Summary
Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.
Abstract
Epilepsie is een neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door terugkerende aanvallen, gedeeltelijk gecorreleerd met genetische oorsprong, die wereldwijd meer dan 70 miljoen mensen treft. Ondanks het klinische belang van epilepsie, moet de functionele analyse van neurale activiteit in het centrale zenuwstelsel nog worden ontwikkeld. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie, in combinatie met stabiele expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren, zoals GCaMP6, hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van epilepsie op zowel hersenbrede als eencellige resolutieniveaus. Drosophila melanogaster is naar voren gekomen als een hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan epilepsie vanwege de geavanceerde moleculaire genetica en gedragstesten. In deze studie presenteren we een nieuw en efficiënt protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila die GCaMP6 tot expressie brengt om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het hele brein is voorbereid op cac, een bekend epilepsie-gen, knockdown-vliegen voor calciumbeeldvorming met een confocale microscoop om de neurale activiteit te identificeren als vervolg op de knalgevoelige aanvalsachtige gedragstest. De cac-knockdown-vliegen vertoonden een hogere mate van epileptisch gedrag en abnormale calciumactiviteiten, waaronder meer grote pieken en minder kleine pieken dan wild-type vliegen. De calciumactiviteiten waren gecorreleerd met epileptisch gedrag. Deze methodologie dient als een efficiënte methodologie bij het screenen van de pathogene genen op epilepsie en het onderzoeken van het mogelijke mechanisme van epilepsie op cellulair niveau.
Introduction
Epilepsie, een complexe chronische neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door de herhaling van spontane en niet-uitgelokte aanvallen en afwijkende neuronale netwerkactiviteit, heeft wereldwijd meer dan 70 miljoen mensen getroffen, waardoor het een van de meest voorkomende neurologischeaandoeningen is 1 en leidt tot de zware lasten van gezinnen en de samenleving. Met het oog op de impact van epilepsie zijn er veel onderzoeken uitgevoerd om de etiologie van aanvallen te identificeren, waarvan genetica is goedgekeurd als een primaire oorzaak van vele soorten epilepsie of epileptische syndromen2. In de afgelopen decennia heeft de vooruitgang in genomische technologieën geleid tot een snelle toename van de ontdekking van nieuwe epilepsie-geassocieerde genen, die een cruciale rol spelen bij het optreden van aanvallen, waaronder ionkanalen en niet-ionkanaalgenen 3,4. De onderliggende mechanismen en functionele analyse tussen de genen en epileptische fenotypes worden echter niet volledig begrepen. Het identificeren van epilepsie-geassocieerde genen en mechanismen biedt de mogelijkheid om patiënten efficiënt te behandelen 5,6.
Cytosolische calciumsignalen zijn cruciale elementen in neuronale activiteit en synaptische transmissie. Calciumbeeldvorming, waaronder hersenplakjes7, in vivo 8,9 en ex vivo10, wordt sinds de jaren 1970 gebruikt om neuronale activiteit11 te volgen als een marker voor neuronale prikkelbaarheid12,13. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie, in combinatie met de genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), zoals GCaMP6, hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van epilepsie op zowel hersenbrede als eencellige resolutieniveaus 14,15,16, die een hoge mate van spatiotemporele precisie heeft. Veranderingen in calciumconcentratie en transiënten werden waargenomen in actiepotentialen en synaptische transmissie, respectievelijk14, wat aangeeft dat de verandering van intracellulaire calciumspiegels een strikte correlatie vertoont met de elektrische prikkelbaarheid van neuronen17,18. Calciumbeeldvorming is ook toegepast als een ontwikkelingsaanvalsmodel9 en uitgevoerd in Drosophila voor het screenen van anticonvulsieve stoffen19.
Drosophila melanogaster is naar voren gekomen als een krachtig modelorganisme in wetenschappelijk onderzoek, zoals epilepsie, vanwege zijn geavanceerde moleculaire genetica en gedragstesten 20,21,22. Bovendien hebben de geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila bijgedragen aan de expressie van de genetisch gecodeerde calciumindicator GCaMP6. De op Gal4 en UAS gebaseerde binaire transcriptiesystemen maken bijvoorbeeld specifieke expressie van de GCaMP6 mogelijk op een ruimtelijk en temporeel gecontroleerde manier. Aangezien Drosophila een klein organisme is, vereist in vivo calciumbeeldvorming bekwame operatievaardigheden om een chirurgische ingreep uit te voeren, waarbij slechts een klein deel van de dorsale hersenhelft werd blootgesteld door een klein venster14,23. Tegelijkertijd kan ex vivo calciumbeeldvorming in de intacte hersenen van Drosophila worden gebruikt om de interessegebieden (ROI's) van de hele hersenen te volgen.
In deze studie presenteren we ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila die GCaMP6 tot expressie brengt om epileptiforme activiteiten te monitoren. CACNA1A een bekend epilepsie-gen is, behoort cac tot het Cav2-kanaal, dat een homoloog is voor CACNA1A. We begonnen met het ontleden van de hersenen van cac knockdown vliegen tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi en beeldden ze af met behulp van een confocale microscoop met xyt-scanmodus. Vervolgens analyseerden we de veranderingen in calciumsignalen van ROI's door indicatoren te berekenen die spontane aanvalsachtige gebeurtenissen kwantificeren, zoals %ΔF/F-waarde en calciumgebeurtenissen van GCaMP6-fluorescentie. Daarnaast voerden we mechanische stimulus uit door een vortexmachine om aanvalsgedragstests op cac-knockdown-vliegen te induceren en om de resultaten van calciumbeeldvorming te valideren. Over het algemeen biedt dit protocol een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protocol voor de banggevoelige test
- Vestig de experimentele vliegen door de tub-Gal4-driverlijn te kruisen met de UAS-cac-RNAi-lijn via het Gal4/UAS-systeem21. Verzamel de maagdelijke vliegen van de tub-Gal4-lijn en de mannelijke vliegen van de UAS-cac-RNAi-lijn . Breng vervolgens de maagdelijke en mannelijke vliegen over in dezelfde flacon om het nageslacht te oogsten.
OPMERKING: De tub-Gal4-driverlijn maakt het mogelijk om het cac-gen globaal uit te schakelen. Gebruik de UAS-cac-RNAi-lijn als controlegroep. - Na 3-5 dagen eclosie de vliegen voorzichtig verdoven met behulp van de 100% CO2 (CO2 -anesthesieapparatuur) en zowel de tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-vliegen als de UAS-cac-RNAi-vliegen verzamelen met een borstel. Breng deze vliegen 1 dag voor het testen over in nieuwe, schone voedselflacons om er zeker van te zijn dat ze goed voorbereid zijn.
- Verdoof de vliegen voorzichtig met behulp van de CO2. Eenmaal verdoofd, plaatst u voorzichtig 4-6 vliegen in individuele verse flesjes. Laat de vliegen ongeveer 1 uur herstellen van de anesthesie voordat u verder gaat met testen.
OPMERKING: Voor elk genotype werden minimaal vijf proeven getest en elke proef bestond uit zes flesjes vliegen. - Stel het opnameapparaat in. Plaats een camera (minimaal 720-1080P, 30-60 FPS, AF-vergrendeld) op een statief voor een whiteboard. Pas de scherpstelling van de camera handmatig aan met behulp van een lege flacon om heldere en nauwkeurige beelden te garanderen.
- Gebruik een vortexmixer om het mechanisch geïnduceerde aanvalsachtige gedrag uit te voeren. Plaats elke flacon met 4-6 vliegen op de vortexmixer en laat deze precies 10 s op de hoogste stand (2800 tpm) draaien. Plaats de flacon na de vortex onmiddellijk op het whiteboard.
- Observeer de vliegen en noteer elk aanvalsachtig gedrag dat ze vertonen.
OPMERKING: Epileptisch gedrag dat bij vliegen wordt waargenomen, bestaat uit drie fasen: epileptische aanval (die zich manifesteert als trillende vleugels), verlamming en herstel24. De verhouding tussen het aantal aanvalsvliegen en geteste vliegen werd gedefinieerd als het aantal aanvallen.- Meet de hersteltijd als de tijd die nodig is na vortexing totdat vliegen weer in staat zijn om rechtop te staan25.
2. Protocol voor calciumbeeldvorming van ex vivo hersenen
- Stel respectievelijk de tub-Gal4>UAS-GCaMP6m- en tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-lijnvliegen vast. Genereer de vliegen met behulp van het Gal4/UAS binaire expressiesysteem21 om de calciumactiviteit in de ex vivo hersenen te kunnen volgen.
- Bereid de dissectieoplossing zoals beschreven in het meegeleverde recept (tabel 1)26.
- Bereid de uitwendige oplossing zoals beschreven in tabel 1. Pas aan naar pH 7.2 met NaOH en pas de osmolariteit aan tot 250-255 mOsm/L.
OPMERKING: De uitwendige oplossing kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. - Voeg voor het bereiden van de dissectieoplossing 9 eenheden papaïnesuspensie en L-lysine (2 mg/ml) toe aan 600 μl van de uitwendige oplossing. Draai de oplossing en wacht 15 minuten tot de oplossing helder is.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de dissectieoplossing binnen 4 uur te gebruiken.
- Bereid de uitwendige oplossing zoals beschreven in tabel 1. Pas aan naar pH 7.2 met NaOH en pas de osmolariteit aan tot 250-255 mOsm/L.
- Doordrenk de externe oplossing met zuurstofrijke zoutoplossing (95% zuurstof en 5% kooldioxide) gedurende 5 minuten voor gebruik. Gebruik de pipet om ongeveer 10 μL van de dissectieoplossing over te brengen in een petrischaaltje. Deze oplossing zal de nodige voorwaarden bieden voor hersendissectie en beeldvorming.
- Ontleed zorgvuldig de hersenen van zowel de tub-Gal4>UAS-GCaMP6m - als de tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-lijnen met behulp van de spuitnaalden en de microscoop. Volg het vastgestelde protocol voor hersendissectie27.
- Gebruik een pipet om de voorbereide hersenen over te brengen in een opnameschaal met 5 ml verse externe oplossing en immobiliseer de hersenen met behulp van een Cis-houder in de opnameschaal gedurende 3-5 minuten voor herstel.
OPMERKING: De Cis-houder is gemaakt van een metalen halve cirkel met een diameter van 7 mm die wordt doorkruist door parallelle vezels die 0,5 mm uit elkaar staan. - Confocale beeldvorming instellen en acquisitie
- Voor confocale beeldvorming legt u elk brein vast met een 20x objectief en xyt-scanmodus. Identificeer de neuronen van het paddenstoelenlichaam met een extra 4,5x digitale versterking op basis van 20x optische versterking.
OPMERKING: Elk ex vivo-brein kan langer dan 1 uur in beeld worden gebracht. - Verkrijg de hele hersenen-GCaMP6m-emissie bij 488 nm laserexcitatie met een laservermogen van 16 μw. Stel de scanparameters in op een snelheid van 400, met een pixelgrootte van 256 pixels x 256 pixels. Gebruik een opnamesnelheid van 5,3 Hz en neem op voor een duur van 3 minuten.
- Voor confocale beeldvorming legt u elk brein vast met een 20x objectief en xyt-scanmodus. Identificeer de neuronen van het paddenstoelenlichaam met een extra 4,5x digitale versterking op basis van 20x optische versterking.
- Identificeer 5-8 ROI's in elk brein en analyseer de fluorescentie. Bepaal handmatig het cellichaam van neuronen in het paddenstoelenlichaam als het interessegebied28.
- Label de geïdentificeerde neuronen en meet hun fluorescentie-intensiteiten met ImageJ. Analyseer de fluorescentiegegevens van GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definieer de intracellulaire fluorescentie, toenemend tussen 2 en 2,5 standaarddeviaties boven de basislijn, als kleine pieken, en intracellulaire fluorescentie, toenemend tot meer dan 2,5 standaarddeviaties boven de basislijn, als grote pieken. Analyseer de frequentie van calciumpieken door de t-toets van de student.
OPMERKING: F0 werd gedefinieerd als de basislijn door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de eerste 5 frames in ROI's, F1 als de fluorescentie-intensiteit van het gegeven tijdstip en B als de achtergrond zonder fluorescentie. Temporele fysiologische activiteiten van neuronen zijn ook nuttig om ze te onderscheiden van geluidstekens.
- Label de geïdentificeerde neuronen en meet hun fluorescentie-intensiteiten met ImageJ. Analyseer de fluorescentiegegevens van GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definieer de intracellulaire fluorescentie, toenemend tussen 2 en 2,5 standaarddeviaties boven de basislijn, als kleine pieken, en intracellulaire fluorescentie, toenemend tot meer dan 2,5 standaarddeviaties boven de basislijn, als grote pieken. Analyseer de frequentie van calciumpieken door de t-toets van de student.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol ontdekten we dat cac-knockdown-vliegen significant hogere percentages van aanvalsachtig gedrag vertoonden dan de WT-vliegen (17.00 ± 2.99 [n = 6] versus 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0,0061; T-toets van de leerling, figuur 1A). De meeste tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-vliegen herstelden zich binnen 1-5 s, terwijl UAS-cac-RNAi-vliegen binnen 2 s herstelden. Het herstelpercentage van cac knockdown vliegen binnen 1 s was significant lager dan de WT vliegen (88,08 ± 1,89 [n = 6] vs 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; T-toets van de leerling, figuur 1B). Zoals te zien is in figuur 2, werden calciumsignalen waargenomen in het paddenstoelenlichaam van vliegen. Kleine pieken kwamen minder voor bij cac-knockdown-vliegen (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Student's t-test), terwijl grote pieken meer voorkwamen bij cac knockdown vliegen (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Deze resultaten geven aan dat de calciumsignalen die bij vliegen worden waargenomen, sterk correleren met neuronale activiteit en consistentie vertoonden met het aanvalsachtige gedrag bij CAC-knockdown-vliegen.
Figuur 1: Klassieke aanvalspercentages en hersteltijd bij vliegen. (A) Aanvallen kwamen vaker voor bij cac-knockdown-vliegen. (B) De hersteltijd na inbeslagname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve calciumsignalen in het paddenstoelenlichaam van vliegen. (A) Calciumsignalen in geselecteerde 5 cellen in het paddenstoelenlichaam van vliegen. (B) Typisch spoor: Verandering in fluorescentie (ΔF/F) in de loop van de tijd van een individuele cel van het paddenstoelenlichaam in knockdown- en wild-type bestanden. (C) Globale of neuronale calciumgebeurtenissen die zich voordoen in het paddenstoelenlichaam van vliegen, onderscheiden in kleine en grote aren. (D) Calciumpieken in het hele brein van knockdown-vliegen en controles. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Liu et al.29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Externe oplossing voor het opnemen en maken van dissectie-oplossing. | |
| Tafelzout | 101 mM |
| Kaliumchloride | 3 mM |
| Calciumchloride | 1 mM |
| Magnesiumchloride | 4 mM |
| Glucose | 5 mM |
| Natriumfosfaat monobasisch | 1,25 mM |
| Natriumbicarbonaat | 20,7 mM |
| Dissectie oplossing | |
| Externe oplossing | 600 μL |
| Papaïne suspensie | 9 U |
| L-lysine | 2 mg/ml |
Tabel 1: Samenstelling van uitwendige en dissectieoplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het calciumion dient als een cruciale tweede boodschapper en speelt een cruciale rol in een reeks fysiologische en pathofysiologische reacties op zowel chemische als elektrische verstoringen. Bovendien is het topologische element van de presynaptische P/Q-kanalen, gecodeerd door het menselijke CACNA1A-gen, geïdentificeerd als verantwoordelijk voor het mediëren van de afvoer van verschillende neurotransmitters, waaronder glutamaat 30,31,32, en is het nauw verbonden met epilepsie 33,34. Voorheen vertoonde het gedrag van Cac-knockdown-vliegen niet de ernst die bij sommige mutanten werd gerapporteerd en vertoonde het zelfs onderdrukkende effecten bij bepaalde dubbele mutantvliegen35 . De bevindingen van deze studie laten zien dat cac-knockdown-vliegen vatbaarder zijn voor aanvallen dan hun wild-type tegenhangers. Deze observatie komt overeen met het feit dat patiënten en andere diermodellen met CACNA1A varianten met functieverlies lijden aan epilepsie28,36. Wereldwijd zou het uitschakelen van cac de neuromusculaire transmissie in motorneuronen direct kunnen verstoren. Hoewel voortbeweging bij volwassenen en larven niet voorspellend bleek te zijn voor de gevoeligheid voor aanvallen, moet de bijdrage van de cac van motorneuronen aan het aanvalsgedrag verder worden onderzocht37. Consequent merkten we in ex vivo calciumbeeldvorming een groter deel van de calciumgebeurtenissen op in het paddenstoelenlichaam van cac-knockdown-vliegen dan dat van de wild-type (WT) vliegen, wat duidde op een hogere frequentie van neuronaal vuren9. Het paddenstoelenlichaam van vliegen wordt beschouwd als losjes analoog aan de hippocampus en cortex in de hersenen van zoogdieren. Omdat epileptische aanvallen meestal voorkomen in de hippocampus en cortex van mensen, wordt het paddenstoelenlichaam in dit onderzoek gebruikt voor het bestuderen van epileptische neurale calciumactiviteit. Concluderend stelde deze studie de consistentie vast van de knalgevoelige aanvalsachtige test en calciumbeeldvorming in Drosophila.
Op het gebied van calciumbeeldvorming maakt het gebruik van de calciumindicator GCaMP6 in combinatie met confocale microscopie het mogelijk om veranderingen in calciumconcentratie te volgen binnen verschillende contexten, zoals in vivo, in celculturen, in hersenplakjes en in ex vivo intact hersenweefsel van het Drosophila-model. Het is echter algemeen bekend dat de in vivo beeldvorming van calciumfluxen in het centrale zenuwstelsel van Drosophila een verfijnde chirurgische ingreep vereist om optische toegang tot de hersenen te bereiken; Deze belemmering kan de bruikbaarheid en vooruitgang van deze techniek in individuele laboratoria belemmeren 8,16. Zebravis is ook een belangrijk diermodel om epilepsie te bestuderen. De in vivo calciumbeeldvormingsmethode werd ook eerder vastgesteld36. Alleen zebravislarven kunnen echter worden gebruikt voor in vivo beeldvorming. Aan de andere kant, hoewel celkweek- en hersensegmentmodellen beelden met een hogere resolutie kunnen opleveren, kan de integriteit van de hersenen en hun neurale netwerken niet volledig worden gerepliceerd in celkweek of hersenplakjes vanwege structurele verstoring. De huidige studie pakt deze problemen aan door geïsoleerde intacte Drosophila-hersenweefsels te implementeren voor calciumbeeldvorming, waardoor de noodzaak van complexe chirurgische technieken wordt vermeden en de integriteit van de hersenen en neurale netwerken zonder verstoring behouden blijft. De ex vivo-benadering levert ook een superieure signaal-ruisverhouding op in vergelijking met in-vivo-beeldvormingstechnieken.
De huidige studie verduidelijkt verschillende cruciale procedures in het protocol met betrekking tot het genereren van de tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-lijnvliegen . Aanvankelijk speelde de dubbele balancer een cruciale rol bij het verkrijgen van de gewenste vliegen. Gemarkeerde balancers stellen onderzoekers in staat om allelen en chromosomen te volgen door middel van complexe kruisingen van meerdere generaties38. Vervolgens, voor de efficiënte scheiding van het intacte hersenweefsel en verbeterde microscopische visualisatie, was het absoluut noodzakelijk om Papaïne-suspensie te gebruiken om de oppervlaktevezel van de hersenen te verzachten. Om de hersenen te stabiliseren en neuronale schade tijdens experimenten te voorkomen, werd bovendien het gebruik van een Cis-houder met nylon dradenkruis noodzakelijkgeacht27.
Concluderend is calciumbeeldvorming die hier wordt toegepast naast de knalgevoelige aanvalsachtige gedragstest in Drosophila een krachtig systeem voor het screenen van de epilepsie-geassocieerde genen en het onderzoeken van het potentiële mechanisme van epilepsie op cellulair niveau. Zeker, deze techniek kan de real-time calciumsignalen die gecorreleerd zijn met diergedrag niet bestuderen zoals andere in vivo methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (subsidie nr. 2022A1515111123 aan Jing-Da Qiao) en is van plan het wetenschappelijk onderzoek in GMU (Jing-Da Qiao) te verbeteren. Dit werk werd ook ondersteund door het Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (financieringsnummer 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
