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Neuroscience

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Abstract

Epilepsie ist eine neurologische Erkrankung, die durch wiederkehrende Anfälle gekennzeichnet ist, die teilweise mit dem genetischen Ursprung korrelieren und weltweit über 70 Millionen Menschen betreffen. Trotz der klinischen Bedeutung der Epilepsie muss die funktionelle Analyse der neuronalen Aktivität im zentralen Nervensystem noch entwickelt werden. Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie in Kombination mit einer stabilen Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie GCaMP6 haben die Untersuchung von Epilepsie sowohl bei der Auflösung des Gehirns als auch bei Einzelzellen revolutioniert. Drosophila melanogaster hat sich aufgrund seiner ausgefeilten Molekulargenetik und Verhaltensassays zu einem Werkzeug zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen entwickelt, die Epilepsie zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir ein neuartiges und effizientes Protokoll für die ex vivo Kalzium-Bildgebung in GCaMP6-exprimierender adulter Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das gesamte Gehirn wird aus cac, einem bekannten Epilepsie-Gen, präpariert, Knockdown-Fliegen für die Kalzium-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop, um die neuronale Aktivität als Folgemaßnahme zum knallsensitiven anfallsähnlichen Verhaltenstest zu identifizieren. Die cac-knockdown-Fliegen zeigten eine höhere Rate an anfallsartigem Verhalten und abnormalen Kalziumaktivitäten, einschließlich mehr großer Stacheln und weniger kleiner Stacheln als Wildtyp-Fliegen. Die Kalziumaktivitäten korrelierten mit anfallsähnlichem Verhalten. Diese Methodik dient als effiziente Methodik, um die pathogenen Gene auf Epilepsie zu untersuchen und den potenziellen Mechanismus der Epilepsie auf zellulärer Ebene zu erforschen.

Introduction

Epilepsie, eine komplexe chronische neurologische Erkrankung, die durch das Wiederauftreten spontaner und unprovozierter Anfälle und abnormer neuronaler Netzwerkaktivität gekennzeichnet ist, hat weltweit über 70 Millionen Menschen betroffen, was sie zu einer der häufigsten neurologischenErkrankungen 1 macht und zu schweren Belastungen für Familien und Gesellschaft führt. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen von Epilepsie wurden viele Studien durchgeführt, um die Ätiologie von Anfällen zu identifizieren, von denen die Genetik als Hauptursache für viele Arten von Epilepsien oder epileptischen Syndromen zugelassen wurde2. In den letzten Jahrzehnten haben Fortschritte in der Genomtechnologie zu einem raschen Anstieg der Entdeckung neuer Epilepsie-assoziierter Gene geführt, die eine entscheidende Rolle beim Auftreten von Anfällen spielen, einschließlich Ionenkanälen und Nicht-Ionenkanal-Genen 3,4. Die zugrundeliegenden Mechanismen und die funktionelle Analyse zwischen den Genen und den epileptischen Phänotypen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die Identifizierung von Epilepsie-assoziierten Genen und Mechanismen bietet die Möglichkeit, Patienten effizient zu behandeln 5,6.

Zytosolische Kalziumsignale sind zentrale Elemente der neuronalen Aktivität und der synaptischen Übertragung. Seit den 1970er Jahren wird die Kalzium-Bildgebung, einschließlich Gehirnschnitte7, in vivo 8,9 und ex vivo10, zur Überwachung der neuronalen Aktivität11 als Marker für neuronale Erregbarkeit eingesetzt12,13. Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie in Kombination mit den genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) wie GCaMP6 haben die Untersuchung von Epilepsie sowohl bei der hirnweiten als auch bei der Einzelzellauflösungrevolutioniert 14,15,16, was ein hohes Maß an raumzeitlicher Präzision aufweist. Es wurden Veränderungen der Kalziumkonzentration und der Transienten in den Aktionspotentialen bzw. der synaptischen Übertragung beobachtet14, was darauf hindeutet, dass die Veränderung des intrazellulären Kalziumspiegels eine strikte Korrelation mit der elektrischen Erregbarkeit von Neuronen aufweist17,18. Die Kalzium-Bildgebung wurde auch als Entwicklungsanfallsmodell9 angewendet und in Drosophila zum Screening von krampflösenden Substanzen durchgeführt19.

Drosophila melanogaster hat sich aufgrund seiner ausgefeilten molekulargenetischen und Verhaltenstests zu einem leistungsstarken Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung, wie z. B. Epilepsie, entwickelt 20,21,22. Darüber hinaus haben die fortschrittlichen genetischen Werkzeuge in Drosophila zur Expression des genetisch kodierten Kalziumindikators GCaMP6 beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die Gal4- und UAS-basierten binären Transkriptionssysteme eine spezifische Expression des GCaMP6 auf räumlich und zeitlich kontrollierte Weise. Da es sich bei Drosophila um einen winzigen Organismus handelt, erfordert die In-vivo-Kalziumbildgebung kompetente chirurgische Fähigkeiten, um einen chirurgischen Eingriff durchzuführen, bei dem nur ein kleiner Teil des dorsalen Gehirns durch ein kleines Fenster freigelegt wurde14,23. Gleichzeitig kann die Ex-vivo-Kalziumbildgebung im intakten Gehirn von Drosophila verwendet werden, um die Regionen von Interesse (ROIs) des gesamten Gehirns zu überwachen.

In dieser Studie präsentieren wir ex vivo Calcium-Imaging in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. CACNA1A ein bekanntes Epilepsie-Gen ist, gehört cac zum Cav2-Kanal, der ein Homolog zu CACNA1A ist. Wir begannen damit, die Gehirne von cac-knockdown-Fliegen tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi zu sezieren und sie mit einem konfokalen Mikroskop im xyt-Scanning-Modus abzubilden. Anschließend analysierten wir die Veränderungen der Kalziumsignale von ROIs, indem wir Indikatoren berechneten, die spontane anfallsartige Ereignisse quantifizieren, wie z.B. den %ΔF/F-Wert und Kalziumereignisse der GCaMP6-Fluoreszenz. Zusätzlich führten wir einen mechanischen Stimulus mit einer Vortex-Maschine durch, um Tests zum Anfallsverhalten an Cac-Knockdown-Fliegen zu induzieren und die Ergebnisse der Kalziumbildgebung zu validieren. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung, was die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene ermöglicht.

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Protocol

1. Protokoll für knallempfindlichen Assay

  1. Etablierung der experimentellen Fliegen durch Kreuzung der tub-Gal4-Treiberlinie mit der UAS-cac-RNAi-Linie über das Gal4/UAS-System21. Sammeln Sie die jungfräulichen Fliegen der tub-Gal4-Linie und die männlichen Fliegen der UAS-cac-RNAi-Linie. Setzen Sie dann die jungfräulichen und männlichen Fliegen in dasselbe Fläschchen um, um den Nachwuchs zu ernten.
    HINWEIS: Die tub-Gal4-Treiberlinie ermöglicht es, einen globalen Knockdown des CAC-Gens zu erreichen. Verwenden Sie die UAS-cac-RNAi-Linie als Kontrollgruppe.
  2. Nach 3-5 Tagen der Exlosion werden die Fliegen mit dem 100% CO2 (CO2 -Anästhesiegerät) sanft betäubt und sowohl die tub-Gal4>UAS-cac-RNAi Fliegen als auch die UAS-cac-RNAi Fliegen mit einer Bürste gesammelt. Füllen Sie diese Fliegen 1 Tag vor dem Test in neue, saubere Futterfläschchen um, um sicherzustellen, dass sie gut vorbereitet sind.
  3. Betäuben Sie die Fliegen sanft mit dem CO2 Nach der Betäubung 4-6 Fliegen vorsichtig in einzelne frische Fläschchen geben. Lassen Sie die Fliegen etwa 1 Stunde lang von der Narkose erholen, bevor Sie mit dem Test fortfahren.
    HINWEIS: Für jeden Genotyp wurden mindestens fünf Versuche getestet, und jeder Versuch bestand aus sechs Fläschchen mit Fliegen.
  4. Richten Sie das Aufnahmegerät ein. Positionieren Sie eine Kamera (720-1080P, mindestens 30-60 FPS, AF gesperrt) auf einem Stativ vor einem Whiteboard. Stellen Sie den Fokus der Kamera manuell mit einer leeren Phiole ein, um klare und genaue Aufnahmen zu gewährleisten.
  5. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um das mechanisch induzierte anfallsartige Verhalten auszuführen. Jedes Fläschchen mit 4-6 Fliegen auf den Vortex-Mischer geben und auf höchster Stufe (2800 U/min) genau 10 s laufen lassen. Stellen Sie das Fläschchen nach dem Wirbeln sofort auf das Whiteboard.
  6. Beobachte die Fliegen und zeichne jedes anfallsartige Verhalten auf, das sie zeigen.
    ANMERKUNG: Anfallsähnliches Verhalten, das bei Fliegen beobachtet wird, besteht aus drei Stadien: Anfall (manifestiert sich als vibrierende Flügel), Lähmung und Erholung24. Das Verhältnis von Anfallsfliegen zu getesteten Fliegen wurde als Anfallsrate definiert.
    1. Messen Sie die Erholungszeit als die Zeit, die nach dem Wirbeln erforderlich ist, bis die Fliegen wieder in der Lage sind, aufrecht zu stehen25.

2. Protokoll für die Kalzium-Bildgebung des Ex-vivo-Gehirns

  1. Etablieren Sie die tub-Gal4>UAS-GCaMP6m bzw. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi Linienfliegen. Erzeugung der Fliegen unter Verwendung des binären Gal4/UAS-Expressionssystems21 , um die Überwachung der Kalziumaktivität im ex vivo Gehirn zu ermöglichen.
  2. Bereiten Sie die Präparierlösung wie im mitgelieferten Rezept (Tabelle 1)26 beschrieben vor.
    1. Bereiten Sie die externe Lösung wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 ein und stellen Sie die Osmolarität auf 250-255 mOsm/L ein.
      HINWEIS: Die externe Lösung kann 1 Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
    2. Zur Herstellung der Sezierlösung werden 9 Einheiten Papain-Suspension und L-Lysin (2 mg/ml) zu 600 μl der externen Lösung gegeben. Die Lösung vortexen und 15 Minuten warten, bis die Lösung klar ist.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Dissektionslösung innerhalb von 4 Stunden zu verwenden.
  3. Perfundiertieren Sie die externe Lösung vor Gebrauch 5 Minuten lang mit sauerstoffhaltiger Kochsalzlösung (95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid). Verwenden Sie die Pipette, um etwa 10 μl der Präparierlösung in eine Petrischale zu überführen. Diese Lösung wird die notwendigen Voraussetzungen für die Präparation und Bildgebung des Gehirns schaffen.
  4. Die Gehirne der tub-Gal4>UAS-GCaMP6m - und tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-Linien werden mit den Spritzennadeln und dem Mikroskop sorgfältig präziert. Befolgen Sie das festgelegte Protokoll für die Gehirndissektion27.
  5. Verwenden Sie eine Pipette, um das vorbereitete Gehirn in eine Aufnahmeschale mit 5 ml frischer externer Lösung zu überführen, und immobilisieren Sie das Gehirn mit einem cis-Halter in der Aufnahmeschale für 3-5 Minuten zur Erholung.
    HINWEIS: Die Cis-Halterung besteht aus einem Metallhalbkreis mit einem Durchmesser von 7 mm, der von parallelen Fasern im Abstand von 0,5 mm gekreuzt wird.
  6. Aufbau und Aufnahme der konfokalen Bildgebung
    1. Für die konfokale Bildgebung erfassen Sie jedes Gehirn mit einem 20-fachen Objektiv und einem xyt-Scan-Modus. Identifizieren Sie die Neuronen des Pilzkörpers mit einer zusätzlichen 4,5-fachen digitalen Verstärkung, die auf einer 20-fachen optischen Verstärkung basiert.
      HINWEIS: Jedes ex vivo Gehirn kann länger als 1 h abgebildet werden.
    2. Erfassen Sie die gesamte GCaMP6m-Emission des Gehirns bei 488 nm Laseranregung mit 16 μW Laserleistung. Stellen Sie die Scanparameter auf eine Geschwindigkeit von 400 mit einer Pixelgröße von 256 x 256 Pixeln ein. Verwenden Sie eine Erfassungsrate von 5,3 Hz und nehmen Sie 3 Minuten lang auf.
  7. Identifizieren Sie 5-8 ROIs in jedem Gehirn und analysieren Sie die Fluoreszenz. Bestimmen Sie manuell den Zellkörper von Pilzkörperneuronen als die Region von Interesse28.
    1. Markieren Sie die identifizierten Neuronen und messen Sie ihre Fluoreszenzintensität mit ImageJ. Analysieren Sie die Fluoreszenzdaten von GCaMP6m über %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definieren Sie die intrazelluläre Fluoreszenz, die zwischen 2 und 2,5 Standardabweichungen über der Basislinie ansteigt, als kleine Spitzen, und die intrazelluläre Fluoreszenz, die größer als 2,5 Standardabweichungen über der Basislinie ansteigt, als große Spitzen. Analysieren Sie die Häufigkeit von Kalziumspitzen mit dem Student's t-Test.
      HINWEIS: F0 wurde als Basislinie durch die mittlere Fluoreszenzintensität der ersten 5 Frames in ROIs definiert, F1 als Fluoreszenzintensität des angegebenen Zeitpunkts und B als Hintergrund ohne Fluoreszenz. Zeitliche physiologische Aktivitäten von Neuronen sind ebenfalls hilfreich, um sie von Rauschzeichen zu unterscheiden.

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Representative Results

Mit Hilfe dieses Protokolls fanden wir heraus, dass CAC-Knockdown-Fliegen signifikant höhere Raten von anfallsartigem Verhalten zeigten als die WT-Fliegen (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs. 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; t-Test des Schülers, Abbildung 1A). Die meisten tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-Fliegen erholten sich innerhalb von 1-5 s, während UAS-cac-RNAi-Fliegen sich innerhalb von 2 s erholten. Der Erholungsprozentsatz der cac-Knockdown-Fliegen innerhalb von 1 s war signifikant niedriger als der der WT-Fliegen (88,08 ± 1,89 [n = 6] vs. 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; Schüler-t-Test, Abbildung 1B). Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurden Kalziumsignale im Pilzkörper von Fliegen beobachtet. Kleine Spikes traten weniger bei cac-knockdown-Fliegen auf (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Student's t-Test), wohingegen große Spikes eher bei cac-knockdown-Fliegen auftraten (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die in Fliegen beobachteten Kalziumsignale stark mit der neuronalen Aktivität korrelieren und eine Übereinstimmung mit dem anfallsähnlichen Verhalten bei cac-knockdown-Fliegen zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Klassische Anfallsraten und Erholungszeit bei Fliegen. (A) Anfälle traten bei CAC-Knockdown-Fliegen häufiger auf. (B) Die Genesungszeit nach der Beschlagnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Kalziumsignale im Pilzkörper von Fliegen. (A) Kalziumsignale in ausgewählten 5 Zellen im Pilzkörper von Fliegen. (B) Typische Spur: Änderung der Fluoreszenz (ΔF/F) im Laufe der Zeit von einer einzelnen Zelle des Pilzkörpers in Knockdown- und Wildtyp-Dateien. (C) Globale oder neuronale Kalziumereignisse, die im Pilzkörper von Fliegen auftreten, unterschieden in kleine und große Stacheln. (D) Kalziumspitzen im gesamten Gehirn von Knockdown-Fliegen und Kontrollen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Liu et al.29 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Externe Lösung zur Aufnahme und Herstellung von Sezierlösung.
Natriumchlorid 101 mM
Kaliumchlorid 3 mM
Calciumchlorid 1 mM
Magnesiumchlorid 4 mM
Traubenzucker 5 mM
Natriumphosphat einbasisch 1,25 mM
Natriumbicarbonat 20,7 mM
Sezierlösung
Externe Lösung 600 μl
Papain-Suspension 9 HE
L-Lysin 2 mg/ml

Tabelle 1: Zusammensetzung von externen und Dissektionslösungen.

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Discussion

Das Kalziumion dient als entscheidender zweiter Botenstoff und spielt eine zentrale Rolle bei einer Reihe von physiologischen und pathophysiologischen Reaktionen auf chemische und elektrische Störungen. Darüber hinaus wurde das topologische Element der präsynaptischen P/Q-Kanäle, das vom menschlichen CACNA1A-Gen kodiert wird, als verantwortlich für die Vermittlung der Ausschüttung verschiedener Neurotransmitter, einschließlich Glutamat 30,31,32, identifiziert und ist eng mit Epilepsie verbunden 33,34. Zuvor zeigte das Verhalten von Cac-Knockdown-Fliegen nicht den Schweregrad, der bei einigen Mutanten berichtet wurde, und zeigte sogar unterdrückende Wirkungen bei bestimmten Doppelmutantenfliegen35 . Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass cac-Knockdown-Fliegen anfälliger für Krampfanfälle sind als ihre Wildtyp-Artgenossen. Diese Beobachtung korrespondiert mit der Tatsache, dass Patienten und andere Tiermodelle, die CACNA1A Loss-of-Function-Varianten tragen, von Epilepsie betroffen sind28,36. Weltweit könnte der Knockdown von CAC die neuromuskuläre Übertragung in Motoneuronen direkt stören. Obwohl sich herausstellte, dass die Fortbewegung bei Erwachsenen und Larven nicht prädiktiv für die Anfallsanfälligkeit ist, muss der Beitrag des Cac von Motoneuronen zum Anfallsverhalten weiter untersucht werden37. Konsequenterweise stellten wir in der ex vivo Kalziumbildgebung einen größeren Anteil an Kalziumereignissen im Pilzkörper von Cac-Knockdown-Fliegen fest als in dem der Wildtyp-Fliegen (WT), was auf eine höhere Frequenz des neuronalen Feuernshindeutete 9. Der Pilzkörper der Fliege wird als lose analog zum Hippocampus und Kortex im Säugetiergehirn angesehen. Da Anfälle in der Regel im Hippocampus und Kortex des Menschen auftreten, wird der Pilzkörper in dieser Studie zur Untersuchung der anfallsbedingten neuronalen Kalziumaktivität verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie die Konsistenz des Bang-sensitiven anfallsähnlichen Assays und der Kalziumbildgebung in Drosophila nachgewiesen hat.

Im Bereich der Kalziumbildgebung ermöglicht die Verwendung des Kalziumindikators GCaMP6 in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie die Überwachung von Veränderungen der Kalziumkonzentration in verschiedenen Kontexten, wie z.B. in vivo, in Zellkulturen, in Hirnschnitten und in ex vivo intaktem Hirngewebe des Drosophila-Modells. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass die In-vivo-Bildgebung von Kalziumflüssen im zentralen Nervensystem von Drosophila einen verfeinerten chirurgischen Eingriff erfordert, um einen optischen Zugang zum Gehirn zu erhalten. Dieses Hindernis kann die Praktikabilität und den Fortschritt dieser Technik in einzelnen Laboratorien behindern 8,16. Der Zebrafisch ist auch ein wichtiges Tiermodell zur Erforschung von Epilepsie. Das In-vivo-Kalzium-Imaging-Verfahren war ebenfalls bereits etabliert36. Für die In-vivo-Bildaufnahme können jedoch nur Zebrafischlarven verwendet werden. Auf der anderen Seite können Zellkultur- und Hirnschnittmodelle zwar höher aufgelöste Bilder liefern, aber die Integrität des Gehirns und seiner neuronalen Netze kann aufgrund struktureller Störungen in Zellkulturen oder Hirnschnitten nicht vollständig repliziert werden. Die aktuelle Studie befasst sich mit diesen Problemen, indem sie isoliertes intaktes Drosophila-Hirngewebe für die Kalziumbildgebung einsetzt, wodurch die Notwendigkeit komplexer chirurgischer Techniken vermieden und die Integrität des Gehirns und der neuronalen Netzwerke ohne Unterbrechung erhalten bleibt. Der Ex-vivo-Ansatz führt auch zu einem überlegenen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu In-vivo-Bildgebungsverfahren.

Die vorliegende Arbeit beleuchtet verschiedene zentrale Vorgänge im Protokoll zur Generierung der tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-Linienfliegen . Anfangs spielte der Double Balancer eine entscheidende Rolle, um die begehrten Fliegen zu erhalten. Markierte Balancer ermöglichen es Forschern, Allele und Chromosomen durch komplexe, generationenübergreifende Kreuzungen zu verfolgen38. Für die effiziente Abtrennung des intakten Hirngewebes und eine verbesserte mikroskopische Visualisierung war es daher unerlässlich, die Papain-Suspension zu verwenden, um die Oberflächenfaser des Gehirns zu erweichen. Um das Gehirn zu stabilisieren und neuronale Schäden während des Experimentierens zu verhindern, wurde die Verwendung eines cis-Halters mit Nylon-Fadenkreuz als notwendig erachtet27.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kalzium-Bildgebung, die hier zusammen mit dem Bang-sensitiven anfallsähnlichen Verhaltenstest in Drosophila angewendet wird, ein leistungsfähiges System ist, um die Epilepsie-assoziierten Gene zu screenen und den potenziellen Mechanismus der Epilepsie auf zellulärer Ebene zu erforschen. Sicherlich kann diese Technik die Echtzeit-Kalziumsignale, die mit dem Verhalten von Tieren korrelieren, nicht wie andere In-vivo-Methoden untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Fördernummer 2022A1515111123 an Jing-Da Qiao) unterstützt und plant, die wissenschaftliche Forschung in GMU (Jing-Da Qiao) zu verbessern. Diese Arbeit wurde auch durch den Student Innovation Ability Enihancement Plan der Guangzhou Medical University (Fördernummer 02-408-2304-02038XM) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

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References

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Ex-vivo-Kalzium-Bildgebung Drosophila-Modell Epilepsie neurologische Störung wiederkehrende Anfälle genetischer Ursprung Bildgebungstechnologie genetisch kodierte Kalziumindikatoren GCaMP6 gehirnweite Auflösung Einzelzellauflösung Molekulargenetik Verhaltenstests Protokoll adulte Drosophila epileptiforme Aktivitäten konfokales Mikroskop neuronale Aktivität Bang-sensitiver anfallsähnlicher Verhaltenstest Cac-Gen-Knockdown-Fliegen abnormale Kalziumaktivitäten pathogenes Gen-Screening
<em>Ex Vivo</em> Kalzium-Bildgebung für <em>Drosophila-Modell</em> der Epilepsie
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He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., … More

He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., Lin, Y. M., Mao, Y. L., Qiao, J. D. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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