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Neuroscience

Ex Vivo Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de la drosophile

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

Nous présentons ici un protocole d’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. Le protocole fournit un outil précieux pour étudier les événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.

Abstract

L’épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par des crises récurrentes, partiellement corrélées à l’origine génétique, affectant plus de 70 millions de personnes dans le monde. Malgré l’importance clinique de l’épilepsie, l’analyse fonctionnelle de l’activité neuronale dans le système nerveux central reste à développer. Les progrès récents de la technologie d’imagerie, combinés à l’expression stable d’indicateurs calciques génétiquement codés, tels que GCaMP6, ont révolutionné l’étude de l’épilepsie à l’échelle du cerveau et à l’échelle d’une cellule. Drosophila melanogaster est apparu comme un outil pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’épilepsie en raison de sa génétique moléculaire sophistiquée et de ses tests comportementaux. Dans cette étude, nous présentons un protocole novateur et efficace pour l’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 afin de surveiller les activités épileptiformes. Le cerveau entier est préparé à partir de cac, un gène bien connu de l’épilepsie, pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal afin d’identifier l’activité neuronale à la suite du test de comportement de type crise sensible à la bang. Les mouches knockdown cac ont montré un taux plus élevé de comportement convulsif et d’activités calciques anormales, y compris plus de gros pics et moins de petits pics que les mouches de type sauvage. Les activités calciques étaient corrélées à un comportement semblable à celui des crises. Cette méthodologie est une méthodologie efficace pour le criblage des gènes pathogènes de l’épilepsie et l’exploration du mécanisme potentiel de l’épilepsie au niveau cellulaire.

Introduction

L’épilepsie, un trouble neurologique chronique complexe caractérisé par la récurrence de crises spontanées et non provoquées et une activité aberrante des réseaux neuronaux, a touché plus de 70 millions de personnes dans le monde, ce qui en fait l’unedes maladies neurologiques les plus courantes 1 et entraîne le lourd fardeau des familles et de la société. Compte tenu de l’impact de l’épilepsie, de nombreuses études ont été menées pour identifier l’étiologie des crises, dont la génétique a été approuvée comme cause principale de nombreux types d’épilepsies ou de syndromes épileptiques2. Au cours des dernières décennies, les progrès des technologies génomiques ont conduit à une augmentation rapide de la découverte de nouveaux gènes associés à l’épilepsie, qui jouent un rôle crucial dans l’apparition des crises, y compris les canaux ioniques et les gènes des canaux non ioniques 3,4. Cependant, les mécanismes sous-jacents et l’analyse fonctionnelle entre les gènes et les phénotypes épileptiques ne sont pas complètement compris. L’identification des gènes et des mécanismes associés à l’épilepsie offre la possibilité d’une prise en charge efficace des patients 5,6.

Les signaux calciques cytosoliques sont des éléments essentiels de l’activité neuronale et de la transmission synaptique. L’imagerie calcique, y compris les tranches de cerveau7, in vivo 8,9 et ex vivo10, est utilisée pour surveiller l’activité neuronale11 en tant que marqueur de l’excitabilité neuronale depuis les années 197012,13. Les progrès récents de la technologie d’imagerie, en combinaison avec les indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP6, ont révolutionné l’étude de l’épilepsie à la fois à l’échelle du cerveau et à des niveaux de résolution unicellulaire 14,15,16, qui a un haut niveau de précision spatio-temporelle. Des changements dans la concentration de calcium et les transitoires ont été observés dans les potentiels d’action et la transmission synaptique, respectivement14, indiquant que l’altération des niveaux de calcium intracellulaire présente une corrélation stricte avec l’excitabilité électrique des neurones17,18. L’imagerie calcique a également été appliquée comme modèle de crise développementale9 et réalisée chez la drosophile pour le criblage de composés anticonvulsifs19.

Drosophila melanogaster est en train de devenir un puissant organisme modèle dans la recherche scientifique, comme l’épilepsie, pour sa génétique moléculaire sophistiquée et ses tests comportementaux 20,21,22. De plus, les outils génétiques avancés chez la drosophile ont contribué à l’expression de l’indicateur calcique génétiquement codé GCaMP6. Par exemple, les systèmes transcriptionnels binaires basés sur Gal4 et UAS permettent une expression spécifique du GCaMP6 d’une manière contrôlée spatialement et temporellement. Étant donné que la drosophile est un organisme minuscule, l’imagerie calcique in vivo nécessite des compétences opérationnelles compétentes pour effectuer une intervention chirurgicale, dans laquelle seule une petite partie de la dorsale du cerveau a été exposée à travers une petite fenêtre14,23. Dans le même temps, l’imagerie calcique ex vivo dans le cerveau intact de la drosophile peut être utilisée pour surveiller les régions d’intérêt (ROI) de l’ensemble du cerveau.

Dans cette étude, nous présentons l’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. CACNA1A est un gène bien connu de l’épilepsie, le cac appartient au canal Cav2, qui est un homologue de CACNA1A. Nous avons commencé par disséquer le cerveau de mouches knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi et les imager à l’aide d’un microscope confocal avec mode de balayage xyt. Nous avons ensuite analysé les changements dans les signaux calciques des ROI en calculant des indicateurs qui quantifient les événements spontanés de type convulsive, tels que la valeur %ΔF/F et les événements calciques de la fluorescence GCaMP6. De plus, nous avons effectué un stimulus mécanique à l’aide d’une machine vortex pour induire des tests de comportement de crise sur des mouches cac-knockdown afin de valider les résultats de l’imagerie calcique. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un outil précieux pour l’étude des événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.

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Protocol

1. Protocole pour l’essai sensible à la bang

  1. Établir les mouches expérimentales en croisant la lignée de conducteur tub-Gal4 avec la lignée UAS-cac-RNAi via le système Gal4/UAS21. Collecter les mouches vierges de la lignée tub-Gal4 et les mouches mâles de la lignée UAS-cac-RNAi . Ensuite, transférez les mouches vierges et mâles dans le même flacon pour récolter la progéniture.
    REMARQUE : La ligne de pilote tub-Gal4 permettra d’obtenir un knockdown global du gène cac . Utilisez la lignée UAS-cac-RNAi comme groupe témoin.
  2. Après 3 à 5 jours d’éclosion, anesthésiez doucement les mouches à l’aide du 100% CO2 (équipement d’anesthésie CO2 ) et collectez à la fois les mouches tub-Gal4>UAS-cac-RNAi et les mouches UAS-cac-RNAi avec un pinceau. Transférez ces mouches dans des flacons d’aliments neufs et propres 1 jour avant l’analyse pour vous assurer qu’elles sont bien préparées.
  3. Anesthésiez doucement les mouches à l’aide du CO2. Une fois anesthésié, placez soigneusement 4 à 6 mouches dans des flacons frais individuels. Laissez les mouches se remettre de l’anesthésie pendant environ 1 h avant de procéder aux tests.
    NOTA : Pour chaque génotype, au moins cinq essais ont été testés, et chaque essai consistait en six flacons de mouches.
  4. Installez l’équipement d’enregistrement. Placez un appareil photo (720-1080P, 30-60 FPS au moins, AF verrouillé) sur un trépied devant un tableau blanc. Ajustez manuellement la mise au point de la caméra à l’aide d’une fiole vide pour garantir des images claires et précises.
  5. Utilisez un mélangeur vortex pour effectuer le comportement de crise induit mécaniquement. Placez chaque flacon contenant 4 à 6 mouches sur le mélangeur vortex et faites-le fonctionner au réglage le plus élevé (2800 tr/min) pendant exactement 10 s. Après le vortex, placez rapidement la fiole sur le tableau blanc.
  6. Observez les mouches et notez tout comportement convulsif qu’elles présentent.
    REMARQUE : Le comportement convulsif observé chez les mouches se compose de trois étapes : la crise (se manifestant par des ailes vibrantes), la paralysie et la récupération24. Le rapport entre le nombre de mouches saisies et le nombre de mouches testées a été défini comme le taux de saisies.
    1. Mesurez le temps de récupération comme le temps nécessaire après le vortex jusqu’à ce que les mouches retrouvent la capacité de se tenir debout25.

2. Protocole d’imagerie calcique du cerveau ex vivo

  1. Établir les mouches de la lignée tub-Gal4>UAS-GCaMP6m et tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , respectivement. Générer les mouches à l’aide du système d’expression binaire Gal4/UAS21 pour permettre le suivi de l’activité calcique dans le cerveau ex vivo .
  2. Préparez la solution de dissection comme décrit dans la recette fournie (tableau 1)26.
    1. Préparez la solution externe comme décrit dans le tableau 1. Ajustez à un pH de 7,2 avec du NaOH et ajustez l’osmolarité à 250-255 mOsm/L.
      REMARQUE : La solution externe peut être conservée à 4 °C pendant 1 semaine.
    2. Pour préparer la solution de dissection, ajouter 9 unités de suspension de papaïne et de L-lysine (2 mg/mL) à 600 μL de solution externe. Mettez la solution en vortex et attendez 15 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser la solution de dissection dans les 4 heures.
  3. Perfuser la solution externe avec une solution saline oxygénée (95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone) pendant 5 min avant utilisation. À l’aide de la pipette, transférer environ 10 μL de la solution de dissection dans une boîte de Pétri. Cette solution fournira les conditions nécessaires à la dissection cérébrale et à l’imagerie.
  4. Disséquez soigneusement les cerveaux des lignées tub-Gal4>UAS-GCaMP6m et tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi à l’aide des aiguilles de seringue et du microscope. Suivez le protocole établi pour la dissection cérébrale27.
  5. À l’aide d’une pipette, transférer le cerveau préparé dans une boîte d’enregistrement contenant 5 ml de solution externe fraîche et immobiliser le cerveau à l’aide d’un support en do dièse dans la boîte d’enregistrement pendant 3 à 5 minutes pour la récupération.
    REMARQUE : Le support C-dièse était constitué d’un demi-cercle métallique de 7 mm de diamètre traversé par des fibres parallèles espacées de 0,5 mm.
  6. Configuration et acquisition de l’imagerie confocale
    1. Pour l’imagerie confocale, capturez chaque cerveau avec un objectif 20x et un mode de balayage xyt. Identifiez les neurones du corps du champignon avec une amplification numérique supplémentaire de 4,5x basée sur une amplification optique de 20x.
      NOTE : Chaque cerveau ex vivo peut être imagé pendant plus de 1 h.
    2. Acquérir l’émission GCaMP6m du cerveau entier à une excitation laser de 488 nm avec une puissance laser de 16 μw. Réglez les paramètres de numérisation sur une vitesse de 400, avec une taille de pixel de 256 pixels x 256 pixels. Utilisez une fréquence d’acquisition de 5,3 Hz et enregistrez pendant une durée de 3 min.
  7. Identifiez 5 à 8 ROI dans chaque cerveau et analysez la fluorescence. Déterminer manuellement le corps cellulaire des neurones du corps du champignon comme région d’intérêt28.
    1. Étiquetez les neurones identifiés et mesurez leurs intensités de fluorescence par ImageJ. Analysez les données de fluorescence de GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Définissez la fluorescence intracellulaire, augmentant entre 2 et 2,5 écarts-types au-dessus de la ligne de base, comme de petits pics, et la fluorescence intracellulaire, augmentant de plus de 2,5 écarts-types au-dessus de la ligne de base, comme de grands pics. Analysez la fréquence des pics calciques à l’aide du test t de Student.
      REMARQUE : F0 a été défini comme la ligne de base par l’intensité moyenne de fluorescence des 5 images initiales dans les ROI, F1 comme l’intensité de fluorescence du point de temps donné et B comme l’arrière-plan sans fluorescence. Les activités physiologiques temporelles des neurones sont également utiles pour les distinguer des signes sonores.

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Representative Results

À l’aide de ce protocole, nous avons constaté que les mouches knockdown cac présentaient des taux significativement plus élevés de comportement convulsif que les mouches WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6] ; P = 0,0061 ; Test t de l’étudiant, figure 1A). La plupart des mouches tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se sont rétablies en 1 à 5 s, tandis que les mouches UAS-cac-RNAi se sont rétablies en 2 s. Le pourcentage de récupération des mouches renversées en 1 s était significativement inférieur à celui des mouches WT (88,08 ± 1,89 [n = 6] contre 96,50 ± 1,82 [n = 6] ; P = 0,0093 ; Test t de l’étudiant, figure 1B). Comme le montre la figure 2, des signaux calciques ont été observés dans le corps des champignons des mouches. Les petits pics ont été moins fréquents chez les mouches knockdown cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] par rapport à tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13] ; P < 0,0001 ; Test t de Student), alors que les pics importants se sont produits davantage chez les mouches knockdown cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13] ; P < 0,0001). Ces résultats indiquent que les signaux calciques observés chez les mouches sont fortement corrélés avec l’activité neuronale et ont montré une cohérence avec le comportement de type convulsif chez les mouches cac knockdown.

Figure 1
Figure 1 : Taux de convulsions classiques et temps de récupération chez les mouches. (A) Les convulsions se sont produites à un taux plus élevé chez les mouches abattantes. (B) Le temps de récupération après la crise. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Signaux calciques représentatifs dans le corps des champignons des mouches. (A) Signaux calciques dans 5 cellules sélectionnées dans le corps des champignons des mouches. (B) Trace typique : Changement de fluorescence (ΔF/F) au fil du temps à partir d’une cellule individuelle du corps du champignon dans des fichiers knockdown et de type sauvage. (C) Événements calciques globaux ou neuronaux se produisant dans le corps du champignon des mouches distingués en petites et grandes pointes. (D) Pics de calcium dans tout le cerveau des mouches knockdown et des témoins. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Liu et al.29. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution externe pour l’enregistrement et la fabrication d’une solution de dissection.
Chlorure de sodium 101 millions d’euros
Chlorure de potassium 3 mM
Chlorure de calcium 1 mM
Chlorure de magnésium 4 mM
Glucose 5 mM
Phosphate de sodium monobasique 1,25 millimètre métrique
Bicarbonate de sodium 20,7 millions d’épaisseur
Solution de dissection
Solution externe 600 μL
Suspension de papaïne 9 U
L-lysine 2 mg/mL

Tableau 1 : Composition des solutions externes et de dissection.

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Discussion

L’ion calcium sert de deuxième messager crucial, jouant un rôle central dans une gamme de réponses physiologiques et physiopathologiques aux perturbations chimiques et électriques. De plus, l’élément topologique des canaux P/Q présynaptiques, codé par le gène CACNA1A humain, a été identifié comme responsable de la médiation de la décharge de divers neurotransmetteurs, dont le glutamate 30,31,32, et est étroitement lié à l’épilepsie 33,34. Auparavant, le comportement des mouches knockdown Cac ne présentait pas la gravité rapportée chez certains mutants et présentait même des effets suppressifs chez certaines mouches doubles mutantes35 . Les résultats de cette étude révèlent que les mouches knockdown cac sont plus sujettes aux convulsions que leurs homologues de type sauvage. Cette observation correspond au fait que les patients et d’autres modèles animaux porteurs de CACNA1A variantes de perte de fonction sont atteints d’épilepsie28,36. À l’échelle mondiale, l’inactivation du cac pourrait perturber directement la transmission neuromusculaire dans les motoneurones. Bien que la locomotion chez les adultes et les larves se soit avérée non prédictive de la susceptibilité aux crises, la contribution du cac des motoneurones dans le comportement épileptique doit être étudiée plus en détail37. De manière cohérente, dans l’imagerie calcique ex vivo, nous avons remarqué une plus grande proportion d’événements calciques dans le corps du champignon des mouches knockdown cac que dans celui des mouches de type sauvage (WT), ce qui indique une fréquence plus élevée de déclenchement neuronal9. Le corps du champignon des mouches est considéré comme vaguement analogue à l’hippocampe et au cortex dans le cerveau des mammifères. Étant donné que les convulsions se produisent généralement dans l’hippocampe et le cortex des humains, le corps du champignon est utilisé pour étudier l’activité neuronale du calcium liée aux crises dans cette étude. En conclusion, cette étude a établi la cohérence du test de type crise sensible à la bang et de l’imagerie calcique chez la drosophile.

Dans le domaine de l’imagerie calcique, l’utilisation de l’indicateur calcique GCaMP6 en combinaison avec la microscopie confocale permet de surveiller les altérations de la concentration en calcium dans divers contextes tels que in vivo, dans des cultures cellulaires, dans des coupes de cerveau et dans des tissus cérébraux intacts in vivo du modèle de drosophile. Cependant, il est communément admis que l’imagerie in vivo des flux de calcium dans le système nerveux central de la drosophile nécessite une intervention chirurgicale raffinée pour obtenir un accès optique au cerveau ; Cet obstacle peut entraver la praticité et le progrès de cette technique dans les laboratoires individuels 8,16. Le poisson-zèbre est également un modèle animal important pour étudier l’épilepsie. La méthode d’imagerie calcique in vivo a également été établie précédemment36. Cependant, seules les larves de poisson-zèbre peuvent être utilisées pour l’enregistrement d’imagerie in vivo. D’autre part, bien que les modèles de culture cellulaire et de coupes cérébrales puissent fournir des images à plus haute résolution, l’intégrité du cerveau et de ses réseaux neuronaux ne peut pas être entièrement reproduite dans la culture cellulaire ou les tranches de cerveau en raison d’une perturbation structurelle. La présente étude aborde ces questions en mettant en œuvre des tissus cérébraux intacts isolés de drosophile pour l’imagerie calcique, évitant ainsi le besoin de techniques chirurgicales complexes et préservant l’intégrité du cerveau et des réseaux neuronaux sans perturbation. L’approche ex vivo permet également d’obtenir un rapport signal/bruit supérieur à celui des techniques d’imagerie in vivo.

La présente étude élucide diverses procédures pivots dans le protocole concernant la génération des mouches de la lignée tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi . Initialement, le double équilibreur jouait un rôle crucial dans l’obtention des mouches souhaitables. Les équilibreurs marqués permettent aux chercheurs de suivre les allèles et les chromosomes à travers des croisements multigénérationnels complexes38. Par la suite, pour une séparation efficace du tissu cérébral intact et une meilleure visualisation microscopique, il était impératif d’utiliser la suspension de papaïne pour ramollir la fibre superficielle du cerveau. De plus, pour stabiliser le cerveau et prévenir les dommages neuronaux pendant l’expérimentation, l’utilisation d’un support en do dièse avec un réticule en nylon a été jugée nécessaire27.

En conclusion, l’imagerie calcique appliquée ici en complément du test de comportement de type crise sensible à la bang chez la drosophile est un système puissant pour cribler les gènes associés à l’épilepsie et explorer le mécanisme potentiel de l’épilepsie au niveau cellulaire. Certes, cette technique ne permet pas d’étudier les signaux calciques en temps réel corrélés au comportement animal comme d’autres méthodes in vivo.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par la Fondation de recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (subvention n° 2022A1515111123 à Jing-Da Qiao) et prévoient de renforcer la recherche scientifique en GMU (Jing-Da Qiao). Ce travail a également été soutenu par le plan d’amélioration de la capacité d’innovation des étudiants de l’Université de médecine de Guangzhou (financement n° 02-408-2304-02038XM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

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References

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<em>Ex Vivo</em> Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de <em>la drosophile</em>
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He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., Lin, Y. M., Mao, Y. L., Qiao, J. D. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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