Summary
Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.
Abstract
Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.
Introduction
Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологическихзаболеваний1 и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептическихсиндромов. За последние десятилетия достижения в области геномных технологий привели к быстрому увеличению числа открытий новых генов, связанных с эпилепсией, которые играют решающую роль в возникновении судорог, включая гены ионных каналов и неионных каналов 3,4. Тем не менее, основные механизмы и функциональный анализ между генами и эпилептическими фенотипами до конца не изучены. Идентификация генов и механизмов, связанных с эпилепсией, дает возможность эффективно вести пациентов 5,6.
Цитозольные кальциевые сигналы являются ключевыми элементами нейрональной активности и синаптической передачи. Визуализация кальция, включая срезы мозга7, in vivo 8,9 и ex vivo10, используется для мониторинга активности нейронов11 в качестве маркера возбудимости нейроновс 1970-х годов 12,13. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), такими как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне разрешения одной клетки14, 15, 16, что имеет высокий уровень пространственно-временной точности. Изменения концентрации кальция и переходных процессов наблюдались в потенциалах действия и синаптической передаче соответственно14, что указывает на то, что изменение внутриклеточных уровней кальция проявляет строгую корреляцию с электрической возбудимостью нейронов17,18. Визуализация кальция также применялась в качестве модели судорогразвития 9 и выполнялась у дрозофилы для скрининга противосудорожных соединений19.
Drosophila melanogaster становится мощным модельным организмом в научных исследованиях, таких как эпилепсия, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим тестам 20,21,22. Более того, усовершенствованные генетические инструменты дрозофилы способствовали экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP6. Например, бинарные транскрипционные системы на основе Gal4 и UAS обеспечивают специфическую экспрессию GCaMP6 пространственно и во времени. Поскольку дрозофила является крошечным организмом, визуализация кальция in vivo требует профессиональных операционных навыков для выполнения хирургического вмешательства, при котором только небольшая часть спинного мозга обнажалась через маленькое окно14,23. В то же время, визуализация кальция ex vivo в интактном мозге дрозофилы может быть использована для мониторинга областей интереса (ROI) всего мозга.
В этом исследовании мы представляем визуализацию ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. CACNA1A является хорошо известным геном эпилепсии, CAC относится к каналу Cav2, который является гомологом CACNA1A. Мы начали с препарирования мозга мух-нокдаунов САС tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi и визуализации их с помощью конфокального микроскопа с режимом рентгеновского сканирования. Затем мы проанализировали изменения кальциевых сигналов ROI, рассчитав показатели, которые количественно оценивают спонтанные судорожные события, такие как значение %ΔF/F и кальциевые события флуоресценции GCaMP6. Кроме того, мы проводили механический стимул с помощью вихревой машины, чтобы индуцировать тесты на судорожное поведение мух, нокдаунов CAC, а также валидировать результаты визуализации кальция. В целом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo, что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Протокол для анализа, чувствительного к взрыву
- Установить экспериментальные мухи путем скрещивания линии драйвера tub-Gal4 с линией UAS-cac-RNAi через систему21 Gal4/UAS. Соберите девственных мух линии tub-Gal4 и самцов мух линии UAS-cac-RNAi . Затем переложите девственницу и самцов мух в один флакон, чтобы собрать потомство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линия драйверов tub-Gal4 позволит добиться глобального нокдауна гена cac . В качестве контрольной группы используйте линию UAS-cac-RNAi . - Через 3-5 дней после эклозии осторожно обезболивайте мух с помощью 100%CO2 (анестезиологическое оборудование CO2 ) и соберите щеткой мухи tub-Gal4>UAS-cac-RNAi и мухи UAS-cac-RNAi . Пересадите этих мух в новые, чистые флаконы с кормом за 1 день до тестирования, чтобы убедиться, что они хорошо приготовлены.
- Осторожно обезболивайте мух с помощью CO2. После обезболивания осторожно поместите 4-6 мух в отдельные свежие флаконы. Дайте мухам оправиться от анестезии в течение примерно 1 часа, прежде чем приступать к тестированию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого генотипа было протестировано не менее пяти испытаний, и каждое испытание состояло из шести флаконов мух. - Настройте записывающее оборудование. Установите камеру (720–1080P, не менее 30–60 кадров в секунду, автофокусировка заблокирована) на штатив перед доской. Отрегулируйте фокусировку камеры вручную с помощью пустого флакона, чтобы обеспечить четкие и точные кадры.
- Используйте вихревой смеситель для выполнения механически индуцированного судорожного поведения. Поместите каждый флакон с 4-6 мухами в вихревой смеситель и запустите его на максимальной настройке (2800 об/мин) ровно на 10 секунд. После вихря быстро поместите флакон на доску.
- Понаблюдайте за мухами и запишите любое поведение, похожее на припадок, которое они проявляют.
Примечание: Судорожное поведение, наблюдаемое у мух, состоит из трех стадий: судороги (проявляющиеся в виде вибрирующих крыльев), паралич и восстановление24. Отношение судорожных мух к испытуемым мухам определялось как частота судорог.- Измерьте время восстановления как время, необходимое после вихря до тех пор, пока мухи не восстановят способность стоять вертикально25.
2. Протокол кальциевой визуализации головного мозга ex vivo
- Устанавливают мухи линейки tub-Gal4>UAS-GCaMP6m и tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi соответственно. Генерация мух с помощью системы двоичной экспрессии Gal4/UAS21 для мониторинга активности кальция в мозге ex vivo .
- Приготовьте раствор для вскрытия, как описано в прилагаемом рецепте (Таблица 1)26.
- Приготовьте наружный раствор, как описано в таблице 1. Доведите до pH 7,2 с NaOH и отрегулируйте осмолярность до 250-255 мОсм/л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели. - Для приготовления диссекционного раствора к 600 мкл наружного раствора добавляют 9 ЕД суспензии папаина и L-лизина (2 мг/мл). Встряхните раствор и подождите 15 минут, пока раствор не станет прозрачным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать раствор для вскрытия в течение 4 ч.
- Приготовьте наружный раствор, как описано в таблице 1. Доведите до pH 7,2 с NaOH и отрегулируйте осмолярность до 250-255 мОсм/л.
- Перед применением раствор для наружного применения обработать оксигенированным физиологическим раствором (95% кислорода и 5% углекислого газа) в течение 5 мин. С помощью пипетки перелейте около 10 мкл раствора для препарирования в чашку Петри. Это решение обеспечит необходимые условия для вскрытия и визуализации мозга.
- Тщательно препарируйте мозг обеих линий tub-Gal4>UAS-GCaMP6m и tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi с помощью игл шприца и микроскопа. Следуйте установленному протоколу вскрытия головного мозга27.
- С помощью пипетки переложите подготовленный мозг в записывающую чашку, содержащую 5 мл свежего наружного раствора, и иммобилизуйте мозг с помощью держателя до-диез в чашке для записи на 3-5 мин для восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель до-диез изготовлен из металлического полукруга диаметром 7 мм, пересеченного параллельными волокнами на расстоянии 0,5 мм друг от друга. - Настройка и получение конфокальной визуализации
- Для конфокальной визуализации захватите каждый мозг с помощью 20-кратного объектива и режима xyt-сканирования. Идентификация нейронов тела гриба с помощью дополнительного 4,5-кратного цифрового усиления на основе 20-кратного оптического усиления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый мозг ex vivo может быть визуализирован в течение более 1 часа. - Получение полного излучения мозга-GCaMP6m при возбуждении лазера с длиной волны 488 нм и мощностью лазера 16 мкВт. Установите параметры сканирования на скорость 400 пикселей с размером пикселя 256 x 256 пикселей. Используйте частоту сбора данных 5,3 Гц и записывайте в течение 3 минут.
- Для конфокальной визуализации захватите каждый мозг с помощью 20-кратного объектива и режима xyt-сканирования. Идентификация нейронов тела гриба с помощью дополнительного 4,5-кратного цифрового усиления на основе 20-кратного оптического усиления.
- Определите 5-8 ROI в каждом мозге и проанализируйте флуоресценцию. Вручную определите тело клетки нейронов тела гриба в качестве интересующей области28.
- Пометьте идентифицированные нейроны и измерьте интенсивность их флуоресценции с помощью ImageJ. Проанализируйте данные флуоресценции GCaMP6m с помощью %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся на 2-2,5 стандартных отклонения выше исходного уровня, определяют как небольшие пики, а внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся более чем на 2,5 стандартных отклонения над исходным уровнем, как большие спайки. Проанализируйте частоту скачков кальция с помощью t-критерия Стьюдента.
ПРИМЕЧАНИЕ: F0 была определена как базовая линия по средней интенсивности флуоресценции начальных 5 кадров в ROI, F1 как интенсивность флуоресценции в данный момент времени, а B как фон без флуоресценции. Временная физиологическая активность нейронов также помогает отличить их от шумовых знаков.
- Пометьте идентифицированные нейроны и измерьте интенсивность их флуоресценции с помощью ImageJ. Проанализируйте данные флуоресценции GCaMP6m с помощью %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся на 2-2,5 стандартных отклонения выше исходного уровня, определяют как небольшие пики, а внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся более чем на 2,5 стандартных отклонения над исходным уровнем, как большие спайки. Проанализируйте частоту скачков кальция с помощью t-критерия Стьюдента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы обнаружили, что мухи с нокдауном cac показали значительно более высокие показатели судорожного поведения, чем мухи WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] против 4,50 ± 2,03 [n = 6]; Р = 0,0061; t-критерий Стьюдента, рисунок 1А). Большинство мух tub-Gal4>UAS-cac-RNAi выздоравливали в течение 1-5 с, в то время как мухи UAS-cac-RNAi восстанавливались в течение 2 с. Процент восстановления мух-нокдаунов CAC в течение 1 с был достоверно ниже, чем у мух WT (88,08 ± 1,89 [n = 6] против 96,50 ± 1,82 [n = 6]; Р = 0,0093; t-критерий Стьюдента, рис. 1Б). Как показано на рисунке 2, кальциевые сигналы наблюдались в грибовидном теле мух. Небольшие всплески наблюдались реже у мух с нокдауном CAC (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] по сравнению с tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; Р < 0,0001; t-критерий Стьюдента), в то время как большие всплески наблюдались чаще у мух-нокдаунов CAC (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] по сравнению с tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Эти результаты указывают на то, что кальциевые сигналы, наблюдаемые у мух, высоко коррелируют с нейронной активностью и показали согласованность с судорожным поведением у мух с нокдауном CAC .
Рисунок 1: Классическая частота судорог и время восстановления у мух. (А) Судороги возникали с большей частотой у мух с нокдауном САС . (Б) Время восстановления после припадка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные кальциевые сигналы в грибовидном теле мух. (А) Кальциевые сигналы в выбранных 5 клетках грибовидного тела мух. (B) Типичный след: изменение флуоресценции (ΔF/F) с течением времени от отдельной клетки тела гриба в файлах нокдауна и дикого типа. (C) Глобальные или нейрональные кальциевые события, происходящие в грибовидном теле мух, различающиеся на маленькие и большие шипы. (D) Всплески кальция во всем мозге сногсшибательных мух и контрольной группы. Эта цифра была изменена с разрешения Liu et al.29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Внешнее решение для регистрации и изготовления диссекционного раствора. | |
| Хлорид натрия | 101 мМ |
| Хлористый калий | 3 мМ |
| Хлористый кальций | 1 мМ |
| Хлорид магния | 4 мМ |
| Глюкоза | 5 мМ |
| Фосфат натрия одноосновный | 1,25 мМ |
| Гидрокарбонат натрия | 20,7 мМ |
| Решение для вскрытия | |
| Внешнее решение | 600 мкл |
| Суспензия папаина | 9 U |
| L-лизин | 2 мг/мл |
Таблица 1: Состав наружных и диссекционных растворов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был идентифицирован как ответственный за опосредование разряда различных нейротрансмиттеров, включая глутамат30, 31, 32, и тесно связан с эпилепсией33,34. Ранее поведение мух-нокдаунов Cac не проявляло той тяжести, о которой сообщалось у некоторых мутантов, и даже проявляло подавляющие эффекты у некоторых мух-мутантов с двойными мутантами35. Результаты этого исследования показывают, что мухи-нокдауны более склонны к судорогам, чем их собратья дикого типа. Это наблюдение согласуется с тем фактом, что пациенты и другие животные модели, являющиеся носителями CACNA1A вариантами потери функций, страдают эпилепсией28,36. В глобальном масштабе нокдаун CAC может напрямую нарушить нервно-мышечную передачу в двигательных нейронах. Несмотря на то, что локомоция у взрослых особей и личинок не является прогностическим фактором восприимчивости к судорогам, вклад САК двигательных нейронов в судорожное поведение нуждается в дальнейшемисследовании. Последовательно, при визуализации кальция ex vivo мы заметили большую долю кальциевых событий в грибовидном теле мух с нокдауном CAC, чем у мух дикого типа (WT), что указывает на более высокую частоту возбуждения нейронов9. Грибовидное тело мух считается примерно аналогом гиппокампа и коры головного мозга млекопитающих. Поскольку судороги обычно происходят в гиппокампе и коре головного мозга человека, тело гриба используется для изучения нейронной активности кальция, связанной с судорогами. В заключение, это исследование установило согласованность чувствительного к взрыву судорожного анализа и визуализации кальция у дрозофилы.
В области кальциевой визуализации использование кальциевого индикатора GCaMP6 в сочетании с конфокальной микроскопией позволяет отслеживать изменения концентрации кальция в различных контекстах, таких как in vivo, в клеточных культурах, в срезах мозга и in vivo в интактной ткани мозга модели дрозофилы. Тем не менее, общеизвестно, что визуализация in vivo потоков кальция в центральной нервной системе дрозофилы требует уточненного хирургического вмешательства для достижения оптического доступа к мозгу; Это препятствие может препятствовать практическому применению и прогрессу этого метода в отдельных лабораториях 8,16. Рыбка данио-рерио также является важной животной моделью для изучения эпилепсии. Метод визуализации кальция in vivo также был разработан ранее36. Тем не менее, только личинки рыбок данио могут быть использованы для записи изображений in vivo. С другой стороны, несмотря на то, что модели клеточных культур и срезов мозга могут обеспечить изображения с более высоким разрешением, целостность мозга и его нейронных сетей не может быть полностью воспроизведена в клеточной культуре или срезах мозга из-за структурных нарушений. Настоящее исследование решает эти проблемы, применяя изолированные интактные ткани мозга дрозофилы для визуализации кальция, что позволяет избежать необходимости в сложных хирургических методах и сохранить целостность мозга и нейронных сетей без нарушений. Метод ex vivo также обеспечивает превосходное соотношение сигнал/шум по сравнению с методами визуализации in vivo.
В настоящем исследовании освещаются различные ключевые процедуры в протоколе, касающиеся генерации мух линии tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi . Первоначально двойной балансир играл решающую роль в получении желаемых мух. Маркированные балансиры позволяют исследователям отслеживать аллели и хромосомы в сложных скрещиваниях нескольких поколений38. Впоследствии, для эффективного отделения интактной мозговой ткани и улучшения микроскопической визуализации, необходимо было использовать суспензию папаина для размягчения поверхностных волокон головного мозга. Кроме того, для стабилизации мозга и предотвращения повреждения нейронов во время экспериментов было признано необходимым использование держателя до-диеза с нейлоновым перекрестием27.
В заключение, кальциевая визуализация, применяемая здесь наряду с анализом судорожного поведения у дрозофилы , является мощной системой для скрининга генов, связанных с эпилепсией, и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне. Конечно, этот метод не может изучать кальциевые сигналы в реальном времени, коррелирующие с поведением животных, как другие методы in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515111123 Jing-Da Qiao) и планом по расширению научных исследований в GMU (Jing-Da Qiao). Эта работа также была поддержана Планом развития инновационных способностей студентов Медицинского университета Гуанчжоу (No финансирования 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
