Summary
ここでは、てんかん様活性をモニターするために、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのプロトコルを紹介します。プロトコルは細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にする前の生体内カルシウムイメージ投射によって大人のショウジョウバエのictalでき事を調査するための貴重な用具を提供する。
Abstract
てんかんは、発作の再発を特徴とする神経疾患であり、遺伝的起源と部分的に相関しており、世界中で7,000万人以上が罹患しています。てんかんの臨床的重要性にもかかわらず、中枢神経系における神経活動の機能分析はまだ開発されていません。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝的にコードされたカルシウム指標の安定発現と相まって、脳全体および単一細胞の分解能レベルでてんかんの研究に革命をもたらしました。ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイにより、てんかんの根底にある分子および細胞メカニズムを調査するためのツールとして登場しました。この研究では、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのための新しい効率的なプロトコルを提示し、てんかん様活性を監視します。脳全体は、よく知られているてんかん遺伝子であるcacから調製され、共焦点顕微鏡でカルシウムイメージングを行い、前髪感受性発作様行動アッセイのフォローアップとして神経活動を特定します。CACノックダウンバエは、野生型ハエよりも発作様行動と異常なカルシウム活性の割合が高く、大きなトゲが多く、小さなトゲが少ないなどを示しました。カルシウム活性は発作様行動と相関していた。この方法論は、てんかんの病原性遺伝子をスクリーニングし、細胞レベルでてんかんの潜在的なメカニズムを探る上で効率的な方法論として機能します。
Introduction
てんかんは、自発的な発作や予期せぬ発作の再発や神経回路の異常な活動を特徴とする複雑な慢性神経疾患で、世界中で7,000万人以上が罹患しており、最も一般的な神経疾患1の1つであり、家族や社会の負担が大きい疾患となっています。てんかんの影響を考慮して、発作の病因を特定するために多くの研究が行われており、遺伝学は多くの種類のてんかんまたはてんかん症候群の主な原因として承認されています2。過去数十年にわたり、ゲノム技術の進歩により、イオンチャネル遺伝子や非イオンチャネル遺伝子など、発作の発生に重要な役割を果たす新しいてんかん関連遺伝子の発見が急速に増加しています3,4。しかし、遺伝子とてんかん表現型の間の根本的なメカニズムと機能解析は完全には理解されていません。てんかん関連の遺伝子とメカニズムを特定することは、患者の効率的な管理の可能性を提供します5,6。
細胞質カルシウムシグナルは、ニューロンの活動とシナプス伝達における極めて重要な要素です。1970年代以降、脳スライス7、in vivo8,9、およびex vivo10を含むカルシウムイメージングは、ニューロンの興奮性のマーカーとしてニューロン活動11をモニターするために利用されてきた12,13。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝子コードカルシウム指標(GECI)と組み合わせることで、脳全体および単一細胞の解像度レベル14,15,16の両方で、時空間精度の高いてんかんの研究に革命をもたらしました。カルシウム濃度の変化と過渡現象は、それぞれ活動電位とシナプス伝達に観察され14、細胞内カルシウムレベルの変化がニューロンの電気的興奮性と厳密な相関関係を示すことを示している17,18。カルシウムイメージングは、発生発作モデル9としても適用されており、抗けいれん性化合物のスクリーニングのためにショウジョウバエで実施されている19。
ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイのために、てんかんなどの科学研究における強力なモデル生物として浮上しています20,21,22。さらに、ショウジョウバエの高度な遺伝学的ツールは、遺伝的にコードされたカルシウム指標GCaMP6の発現に貢献しています。例えば、Gal4およびUASベースのバイナリ転写系は、空間的および時間的に制御された方法でGCaMP6の特異的な発現を可能にします。ショウジョウバエは小さな生物であるため、in vivoカルシウムイメージングは、脳の背側のごく一部のみが小さな窓を通して露出した外科的介入を行うために熟練した操作技術を必要とする14,23。同時に、ショウジョウバエの無傷の脳におけるex vivoカルシウムイメージングを使用して、脳全体の関心領域(ROI)をモニターできます。
本研究では、GCaMP6を発現する成体ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングを行い、てんかん様活性をモニタリングする。CACNA1Aよく知られているてんかん遺伝子であるCACは、CACNA1Aの相同体であるCav2チャネルに属しています。まず、cacノックダウンハエtub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAiの脳を解剖し、xytスキャンモードの共焦点顕微鏡を使用してイメージングしました。次に、GCaMP6蛍光の%ΔF/F値やカルシウムイベントなど、自然発作様事象を定量化する指標を計算することにより、ROIのカルシウムシグナルの変化を解析しました。また、ボルテックスマシンによる機械的刺激を行い、カックノックダウンバエの発作行動試験を行い、カルシウムイメージングの結果を検証しました。全体として、このプロトコルは、ex vivoカルシウムイメージングを通じて成虫ショウジョウバエの発作イベントを調査するための貴重なツールを提供し、細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にします。
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Protocol
1. 前髪感受性アッセイのプロトコール
- Gal4/UASシステム21を介して、tub-Gal4ドライバーラインとUAS-cac-RNAiラインを交差させることにより、実験用ハエを確立します。tub-Gal4系統の処女バエとUAS-cac-RNAi系統のオスバエを採集します。次に、処女と雄のハエを同じバイアルに移して子孫を収穫します。
注: tub-Gal4 ドライバーラインは、 cac 遺伝子の全体的なノックダウンを達成することができます。 UAS-cac-RNAi 株をコントロールグループとして使用します。 - 3〜5日後、100%CO2 (CO2 麻酔装置)を使用してハエを静かに麻酔し、 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi ハエと UAS-cac-RNAi ハエの両方をブラシで収集します。これらのハエを検査の1日前に新しい清潔な食品バイアルに移し、十分に準備されていることを確認します。
- CO2を使用してハエを穏やかに麻酔します。麻酔をかけたら、4〜6匹のハエを個々の新しいバイアルに慎重に入れます。ハエが麻酔から約1時間回復してから、テストに進みます。
注:各遺伝子型について、最低5件の試験が試験され、各試験は6バイアルのハエで構成されていた。 - 録音機器をセットアップします。カメラ(720-1080P、少なくとも30-60 FPS、AFロック)をホワイトボードの前の三脚に配置します。空のバイアルを使用してカメラのフォーカスを手動で調整し、鮮明で正確な映像を確保します。
- ボルテックスミキサーを使用して、機械的に誘発される発作のような動作を実行します。4〜6匹のハエが入った各バイアルをボルテックスミキサーに置き、最高設定(2800 rpm)で正確に10秒間実行します。ボルテックス後、すぐにバイアルをホワイトボードに置きます。
- ハエを観察し、ハエが示す発作のような行動を記録します。
注:ハエで観察される発作様行動は、発作(振動する翼として現れる)、麻痺、回復の3つの段階からなる24。試験されたハエに対する発作ハエの比率を発作率として定義しました。- 回復時間は、ボルテックス後、ハエが直立する能力を取り戻すまでに必要な時間として測定します25。
2. ex vivo の頭脳のカルシウムイメージ投射のためのプロトコル
- tub-Gal4>UAS-GCaMP6mとtub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAiラインをそれぞれ確立する。Gal4/UASバイナリー発現系21を用いてハエを生成し、ex vivo脳におけるカルシウム活性のモニタリングを可能にする。
- 提供されたレシピ(表1)26に記載されているように解剖溶液を調製します。
- 表 1 の説明に従って外部溶液を調製します。NaOHでpH 7.2に調整し、浸透圧を250-255 mOsm/Lに調整します。
注:外用溶液は4°Cで1週間保存できます。 - 解剖液を調製するには、9単位のパパイン懸濁液とL-リジン(2 mg/mL)を600 μLの外用溶液に加えます。溶液をボルテックスし、溶液が透明になるまで15分間待ちます。
注:解剖液は4時間以内に使用することをお勧めします。
- 表 1 の説明に従って外部溶液を調製します。NaOHでpH 7.2に調整し、浸透圧を250-255 mOsm/Lに調整します。
- 使用前に、外用溶液を酸素化生理食塩水(95%酸素と5%二酸化炭素)で5分間灌流します。.ピペットを使用して、約10 μLの解剖溶液をペトリ皿に移します。このソリューションは、脳の解剖とイメージングに必要な条件を提供します。
- tub-Gal4>UAS-GCaMP6mおよびtub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAiラインの脳をシリンジ針と顕微鏡を用いて注意深く解剖します。脳解剖の確立されたプロトコルに従ってください27.
- ピペットを使用して、準備した脳を5 mLの新鮮な外用溶液を含む記録皿に移し、記録皿内のCシャープホルダーを使用して脳を3〜5分間固定して回復させます。
注:Cシャープホルダーは、直径7mmの金属半円でできており、0.5mm間隔で平行な繊維が交差しています。 - 共焦点イメージングのセットアップと取得
- 共焦点イメージングでは、20倍の対物レンズと xytスキャンモードで各脳をキャプチャします。20倍の光増幅に基づいて、追加の4.5倍のデジタル増幅でキノコ体のニューロンを特定します。
注:各 ex vivo 脳は1時間以上画像化できます。 - 488 nmのレーザー励起で16 μwのレーザー出力で全脳GCaMP6m発光を取得します。スキャン パラメーターを速度 400、ピクセル サイズを 256 ピクセル x 256 ピクセルに設定します。5.3 Hzのアクイジション・レートを使用し、3分間記録します。
- 共焦点イメージングでは、20倍の対物レンズと xytスキャンモードで各脳をキャプチャします。20倍の光増幅に基づいて、追加の4.5倍のデジタル増幅でキノコ体のニューロンを特定します。
- すべての脳で5〜8のROIを特定し、蛍光を分析します。キノコ体ニューロンの細胞体を関心領域として手動で決定する28。
- 同定したニューロンを標識し、その蛍光強度をImageJで測定します。GCaMP6mの蛍光データを%ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B)で解析します。ベースラインより2〜2.5標準偏差上の増加を小さなスパイクとして細胞内蛍光を定義し、ベースラインより2.5標準偏差を超えて増加する細胞内蛍光を大きなスパイクとして定義します。スチューデントのt検定でカルシウムスパイクの頻度を分析します。
注:F0は、ROIの最初の5フレームの平均蛍光強度によってベースラインとして定義され、F1は特定の時点の蛍光強度として、Bは蛍光のないバックグラウンドとして定義されました。ニューロンの時間的な生理学的活動も、それらをノイズサインと区別するのに役立ちます。
- 同定したニューロンを標識し、その蛍光強度をImageJで測定します。GCaMP6mの蛍光データを%ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B)で解析します。ベースラインより2〜2.5標準偏差上の増加を小さなスパイクとして細胞内蛍光を定義し、ベースラインより2.5標準偏差を超えて増加する細胞内蛍光を大きなスパイクとして定義します。スチューデントのt検定でカルシウムスパイクの頻度を分析します。
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Representative Results
このプロトコルを用いて、 cac ノックダウンハエはWTハエよりも有意に高い発作様行動を示すことがわかった(17.00 ± 2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061;スチューデントのt検定、 図1A)。ほとんどのtub-Gal4>UAS-cac-RNAi ハエは1〜5秒以内に回復し、 UAS-cac-RNAi ハエは2秒以内に回復します。1秒以内の cac ノックダウンフライの回収率は、WTフライよりも有意に低かった(88.08 ± 1.89 [n = 6] vs 96.50 ± 1.82 [n = 6]; P = 0.0093;スチューデントのt検定、 図1B)。 図2に示すように、ハエのキノコ体ではカルシウムシグナルが観察されました。 cac ノックダウンハエ(tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi、2.97 ± 0.96 [n = 13]、 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m、5.33 ± 1.31 [n = 13]; P < 0.0001;スチューデントのt検定)、一方、 cac ノックダウンハエ(tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi、2.87 ± 0.63 [n = 13]、 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m、1.72 ± 0.62 [n = 13]; P < 0.0001)。これらの結果は、ハエで観察されたカルシウムシグナルが神経細胞の活動と高い相関を示し、 cac ノックダウンバエの発作様行動と一貫性を示したことを示しています。
図1:ハエの古典的な発作率と回復時間。 (A) CAC ノックダウンハエでは発作の発生率が高かった。(B)発作からの回復時間。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ハエのキノコ体における代表的なカルシウムシグナル。 (A)ハエのキノコ体で選択された5つの細胞におけるカルシウムシグナル。(B)典型的なトレース:ノックダウンおよび野生型ファイルにおけるキノコ本体の個々の細胞からの経時的な蛍光の変化(ΔF/F)。(C)ハエのキノコ体で発生する全体的または神経細胞のカルシウムイベントは、大小のスパイクに区別されます。(D)ノックダウンハエとコントロールの脳全体のカルシウムスパイク。この図は、Liu et al.29の許可を得て修正したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 解剖液を記録して作るための外用液。 | |
| 塩化ナトリウム | 101ミリメートル |
| 塩化カリウム | 3ミリメートル |
| 塩化カルシウム | 1ミリメートル |
| 塩化マグネシウム | 4ミリメートル |
| グルコース | 5ミリメートル |
| リン酸ナトリウム一塩基 | 1.25メートル |
| 炭酸水素ナトリウム | 20.7ミリメートル |
| 解剖液 | |
| 外部ソリューション | 600 μL |
| パパイン懸濁液 | 9 U |
| L-リジン | 2 mg/mL |
表1:外用液と解剖液の組成。
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Discussion
カルシウムイオンは重要なセカンドメッセンジャーとして機能し、化学的および電気的摂動の両方に対するさまざまな生理学的および病態生理学的応答において極めて重要な役割を果たします。さらに、ヒトCACNA1A遺伝子によってコードされるシナプス前P/Qチャネルのトポロジカル要素は、グルタミン酸30,31,32を含む様々な神経伝達物質の排出を媒介する役割を担っていることが確認されており、てんかんと密接に関連している33,34。以前は、Cacノックダウンバエの行動は、一部の変異体で報告された重症度を示さず、特定の二重変異体ハエでは抑制効果さえ示していました35。この研究の結果、cacノックダウンバエは野生型のハエよりも発作を起こしやすいことが明らかになりました。この観察は、CACNA1A機能喪失変異体を有する患者および他の動物モデルがてんかんに罹患しているという事実と対応している28,36。世界的に、cacのノックダウンは、運動ニューロンの神経筋伝達を直接破壊する可能性があります。成虫と幼虫の歩行運動は発作感受性を予測できないことがわかったが、発作行動における運動ニューロンのcacの寄与については、さらに調査する必要がある37。一貫して、ex vivoカルシウムイメージングでは、野生型(WT)ハエよりもCACノックダウンバエのキノコ体におけるカルシウムイベントの割合が高く、ニューロン発火の頻度が高いことが示されました9。ハエのキノコ体は、哺乳類の脳の海馬や皮質に大まかに似ていると考えられています。通常、ヒトの海馬や大脳皮質で発作が起きるため、本研究ではキノコ体を用い、発作に関連する神経カルシウム活性を調べています。結論として、この研究は、ショウジョウバエにおける前髪感受性発作様アッセイとカルシウムイメージングの一貫性を確立しました。
カルシウムイメージングの分野では、カルシウム指示薬GCaMP6を共焦点顕微鏡と組み合わせて利用することで、in vivo、細胞培養、脳スライス、ショウジョウバエモデルのex vivo無傷の脳組織など、さまざまな状況でカルシウム濃度の変化をモニタリングすることができます。しかし、ショウジョウバエの中枢神経系内のカルシウムフラックスのin vivoイメージングは、脳への光アクセスを達成するために洗練された外科的介入を必要とすることが一般的に理解されています。この障害は、個々の実験室におけるこの技術の実用性と進歩を阻害する可能性があります8,16。ゼブラフィッシュは、てんかんを研究するための重要な動物モデルでもあります。in vivoカルシウムイメージング法も以前に確立されました36。ただし、in vivoイメージング記録に使用できるのはゼブラフィッシュの幼生のみです。一方、細胞培養モデルや脳スライスモデルでは、より高解像度の画像を得ることができますが、細胞培養や脳スライスでは、構造破壊のために脳とその神経ネットワークの完全性を完全に再現することはできません。現在の研究では、カルシウムイメージングのために単離された無傷のショウジョウバエの脳組織を実装することで、これらの問題に対処し、複雑な外科的技術の必要性を回避し、脳と神経ネットワークの完全性を中断することなく維持します。また、ex vivoアプローチは、in vivoイメージング技術と比較して、優れたS/N比を実現します。
本研究は、 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 系統のハエの生成に関するプロトコルにおける様々な重要な手順を解明する。当初、ダブルバランサーは望ましいハエを得る上で重要な役割を果たしました。マークされたバランサーにより、研究者は対立遺伝子と染色体を複雑な多世代交配で追跡することができます38。その後、無傷の脳組織を効率的に分離し、顕微鏡での可視化を改善するために、パパイン懸濁液を使用して脳の表面線維を軟化させることが不可欠でした。さらに、実験中の脳を安定させ、神経細胞の損傷を防ぐために、ナイロン十字線付きのCシャープホルダーの使用が必要であると考えられました27。
結論として、ショウ ジョウバエ における前髪感受性発作様行動アッセイと並行してここで適用されたカルシウムイメージングは、てんかん関連遺伝子をスクリーニングし、細胞レベルでてんかんの潜在的なメカニズムを探るための強力なシステムです。確かに、この手法では、他のin vivo法のように動物の行動と相関するリアルタイムのカルシウムシグナルを研究することはできません。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、広東省基礎応用基礎研究基金会(助成金番号2022A1515111123 to Jing-Da Qiao)の支援を受けており、GMU(Jing-Da Qiao)の科学研究を強化する計画です。この研究は、広州医科大学学生イノベーション能力強化計画(資金番号02-408-2304-02038XM)の支援も受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
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