Summary
Her presenterer vi en protokoll for ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. Protokollen gir et verdifullt verktøy for å undersøke iktale hendelser i voksen Drosophila gjennom ex vivo kalsiumavbildning, noe som muliggjør utforskning av potensielle mekanismer for epilepsi på cellenivå.
Abstract
Epilepsi er en nevrologisk lidelse preget av tilbakevendende anfall, delvis korrelert med genetisk opprinnelse, som påvirker over 70 millioner individer over hele verden. Til tross for den kliniske betydningen av epilepsi, er den funksjonelle analysen av nevral aktivitet i sentralnervesystemet fortsatt utviklet. Nylige fremskritt innen bildebehandlingsteknologi, i kombinasjon med stabilt uttrykk for genetisk kodede kalsiumindikatorer, som GCaMP6, har revolusjonert studiet av epilepsi på både hjernebrede og enkeltcelleoppløsningsnivåer. Drosophila melanogaster har dukket opp som et verktøy for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for epilepsi på grunn av sin sofistikerte molekylære genetikk og atferdsanalyser. I denne studien presenterer vi en ny og effektiv protokoll for ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. Hele hjernen er utarbeidet fra cac, et velkjent epilepsigen, knockdownfluer for kalsiumavbildning med et konfokalmikroskop for å identifisere nevralaktiviteten som en oppfølging av den bang-sensitive anfallslignende atferdsanalysen. Cac knockdown-fluene viste en høyere grad av anfallslignende oppførsel og unormale kalsiumaktiviteter, inkludert flere store pigger og færre små pigger enn villtype fluer. Kalsiumaktivitetene var korrelert med anfallslignende atferd. Denne metoden fungerer som en effektiv metodikk i screening av patogene gener for epilepsi og utforske den potensielle mekanismen for epilepsi på mobilnivå.
Introduction
Epilepsi, en kompleks kronisk nevrologisk lidelse preget av gjentakelse av spontane og uprovoserte anfall og avvikende nevronnettverksaktivitet, har påvirket over 70 millioner individer over hele verden, noe som gjør den til en av de vanligste nevrologiske sykdommene1 og fører til de store byrdene av familier og samfunn. Med tanke på virkningen av epilepsi har det blitt utført mange studier for å identifisere etiologien til anfall, hvorav genetikk er godkjent som en primær årsak til mange typer epilepsier eller epileptiske syndromer2. I de siste tiårene har fremskritt innen genomiske teknologier ført til en rask økning i oppdagelsen av nye epilepsiassosierte gener, som spiller en avgjørende rolle i anfallsforekomst, inkludert ionkanaler og ikke-ionkanalgener 3,4. Imidlertid er de underliggende mekanismene og funksjonsanalysen mellom genene og epileptiske fenotyper ufullstendig forstått. Identifisering av epilepsiassosierte gener og mekanismer gir mulighet for effektiv behandling av pasienter 5,6.
Cytosoliske kalsiumsignaler er sentrale elementer i nevronaktivitet og synaptisk overføring. Kalsiumavbildning, inkludert hjerneskiver7, in vivo 8,9 og ex vivo10, har blitt brukt til å overvåke nevronaktivitet11 som en markør for nevronal eksitabilitet siden1970-tallet 12,13. Nylige fremskritt innen bildebehandlingsteknologi, i kombinasjon med de genetisk kodede kalsiumindikatorene (GECI), som GCaMP6, har revolusjonert studiet av epilepsi ved både hjernebrede og enkeltcelleoppløsningsnivåer 14,15,16, som har et høyt nivå av spatiotemporal presisjon. Endringer i kalsiumkonsentrasjon og transienter ble observert i henholdsvis aksjonspotensialer og synaptisk overføring14, noe som indikerer at endringen av intracellulære kalsiumnivåer viser en streng korrelasjon med den elektriske eksitabiliteten til nevroner17,18. Kalsiumavbildning har også blitt brukt som en utviklingsanfallsmodell9 og utført i Drosophila for screening av antikonvulsive forbindelser19.
Drosophila melanogaster har dukket opp som en kraftig modellorganisme i vitenskapelig forskning, som epilepsi, for sin sofistikerte molekylære genetikk og atferdsanalyser 20,21,22. Videre har de avanserte genetiske verktøyene i Drosophila bidratt til uttrykket av genetisk kodet kalsiumindikator GCaMP6. For eksempel muliggjør Gal4- og UAS-baserte binære transkripsjonssystemer spesifikt uttrykk for GCaMP6 på en romlig og tidsmessig kontrollert måte. Siden Drosophila er en liten organisme, krever in vivo kalsiumavbildning dyktige operasjonsevner for å utføre et kirurgisk inngrep, hvor bare en liten del av hjernens dorsale ble eksponert gjennom et lite vindu14,23. Samtidig kan ex vivo kalsiumavbildning i den intakte hjernen til Drosophila brukes til å overvåke interesseområdene (ROI) i hele hjernen.
I denne studien presenterer vi ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. CACNA1A er et velkjent epilepsigen, tilhører cac Cav2-kanalen, som er en homolog til CACNA1A. Vi begynte med å dissekere hjernen til cac knockdown fluer tub-Gal4>GCaMP6m / cac-RNAi og avbilde dem ved hjelp av et konfokalmikroskop med xyt skanningsmodus. Vi analyserte deretter endringene i kalsiumsignaler av avkastning ved å beregne indikatorer som kvantifiserer spontane anfallslignende hendelser, for eksempel% ΔF / F-verdi og kalsiumhendelser av GCaMP6-fluorescens. I tillegg utførte vi mekanisk stimulans av virvelmaskin for å indusere anfallsadferdstester på cac-knockdownfluer, samt for å validere resultatene av kalsiumavbildning. Samlet sett gir denne protokollen et verdifullt verktøy for å undersøke iktale hendelser i voksen Drosophila gjennom ex vivo kalsiumavbildning, noe som muliggjør utforskning av potensielle mekanismer for epilepsi på cellenivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protokoll for bang-sensitiv analyse
- Etablere eksperimentelle fluer ved å krysse tub-Gal4 driverlinjen med UAS-cac-RNAi linjen via Gal4 / UAS system21. Samle jomfrufluene til kar-Gal4-linjen og hannfluene til UAS-cac-RNAi-linjen . Deretter overfører du jomfruen og hannfluene til samme hetteglass for å høste avkom.
MERK: Tub-Gal4-driverlinjen vil tillate å oppnå global knockdown av cac-genet . Bruk UAS-cac-RNAi-linjen som kontrollgruppe. - Etter 3-5 dager med eclosion, bedøv forsiktig fluene ved hjelp av 100% CO2 (CO2 anestesiutstyr) og samle både kar-Gal4>UAS-cac-RNAi fluer og UAS-cac-RNAi flyr med en børste. Overfør disse fluene til nye, rene hetteglass med mat 1 dag før testing for å sikre at de er godt forberedt.
- Bedøv forsiktig fluene ved hjelp av CO2. Når den er bedøvet, plasser forsiktig 4-6 fluer i individuelle ferske hetteglass. La fluene komme seg fra anestesi i ca 1 time før du fortsetter med testingen.
MERK: For hver genotype ble minst fem forsøk testet, og hver prøve besto av seks hetteglass med fluer. - Sett opp opptaksutstyret. Plasser et kamera (720-1080P, minst 30-60 FPS, AF låst) på et stativ foran en tavle. Juster kameraets fokus manuelt ved hjelp av et tomt hetteglass for å sikre klare og nøyaktige opptak.
- Bruk en virvelblander for å utføre mekanisk indusert anfall-lignende oppførsel. Plasser hvert hetteglass med 4-6 fluer på virvelblanderen og kjør den på høyeste innstilling (2800 rpm) i nøyaktig 10 s. Etter virvelen plasserer du hetteglasset straks på tavlen.
- Observer fluene og registrer enhver anfallslignende oppførsel de utviser.
MERK: Anfallslignende oppførsel observert hos fluer består av tre stadier: anfall (manifesterer seg som vibrerende vinger), lammelse og gjenoppretting24. Forholdet mellom anfallsfluer og testede fluer ble definert som anfallsrate.- Mål restitusjonstiden som tiden som kreves etter virveldannelse til fluene gjenvinner evnen til å stå oppreist25.
2. Protokoll for kalsiumavbildning av ex vivo hjerne
- Etablere henholdsvis tub-Gal4>UAS-GCaMP6m og tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi linjefluer . Generer fluene ved hjelp av Gal4 / UAS binært ekspresjonssystem21 for å tillate overvåking av kalsiumaktivitet i ex vivo hjernen.
- Tilbered disseksjonsoppløsningen som beskrevet i den medfølgende oppskriften (tabell 1)26.
- Klargjør den eksterne oppløsningen som beskrevet i tabell 1. Juster til pH 7,2 med NaOH og juster osmolariteten til 250-255 mOsm/L.
MERK: Den eksterne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i 1 uke. - For tilberedning av disseksjonsoppløsningen, tilsett 9 enheter papain-suspensjon og L-lysin (2 mg/ml) til 600 mikrol av den eksterne oppløsningen. Virv oppløsningen og vent i 15 minutter til oppløsningen er klar.
MERK: Det anbefales å bruke disseksjonsoppløsningen innen 4 timer.
- Klargjør den eksterne oppløsningen som beskrevet i tabell 1. Juster til pH 7,2 med NaOH og juster osmolariteten til 250-255 mOsm/L.
- Perfus den eksterne oppløsningen med oksygenert saltvann (95% oksygen og 5% karbondioksid) i 5 minutter før bruk. Bruk pipetten til å overføre ca. 10 μl av disseksjonsoppløsningen til en petriskål. Denne løsningen vil gi de nødvendige forholdene for hjernedisseksjon og avbildning.
- Forsiktig dissekere hjernen til både tub-Gal4>UAS-GCaMP6m og tub-Gal4>UAS-GCaMP6m / cac-RNAi linjer ved hjelp av sprøytenåler og mikroskop. Følg den etablerte protokollen for hjernedisseksjon27.
- Bruk en pipette til å overføre den tilberedte hjernen til en opptaksskål som inneholder 5 ml fersk ekstern oppløsning og immobiliser hjernen ved hjelp av en C-skarp holder i opptaksskålen i 3-5 minutter for gjenoppretting.
MERK: C-skarp holder ble laget av en metall halvsirkel med 7 mm diameter krysset av parallelle fibre 0,5 mm fra hverandre. - Konfokal bildeoppsett og anskaffelse
- For konfokal avbildning, fang hver hjerne med en 20x objektiv og xyt skannemodus. Identifiser soppkroppsnevronene med en ekstra 4,5x digital forsterkning basert på 20x optisk forsterkning.
MERK: Hver ex vivo hjerne kan avbildes i mer enn 1 time. - Skaff deg hele hjerne-GCaMP6m-utslipp ved 488 nm lasereksitasjon med 16 μw laserkraft. Sett skanneparametrene til en hastighet på 400, med en pikselstørrelse på 256 piksler x 256 piksler. Bruk en anskaffelseshastighet på 5,3 Hz og ta opp i en varighet på 3 minutter.
- For konfokal avbildning, fang hver hjerne med en 20x objektiv og xyt skannemodus. Identifiser soppkroppsnevronene med en ekstra 4,5x digital forsterkning basert på 20x optisk forsterkning.
- Identifiser 5-8 avkastning i hver hjerne og analyser fluorescensen. Manuelt bestemme cellekroppen til soppkroppsneuroner som interesseområdet28.
- Merk de identifiserte nevronene og mål fluorescensintensitetene deres med ImageJ. Analyser fluorescensdataene til GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definer den intracellulære fluorescensen, økende mellom 2 og 2,5 standardavvik over grunnlinjen, som små pigger, og intracellulær fluorescens, økende større enn 2,5 standardavvik over grunnlinjen, som store pigger. Analyser hyppigheten av kalsiumpigger ved hjelp av Student t-test.
MERK: F0 ble definert som grunnlinjen ved den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til de første 5 bildene i ROI, F1 som fluorescensintensiteten til det gitte tidspunktet og B som bakgrunn uten fluorescens. Tidsmessige fysiologiske aktiviteter av nevroner er også nyttige for å skille dem fra støytegn.
- Merk de identifiserte nevronene og mål fluorescensintensitetene deres med ImageJ. Analyser fluorescensdataene til GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definer den intracellulære fluorescensen, økende mellom 2 og 2,5 standardavvik over grunnlinjen, som små pigger, og intracellulær fluorescens, økende større enn 2,5 standardavvik over grunnlinjen, som store pigger. Analyser hyppigheten av kalsiumpigger ved hjelp av Student t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen fant vi at cac knockdown-fluer viste signifikant høyere forekomst av anfallslignende oppførsel enn WT-fluene (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Student t-test, figur 1A). De fleste tub-Gal4>UAS-cac-RNAi fluer gjenvunnet innen 1-5 s, mens UAS-cac-RNAi flyr gjenopprettet innen 2 s. Restitusjonsprosenten av cac knockdownfluer innen 1 s var signifikant lavere enn WT-fluene (88,08 ± 1,89 [n = 6] vs 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; Student t-test, figur 1B). Som vist i figur 2 ble det observert kalsiumsignaler i fluenes soppkropp. Små pigger forekom mindre i cac knockdown fluer (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Student t-test), mens store pigger forekom mer i cac knockdown fluer (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] vs. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Disse resultatene indikerer at kalsiumsignalene observert hos fluer korrelerer sterkt med nevronaktivitet og viste konsistens med den anfallslignende oppførselen i cac knockdownfluer.
Figur 1: Klassiske anfallsrater og restitusjonstid hos fluer. (A) Beslag forekom med høyere frekvens hos cac knockdownfluer. (B) Gjenopprettingstiden fra anfall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative kalsiumsignaler i fluenes soppkropp. (A) Kalsiumsignaler i utvalgte 5 celler i fluenes soppkropp. (B) Typisk spor: Endring i fluorescens (ΔF / F) over tid fra en individuell celle i sopplegemet i knockdown og villtypefiler. (C) Globale eller nevronale kalsiumhendelser som forekommer i soppkroppen til fluer som skiller seg ut i små og store pigger. (D) Kalsium pigger i hele hjernen av knockdown fluer og kontroller. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Liu et al.29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ekstern løsning for opptak og fremstilling av disseksjonsløsning. | |
| Natriumklorid | 101 mM |
| Kaliumklorid | 3 mM |
| Kalsiumklorid | 1 mM |
| Magnesiumklorid | 4 mM |
| Glukose | 5 mM |
| Monobasisk natriumfosfat | 1,25 mM |
| Natron | 20,7 mM |
| Disseksjon løsning | |
| Ekstern løsning | 600 μL |
| Papain suspensjon | 9 U |
| L-lysin | 2 mg/ml |
Tabell 1: Sammensetning av eksterne løsninger og disseksjonsløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiumionet fungerer som en avgjørende andre budbringer, og spiller en sentral rolle i en rekke fysiologiske og patofysiologiske responser på både kjemiske og elektriske forstyrrelser. Videre har det topologiske elementet i de presynaptiske P / Q-kanalene, kodet av det humane CACNA1A-genet, blitt identifisert som ansvarlig for å formidle utslipp av forskjellige nevrotransmittere, inkludert glutamat 30,31,32, og er nært knyttet til epilepsi 33,34. Tidligere viste oppførselen til Cac knockdownfluer ikke alvorlighetsgraden rapportert hos noen mutanter og viste til og med undertrykkende effekter i visse doble mutantfluer35 . Resultatene av denne studien viser at cac knockdown fluer er mer utsatt for anfall enn deres villtype kolleger. Denne observasjonen samsvarer med det faktum at pasienter og andre dyremodeller som bærer CACNA1A funksjonstapsvarianter, er rammet av epilepsi28,36. Globalt kan knockdown av cac direkte forstyrre nevromuskulær overføring i motorneuroner. Selv om bevegelse hos voksne og larver ble funnet å være ikke-prediktive for anfallsfølsomhet, må bidraget fra motorneuroners CAC i anfallsatferd undersøkes videre37. Konsekvent, i ex vivo kalsiumavbildning, la vi merke til en større andel kalsiumhendelser i soppkroppen til cac knockdown-fluer enn hos villtype (WT) fluer, noe som indikerte en høyere frekvens av nevronavfyring9. Fluenes soppkropp regnes løst analogt med hippocampus og cortex i pattedyrhjernen. Siden anfall vanligvis forekommer i hippocampus og cortex hos mennesker, brukes sopplegemet til å studere anfallsrelatert nevral kalsiumaktivitet i denne studien. Avslutningsvis etablerte denne studien konsistensen av den smellfølsomme anfallslignende analysen og kalsiumavbildningen i Drosophila.
Innen kalsiumavbildning muliggjør utnyttelse av kalsiumindikatoren GCaMP6 i kombinasjon med konfokalmikroskopi overvåking av endringer i kalsiumkonsentrasjon i forskjellige sammenhenger som in vivo, i cellekulturer, i hjerneskiver og i ex vivo intakt hjernevev av Drosophila-modellen. Imidlertid er det allment forstått at in vivo-avbildning av kalsiumflukser i sentralnervesystemet til Drosophila nødvendiggjør et raffinert kirurgisk inngrep for å oppnå optisk tilgang til hjernen; Denne hindringen kan hemme den praktiske og fremgangen til denne teknikken i individuelle laboratorier 8,16. Sebrafisk er også en viktig dyremodell for å studere epilepsi. In vivo kalsiumavbildningsmetoden ble også etablert tidligere36. Imidlertid kan bare sebrafisklarver brukes til in vivo bildeopptak. På den annen side, selv om cellekultur og hjerneskivemodeller kan gi bilder med høyere oppløsning, kan integriteten til hjernen og dens nevrale nettverk ikke replikeres fullt ut i cellekultur eller hjerneskiver på grunn av strukturelle forstyrrelser. Den nåværende studien løser disse problemene ved å implementere isolerte intakte Drosophila hjernevev for kalsiumavbildning, og dermed unngå behovet for komplekse kirurgiske teknikker og bevare integriteten til hjernen og nevrale nettverk uten forstyrrelser. Ex vivo-tilnærmingen gir også et overlegent signal-støy-forhold sammenlignet med in vivo bildebehandlingsteknikker.
Denne studien belyser ulike sentrale prosedyrer i protokollen angående generering av tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjefluer . I utgangspunktet spilte dobbeltbalanseren en avgjørende rolle for å skaffe de ønskelige fluene. Markerte balansere tillater forskere å følge alleler og kromosomer gjennom komplekse flergenerasjonskryss38. Deretter, for effektiv separasjon av det intakte hjernevevet og forbedret mikroskopisk visualisering, var det viktig å bruke Papain-suspensjon for å myke overflatefiberen i hjernen. Videre, for å stabilisere hjernen og forhindre nevronskader under eksperimentering, ble bruk av en C-skarp holder med nylontrådkors ansett nødvendig27.
Avslutningsvis er kalsiumavbildning anvendt her sammen med den bang-sensitive anfallslignende atferdsanalysen i Drosophila et kraftig system for screening av epilepsiassosierte gener og undersøkelse av den potensielle mekanismen for epilepsi på mobilnivå. Sikkert, denne teknikken kan ikke studere sanntids kalsiumsignaler korrelert med dyreadferd som andre in vivo-metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (stipendnr. 2022A1515111123 til Jing-Da Qiao) og planlegger å styrke vitenskapelig forskning i GMU (Jing-Da Qiao). Dette arbeidet ble også støttet av Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (finansiering nr. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
