Summary
Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila'da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.
Abstract
Epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyen, kısmen genetik kökenle ilişkili, tekrarlayan nöbetlerle karakterize nörolojik bir hastalıktır. Epilepsinin klinik önemine rağmen, merkezi sinir sistemindeki nöral aktivitenin fonksiyonel analizi hala geliştirilmemiştir. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, GCaMP6 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin kararlı ekspresyonu ile birlikte, hem beyin çapında hem de tek hücreli çözünürlük seviyelerinde epilepsi çalışmalarında devrim yaratmıştır. Drosophila melanogaster, karmaşık moleküler genetiği ve davranışsal tahlilleri nedeniyle epilepsinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, GCaMP6 eksprese eden erişkin Drosophila'da epileptiform aktiviteleri izlemek için ex vivo kalsiyum görüntüleme için yeni ve etkili bir protokol sunuyoruz. Tüm beyin, iyi bilinen bir epilepsi geni olan cac'den hazırlanır, nöral aktiviteyi patlamaya duyarlı nöbet benzeri davranış testinin bir devamı olarak tanımlamak için konfokal mikroskopla kalsiyum görüntüleme için nakavt sinekleri. Cac knockdown sinekleri, vahşi tip sineklere göre daha büyük sivri uçlar ve daha az küçük sivri uçlar dahil olmak üzere daha yüksek oranda nöbet benzeri davranış ve anormal kalsiyum aktiviteleri gösterdi. Kalsiyum aktiviteleri nöbet benzeri davranışla ilişkiliydi. Bu metodoloji, epilepsi için patojenik genlerin taranmasında ve hücresel düzeyde epilepsinin potansiyel mekanizmasının araştırılmasında etkili bir metodoloji olarak hizmet eder.
Introduction
Spontan ve provoke edilmemiş nöbetlerin ve anormal nöronal ağ aktivitesinin nüksü ile karakterize karmaşık bir kronik nörolojik bozukluk olan epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyerek onu en yaygın nörolojik hastalıklardan biri haline getirmiştir1 ve ailelerin ve toplumun ağır yüklerine yol açmaktadır. Epilepsinin etkisi göz önüne alındığında, genetiği birçok epilepsi veya epileptik sendrom tipinin birincil nedeni olarak onaylanan nöbetlerin etiyolojisini belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır2. Son on yıllarda, genomik teknolojilerdeki ilerlemeler, iyon kanalları ve iyon kanalı olmayan genlerde dahil olmak üzere nöbet oluşumunda çok önemli bir rol oynayan yeni epilepsi ile ilişkili genlerin keşfinde hızlı bir artışa yol açmıştır 3,4. Bununla birlikte, genler ve epileptik fenotipler arasındaki altta yatan mekanizmalar ve fonksiyonel analizler tam olarak anlaşılamamıştır. Epilepsi ile ilişkili genlerin ve mekanizmaların tanımlanması, hastaların etkin bir şekilde yönetilmesine olanak sağlar 5,6.
Sitozolik kalsiyum sinyalleri, nöronal aktivite ve sinaptik iletimde çok önemli unsurlardır. Beyin dilimleri7, in vivo 8,9 ve ex vivo10 dahil olmak üzere kalsiyum görüntüleme, 1970'lerden beri nöronal uyarılabilirlik için bir belirteç olarak nöronal aktiviteyi11 izlemek için kullanılmıştır12,13. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, GCaMP6 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile birlikte, hem beyin çapında hem de tek hücreli çözünürlük seviyelerinde 14,15,16 epilepsi çalışmasında devrim yaratmıştır. Sırasıyla aksiyon potansiyellerinde ve sinaptik iletimde kalsiyum konsantrasyonunda ve geçici akımlarda değişiklikler gözlenmiştir14, bu da hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişikliğin nöronların elektriksel uyarılabilirliği ile sıkı bir korelasyon sergilediğinigösterir 17,18. Kalsiyum görüntüleme ayrıca gelişimsel nöbet modeli9 olarak uygulanmış ve antikonvülsif bileşiklerin taranması için Drosophila'da gerçekleştirilmiştir19.
Drosophila melanogaster, sofistike moleküler genetiği ve davranışsal tahlilleri nedeniyle epilepsi gibi bilimsel araştırmalarda güçlü bir model organizma olarak ortaya çıkmaktadır 20,21,22. Ayrıca, Drosophila'daki gelişmiş genetik araçlar, genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü GCaMP6'nın ekspresyonuna katkıda bulunmuştur. Örneğin, Gal4 ve UAS tabanlı ikili transkripsiyonel sistemler, GCaMP6'nın uzamsal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde spesifik ekspresyonunu sağlar. Drosophila küçük bir organizma olduğundan, in vivo kalsiyum görüntüleme, beynin dorsalinin sadece küçük bir kısmının küçük bir pencereden açığa çıktığı cerrahi bir müdahaleyi gerçekleştirmek için yetkin operasyon becerileri gerektirir14,23. Aynı zamanda, Drosophila'nın sağlam beynindeki ex vivo kalsiyum görüntüleme, tüm beynin ilgilenilen bölgelerini (ROI'ler) izlemek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, GCaMP6 eksprese eden erişkin Drosophila'da epileptiform aktiviteleri izlemek için ex vivo kalsiyum görüntüleme sunuldu. CACNA1A iyi bilinen bir epilepsi geni olan cac, CACNA1A için bir homolog olan Cav2 kanalına aittir. Cac knockdown sineklerinin beyinlerini tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi'yi inceleyerek ve bunları xyt tarama modlu bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyerek başladık. Daha sonra, %ΔF/F değeri ve GCaMP6 floresansının kalsiyum olayları gibi spontan nöbet benzeri olayları ölçen göstergeleri hesaplayarak ROI'lerin kalsiyum sinyallerindeki değişiklikleri analiz ettik. Ek olarak, kalsiyum görüntüleme sonuçlarını doğrulamak için cac-knockdown sinekleri üzerinde nöbet davranışı testlerini indüklemek için vorteks makinesi ile mekanik uyaran gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Patlamaya duyarlı test için protokol
- Gal4/UAS sistemi21 üzerinden tub-Gal4 sürücü hattını UAS-cac-RNAi hattıyla geçerek deneysel sinekleri oluşturun. Tub-Gal4 hattının bakire sineklerini ve UAS-cac-RNAi hattının erkek sineklerini toplayın. Daha sonra, yavruları hasat etmek için bakire ve erkek sinekleri aynı şişeye aktarın.
NOT: tub-Gal4 sürücü hattı, cac geninin küresel olarak yıkılmasına izin verecektir. Kontrol grubu olarak UAS-cac-RNAi hattını kullanın. - 3-5 günlük eklosiyondan sonra,% 100 CO2 (CO2 anestezi ekipmanı) kullanarak sinekleri nazikçe uyuşturun ve hem tub-Gal4>UAS-cac-RNAi sineklerini hem de UAS-cac-RNAi sineklerini bir fırça ile toplayın. İyi hazırlandıklarından emin olmak için bu sinekleri testten 1 gün önce yeni, temiz gıda şişelerine aktarın.
- CO2 kullanarak sinekleri nazikçe uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, 4-6 sineği dikkatlice taze şişelere yerleştirin. Teste devam etmeden önce sineklerin anesteziden yaklaşık 1 saat iyileşmesine izin verin.
NOT: Her genotip için en az beş deneme test edildi ve her deneme altı şişe sinek içeriyordu. - Kayıt ekipmanını kurun. Bir fotoğraf makinesini (720-1080P, en az 30-60 FPS, AF kilitli) beyaz tahtanın önündeki bir tripoda yerleştirin. Net ve doğru çekimler sağlamak için boş bir şişe kullanarak kameranın odağını manuel olarak ayarlayın.
- Mekanik olarak indüklenen nöbet benzeri davranışı gerçekleştirmek için bir girdap karıştırıcı kullanın. 4-6 sinek içeren her bir şişeyi vorteks karıştırıcıya yerleştirin ve tam olarak 10 saniye boyunca en yüksek ayarda (2800 rpm) çalıştırın. Girdaptan sonra, şişeyi derhal beyaz tahtaya yerleştirin.
- Sinekleri gözlemleyin ve sergiledikleri nöbet benzeri davranışları kaydedin.
NOT: Sineklerde gözlenen nöbet benzeri davranışlar üç aşamadan oluşur: nöbet (titreşen kanatlar olarak ortaya çıkar), felç ve iyileşme24. Nöbet geçiren sineklerin test edilen sineklere oranı nöbet oranı olarak tanımlandı.- İyileşme süresini, girdaptan sonra sinekler dik durma yeteneğini yeniden kazanana kadar gereken süre olarak ölçün25.
2. Ex vivo beynin kalsiyum görüntülemesi için protokol
- Sırasıyla tub-Gal4>UAS-GCaMP6m ve tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi çizgi sineklerini oluşturun. Ex vivo beyindeki kalsiyum aktivitesinin izlenmesine izin vermek için Gal4 / UAS ikili ekspresyon sistemi21 kullanarak sinekleri oluşturun.
- Diseksiyon solüsyonunu verilen tarifte açıklandığı gibi hazırlayın (Tablo 1)26.
- Harici çözümü Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. NaOH ile pH 7.2'ye ayarlayın ve ozmolariteyi 250-255 mOsm/L'ye ayarlayın.
NOT: Harici solüsyon 4 °C'de 1 hafta saklanabilir. - Diseksiyon solüsyonunu hazırlamak için, 600 μL harici solüsyona 9 ünite papain süspansiyonu ve L-lizin (2 mg / mL) ekleyin. Çözeltiyi girdap haline getirin ve çözelti berraklaşana kadar 15 dakika bekleyin.
NOT: Diseksiyon solüsyonunun 4 saat içinde kullanılması tavsiye edilir.
- Harici çözümü Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. NaOH ile pH 7.2'ye ayarlayın ve ozmolariteyi 250-255 mOsm/L'ye ayarlayın.
- Harici solüsyonu kullanmadan önce 5 dakika boyunca oksijenli salin (%95 oksijen ve %5 karbondioksit) ile perfüze edin. Diseksiyon solüsyonunun yaklaşık 10 μL'sini bir Petri kabına aktarmak için pipeti kullanın. Bu çözüm, beyin diseksiyonu ve görüntüleme için gerekli koşulları sağlayacaktır.
- Şırınga iğneleri ve mikroskobu kullanarak hem tub-Gal4>UAS-GCaMP6m hem de tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi hatlarının beyinlerini dikkatlice inceleyin. Beyin diseksiyonu için belirlenmiş protokolü takip edin27.
- Hazırlanan beyni 5 mL taze harici solüsyon içeren bir kayıt kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve iyileşme için kayıt kabında bir C-keskin tutucu kullanarak beyni 3-5 dakika hareketsiz hale getirin.
NOT: C-sharp tutucu, 7 mm aralıklı paralel liflerle çaprazlanan 0.5 mm çapında metal bir yarım daireden yapılmıştır. - Konfokal görüntüleme kurulumu ve edinimi
- Konfokal görüntüleme için, her beyni 20x objektif ve xyt Tarama Modu ile yakalayın. Mantar gövdesi nöronlarını, 20x optik amplifikasyona dayalı ek bir 4,5x dijital amplifikasyon ile tanımlayın.
NOT: Her ex vivo beyin 1 saatten fazla görüntülenebilir. - 16 μw lazer gücü ile 488 nm lazer uyarımında tüm beyin-GCaMP6m emisyonunu elde edin. Tarama parametrelerini 256 piksel x 256 piksel boyutuyla 400 hıza ayarlayın. 5,3 Hz alım hızı kullanın ve 3 dakikalık bir süre için kaydedin.
- Konfokal görüntüleme için, her beyni 20x objektif ve xyt Tarama Modu ile yakalayın. Mantar gövdesi nöronlarını, 20x optik amplifikasyona dayalı ek bir 4,5x dijital amplifikasyon ile tanımlayın.
- Her beyindeki 5-8 ROI'yi tanımlayın ve floresansı analiz edin. Mantar gövdesi nöronlarının hücre gövdesini ilgilenilen bölge olarak manuel olarak belirleyin28.
- Tanımlanan nöronları etiketleyin ve floresan yoğunluklarını ImageJ ile ölçün. GCaMP6m'nin Floresan verilerini %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B) aracılığıyla analiz edin. Taban çizgisinin üzerinde 2 ila 2,5 standart sapma arasında artan hücre içi floresansı, küçük sivri uçlar olarak ve taban çizgisinin üzerinde 2,5 standart sapmadan daha büyük olan hücre içi floresansı, büyük sivri uçlar olarak tanımlayın. Kalsiyum artışlarının sıklığını Student t-testi ile analiz edin.
NOT: ROI'lerde ilk 5 karenin ortalama floresan yoğunluğu ile taban çizgisi olarak F0, verilen zaman noktasının floresan yoğunluğu olarak F1 ve floresan olmadan arka plan olarak B tanımlanmıştır. Nöronların zamansal fizyolojik aktiviteleri de onları gürültü işaretlerinden ayırt etmede yardımcı olur.
- Tanımlanan nöronları etiketleyin ve floresan yoğunluklarını ImageJ ile ölçün. GCaMP6m'nin Floresan verilerini %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B) aracılığıyla analiz edin. Taban çizgisinin üzerinde 2 ila 2,5 standart sapma arasında artan hücre içi floresansı, küçük sivri uçlar olarak ve taban çizgisinin üzerinde 2,5 standart sapmadan daha büyük olan hücre içi floresansı, büyük sivri uçlar olarak tanımlayın. Kalsiyum artışlarının sıklığını Student t-testi ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, cac knockdown sineklerinin WT sineklerinden önemli ölçüde daha yüksek nöbet benzeri davranış oranları gösterdiğini bulduk (17.00 ± 2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061; Student's t-testi, Şekil 1A). Çoğu tub-Gal4>UAS-cac-RNAi sineği 1-5 saniye içinde iyileşirken, UAS-cac-RNAi sinekleri 2 saniye içinde iyileşti. Cac knockdown sineklerinin 1 saniye içindeki iyileşme yüzdesi, WT sineklerinden önemli ölçüde daha düşüktü (88.08 ± 1.89 [n = 6] vs 96.50 ± 1.82 [n = 6]; P = 0.0093; Öğrenci t-testi, Şekil 1B). Şekil 2'de gösterildiği gibi, sineklerin mantar gövdesinde kalsiyum sinyalleri gözlenmiştir. Küçük sivri uçlar cac knockdown sineklerinde daha az meydana geldi (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi, 2.97 ± 0.96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5.33 ± 1.31 [n = 13]; P < 0.0001; Student's t-testi), cac knockdown sineklerinde (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2.87 ± 0.63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1.72 ± 0.62 [n = 13]; P < 0.0001). Bu sonuçlar, sineklerde gözlenen kalsiyum sinyallerinin nöronal aktivite ile yüksek oranda ilişkili olduğunu ve cac knockdown sineklerinde nöbet benzeri davranışla tutarlılık gösterdiğini göstermektedir.
Şekil 1: Sineklerde klasik nöbet oranları ve iyileşme süresi. (A) Nöbetler, cac knockdown sineklerinde daha yüksek oranda meydana geldi. (B) Nöbetten iyileşme süresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sineklerin mantar gövdesindeki temsili kalsiyum sinyalleri. (A) Sineklerin mantar gövdesindeki seçilmiş 5 hücredeki kalsiyum sinyalleri. (B) Tipik iz: Mantar gövdesinin tek bir hücresinden, yıkılma ve vahşi tip eğelerde zaman içinde floresanstaki (ΔF/F) değişiklik. (C) Sineklerin mantar gövdesinde meydana gelen küresel veya nöronal kalsiyum olayları, küçük ve büyük sivri uçlara ayrılır. (D) Devrilme sinekleri ve kontrollerinin tüm beynindeki kalsiyum artışları. Bu rakam Liu ve ark.29'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Diseksiyon çözümünün kaydedilmesi ve yapılması için harici çözüm. | |
| Sodyum klorür | 101 milyon |
| Potasyum klorür | 3 mM |
| Kalsiyum klorür | 1 milyon |
| Magnezyum klorür | 4 milyon |
| Glikoz | 5 milyon |
| Sodyum fosfat monobazik | 1,25 milyon |
| Sodyum bikarbonat | 20,7 milyon |
| Diseksiyon çözümü | |
| Harici çözüm | 600 μL |
| Papain süspansiyonu | 9 U |
| L-lizin | 2 mg/mL |
Tablo 1: Eksternal ve diseksiyon solüsyonlarının bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiyum iyonu, hem kimyasal hem de elektriksel bozulmalara karşı bir dizi fizyolojik ve patofizyolojik yanıtta çok önemli bir rol oynayan çok önemli bir ikinci haberci olarak hizmet eder. Ayrıca, insan CACNA1A geni tarafından kodlanan presinaptik P/Q kanallarının topolojik elemanının, glutamat30,31,32 dahil olmak üzere çeşitli nörotransmiterlerin deşarjına aracılık etmekten sorumlu olduğu ve epilepsi ile yakından bağlantılıolduğu tespit edilmiştir 33,34. Daha önce, Cac knockdown sineklerinin davranışı, bazı mutantlarda bildirilen şiddeti göstermedi ve hatta bazı çift mutant sineklerde baskılayıcı etkiler gösterdi35 . Bu çalışmanın bulguları, cac knockdown sineklerinin vahşi tip muadillerine göre nöbetlere daha yatkın olduğunu ortaya koymaktadır. Bu gözlem, CACNA1A fonksiyon kaybı varyantları taşıyan hastaların ve diğer hayvan modellerinin epilepsiden muzdarip olduğu gerçeğiyle örtüşmektedir28,36. Küresel olarak, cac'nin yıkılması, motor nöronlardaki nöromüsküler iletimi doğrudan bozabilir. Erişkinlerde ve larvalarda hareketin nöbet duyarlılığını öngörmediği bulunmasına rağmen, motor nöronların cac'sinin nöbet davranışına katkısının daha fazla araştırılması gerekmektedir37. Tutarlı bir şekilde, in ex vivo kalsiyum görüntülemede, cac knockdown sineklerinin mantar gövdesinde, vahşi tip (WT) sineklerinkinden daha fazla kalsiyum olayı olduğunu fark ettik, bu da daha yüksek bir nöronal ateşleme sıklığını gösterdi9. Sineklerin mantar gövdesi, memeli beynindeki hipokampus ve kortekse gevşek bir şekilde benzer olarak kabul edilir. Nöbetler genellikle insanların hipokampus ve korteksinde meydana geldiğinden, bu çalışmada nöbetle ilişkili nöral kalsiyum aktivitesini incelemek için mantar gövdesi kullanılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışma Drosophila'da patlamaya duyarlı nöbet benzeri test ile kalsiyum görüntülemenin tutarlılığını ortaya koymuştur.
Kalsiyum görüntüleme alanında, kalsiyum indikatörü GCaMP6'nın konfokal mikroskopi ile kombinasyon halinde kullanılması, in vivo, hücre kültürleri, beyin dilimleri ve Drosophila modelinin ex vivo bozulmamış beyin dokusu gibi çeşitli bağlamlarda kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerin izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, Drosophila'nın merkezi sinir sistemi içindeki kalsiyum akışlarının in vivo görüntülenmesinin, beyne optik erişim sağlamak için rafine bir cerrahi müdahale gerektirdiği yaygın olarak anlaşılmaktadır; Bu engel, bu tekniğin bireysel laboratuvarlarda uygulanabilirliğini ve ilerlemesini engelleyebilir 8,16. Zebra balığı ayrıca epilepsiyi incelemek için önemli bir hayvan modelidir. İn vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi de daha öncekurulmuştur 36. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme kaydı için yalnızca zebra balığı larvaları kullanılabilir. Öte yandan, hücre kültürü ve beyin dilimi modelleri daha yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlayabilse de, beynin ve sinir ağlarının bütünlüğü, yapısal bozulma nedeniyle hücre kültüründe veya beyin dilimlerinde tam olarak kopyalanamaz. Mevcut çalışma, kalsiyum görüntüleme için izole edilmiş sağlam Drosophila beyin dokuları uygulayarak, böylece karmaşık cerrahi tekniklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak ve beyin ve sinir ağlarının bütünlüğünü bozulmadan koruyarak bu sorunları ele almaktadır. Ex vivo yaklaşım, in vivo görüntüleme tekniklerine kıyasla daha üstün bir sinyal-gürültü oranı da sağlar.
Bu çalışma, tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi hat sineklerinin üretilmesi ile ilgili protokoldeki çeşitli önemli prosedürleri açıklamaktadır. Başlangıçta, çift dengeleyici, arzu edilen sineklerin elde edilmesinde çok önemli bir rol oynadı. İşaretli dengeleyiciler, araştırmacıların karmaşık çok kuşaklı çaprazlamalar yoluyla alelleri ve kromozomları takip etmelerini sağlar38. Daha sonra, sağlam beyin dokusunun verimli bir şekilde ayrılması ve mikroskobik görselleştirmenin iyileştirilmesi için, beynin yüzey lifini yumuşatmak için Papain süspansiyonunun kullanılması zorunluydu. Ayrıca, deney sırasında beyni stabilize etmek ve nöronal hasarı önlemek için, naylon artı işaretli bir C-keskin tutucunun kullanılması gerekli görülmüştür27.
Sonuç olarak, Drosophila'da patlamaya duyarlı nöbet benzeri davranış testinin yanı sıra burada uygulanan kalsiyum görüntüleme, epilepsi ile ilişkili genlerin taranması ve epilepsinin hücresel düzeyde potansiyel mekanizmasının araştırılması için güçlü bir sistemdir. Elbette, bu teknik, diğer in vivo yöntemler gibi hayvan davranışıyla ilişkili gerçek zamanlı kalsiyum sinyallerini inceleyemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. 2022A1515111123 Jing-Da Qiao'ya) ve GMU'daki (Jing-Da Qiao) bilimsel araştırmaları geliştirmeyi planlamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda Guangzhou Tıp Üniversitesi Öğrenci İnovasyon Yeteneği Enihancement Planı (Finansman No. 02-408-2304-02038XM) tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
