型迹线：敲低型和野生型文件中蘑菇体单个细胞的荧光 （ΔF/F） 随时间的变化。（C）在苍蝇蘑菇体中发生的全局或神经元钙事件，分为小尖峰和大尖峰。（D）击倒苍蝇和对照的整个大脑中的钙峰值。该图经Liu et al.29许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 用于记录和制作解剖液的外部解决方案。 | |
| 氯化钠 | 101毫米 |
| 氯化钾 | 3 毫米 |
| 氯化钙 | 1 毫米 |
| 氯化镁 | 4 毫米 |
| 葡萄糖 | 5 毫米 |
| 磷酸二钠 | 1.25 米 |
| 碳酸氢钠 | 20.7 毫米 |
| 解剖液 | |
| 外部解决方案 | 600微升 |
| 木瓜蛋白酶混悬液 | 9 U |
| L-赖氨酸 | 2 毫克/毫升 |
表1：外部和解剖溶液的组成。
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Discussion
钙离子是关键的第二信使，在对化学和电扰动的一系列生理和病理生理反应中起着关键作用。此外，由人CACNA1A基因编码的突触前 P/Q 通道的拓扑元件已被确定为负责介导各种神经递质（包括谷氨酸30,31,32）的放电，并且与癫痫密切相关 33,34。以前，Cac 敲除果蝇的行为没有表现出某些突变体中报告的严重程度，甚至在某些双突变果蝇中表现出抑制作用35 。这项研究的结果表明，cac敲除果蝇比野生型果蝇更容易癫痫发作。这一观察结果与携带CACNA1A功能丧失变异的患者和其他动物模型患有癫痫的事实相对应28,36。在全球范围内，cac的敲除可能直接破坏运动神经元中的神经肌肉传递。尽管发现成虫和幼虫的运动不能预测癫痫发作易感性，但运动神经元的 cac 在癫痫发作行为中的作用需要进一步研究37。一致地，在离体钙成像中，我们注意到 cac 敲低果蝇的蘑菇体内钙事件的比例高于野生型 （WT） 果蝇，这表明神经元放电的频率更高9。苍蝇的蘑菇体被认为与哺乳动物大脑中的海马体和皮层大致相似。由于癫痫发作通常发生在人类的海马体和皮层中，因此在本研究中，蘑菇体用于研究与癫痫发作相关的神经钙活性。总之，本研究确定了果蝇中爆炸敏感性癫痫样测定和钙成像的一致性。
在钙成像领域，将钙指示剂GCaMP6与共聚焦显微镜结合使用，可以监测各种情况下钙浓度的变化，例如体内、细胞培养物、脑切片和果蝇模型的离体完整脑组织。然而，人们普遍认为，果蝇中枢神经系统内钙通量的体内成像需要精细的手术干预才能实现对大脑的光学通路;这种障碍可能会抑制该技术在个别实验室中的实用性和进步8,16。斑马鱼也是研究癫痫的重要动物模型。体内钙成像方法也已建立36。然而，只有斑马鱼幼虫可用于体内成像记录。另一方面，尽管细胞培养和脑切片模型可以提供更高分辨率的图像，但由于结构破坏，大脑及其神经网络的完整性无法在细胞培养或脑切片中完全复制。目前的研究通过实施分离的完整果蝇脑组织进行钙成像来解决这些问题，从而避免了对复杂手术技术的需求，并在不中断的情况下保持大脑和神经网络的完整性。与体内成像技术相比，离体方法还具有出色的信噪比。
本研究阐明了方案中有关 产生tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 系果蝇的各种关键程序。最初，双平衡器在获得所需的苍蝇方面发挥了至关重要的作用。标记平衡器允许研究人员通过复杂的多代杂交跟踪等位基因和染色体38。随后，为了有效分离完整的脑组织并改善显微镜可视化，必须使用木瓜蛋白酶悬浮液来软化大脑的表面纤维。此外，为了稳定大脑并防止实验过程中的神经元损伤，使用带有尼龙十字准线的 C 型尖锐支架被认为是必要的27。
总之，这里应用的钙成像与 果蝇 中的爆炸敏感性癫痫样行为测定法一起是一种强大的系统，用于筛选癫痫相关基因并在细胞水平上探索癫痫的潜在机制。当然，这种技术不能像其他体内方法那样研究与动物行为相关的实时钙信号。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了广东省基础与应用基础研究基金会（批准号：2022A15151111123）的支持，并计划加强GMU（京大桥）的科学研究。这项工作还得到了广州医科大学学生创新能力项目（资助编号：02-408-2304-02038XM）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
