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Neuroscience

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la obtención de imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. El protocolo proporciona una herramienta valiosa para investigar eventos ictales en Drosophila adulta a través de imágenes de calcio ex vivo , lo que permite explorar los posibles mecanismos de la epilepsia a nivel celular.

Abstract

La epilepsia es un trastorno neurológico caracterizado por convulsiones recurrentes, parcialmente correlacionadas con el origen genético, que afecta a más de 70 millones de personas en todo el mundo. A pesar de la importancia clínica de la epilepsia, el análisis funcional de la actividad neuronal en el sistema nervioso central aún está por desarrollar. Los avances recientes en la tecnología de imágenes, en combinación con la expresión estable de indicadores de calcio codificados genéticamente, como GCaMP6, han revolucionado el estudio de la epilepsia tanto a nivel de resolución cerebral como de una sola célula. Drosophila melanogaster se ha convertido en una herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la epilepsia debido a su sofisticada genética molecular y ensayos conductuales. En este estudio, presentamos un protocolo novedoso y eficiente para la obtención de imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. Todo el cerebro se prepara a partir de cac, un gen bien conocido de la epilepsia, para obtener imágenes de calcio con un microscopio confocal para identificar la actividad neuronal como seguimiento del ensayo de comportamiento similar a las convulsiones sensible a la explosión. Las moscas de derribo de cac mostraron una tasa más alta de comportamiento similar a las convulsiones y actividades anormales de calcio, incluyendo más picos grandes y menos picos pequeños que las moscas de tipo salvaje. Las actividades de calcio se correlacionaron con un comportamiento similar a las convulsiones. Esta metodología sirve como una metodología eficiente en la detección de los genes patógenos de la epilepsia y en la exploración del mecanismo potencial de la epilepsia a nivel celular.

Introduction

La epilepsia, un trastorno neurológico crónico complejo caracterizado por la recurrencia de convulsiones espontáneas y no provocadas y una actividad aberrante de la red neuronal, ha afectado a más de 70 millones de personas en todo el mundo, lo que la convierte en una de las enfermedades neurológicas más comunes1 y conlleva una pesada carga para las familias y la sociedad. Teniendo en cuenta el impacto de la epilepsia, se han realizado muchos estudios para identificar la etiología de las convulsiones, de las cuales la genética ha sido aprobada como causa primaria de muchos tipos de epilepsias o síndromes epilépticos2. Durante las últimas décadas, los avances en las tecnologías genómicas han llevado a un rápido aumento en el descubrimiento de nuevos genes asociados a la epilepsia, que desempeñan un papel crucial en la aparición de convulsiones, incluidos los canales iónicos y los genes sin canales iónicos 3,4. Sin embargo, los mecanismos subyacentes y el análisis funcional entre los genes y los fenotipos epilépticos no se comprenden completamente. La identificación de genes y mecanismos asociados a la epilepsia ofrece la posibilidad de manejar a los pacientes de manera eficiente 5,6.

Las señales citosólicas de calcio son elementos fundamentales en la actividad neuronal y la transmisión sináptica. Las imágenes de calcio, incluyendo cortes cerebrales7, in vivo 8,9 y ex vivo10, se han utilizado para monitorear la actividad neuronal11 como marcador de excitabilidad neuronal desde la década de 1970 12,13. Los avances recientes en la tecnología de imagen, en combinación con los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP6, han revolucionado el estudio de la epilepsia tanto a nivel de resolución cerebral como de resolución de una sola célula 14,15,16, que tiene un alto nivel de precisión espacio-temporal. Se observaron cambios en la concentración de calcio y transitorios en los potenciales de acción y transmisión sináptica, respectivamente14, lo que indica que la alteración de los niveles de calcio intracelular exhibe una estricta correlación con la excitabilidad eléctrica de las neuronas17,18. Las imágenes de calcio también se han aplicado como modelo de crisis del desarrollo9 y se han realizado en Drosophila para el cribado de compuestos anticonvulsivos19.

Drosophila melanogaster ha emergido como un poderoso organismo modelo en la investigación científica, como la epilepsia, por su sofisticada genética molecular y ensayos conductuales 20,21,22. Además, las herramientas genéticas avanzadas en Drosophila han contribuido a la expresión del indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP6. Por ejemplo, los sistemas transcripcionales binarios basados en Gal4 y UAS permiten la expresión específica de GCaMP6 de una manera controlada espacial y temporalmente. Dado que Drosophila es un organismo diminuto, la obtención de imágenes de calcio in vivo requiere habilidades operativas competentes para realizar una intervención quirúrgica, en la que solo una pequeña parte de la parte dorsal del cerebro fue expuesta a través de una pequeña ventana14,23. Al mismo tiempo, las imágenes de calcio ex vivo en el cerebro intacto de Drosophila se pueden utilizar para monitorear las regiones de interés (ROI) de todo el cerebro.

En este estudio, presentamos imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. CACNA1A es un gen bien conocido de la epilepsia, el cac pertenece al canal Cav2, que es un homólogo de CACNA1A. Comenzamos diseccionando los cerebros de moscas cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi y obteniendo imágenes de ellos utilizando un microscopio confocal con modo de barrido xyt. A continuación, analizamos los cambios en las señales de calcio de los ROI mediante el cálculo de indicadores que cuantifican los eventos espontáneos similares a las convulsiones, como el valor de %ΔF/F y los eventos de calcio de la fluorescencia de GCaMP6. Además, realizamos un estímulo mecánico mediante una máquina de vórtice para inducir pruebas de comportamiento convulsivo en moscas de derribo de cac para validar los resultados de las imágenes de calcio. En general, este protocolo proporciona una herramienta valiosa para investigar eventos ictales en Drosophila adulta a través de imágenes de calcio ex vivo , lo que permite explorar los posibles mecanismos de la epilepsia a nivel celular.

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Protocol

1. Protocolo para el ensayo sensible a la explosión

  1. Establecer las moscas experimentales cruzando la línea conductora tub-Gal4 con la línea UAS-cac-RNAi a través del sistema Gal4/UAS21. Recolecta las moscas vírgenes de la línea tub-Gal4 y las moscas macho de la línea UAS-cac-RNAi . Luego, transfiera las moscas vírgenes y machos al mismo frasco para cosechar la descendencia.
    NOTA: La línea de controladores tub-Gal4 permitirá lograr la eliminación global del gen cac . Utilice la línea UAS-cac-RNAi como grupo de control.
  2. Después de 3-5 días de eclosión, anestesiar suavemente las moscas con el 100% de CO2 (equipo de anestesia de CO2 ) y recolectar tanto las moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi como las moscas UAS-cac-RNAi con un cepillo. Transfiera estas moscas a viales de alimentos nuevos y limpios 1 día antes de la prueba para asegurarse de que estén bien preparadas.
  3. Anestesiar suavemente a las moscas con el CO2. Una vez anestesiado, coloque con cuidado de 4 a 6 moscas en viales frescos individuales. Deje que las moscas se recuperen de la anestesia durante aproximadamente 1 hora antes de continuar con la prueba.
    NOTA: Para cada genotipo, se probaron un mínimo de cinco ensayos, y cada ensayo consistió en seis viales de moscas.
  4. Configure el equipo de grabación. Coloque una cámara (720-1080P, 30-60 FPS como mínimo, AF bloqueado) en un trípode frente a una pizarra. Ajuste el enfoque de la cámara manualmente con un vial vacío para garantizar imágenes claras y precisas.
  5. Utilice un mezclador de vórtice para realizar el comportamiento similar a las convulsiones inducidas mecánicamente. Coloque cada vial que contenga de 4 a 6 moscas en el mezclador de vórtice y hágalo funcionar en la configuración más alta (2800 rpm) durante exactamente 10 s. Después del vórtice, coloque rápidamente el vial en la pizarra.
  6. Observe a las moscas y registre cualquier comportamiento similar a las convulsiones que exhiban.
    NOTA: El comportamiento similar a las convulsiones observado en las moscas consta de tres etapas: convulsiones (que se manifiestan como alas vibrantes), parálisis y recuperación24. La relación entre las moscas incautadas y las moscas analizadas se definió como tasa de convulsiones.
    1. Mida el tiempo de recuperación como el tiempo requerido después del vórtice hasta que las moscas recuperen la capacidad de mantenerse erguidas25.

2. Protocolo para la obtención de imágenes de calcio del cerebro ex vivo

  1. Establecer las moscas de la línea tub-Gal4>UAS-GCaMP6m y tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , respectivamente. Generar las moscas utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS21 para permitir el monitoreo de la actividad de calcio en el cerebro ex vivo .
  2. Prepare la solución de disección como se describe en la receta proporcionada (Tabla 1)26.
    1. Prepare la solución externa como se describe en la Tabla 1. Ajustar a pH 7.2 con NaOH y ajustar la osmolaridad a 250-255 mOsm/L.
      NOTA: La solución externa puede almacenarse a 4 °C durante 1 semana.
    2. Para preparar la solución de disección, añadir 9 unidades de suspensión de papaína y L-lisina (2 mg/mL) a 600 μL de la solución externa. Agite la solución en vórtice y espere 15 minutos hasta que la solución esté clara.
      NOTA: Se recomienda utilizar la solución de disección dentro de las 4 h.
  3. Perfundir la solución externa con solución salina oxigenada (95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono) durante 5 min antes de usar. Utilice la pipeta para transferir aproximadamente 10 μL de la solución de disección a una placa de Petri. Esta solución proporcionará las condiciones necesarias para la disección y la obtención de imágenes cerebrales.
  4. Diseccione cuidadosamente los cerebros de las líneas tub-Gal4>UAS-GCaMP6m y tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi utilizando las agujas de la jeringa y el microscopio. Seguir el protocolo establecido para la disección cerebral27.
  5. Utilice una pipeta para transferir el cerebro preparado a una placa de grabación que contenga 5 ml de solución externa fresca e inmovilice el cerebro utilizando un soporte de Do sostenido en la placa de grabación durante 3-5 minutos para la recuperación.
    NOTA: El soporte de C sostenido estaba hecho de un semicírculo metálico de 7 mm de diámetro atravesado por fibras paralelas separadas por 0,5 mm.
  6. Configuración y adquisición de imágenes confocales
    1. Para obtener imágenes confocales, capture cada cerebro con un objetivo de 20x y un modo de escaneo xyt. Identifique las neuronas del cuerpo del hongo con una amplificación digital adicional de 4,5x basada en una amplificación óptica de 20x.
      NOTA: Cada cerebro ex vivo puede ser fotografiado durante más de 1 h.
    2. Adquiera la emisión GCaMP6m de todo el cerebro a una excitación láser de 488 nm con una potencia láser de 16 μw. Establezca los parámetros de escaneo a una velocidad de 400, con un tamaño de píxel de 256 píxeles x 256 píxeles. Utilice una frecuencia de adquisición de 5,3 Hz y grabe durante 3 minutos.
  7. Identifique de 5 a 8 ROI en cada cerebro y analice la fluorescencia. Determinar manualmente el cuerpo celular de las neuronas del cuerpo del hongo como la región de interés28.
    1. Etiquete las neuronas identificadas y mida sus intensidades de fluorescencia con ImageJ. Analice los datos de fluorescencia de GCaMP6m a través de %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Defina la fluorescencia intracelular, que aumenta entre 2 y 2,5 desviaciones estándar por encima de la línea de base, como picos pequeños, y la fluorescencia intracelular, que aumenta más de 2,5 desviaciones estándar por encima de la línea de base, como picos grandes. Analice la frecuencia de los picos de calcio mediante la prueba t de Student.
      NOTA: F0 se definió como la línea de base por la intensidad de fluorescencia media de los 5 fotogramas iniciales en ROI, F1 como la intensidad de fluorescencia del punto de tiempo dado y B como el fondo sin fluorescencia. Las actividades fisiológicas temporales de las neuronas también son útiles para distinguirlas de los signos de ruido.

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Representative Results

Usando este protocolo, encontramos que las moscas de derribo cac mostraron tasas significativamente más altas de comportamiento similar a las convulsiones que las moscas WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0,0061; Prueba t de Student, Figura 1A). La mayoría de las moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se recuperaron en 1-5 s, mientras que las moscas UAS-cac-RNAi se recuperaron en 2 s. El porcentaje de recuperación de las moscas de derribo cac en 1 s fue significativamente menor que el de las moscas WT (88.08 ± 1.89 [n = 6] vs 96.50 ± 1.82 [n = 6]; P = 0,0093; Prueba t de Student, Figura 1B). Como se muestra en la Figura 2, se observaron señales de calcio en el cuerpo del hongo de las moscas. Los picos pequeños ocurrieron menos en las moscas de derribo cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] frente a tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Prueba t de Student), mientras que los picos grandes ocurrieron más en las moscas de derribo cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] frente a tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Estos resultados indican que las señales de calcio observadas en las moscas se correlacionan altamente con la actividad neuronal y mostraron consistencia con el comportamiento similar a las convulsiones en las moscas de derribo de cac .

Figure 1
Figura 1: Tasas clásicas de convulsiones y tiempo de recuperación en moscas. (A) Las incautaciones ocurrieron a una tasa más alta en moscas de derribo cac . (B) El tiempo de recuperación de la convulsión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Señales representativas de calcio en el cuerpo del hongo de las moscas. (A) Señales de calcio en 5 células seleccionadas en el cuerpo del hongo de las moscas. (B) Traza típica: Cambio en la fluorescencia (ΔF/F) a lo largo del tiempo a partir de una célula individual del cuerpo del hongo en archivos de tipo knockdown y wild-type. (C) Eventos globales o neuronales de calcio que ocurren en el cuerpo del hongo de las moscas que se distinguen en espigas pequeñas y grandes. (D) Picos de calcio en todo el cerebro de las moscas y los controles. Esta figura ha sido modificada con permiso de Liu et al.29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución externa para registrar y realizar la disección de la solución.
Cloruro de sodio 101 mM
Cloruro de potasio 3 mM
Cloruro de calcio 1 mM
Cloruro de magnesio 4 mM
Glucosa 5 mM
Fosfato sódico monobásico 1,25 mM
Bicarbonato de sodio 20,7 mM
Solución de disección
Solución externa 600 μL
Suspensión de papaína 9 U
L-lisina 2 mg/mL

Tabla 1: Composición de las soluciones externas y de disección.

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Discussion

El ion calcio sirve como un segundo mensajero crucial, desempeñando un papel fundamental en una serie de respuestas fisiológicas y fisiopatológicas a las perturbaciones químicas y eléctricas. Además, el elemento topológico de los canales presinápticos P/Q, codificado por el gen CACNA1A humano, ha sido identificado como responsable de mediar la descarga de varios neurotransmisores, incluido el glutamato 30,31,32, y está estrechamente relacionado con la epilepsia 33,34. Anteriormente, el comportamiento de las moscas Cac knockdown no exhibía la severidad reportada en algunos mutantes e incluso mostraba efectos supresores en ciertas moscas dobles mutantes35 . Los hallazgos de este estudio revelan que las moscas de derribo de cac son más propensas a las convulsiones que sus contrapartes de tipo salvaje. Esta observación se corresponde con el hecho de que los pacientes y otros modelos animales portadores de variantes CACNA1A pérdida de función están afectados por epilepsia28,36. A nivel mundial, la eliminación de cac podría interrumpir directamente la transmisión neuromuscular en las neuronas motoras. Aunque se encontró que la locomoción en adultos y larvas no es predictiva de la susceptibilidad a las convulsiones, la contribución de las neuronas motoras en el comportamiento convulsivo necesita ser investigada más a fondo37. Consistentemente, en las imágenes de calcio ex vivo, notamos una mayor proporción de eventos de calcio en el cuerpo del hongo de las moscas de derribo de cac que en el de las moscas de tipo salvaje (WT), lo que indicó una mayor frecuencia de disparo neuronal9. El cuerpo de hongo de las moscas se considera vagamente análogo al hipocampo y la corteza en el cerebro de los mamíferos. Dado que las convulsiones generalmente ocurren en el hipocampo y la corteza de los humanos, el cuerpo del hongo se utiliza para estudiar la actividad neural del calcio relacionada con las convulsiones en este estudio. En conclusión, este estudio estableció la consistencia del ensayo similar a las convulsiones sensibles a la explosión y las imágenes de calcio en Drosophila.

En el campo de las imágenes de calcio, la utilización del indicador de calcio GCaMP6 en combinación con la microscopía confocal permite el seguimiento de las alteraciones en la concentración de calcio en diversos contextos, como in vivo, en cultivos celulares, en cortes de cerebro e in vivo en tejido cerebral intacto del modelo de Drosophila. Sin embargo, comúnmente se entiende que la obtención de imágenes in vivo de los flujos de calcio dentro del sistema nervioso central de Drosophila requiere una intervención quirúrgica refinada para lograr el acceso óptico al cerebro; Este obstáculo puede inhibir la practicidad y el progreso de esta técnica en laboratorios individuales 8,16. El pez cebra también es un modelo animal importante para estudiar la epilepsia. El método de imagen de calcio in vivo también fue establecido previamente36. Sin embargo, solo las larvas de pez cebra pueden utilizarse para el registro de imágenes in vivo. Por otro lado, aunque los modelos de cultivos celulares y cortes de cerebro pueden proporcionar imágenes de mayor resolución, la integridad del cerebro y sus redes neuronales no se pueden replicar completamente en cultivos celulares o cortes de cerebro debido a la disrupción estructural. El estudio actual aborda estos problemas mediante la implementación de tejidos cerebrales intactos aislados de Drosophila para obtener imágenes de calcio, evitando así la necesidad de técnicas quirúrgicas complejas y preservando la integridad del cerebro y las redes neuronales sin interrupciones. El enfoque ex vivo también produce una relación señal-ruido superior en comparación con las técnicas de obtención de imágenes in vivo.

El presente estudio dilucida varios procedimientos fundamentales en el protocolo con respecto a la generación de las moscas de la línea tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi . Inicialmente, el doble equilibrador jugó un papel crucial en la obtención de las moscas deseables. Los balanceadores marcados permiten a los investigadores seguir alelos y cromosomas a través de cruces complejos multigeneracionales38. Posteriormente, para la separación eficiente del tejido cerebral intacto y la mejora de la visualización microscópica, era imperativo utilizar la suspensión de papaína para ablandar la fibra superficial del cerebro. Además, para estabilizar el cerebro y prevenir el daño neuronal durante la experimentación, se consideró necesario el uso de un soporte de Do sostenido con retícula de nailon27.

En conclusión, las imágenes de calcio aplicadas aquí junto con el ensayo de comportamiento similar a las convulsiones sensibles a explosiones en Drosophila son un sistema poderoso para detectar los genes asociados a la epilepsia y explorar el mecanismo potencial de la epilepsia a nivel celular. Ciertamente, esta técnica no puede estudiar las señales de calcio en tiempo real correlacionadas con el comportamiento animal como otros métodos in vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (subvención n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) y tiene previsto mejorar la investigación científica en la GMU (Jing-Da Qiao). Este trabajo también contó con el apoyo del Plan de Mejora de la Capacidad de Innovación de los Estudiantes de la Universidad de Medicina de Guangzhou (Financiación No. 02-408-2304-02038XM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

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References

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Imágenes de Calcio Ex Vivo Modelo de Drosophila Epilepsia Trastorno Neurológico Convulsiones Recurrentes Origen Genético Tecnología de Imagen Indicadores de Calcio Codificados Genéticamente GCaMP6 Resolución de Todo el Cerebro Resolución de una sola célula Genética Molecular Ensayos de Comportamiento Protocolo Drosophila Adulta Actividades Epileptiformes Microscopio Confocal Actividad Neural Ensayo de Comportamiento Similar a las Convulsiones Sensible a la Explosión Moscas de Derribo del Gen Cac Actividades Anormales de Calcio Detección de Genes Patógenos
<em>Ex Vivo</em> Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de <em>Drosophila</em>
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He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., … More

He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., Lin, Y. M., Mao, Y. L., Qiao, J. D. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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