Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65825
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3,4, 1
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يوفر البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة للبالغين من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.

Abstract

الصرع هو اضطراب عصبي يتميز بنوبات متكررة ، ترتبط جزئيا بالأصل الجيني ، وتؤثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم. على الرغم من الأهمية السريرية للصرع ، لا يزال يتعين تطوير التحليل الوظيفي للنشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي. أحدثت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير ، جنبا إلى جنب مع التعبير المستقر لمؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، مثل GCaMP6 ، ثورة في دراسة الصرع على مستوى الدماغ ومستويات دقة الخلية الواحدة. برزت ذبابة الفاكهة الميلانية كأداة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الصرع بسبب علم الوراثة الجزيئي المتطور والمقايسات السلوكية. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا جديدا وفعالا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يتم تحضير الدماغ كله من CAC ، وهو جين صرع معروف ، يطير ضربة قاضية لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر متحد البؤر لتحديد النشاط العصبي كمتابعة لفحص السلوك الشبيه بالنوبات الحساسة للانفجار. أظهر ذباب ضربة قاضية CAC معدلا أعلى من السلوك الشبيه بالنوبات وأنشطة الكالسيوم غير الطبيعية ، بما في ذلك المزيد من المسامير الكبيرة وعدد أقل من المسامير الصغيرة مقارنة بالذباب البري. ارتبطت أنشطة الكالسيوم بالسلوك الشبيه بالنوبات. تعمل هذه المنهجية كمنهجية فعالة في فحص الجينات المسببة للأمراض للصرع واستكشاف الآلية المحتملة للصرع على المستوى الخلوي.

Introduction

الصرع ، وهو اضطراب عصبي مزمن معقد يتميز بتكرار النوبات التلقائية وغير المبررة ونشاط الشبكة العصبية الشاذ ، أثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم ، مما يجعله أحد أكثر الأمراض العصبية شيوعا1 ويؤدي إلى أعباء ثقيلة على الأسر والمجتمع. بالنظر إلى تأثير الصرع ، أجريت العديد من الدراسات لتحديد مسببات النوبات ، والتي تمت الموافقة على علم الوراثة كسبب رئيسي للعديد من أنواع الصرع أو متلازمات الصرع2. على مدى العقود الماضية ، أدى التقدم في التقنيات الجينومية إلى زيادة سريعة في اكتشاف الجينات الجديدة المرتبطة بالصرع ، والتي تلعب دورا حاسما في حدوث النوبات ، بما في ذلك القنوات الأيونية وجينات القناة غير الأيونية 3,4. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية والتحليل الوظيفي بين الجينات والأنماط الظاهرية للصرع غير مفهومة بشكل كامل. يوفر تحديد الجينات والآليات المرتبطة بالصرع إمكانية إدارة المرضى بكفاءة 5,6.

إشارات الكالسيوم الخلوية هي عناصر محورية في النشاط العصبي والانتقال المشبكي. تم استخدام تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك شرائح الدماغ7 ، في الجسم الحي 8,9 ، و ex vivo10 ، لمراقبة النشاط العصبي11 كعلامة على استثارة الخلايا العصبية منذ سبعينيات القرن العشرين12,13. أحدثت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير ، جنبا إلى جنب مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP6 ، ثورة في دراسة الصرع على مستوى الدماغ ومستويات دقة الخليةالواحدة 14،15،16 ، والتي تتمتع بمستوى عال من الدقة الزمانية المكانية. لوحظت تغيرات في تركيز الكالسيوم والعابرين في إمكانات العمل والانتقال المشبكي ، على التوالي14 ، مما يشير إلى أن تغيير مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يظهر علاقة صارمة مع الإثارة الكهربائية للخلايا العصبية17,18. كما تم تطبيق تصوير الكالسيوم كنموذج نوبة تنموية9 وتم إجراؤه في ذبابة الفاكهة لفحص المركبات المضادة للاختلاج19.

ظهرت ذبابة الفاكهة الميلانية ككائن نموذجي قوي في البحث العلمي ، مثل الصرع ، لعلم الوراثة الجزيئي المتطور والمقايسات السلوكية20،21،22. علاوة على ذلك ، ساهمت الأدوات الجينية المتقدمة في ذبابة الفاكهة في التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا GCaMP6. على سبيل المثال ، تتيح أنظمة النسخ الثنائية القائمة على Gal4 و UAS تعبيرا محددا عن GCaMP6 بطريقة يتم التحكم فيها مكانيا وزمانيا. نظرا لأن ذبابة الفاكهة هي كائن حي صغير ، فإن تصوير الكالسيوم في الجسم الحي يتطلب مهارات تشغيل بارعة لإجراء تدخل جراحي ، حيث تم تعريض جزء صغير فقط من الظهر للدماغ من خلال نافذة صغيرة14,23. في الوقت نفسه ، يمكن استخدام تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في الدماغ السليم لذبابة الفاكهة لمراقبة مناطق الاهتمام (ROIs) في الدماغ بأكمله.

في هذه الدراسة ، نقدم تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. CACNA1A هو جين صرع معروف ، ينتمي CAC إلى قناة Cav2 ، وهو متماثل مع CACNA1A. بدأنا بتشريح أدمغة ذباب ضربة قاضية من CAC-Gal4 > GCaMP6m / cac-RNAi وتصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر مع وضع المسح xyt. ثم قمنا بتحليل التغيرات في إشارات الكالسيوم لعائد الاستثمار عن طريق حساب المؤشرات التي تحدد الأحداث الشبيهة بالنوبات التلقائية ، مثل قيمة ٪ ΔF / F وأحداث الكالسيوم لتألق GCaMP6. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا محفزا ميكانيكيا بواسطة آلة دوامة للحث على اختبارات سلوك النوبات على ذباب ضربة قاضية للكاك وكذلك للتحقق من صحة نتائج تصوير الكالسيوم. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة البالغة من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بروتوكول للمقايسة الحساسة للانفجار

  1. إنشاء الذباب التجريبي عن طريق عبور خط سائق الحوض Gal4 مع خط UAS-cac-RNAi عبر نظام Gal4 / UAS21. اجمع الذباب البكر لخط الحوض Gal4 والذباب الذكور لخط UAS-cac-RNAi . ثم انقل الذباب البكر والذكور إلى نفس القارورة لحصاد النسل.
    ملاحظة: سيسمح خط تشغيل tub-Gal4 بتحقيق ضربة قاضية عالمية لجين CAC . استخدم خط UAS-cac-RNAi كمجموعة تحكم.
  2. بعد 3-5 أيام من الانسداد ، قم بتخدير الذباب برفق باستخدام 100٪ CO2 (معدات التخديرCO 2 ) وجمع كل من ذباب الحوض Gal4 > UAS-cac-RNAi وذباب UAS-cac-RNAi بفرشاة. نقل هذه الذباب إلى قوارير طعام جديدة ونظيفة 1 يوم قبل الاختبار للتأكد من أنها مستعدة جيدا.
  3. تخدير الذباب بلطف باستخدام CO2. بمجرد التخدير ، ضع بعناية 4-6 ذباب في قوارير طازجة فردية. اسمح للذباب بالتعافي من التخدير لمدة 1 ساعة تقريبا قبل الشروع في الاختبار.
    ملاحظة: لكل نمط جيني، تم اختبار ما لا يقل عن خمس تجارب، وتألفت كل تجربة من ست قوارير من الذباب.
  4. قم بإعداد معدات التسجيل. ضع كاميرا (720-1080 بكسل ، 30-60 إطارا في الثانية على الأقل ، مقفلة بالتركيز البؤري التلقائي) على حامل ثلاثي القوائم أمام السبورة البيضاء. اضبط تركيز الكاميرا يدويا باستخدام قنينة فارغة لضمان لقطات واضحة ودقيقة.
  5. استخدم خلاط دوامة لأداء السلوك الشبيه بالنوبات المستحثة ميكانيكيا. ضع كل قارورة تحتوي على 4-6 ذباب على خلاط الدوامة وقم بتشغيلها على أعلى إعداد (2800 دورة في الدقيقة) لمدة 10 ثوان بالضبط. بعد الدوامة ، ضع القارورة على الفور على السبورة البيضاء.
  6. راقب الذباب وسجل أي سلوك يشبه النوبات التي يظهرها.
    ملاحظة: يتكون السلوك الشبيه بالنوبات الذي لوحظ في الذباب من ثلاث مراحل: النوبة (تظهر كأجنحة تهتز) ، والشلل ، والتعافي24. تم تعريف نسبة ذباب المضبوطات إلى الذباب المختبر على أنها معدل النوبات.
    1. قم بقياس وقت التعافي باعتباره الوقت المطلوب بعد الدوامة حتى يستعيد الذباب القدرة على الوقوف في وضع مستقيم25.

2. بروتوكول لتصوير الكالسيوم للدماغ خارج الجسم الحي

  1. قم بإنشاء ذباب خط الحوض Gal4 > UAS-GCaMP6m و tub-Gal4 > UAS-GCaMP6m / cac-RNAi ، على التوالي. قم بتوليد الذباب باستخدام نظام التعبير الثنائي Gal4 / UAS21 للسماح بمراقبة نشاط الكالسيوم في الدماغ خارج الجسم الحي .
  2. تحضير محلول التشريح كما هو موضح في الوصفة المقدمة (الجدول 1)26.
    1. قم بإعداد الحل الخارجي كما هو موضح في الجدول 1. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم واضبط الأسمولية على 250-255 مللي أوزم / لتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل الخارجي في 4 °C لمدة 1 أسبوع.
    2. لتحضير محلول التشريح ، أضف 9 وحدات من معلق غراء و L-lysine (2 مجم / مل) إلى 600 ميكرولتر من المحلول الخارجي. دوامة الحل وانتظر 15 دقيقة حتى يصبح الحل واضحا.
      ملاحظة: يوصى باستخدام محلول التشريح في غضون 4 ساعات.
  3. قم برش المحلول الخارجي بمحلول ملحي مؤكسج (95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون) لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. استخدم الماصة لنقل حوالي 10 ميكرولتر من محلول التشريح إلى طبق بتري. سيوفر هذا الحل الظروف اللازمة لتشريح الدماغ والتصوير.
  4. قم بتشريح أدمغة كل من خطوط الحوض Gal4 > UAS - GCaMP6m و tub-Gal4 > UAS-GCaMP6m / cac-RNAi بعناية باستخدام إبر الحقن والمجهر. اتبع البروتوكول المعمول به لتشريح الدماغ27.
  5. استخدم ماصة لنقل الدماغ المحضر إلى طبق تسجيل يحتوي على 5 مل من محلول خارجي طازج وشل حركة الدماغ باستخدام حامل C-sharp في طبق التسجيل لمدة 3-5 دقائق للتعافي.
    ملاحظة: تم تصنيع حامل C-sharp من نصف دائرة معدنية بقطر 7 مم تتقاطع مع ألياف متوازية بمسافة 0.5 مم.
  6. إعداد التصوير البؤري واكتسابه
    1. للتصوير متحد البؤر ، التقط كل دماغ بهدف 20x ووضع المسح الضوئي xyt. حدد الخلايا العصبية لجسم الفطر باستخدام تضخيم رقمي إضافي 4.5x يعتمد على التضخيم البصري 20x.
      ملاحظة: يمكن تصوير كل دماغ خارج الجسم الحي لأكثر من 1 ساعة.
    2. احصل على انبعاث الدماغ GCaMP6m بالكامل عند إثارة ليزر 488 نانومتر بقوة ليزر 16 ميكروواط. اضبط معلمات المسح على سرعة 400 ، بحجم بكسل 256 بكسل × 256 بكسل. استخدم معدل اكتساب 5.3 هرتز وسجل لمدة 3 دقائق.
  7. تحديد 5-8 عائد استثمار في كل دماغ وتحليل التألق. تحديد جسم الخلية يدويا من الخلايا العصبية جسم الفطر كمنطقة الاهتمام28.
    1. قم بتسمية الخلايا العصبية المحددة وقياس شدة مضانها بواسطة ImageJ. تحليل البيانات الفلورية ل GCaMP6m عبر٪ ΔF / F = (F1-F0) / (F0-B). حدد التألق داخل الخلايا ، الذي يزيد بين 2 و 2.5 انحراف معياري فوق خط الأساس ، كطفرات صغيرة ، ومضان داخل الخلايا ، يزيد أكثر من 2.5 انحراف معياري فوق خط الأساس ، كطفرات كبيرة. تحليل تواتر طفرات الكالسيوم عن طريق اختبار t للطالب.
      ملاحظة: تم تعريف F0 على أنه خط الأساس من خلال متوسط شدة التألق للإطارات الخمسة الأولية في عائد الاستثمار ، و F1 كشدة مضان للنقطة الزمنية المحددة ، و B كخلفية بدون مضان. الأنشطة الفسيولوجية الزمنية للخلايا العصبية مفيدة أيضا في تمييزها عن علامات الضوضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن ذباب ضربة قاضية من الصبار أظهر معدلات أعلى بكثير من السلوك الشبيه بالنوبات من ذباب WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] مقابل 4.50 ± 2.03 [n = 6] ؛ ف = 0.0061 ؛ اختبار t للطالب ، الشكل 1 أ). تعافى معظم ذباب الحوض Gal4 > UAS-cac-RNAi في غضون 1-5 ثوان ، بينما تعافى ذباب UAS-cac-RNAi في غضون 2 ثانية. كانت النسبة المئوية لاسترداد ذباب ضربة قاضية من الصبار في غضون ثانية واحدة أقل بكثير من ذباب WT (88.08 ± 1.89 [n = 6] مقابل 96.50 ± 1.82 [n = 6] ؛ ف = 0.0093 ؛ اختبار t للطالب ، الشكل 1 ب). كما هو موضح في الشكل 2 ، لوحظت إشارات الكالسيوم في جسم فطر الذباب. حدثت طفرات صغيرة أقل في ذباب ضربة قاضية CAC (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi ، 2.97 ± 0.96 [n = 13] مقابل tub-Gal4 > UAS-GCaMP6m ، 5.33 ± 1.31 [n = 13] ؛ P < 0.0001 ؛ اختبار t للطالب) ، في حين حدثت طفرات كبيرة أكثر في ذباب ضربة قاضية CAC (tub-Gal4 > UAS-GCaMP6m / cac-RNAi ، 2.87 ± 0.63 [n = 13] مقابل tub-Gal4 > UAS-GCaMP6m ، 1.72 ± 0.62 [n = 13] ؛ P < 0.0001). تشير هذه النتائج إلى أن إشارات الكالسيوم التي لوحظت في الذباب ترتبط ارتباطا وثيقا بالنشاط العصبي وأظهرت اتساقا مع السلوك الشبيه بالنوبات في ذباب ضربة قاضية.

Figure 1
الشكل 1: معدلات النوبات الكلاسيكية ووقت التعافي في الذباب. (أ) حدثت المضبوطات بمعدل أعلى في ذباب ضربة قاضية من الكاك . ب: زمن التعافي من النوبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إشارات الكالسيوم الممثلة في جسم فطر الذباب. أ: إشارات الكالسيوم في 5 خلايا مختارة في جسم فطر الذباب. (ب) التتبع النموذجي: التغير في التألق (ΔF / F) بمرور الوقت من خلية فردية من جسم الفطر في ملفات من النوع الضربة القاضية والبرية. (ج) أحداث الكالسيوم العصبية العامة أو التي تحدث في جسم فطر الذباب المميز إلى مسامير صغيرة وكبيرة. د: طفرات الكالسيوم في الدماغ كله للذباب بالضربة القاضية وعناصر التحكم. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Liu et al.29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحل الخارجي لتسجيل وصنع حل التشريح.
كلوريد الصوديوم 101 مللي متر
كلوريد البوتاسيوم 3 مللي متر
كلوريد الكالسيوم 1 مللي متر
كلوريد المغنيسيوم 4 مللي متر
الجلوكوز 5 مللي متر
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة 1.25 مللي متر
بيكربونات الصوديوم 20.7 مللي متر
حل التشريح
الحل الخارجي 600 ميكرولتر
تعليق غراء 9 ش
ل-ليسين 2 ملغ/مل

الجدول 1: تكوين الحلول الخارجية والتشريح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعمل أيون الكالسيوم كرسول ثان حاسم ، حيث يلعب دورا محوريا في مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لكل من الاضطرابات الكيميائية والكهربائية. علاوة على ذلك ، تم تحديد العنصر الطوبولوجي لقنوات P / Q قبل المشبكي ، المشفرة بواسطة جين CACNA1A البشري ، على أنها مسؤولة عن التوسط في تصريف الناقلات العصبية المختلفة ، بما في ذلك الغلوتامات30،31،32 ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بالصرع33،34. في السابق ، لم يظهر سلوك ذباب ضربة قاضية Cac الشدة المبلغ عنها في بعض الطفرات وحتى أظهر تأثيرات قمعية في بعض الذباب الطافر المزدوج35 . تكشف نتائج هذه الدراسة أن ذباب ضربة قاضية من الصبار أكثر عرضة للنوبات من نظرائهم من النوع البري. تتوافق هذه الملاحظة مع حقيقة أن المرضى والنماذج الحيوانية الأخرى التي تحمل متغيرات فقدان الوظيفة CACNA1A مصابة بالصرع28,36. على الصعيد العالمي ، يمكن أن تؤدي ضربة قاضية من CAC إلى تعطيل الانتقال العصبي العضلي بشكل مباشر في الخلايا العصبية الحركية. على الرغم من أن الحركة في البالغين واليرقات وجدت أنها غير تنبؤية بقابلية النوبات ، إلا أن مساهمة الخلايا العصبية الحركية في سلوك النوبات تحتاج إلى مزيد من التحقيق37. باستمرار ، في تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، لاحظنا نسبة أكبر من أحداث الكالسيوم في جسم الفطر لذباب ضربة قاضية من ذباب CAC من الذباب البري (WT) ، مما يشير إلى ارتفاع وتيرة إطلاق الخلايا العصبية9. يعتبر جسم فطر الذباب مشابها بشكل فضفاض للحصين والقشرة في دماغ الثدييات. نظرا لأن النوبات تحدث عادة في الحصين وقشرة البشر ، يتم استخدام جسم الفطر لدراسة نشاط الكالسيوم العصبي المرتبط بالنوبات في هذه الدراسة. في الختام ، أثبتت هذه الدراسة اتساق المقايسة الشبيهة بالنوبات الحساسة للانفجار وتصوير الكالسيوم في ذبابة الفاكهة.

في مجال تصوير الكالسيوم ، يتيح استخدام مؤشر الكالسيوم GCaMP6 مع الفحص المجهري متحد البؤر مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في سياقات مختلفة مثل الجسم الحي ، وفي مزارع الخلايا ، وفي شرائح الدماغ ، وفي أنسجة المخ السليمة خارج الجسم الحي لنموذج ذبابة الفاكهة. ومع ذلك ، فمن المفهوم عموما أن التصوير في الجسم الحي لتدفقات الكالسيوم داخل الجهاز العصبي المركزي لذبابة الفاكهة يتطلب تدخلا جراحيا دقيقا لتحقيق الوصول البصري إلى الدماغ. قد يمنع هذا العائق التطبيق العملي والتقدم لهذه التقنية في المختبرات الفردية 8,16. الزرد هو أيضا نموذج حيواني مهم لدراسة الصرع. كما تم إنشاء طريقة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي سابقا36. ومع ذلك ، يمكن استخدام يرقات الزرد فقط لتسجيل التصوير في الجسم الحي. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن نماذج زراعة الخلايا وشرائح الدماغ يمكن أن توفر صورا عالية الدقة ، إلا أنه لا يمكن تكرار سلامة الدماغ وشبكاته العصبية بالكامل في زراعة الخلايا أو شرائح الدماغ بسبب الاضطراب الهيكلي. تعالج الدراسة الحالية هذه القضايا من خلال تنفيذ أنسجة دماغية سليمة معزولة لتصوير الكالسيوم ، وبالتالي تجنب الحاجة إلى تقنيات جراحية معقدة والحفاظ على سلامة الدماغ والشبكات العصبية دون انقطاع. ينتج عن النهج خارج الجسم الحي أيضا نسبة إشارة إلى ضوضاء فائقة عند مقارنتها بتقنيات التصوير في الجسم الحي.

توضح هذه الدراسة الإجراءات المحورية المختلفة في البروتوكول المتعلق بتوليد ذباب خط الحوض Gal4 > UAS - GCaMP6m / cac-RNAi . في البداية ، لعب الموازن المزدوج دورا حاسما في الحصول على الذباب المرغوب فيه. تسمح الموازنات المميزة للباحثين بمتابعة الأليلات والكروموسومات من خلال الصلبان المعقدة متعددة الأجيال38. بعد ذلك ، من أجل الفصل الفعال لأنسجة المخ السليمة وتحسين التصور المجهري ، كان من الضروري استخدام تعليق غراء لتليين الألياف السطحية للدماغ. علاوة على ذلك ، لتحقيق الاستقرار في الدماغ ومنع تلف الخلايا العصبية أثناء التجريب ، اعتبر استخدام حامل C-sharp مع مرمى النايلون ضروريا27.

في الختام ، يعد تصوير الكالسيوم المطبق هنا جنبا إلى جنب مع اختبار السلوك الشبيه بالنوبات الحساسة للانفجار في ذبابة الفاكهة نظاما قويا لفحص الجينات المرتبطة بالصرع واستكشاف الآلية المحتملة للصرع على المستوى الخلوي. بالتأكيد ، لا يمكن لهذه التقنية دراسة إشارات الكالسيوم في الوقت الفعلي المرتبطة بسلوك مثل الطرق الأخرى في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (منحة رقم 2022A1515111123 إلى Jing-Da Qiao) وخطة لتعزيز البحث العلمي في GMU (Jing-Da Qiao). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل خطة Enihancement لقدرة الابتكار لطلاب جامعة قوانغتشو الطبية (التمويل رقم 02-408-2304-02038XM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
  2. Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
  3. Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
  4. Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
  5. Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
  6. Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
  7. Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
  8. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  9. Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
  11. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
  13. Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
  14. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  15. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  16. Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
  17. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  18. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
  19. Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
  20. Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
  21. Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  22. Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
  23. Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
  24. Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
  25. Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
  26. Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
  27. Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
  28. Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
  29. Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
  30. Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
  31. Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
  32. Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
  33. Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
  34. Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
  35. Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
  36. Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
  37. Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
  38. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).

Tags

تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، نموذج ذبابة الفاكهة ، الصرع ، الاضطراب العصبي ، النوبات المتكررة ، الأصل الجيني ، تقنية التصوير ، مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، GCaMP6 ، الدقة على مستوى الدماغ ، دقة الخلية الواحدة ، علم الوراثة الجزيئية ، المقايسات السلوكية ، البروتوكول ، ذبابة الفاكهة للبالغين ، أنشطة الصرع ، المجهر متحد البؤر ، النشاط العصبي ، مقايسة السلوك الشبيه بالنوبات الحساسة للانفجار ، ذباب ضربة قاضية لجين CAC ، أنشطة الكالسيوم غير الطبيعية ، فحص الجينات المسببة للأمراض
<em>إكس فيفو</em> تصوير الكالسيوم <em>لنموذج ذبابة الفاكهة</em> للصرع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., … More

He, M. F., Liu, C. Q., Zhang, X. X., Lin, Y. M., Mao, Y. L., Qiao, J. D. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter